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1 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 前 言 由 本 公 司 开 发 生 产 的 发 光 免 疫 试 剂 及 检 测 仪 器 进 入 市 场 已 经 有 5 6 个 年 头 了, 期 间 不 仅 赢 得 了 国 内 外 广 大 用 户 的 广 泛 肯 定, 同 时 也 受 到 了 国 内 外 许 多 同 行 的 关 注 学 习 和 模 仿 这 意 味 着 我 们 经 过 十 几 年 的 艰 苦 努 力, 不 仅 将 这 个 唯 一 由 中 国 人 独 立 自 主 研 制 开 发, 并 拥 有 检 测 仪 器 和 发 光 试 剂 全 部 自 主 知 识 产 权 的 发 光 免 疫 系 统 实 现 了 产 业 化 ; 而 且 随 着 我 们 的 一 系 列 独 有 技 术 发 现 和 创 新 在 国 际 上 得 到 普 遍 公 认 和 应 用, 在 相 关 国 际 学 术 领 域 也 争 得 了 一 席 之 地 而 我 们 被 当 选 为 国 际 发 光 协 会 学 术 理 事 也 正 好 体 现 了 这 一 点 虽 然 发 光 免 疫 技 术 应 用 于 临 床 检 验 已 经 有 近 十 年 的 历 史, 但 遗 憾 的 是, 目 前 国 内 缺 乏 专 门 针 对 这 一 技 术 领 域 的 学 术 专 著 因 此, 大 多 数 用 户 对 发 光 免 疫 技 术 的 原 理 特 点 影 响 因 素 等 均 缺 乏 全 面 系 统 的 了 解 特 别 是 由 于 发 光 技 术 的 应 用 使 得 许 多 免 疫 检 测 指 标 的 性 能 大 大 提 高, 从 而 极 大 地 拓 展 了 它 们 的 临 床 意 义 和 应 用 范 围, 由 此 又 产 生 了 一 系 列 新 的 概 念 和 理 论 ; 但 许 多 临 床 医 师 和 检 验 人 员 对 这 些 问 题 具 体 细 节 的 认 识 依 然 十 分 有 限 这 一 方 面 使 得 发 光 技 术 的 优 越 性 无 法 在 临 床 检 验 中 得 到 充 分 发 挥 ; 另 一 方 面 在 某 些 不 负 责 任 的 厂 家 误 导 下, 造 成 了 许 多 模 糊 和 错 误 认 识 的 流 行, 甚 至 导 致 了 技 术 的 滥 用 因 此, 在 过 去 几 年 的 实 践 中, 我 们 深 深 体 会 到, 只 有 将 整 个 技 术 本 身 及 其 临 床 应 用 的 发 展 方 向 全 面 客 观 地 介 绍 给 大 家, 特 别 是 要 将 服 务 的 对 象 延 伸 到 临 床 医 师 身 上, 才 能 真 正 做 好 技 术 支 持 工 作 这 不 仅 是 产 品 推 广 的 需 要, 更 是 作 为 国 际 发 光 协 会 学 术 理 事 和 中 国 生 物 物 理 学 会 光 生 物 学 专 业 委 员 会 副 主 任 委 员 单 位 的 社 会 责 任 因 此, 我 们 在 收 集 近 期 相 关 国 际 会 议 资 料 和 学 术 专 著 的 基 础 上, 结 合 近 几 年 来 应 邀 在 协 和 医 院 301 医 院 等 单 位 做 学 术 讲 座 的 经 验, 编 写 了 这 本 教 材 本 教 材 供 用 户 培 训 班 使 用, 也 可 以 供 各 级 临 床 检 验 人 员 和 临 床 各 科 医 师 在 平 时 的 工 作 中 参 考 但 我 们 深 知, 这 项 工 作 仅 仅 是 刚 刚 开 始 今 后 我 们 还 要 陆 续 邀 请 临 床 各 科 医 师 分 别 参 加 专 门 针 对 各 自 专 业 领 域 的 技 术 讲 座 和 学 习 班, 与 相 关 领 域 内 的 国 内 外 知 名 专 家 一 起 交 流 知 识 和 经 验 同 时, 由 于 时 间 仓 促, 加 之 我 们 的 水 平 有 限, 本 教 材 内 容 肯 定 有 许 多 遗 漏 和 错 误 之 处 我 们 忠 心 希 望 各 位 专 家 和 学 者 提 出 宝 贵 意 见 和 建 议, 并 邀 请 您 共 同 参 与 本 教 材 的 补 充 完 善 提 高 愿 在 我 们 的 共 同 努 力 下, 将 该 教 材 逐 步 提 炼 成 一 部 有 影 响 力 的 学 术 专 著, 从 而 为 推 动 我 国 临 床 免 疫 检 测 技 术 水 平 的 提 高 发 挥 一 定 作 用 编 者 2005 年 初 于 北 京 [ 版 权 所 有 翻 录 必 究 ] 1

