钝头蛇类系统学研究进展

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1 动 物 学 杂 志 Chinese Journal of Zoology 2015, 50(5): 773 ~ 779 马 兜 铃 酸 对 斑 马 鱼 胚 胎 肾 毒 性 作 用 王 雪 刘 可 春 * 王 荣 春 王 希 敏 韩 利 文 孙 晨 张 云 何 秋 霞 侯 海 荣 山 东 省 科 学 院 生 物 研 究 所 济 南 摘 要 : 选 用 肾 发 育 完 成 ( 受 精 后 3 天 ) 的 斑 马 鱼 (Danio rerio) 胚 胎, 用 马 兜 铃 酸 进 行 染 毒 处 理, 观 察 胚 胎 的 表 型 变 化 及 死 亡 情 况, 分 析 马 兜 铃 酸 对 胚 胎 的 毒 性 作 用 及 规 律 ; 利 用 肾 荧 光 观 察 及 肾 组 织 切 片, 观 察 马 兜 铃 酸 处 理 后 胚 胎 肾 形 态 和 肾 组 织 结 构 的 改 变 情 况 ; 利 用 qpcr 检 测 马 兜 铃 酸 处 理 前 后 nephrin 的 表 达 变 化, 初 步 探 讨 足 细 胞 在 马 兜 铃 酸 毒 性 作 用 中 的 功 能 状 态 20 μmol/l 马 兜 铃 酸 处 理 24 h 后, 胚 胎 出 现 明 显 眼 周 水 肿 表 现 ; 在 马 兜 铃 酸 高 浓 度 组 (40 ~ 80 μmol/l), 除 眼 周 水 肿 外, 胚 胎 血 循 环 系 统 功 能 出 现 异 常, 表 现 为 心 率 降 低 血 流 缓 慢 甚 至 停 滞 ; 荧 光 显 微 镜 下 观 察 发 现, 马 兜 铃 酸 处 理 组 胚 胎 肾 出 现 肾 小 球 囊 性 膨 胀 前 肾 管 囊 性 扩 张 和 形 态 异 常 ; 切 片 显 示 马 兜 铃 酸 处 理 组 胚 胎 肾 组 织 结 构 受 到 损 害, 表 现 为 肾 小 球 结 构 疏 松 囊 性 扩 张, 前 肾 管 上 皮 细 胞 细 胞 排 列 松 散 紊 乱 及 管 腔 扩 张 样 改 变 ;qpcr 结 果, 马 兜 铃 酸 处 理 组 斑 马 鱼 胚 胎 nephrin 的 表 达 水 平 比 对 照 组 显 著 降 低 (P < 0.01) 研 究 表 明, 马 兜 铃 酸 能 损 害 斑 马 鱼 胚 胎 肾 结 构 和 功 能, 其 毒 性 作 用 与 肾 小 球 足 细 胞 的 功 能 改 变 有 关 关 键 词 : 斑 马 鱼 ; 肾 毒 性 ; 马 兜 铃 酸 中 图 分 类 号 :Q955 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2015) Nephrotoxic Effects of Aristolochic Acid in Zebrafish (Danio rerio) Embryos WANG Xue LIU Ke-Chun * WANG Rong-Chun WANG Xi-Min HAN Li-Wen SUN Chen ZHANG Yun HE Qiu-Xia HOU Hai-Rong Biology Institute of Shandong Academy of Sciences, Jinan , China Abstract: The nephrotoxicity of aristolochic acid was studied using zebrafish as a model animal. Zebrafish (Danio rerio) embryos at 3 days post-fertilization were treated with various concentrations of aristolochic acid for 24 h. Morphological changes of embryos and kidney were observed under the microscope and the percentage of abnormal embryos was counted. Histological structure of kidney was further examined by tissue sections. The expression level of nephrin was tested by qpcr to explore the podocyte function in embryonic kidney treated with aristolochic acid (AA). Embryos treated with 20 μmol/l aristolochic acid for 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 基 金 项 目 (No , ), 山 东 省 自 主 创 新 重 大 专 项 (No. 2014ZZCX02105); 通 讯 作 者, hliukch@sdas.org; 第 一 作 者 介 绍 王 雪, 女, 高 级 工 程 师 ; 研 究 方 向 : 药 物 毒 性 评 价 与 活 性 筛 选 ; wangxue8809@163.com 收 稿 日 期 : , 修 回 日 期 : DOI: /j.cjz

2 774 动 物 学 杂 志 Chinese Journal of Zoology 50 卷 24 h exhibited periocular edema. As the exposure dosages of aristolochic acid increased to μmol/l, besides periocular edema, a large number of embryos also displayed cardiovascular dysfunction characterized by decreased heart rate, slow blood flow and even blood stasis. Expansion of glomeruli and distortion of pronephric tubules were observed in embryos treated with aristolochic acid under a fluorescence microscope. Paraffin sections from AA-treated embryos displayed malformed histological structure of kidney, such as cystic glomeruli and disorganized epithelial cells of pronephric tubules. qpcr showed that aristolochic acid treatment down-regulated the expression of nephrin in half in comparison with mock-control siblings (P < 0.01). The results indicated that aristolochic acid caused profound nephrotoxicity in histological structure and biological function of zebrafish embryos. Dysfunction of podocyte may involve in the renal impairment. Key words: Zebrafish (Danio rerio); Nephrotoxicity; Aristolochic acid 马 兜 铃 酸 (aristolochic acids,aas) 又 被 称 为 马 兜 铃 总 酸 增 噬 力 酸 或 木 通 甲 素, 是 多 种 具 有 类 似 结 构 的 马 兜 铃 酸 分 子 的 总 称, 马 兜 铃 酸 Ⅰ( 马 兜 铃 酸 A) 是 其 中 最 重 要 且 最 常 见 的 一 种 马 兜 铃 酸 是 硝 基 菲 羧 酸, 存 在 于 马 兜 铃 属 (Aristolochia) 及 细 辛 属 (Asarum) 等 马 兜 铃 科 植 物 中, 这 些 植 物 曾 作 为 中 草 药 被 广 泛 应 用, 后 来 因 发 现 会 引 起 严 重 的 肾 功 能 损 害 而 被 禁 用 马 兜 铃 酸 对 多 种 动 物 均 具 有 肾 毒 性 和 致 癌 性, 能 损 伤 肾 小 