2 本 教 材 的 主 要 参 考 文 献 David Wild, The Immunoassay Handbook, Stockton Press, 1994 New York USA. 史 轶 蘩 主 编, 协 和 内 分 泌 和 代 谢 学, 科 学 出 版 社,1999 中 国 北 京 Proceeding of 10 th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence,1998 Bologna Italy. Proceeding of 11 th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence,2000 Monterey USA. Proceeding of 12 th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence,2002 Cambridge UK. Proceeding of 13 th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence,2004 Yokohama Japan. Modules in Emerging Fields 6, Bioanalytical Applications of Bioluminescence, 2004 Connecticut College, USA. 2

3 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 目 录 第 一 章. 发 光 免 疫 分 析 技 术 的 原 理 和 特 点 第 一 节. 生 物 发 光 和 化 学 发 光 技 术 的 基 本 原 理 1 一. 生 物 发 光 1 二. 化 学 发 光 2 三. 发 光 信 号 的 检 测 4 第 二 节. 免 疫 分 析 技 术 原 理 6 一. 抗 体 的 获 得 6 二. 常 见 免 疫 分 析 法 的 分 类 7 三. 常 见 的 固 相 免 疫 法 实 验 模 式 8 四. 固 相 免 疫 法 实 验 步 骤 11 第 三 节. 发 光 检 测 技 术 的 特 点 与 优 势 12 一. 非 放 射 性 12 二. 高 灵 敏 度 13 三. 宽 线 性 范 围 14 四. 长 有 效 期 15 五. 低 运 行 成 本 15 第 四 节. 发 光 免 疫 分 析 技 术 的 现 状 与 特 点 16 一. 常 见 的 商 品 化 发 光 免 疫 技 术 及 其 分 析 比 较 16 二. 现 有 发 光 免 疫 分 析 技 术 的 共 同 特 点 现 状 及 应 注 意 的 问 题 19 第 二 章. 光 生 物 学 检 测 技 术 在 医 学 领 域 中 的 应 用 第 一 节. 化 学 发 光 和 生 物 发 光 技 术 的 应 用 范 围 23 一. 微 生 物 快 速 检 测 23

4 二. 生 物 传 感 器 24 三. 分 子 生 物 学 技 术 26 四. 自 由 基 测 定 28 第 二 节. 新 型 光 生 物 学 检 测 技 术 展 望 29 一. 均 相 (homogeneous) 检 测 技 术 29 二. 生 物 传 感 器 (Biosensor) 31 三. 多 通 道 免 疫 及 基 因 分 析 系 统 33 第 三 节. 源 德 公 司 发 光 免 疫 技 术 的 优 势 与 发 展 34 一. 发 展 历 程 34 二. 发 光 试 剂 的 研 制 34 三. 发 光 检 测 仪 的 研 制 36 第 三 章. 临 床 免 疫 分 析 实 验 总 论 第 一 节. 实 验 室 检 验 项 目 与 临 床 工 作 的 关 系 38 第 二 节. 检 验 项 目 方 法 学 性 能 的 评 价 指 标 及 其 意 义 39 一. 检 测 方 法 的 分 级 39 二. 标 准 品 的 分 级 39 三. 检 测 方 法 的 评 价 指 标 40 四. 定 性 检 测 方 法 的 特 殊 评 价 指 标 41 五. 正 常 参 考 值 的 基 本 概 念 及 其 建 立 42 第 三 节. 检 验 项 目 的 方 法 学 整 体 性 能 评 价 43 一. 灵 敏 度 43 二. 特 异 性 与 抗 干 扰 性 44 三. 线 性 范 围 44 四. 测 量 误 差 44 五. 仪 器 及 试 剂 盒 的 其 它 性 能 指 标 45 第 四 节. 临 床 免 疫 分 析 的 质 量 控 制 46 一. 总 则 46 二. 室 内 质 量 控 制 46