管 上 皮 细 胞, 导 致 肾 间 质 纤 维 化 及 肾 萎 缩, 并 出 现 低 分 子 蛋 白 尿 严 重 贫 血 症 状, 被 称 为 马 兜 铃 酸 肾 病 目 前, 马 兜 铃 酸 肾 病 的 确 切 发 病 机 制 仍 不 明 确 肾 滤 过 屏 障 由 上 皮 细 胞 ( 足 细 胞 ) 基 底 膜 和 内 皮 细 胞 三 层 组 成 在 足 细 胞 表 面 有 多 种 与 肾 功 能 相 关 的 蛋 白 质 分 子 特 异 表 达, 如 nephrin CD2AP(CD2-associated protein,cd2 相 关 蛋 白 ) 和 podocin 等 在 肾 病 理 状 态 下, 这 些 分 子 在 足 细 胞 表 面 的 表 达 量 及 表 达 位 置 会 发 生 改 变, 而 且 这 种 改 变 往 往 在 蛋 白 尿 或 肾 形 态 改 变 出 现 之 前 更 早 发 生 如 nephrin, 是 在 肾 小 球 足 细 胞 膜 上 表 达 的 一 种 跨 膜 蛋 白, 其 胞 外 部 分 是 构 成 裂 孔 隔 膜 的 主 要 组 件, 对 裂 孔 隔 膜 的 完 整 和 功 能 至 关 重 要 (Mundel et al. 2002) nephrin 缺 陷 的 人 (Homo sapiens) 或 鼠 (Mus musculus) 表 现 为 严 重 肾 功 能 异 常, 其 编 码 基 因 Nphs1 是 引 起 先 天 性 ( 芬 兰 型 ) 肾 病 综 合 征 (congenital nephrotic syndrome of the Finnish type) 的 突 变 基 因 (Salant et al. 2003) 斑 马 鱼 (Danio rerio) 是 进 行 器 官 发 育 和 疾 病 模 型 研 究 的 理 想 模 式 生 物, 具 有 发 育 周 期 短 的 特 点, 斑 马 鱼 肾 在 受 精 后 14 h(14 hpf,14 hours post fertilization) 开 始 发 育, 在 72 hpf 内, 肾 发 育 完 成 (Kubota et al. 2007), 具 备 滤 过 功 能 胚 胎 期 斑 马 鱼 的 肾 在 进 化 阶 段 上 属 于 前 肾, 仅 由 一 对 肾 单 位 组 成, 前 肾 解 剖 结 构 虽 然 简 单, 但 表 现 出 与 高 等 脊 椎 动 物 肾 相 似 的 生 物 功 能 (Ebarasi et al. 2011), 而 且 对 毒 性 物 质 的 反 应 表 现 与 人 类 相 似 本 文 利 用 受 精 后 3 d(3 dpf, 3 days post fertilization) 以 上 的 斑 马 鱼 胚 胎 研 究 马 兜 铃 酸 对 肾 的 毒 性 作 用, 初 步 探 讨 了 马 兜 铃 酸 处 理 后 肾 功 能 相 关 因 子 nephrin 的 表 达 变 化, 为 进 一 步 掌 握 马 兜 铃 酸 的 肾 毒 性 作 用 机 制, 更 好 地 预 防 和 治 疗 马 兜 铃 酸 肾 病 提 供 有 价 值 的 参 考 1 实 验 材 料 1.1 实 验 动 物 实 验 所 用 为 Tg(wt1b:GFP) 转 基 因 斑 马 鱼, 由 德 国 莱 布 尼 茨 老 年 病 研 究 所 惠 赠, 在 Tg (wt1b:gfp) 斑 马 鱼 胚 胎 绿 色 荧 光 蛋 白 报 告 基 因 表 达 于 前 肾 的 肾 小 球 前 肾 管 及 近 端 前 肾 弓 区 域 养 殖 条 件, 水 温 28.5, 保 持 14 h 光 照 /10 h 黑 暗 的 光 照 周 期, 每 日 于 9:00 时 和

3 5 期 王 雪 等 : 马 兜 铃 酸 对 斑 马 鱼 胚 胎 肾 毒 性 作 用 :00 时 两 次 喂 食 颗 粒 饲 料 排 卵 前 日 将 斑 马 鱼 成 鱼 按 雌 雄 比 2..1 放 入 产 卵 缸 内, 每 缸 中 共 6 尾, 为 保 证 排 孵 时 间 一 致, 中 间 放 隔 板 隔 开 雌 雄 成 鱼, 次 日 亮 灯 前 抽 去 隔 板, 在 光 照 刺 激 下 排 卵, 亮 灯 后 半 小 时 内 收 集 鱼 卵, 将 卵 用 培 养 水 冲 洗 3 遍, 然 后 放 入 新 培 养 水 中, 在 28.5 相 同 光 照 条 件 下 发 育 至 3 dpf 1.2 试 剂 和 仪 器 马 兜 铃 酸 A, 购 自 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院, 分 子 量 , 纯 度 高 于 99.0% 用 二 甲 基 亚 砜 (dimethyl sulfoxide,dmso) 溶 解 配 制 成 5 mmol/l 储 液,4 保 存 Trizol 试 剂 ( 美 国 Invitrogen 公 司 ),PrimeScript TM 1st Strand cdna 合 成 试 剂 盒 ( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ),itaq Universal SYBR Green Supermix( 美 国 Bio-Rad 公 司 ), 苏 木 素 和 水 溶 性 伊 红 染 料 (Sigma 公 司 ),MS-222(Sigma 公 司 ) 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 胚 胎 培 养 水 成 分 为 :NaCl 5 mmol/l,kcl 0.17 mmol/l,cacl mmol/l,mgso mmol/l, 用 去 离 子 水 配 制 荧 光 定 量 PCR 仪 CFX96 为 美 国 Bio-Rad 产 品 ; 倒 置 显 微 镜 IX51 和 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 为 日 本 Olympus 产 品 ;Shandon Histocentre 2 型 石 蜡 包 埋 机 和 Shandon Finesse 325 型 切 片 机 为 美 国 Thermo 产 品 2 方 法 2.1 胚 胎 分 组 及 给 药 处 理 根 据 预 实 验 中 得 到 的 马 兜 铃 酸 A 对 斑 马 鱼 胚 胎 (3 dpf) 的 24 h 半 致 死 浓 度, 设 μmol/l 3 个 马 兜 铃 酸 A 浓 度 组, 用 6 孔 细 胞 培 养 板 进 行 实 验, 以 含 DMSO 的 培 养 水 (DMSO 含 量 0.8%, 体 积 比 ) 作 为 空 白 对 照 组, 每 孔 内 溶 液 终 体 积 为 6 ml 随 机 吸 取 发 育 3 dpf 的 斑 马 鱼 胚 胎, 移 入 各 孔 内, 每 孔 胚 胎 数 量 为 30 枚, 每 浓 度 组 设 3 个 平 行, 加 盖 后 放 于 恒 温 控 光 培 养 箱 内 孵 育 24 h 药 物 处 理 结 束 后, 取 出 胚 胎 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 胚 胎 形 态, 记 录 胚 胎 异 常 情 况 并 计 数, 拍 照 2.2 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 拍 照 收 集 马 兜 铃 酸 A 处 理 组 和 对 照 组 的 斑 马 鱼 胚 胎, 先 用 0.02% 三 卡 因 (tricaine,ms-222) 麻 醉 1 min, 然 后 移 入 含 0.02%( 质 量 体 积 比 ) MS-222 和 0.8%( 质 量 体 积 比 ) 低 融 点 琼 脂 糖 的 培 养 液 中, 调 整 胚 胎 为 俯 卧 位, 用 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 肾 荧 光, 并 拍 照 2.3 斑 马 鱼 胚 胎 肾 组 织 切 片 收 集 对 照 组 和 处 理 组 的 胚 胎 用 0.15%( 质 量 体 积 比 )MS-222 麻 醉 后, 放 入 4% 多 聚 甲 醛 (paraformaldehyde,pfa) 中,4 过 夜 固 定, 次 日 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) 冲 洗 后, 依 次 进 行 梯 度 乙 醇 脱 水 二 甲 苯 透 明 和 石 蜡 包 埋, 然 后 进 行 切 片, 切 片 厚 度 为 5 μm, 最 后 进 行 苏 木 精 - 伊 红 (H.E) 染 色, 在 显 微 镜 下 观 察 胚 胎 肾 组 织 结 构 变 化 并 拍 照 2.4 qpcr 检 测 胚 胎 nephrin 表 达 水 平 收 集 对 照 组 和 处 理 组 的 胚 胎 用 灭 菌 水 冲 洗 后, 分 别 加 入 Trizol 试 剂 提 取 胚 胎 组 织 的 总 RNA, 逆 转 录 成 cdna, 取 1 µl cdna 产 物 进 行 qpcr, 以 β-actin 作 为 内 参 基 因 扩 增 引 物 序 列 分 别 为,nephrin 上 游 引 物 5 -GAC CAG ACC TCC GTT ACT C-3, 下 游 引 物 5 -AGG ATC ACC ACC ACA TAG AC-3 ;β-actin 上 游 引 物 5 -TCC CCT TGT TCA CAA TAA CC-3, 下 游 引 物 5 -TCT GTG GCT TTG GGA TTC A-3 qpcr 反 应 体 系 为 20 µl, 反 应 条 件 为 95 预 变 性 30 s,95 5 s s 共 40 个 循 环 采 用 2 - Cq 法 分 析 基 因 的 相 对 表 达 量, C q ( 处 理 组 )= C q ( 处 理 组 目 的 基 因 )-C q ( 处 理 组 内 参 基 因 ), C q ( 对 照 组 ) = C q ( 对 照 组 目 的 基 因 )-C q ( 对 照 组 内 参 基 因 ), C q = C q ( 处 理 组 )- C q ( 对 照 组 ), 以 2 - Cq 表 示 处 理 组 目 的 基 因 的 表 达 倍 数 C q 指 PCR 扩 增 过 程 中, 扩 增 产 物 的 荧 光 信 号 达 到 设 定 阈 值 时 所 经 过 的 扩 增 循 环 次 数 2.5 统 计 学 分 析 采 用 SPSS13.0 对 实 验 数 据 进 行 分 析, 各 组 数 据 用 平 均 值 ± 标 准 误 (Mean ± SE) 表 示,

4 776 动 物 学 杂 志 Chinese Journal of Zoology 50 卷 采 用 单 因 素 方 差 分 析 法 (one way analysis of variance,anova) 比 较 组 间 均 值 的 差 异, 并 用 LSD 法 进 行 组 间 两 两 比 较,P < 0.05 为 差 异 具 有 统 计 学 意 义 3 结 果 3.1 马 兜 铃 酸 A 对 斑 马 鱼 胚 胎 的 毒 性 作 用 发 育 3 dpf 的 斑 马 鱼 胚 胎 经 20 μmol/l 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后, 部 分 胚 胎 出 现 明 显 眼 周 水 肿 表 现 ( 图 1), 但 心 率 及 循 环 血 流 速 度 与 对 照 组 比 无 明 显 改 变 随 着 马 兜 铃 酸 A 浓 度 升 高, 形 态 异 常 的 胚 胎 所 占 比 例 逐 渐 升 高, 除 眼 周 水 肿 外, 胚 胎 同 时 出 现 了 血 循 环 系 统 的 异 常, 表 现 为 心 率 降 低 血 流 缓 慢 等 ( 图 2) 在 40 ~ 80 μmol/l 浓 度 组, 可 以 看 到 部 分 胚 胎 心 跳 微 弱 主 干 血 流 缓 慢, 尾 部 主 动 脉 及 体 节 间 血 管 出 现 血 流 停 滞 血 细 胞 淤 积 现 象, 但 并 无 明 显 的 眼 周 或 其 他 部 位 水 肿 表 现 处 理 时 间 为 24 h 时, 所 有 处 理 组 胚 胎 的 死 亡 率 与 对 照 组 均 无 明 显 差 异 3.2 马 兜 铃 酸 A 处 理 后 肾 表 型 变 化 在 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 Tg(wt1b: GFP) 斑 马 鱼 胚 胎 (4 dpf) 的 肾 形 态, 可 见 正 常 胚 胎 肾 小 球 在 中 线 处 融 合, 前 肾 管 结 构 居 于 两 侧, 马 兜 铃 酸 A 处 理 组 胚 胎 肾 小 球 呈 囊 性 膨 胀, 前 肾 管 出 现 囊 性 扩 张 和 形 态 异 常 改 变 ( 图 3) 3.3 斑 马 鱼 胚 胎 肾 组 织 结 构 变 化 为 进 一 步 确 认 肾 损 伤 情 况, 将 各 组 胚 胎 进 行 固 定 包 埋 后, 切 片 观 察 对 照 组 斑 马 鱼 胚 胎 的 肾 小 球 结 构 致 密 轮 廓 清 晰, 前 肾 管 上 皮 细 胞 排 列 整 齐, 而 马 兜 铃 酸 A 处 理 组 胚 胎 肾 小 球 出 现 结 构 疏 松 和 囊 性 扩 张, 前 肾 管 上 皮 细 胞 排 列 松 散 紊 乱, 并 有 管 腔 扩 张 样 改 变 ( 图 4), 表 明 肾 组 织 结 构 受 到 损 害 3.4 马 兜 铃 酸 A 对 斑 马 鱼 胚 胎 nephrin 表 达 水 平 的 影 响 用 qpcr 对 各 处 理 组 及 对 照 组 斑 马 鱼 胚 胎 的 nephrin 表 达 情 况 进 行 检 测,20 μmol/l 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后, 斑 马 鱼 胚 胎 nephrin 的 表 达 水 平 比 对 照 组 显 著 降 低 (P < 0.01), 仅 为 对 照 组 的 ± 0.08( 图 5) 4 讨 论 服 用 含 马 兜 铃 酸 成 分 的 中 药 材 会 导 致 人 体 发 生 不 可 逆 肾 损 伤 和 癌 变, 其 肾 损 伤 机 制 随 剂 量 不 同 而 不 同, 大 剂 量 马 兜 铃 酸 直 接 引 起 急 性 肾 小 管 上 皮 细 胞 坏 死, 并 进 而 发 生 肾 间 质 纤 维 化, 长 期 小 剂 量 摄 入 马 兜 铃 酸 则 通 过 与 细 胞 DNA 形 成 AA-DNA 加 合 物 导 致 肾 小 管 损 伤 和 图 1 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后 斑 马 鱼 胚 胎 的 表 型 变 化 Fig. 1 Defective phenotypes of zebrafish embryos after aristolochic acid treatment for 24 h a. 对 照 组 斑 马 鱼 胚 胎 (4 dpf); b. 马 兜 铃 酸 A(20 μmol/l) 处 理 24 h 后 斑 马 鱼 胚 胎 出 现 眼 周 水 肿 E. 眼 a. Control group (4 dpf); b. 20 μmol/l AA-treated embryos displayed periocular edema. E. Eye.

5 5 期 王 雪 等 : 马 兜 铃 酸 对 斑 马 鱼 胚 胎 肾 毒 性 作 用 777 图 2 马 兜 铃 酸 A 对 斑 马 鱼 胚 胎 (3 dpf) 的 毒 性 作 用 Fig. 2 Toxic effects of aristolochic acid on 3 dpf zebrafish embryos 与 对 照 组 相 比, :P < 0.01 P < 0.01, compared with control group. 图 3 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后 斑 马 鱼 (wt1b:gfp) 胚 胎 肾 形 态 Fig. 3 Pronephric phenotype of transgenic line (wt1b:gfp) after exposure to aristolochic acid for 24 h a. 对 照 组 斑 马 鱼 胚 胎 (4 dpf); b. 40 μmol/l 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后 斑 马 鱼 胚 胎 (4 dpf);c. 80 μmol/l 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后 斑 马 鱼 胚 胎 (4 dpf) Embryos treated with 40μmol/L (b) and 80 μmol/l aristolochic acid (c) exhibited cystic glomeruli and warping pronephric tubules compared with the control group (a). GL. 肾 小 球 ;PT. 前 肾 管 GL. Glomeruli; PT. Pronephric tubule.

6 778 动 物 学 杂 志 Chinese Journal of Zoology 50 卷 图 4 马 兜 铃 酸 A 对 斑 马 鱼 胚 胎 肾 组 织 结 构 的 影 响 Fig. 4 Transverse histological sections of glomeruli and pronephric tubule of zebrafish embryos a. 正 常 组 斑 马 鱼 胚 胎 (96 hpf) 肾 组 织 切 片 ( 横 断 面,H.E 染 色 );b. 40 μmol/l 马 兜 铃 酸 处 理 24 h 后 斑 马 鱼 胚 胎 (96 hpf) 肾 组 织 切 片 ( 横 断 面,H.E 染 色 ) Transverse histological sections (5 μm) were obtained from 96 hpf zebrafish embryos after exposure to solvent (a) and 40 μmol/l aristolochic acid (b) for 24 h, respectively. NC. 脊 索 ;GL. 肾 小 球 ;PT. 前 肾 管 ; 囊 性 扩 张 NC. Notochord; GL. Glomeruli; PT. Pronephric tubule; Indicate the location of cyst. 图 5 马 兜 铃 酸 A 对 斑 马 鱼 胚 胎 nephrin 表 达 水 平 的 影 响 Fig. 5 Quantitative real-time polymerase chain reaction (qpcr) analysis for the expression levels of nephrin in mock and AA-treated embryos : 与 对 照 组 比,P < 0.01 P < 0.01, compared with control group. 肾 间 质 纤 维 化 ( 商 朴 等 2008) 在 Ding 等 ( 2012) 研 究 中, 用 马 兜 铃 酸 处 理 处 于 肾 发 育 期 的 斑 马 鱼 胚 胎 (16 hpf 以 上 ), 导 致 肾 形 态 出 现 畸 形, 肾 小 球 滤 过 率 (glomerular filtration rate,gfr) 比 正 常 胚 胎 显 著 下 降, 显 示 马 兜 铃 酸 对 肾 发 育 产 生 毒 性 影 响 在 本 文 中, 用 3 dpf 肾 发 育 完 成 的 斑 马 鱼 胚 胎 研 究 马 兜 铃 酸 的 肾 毒 性 作 用, 经 20 μmol/l 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后, 胚 胎 出 现 了 明 显 的 眼 周 水 肿 表 现, 心 率 及 血 流 速 度 未 见 异 常, 提 示 胚 胎 肾 功 能 可 能 出 现 异 常 荧 光 显 微 镜 下 观 察,40 ~ 80 μmol/l 马 兜 铃 酸 A 处 理 组 胚 胎 肾 出 现 肾 小 球 囊 性 膨 胀 前 肾 管 囊 性 扩 张 和 形 态 异 常 肾 组 织 切 片 发 现 处 理 组 胚 胎 肾 小 球 出 现 结 构 疏 松 和 囊 性 扩 张, 前 肾 管 上 皮 细 胞 排 列 松 散 紊 乱, 并 有 管 腔 扩 张 样 改 变, 说 明 肾 结 构 受 到 损 害, 从 而 导 致 局 部 水 肿 的 发 生 实 验 中 发 现, 经 40 ~ 80 μmol/l 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后 的 斑 马 鱼 胚 胎, 除 出 现 眼 周 水 肿 改 变 外, 还 出 现 心 率 降 低 血 流 缓 慢 甚 至 停 滞 表 现, 说 明 马 兜 铃 酸 A 处 理 引 起 胚 胎 血 循 环 系 统 功 能 发 生 异 常 已 有 研 究 认 为, 马 兜 铃 酸 对 斑 马 鱼 胚 胎 的 心 发 育 具 有 毒 性 作 用, 在 Huang 等 (2007) 的 研 究 中, 用 马 兜 铃 酸 处 理 发 育 早 期 (6 hpf 以 上 ) 的 斑 马 鱼 胚 胎, 会 引 起 胚 胎 心 结 构 发 育 异 常 和 心 功 能 障 碍 Ding 等 (2012) 研 究 中 发 现 马 兜 铃 酸 对 斑 马 鱼 胚 胎 的 心 和 肾 发 育 均 有 毒 性 影 响, 并 通 过 进 一 步 研 究 比 较, 认 为 肾 对 马 兜 铃 酸 的 毒 性 作 用 比 心 更 为 敏 感 作 为 机 体 的 两 大 重 要 器 官, 心 与 肾 之 间 通 过 复 杂 网 络 系 统 和 多 种 介 质 在 功 能 上 密 切 相 关 相 互 影 响, 一 方 的 功 能 改 变 会 严 重 影 响 另 一 器 官 的 功 能, 两 者 在 病 程 上 往 往 产 生 协 同 促 进 作 用

7 5 期 王 雪 等 : 马 兜 铃 酸 对 斑 马 鱼 胚 胎 肾 毒 性 作 用 779 本 文 中 马 兜 铃 酸 A 处 理 组 胚 胎 出 现 的 心 血 管 系 统 功 能 的 异 常 改 变, 是 源 于 马 兜 铃 酸 对 心 的 直 接 毒 性 作 用, 还 是 继 发 于 肾 功 能 的 严 重 损 伤, 还 需 要 进 一 步 研 究 确 认 本 文 中, 处 理 时 间 为 24 h 时,20 ~ 80 μmol/l 各 处 理 组 胚 胎 均 出 现 形 态 异 常, 但 死 亡 率 与 对 照 组 无 明 显 差 异 在 实 验 中, 将 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后 的 各 组 胚 胎 用 培 养 水 进 行 冲 洗 后, 转 移 入 空 白 培 养 水 中 继 续 孵 育 24 h, 发 现 包 括 20 μmol/l 组 在 内 的 各 处 理 组 胚 胎 仍 全 部 死 亡, 这 说 明 马 兜 铃 酸 对 胚 胎 造 成 的 肾 损 伤 是 一 个 进 行 性 发 展 不 可 逆 的 过 程, 这 也 符 合 临 床 肾 疾 病 持 续 进 展 的 病 程 特 点 Nephrin 为 一 分 子 量 为 180 ku 的 跨 膜 蛋 白, 在 肾 特 异 表 达 于 肾 小 球 足 细 胞, 与 足 细 胞 膜 上 同 时 表 达 的 CD2AP 和 podocin 形 成 蛋 白 复 合 体, 一 端 锚 定 足 细 胞 膜 的 磷 脂 双 分 子 层 区, 另 一 端 与 相 临 足 细 胞 上 蛋 白 复 合 体 相 互 作 用, 形 成 裂 孔 隔 膜 Nephrin 对 裂 孔 隔 膜 的 完 整 和 功 能 具 有 重 要 作 用, 与 蛋 白 尿 发 生 密 切 相 关, 在 肾 功 能 异 常 时,nephrin 的 表 达 量 及 足 细 胞 上 的 表 达 位 置 往 往 会 发 生 变 化 在 本 文 中, 20 μmol/l 马 兜 铃 酸 A 处 理 24 h 后, 仅 有 20% 胚 胎 出 现 眼 周 水 肿 改 变,qPCR 结 果 显 示, 胚 胎 nephrin 的 相 对 表 达 量 已 明 显 降 低, 仅 为 对 照 组 的 1/2, 说 明 马 兜 铃 酸 不 仅 损 伤 肾 小 管 上 皮 细 胞, 对 肾 小 球 足 细 胞 也 有 影 响, 进 而 破 坏 了 肾 小 球 滤 过 屏 障 功 能, 这 可 能 也 是 马 兜 铃 酸 肾 病 中 出 现 蛋 白 尿 症 状 的 原 因 之 一 参 考 文 献 Ding Y J, Chen Y H Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicology and Applied Pharmacology, 261(1): Ebarasi L, Oddsson A, Hultenby K, et al Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Current Opinion in Nephrology and Hypertension, 20(4): Huang C C, Chen P C, Huang C W, et al Aristolochic Acid induces heart failure in zebrafish embryos that is mediated by inflammation. Toxicological Sciences, 100(2): Kubota F, Murakami T, Mogi K, et al Cadherin-6 is required for zebrafish nephrogenesis during early development. The International Journal of Developmental Biology, 51(2): Mundel P, Shankland S J Podocyte biology and response to injury. Journal of the American Society of Nephrology, 13(12): Salant D J, Topham P S Role of nephrin in proteinuric renal diseases. Springer Seminars in Immunopathology, 24(4): 商 朴, 王 璇, 李 晓 玫, 等 马 兜 铃 内 酰 胺 -Ⅰ 进 入 人 肾 小 管 上 皮 细 胞 及 细 胞 内 分 布 和 蓄 积 的 观 察. 中 国 中 药 杂 志, 33(7):

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