5 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 三. 室 间 质 量 评 价 48 第 五 节. 标 本 的 正 确 收 集 和 保 存 49 一. 病 人 的 基 础 疾 病 及 饮 食 服 药 对 结 果 的 影 响 49 二. 标 本 采 集 时 间 与 标 本 采 集 条 件 的 影 响 50 三. 标 本 贮 存 与 运 输 对 结 果 的 影 响 50 第 四 章. 下 丘 脑 及 垂 体 内 分 泌 免 疫 分 析 第 一 节. 人 体 内 分 泌 系 统 概 述 51 第 二 节. 下 丘 脑 - 垂 体 内 分 泌 功 能 的 免 疫 分 析 52 一. 下 丘 脑 - 垂 体 内 分 泌 功 能 及 调 节 总 论 52 二. 生 长 激 素 及 生 长 介 素 53 第 五 章. 甲 状 腺 功 能 的 免 疫 分 析 第 一 节. 甲 状 腺 机 能 的 常 见 评 价 指 标 及 其 临 床 意 义 57 一. 甲 状 腺 机 能 的 调 节 57 二. 常 见 的 甲 状 腺 机 能 相 关 激 素 58 三. 常 见 的 甲 状 腺 机 能 障 碍 评 价 方 法 63 第 二 节. 其 它 与 甲 状 腺 疾 病 有 关 的 免 疫 学 指 标 66 一. 抗 甲 状 腺 球 蛋 白 抗 体 (TGAb) 66 二. 抗 甲 状 腺 微 粒 体 抗 体 (TMAb) 66 第 三 节. 高 灵 敏 度 TSH 测 定 技 术 在 甲 状 腺 功 能 评 价 中 的 新 作 用 67 一.TSH 与 FT 4 的 关 系 67 二. 亚 临 床 甲 状 腺 功 能 异 常 67 三.TSH 与 TRH 的 关 系 67 四. 高 危 人 群 筛 查 68 五. 甲 状 腺 功 能 衰 退 的 甲 状 腺 素 治 疗 68 六. 甲 状 腺 癌 的 T 4 抑 制 治 疗 69

6 七.TSH 与 FT 4 变 化 不 一 致 的 原 因 69 八. 门 诊 病 人 的 甲 状 腺 功 能 测 定 71 九. 非 甲 状 腺 疾 病 患 者 的 甲 状 腺 功 能 测 定 71 十. 总 结 72 第 四 节. 新 型 游 离 甲 状 腺 激 素 测 定 技 术 的 临 床 应 用 及 影 响 因 素 74 一. 游 离 甲 状 腺 激 素 的 测 定 方 法 74 二. 游 离 甲 状 腺 激 素 测 定 的 技 术 要 求 75 三. 生 理 或 病 理 状 态 下 的 游 离 甲 状 腺 激 素 水 平 的 变 化 78 四. 药 物 对 游 离 甲 状 腺 激 素 水 平 的 影 响 80 五. 甲 状 腺 激 素 自 身 抗 体 对 游 离 甲 状 腺 激 素 测 定 的 影 响 81 第 六 章. 糖 代 谢 紊 乱 的 免 疫 分 析 第 一 节. 概 述 84 一. 糖 的 生 理 作 用 84 二. 血 糖 浓 度 的 调 节 85 第 二 节. 高 血 糖 症 与 糖 尿 病 87 一. 糖 尿 病 的 分 型 87 二. 糖 尿 病 的 主 要 代 谢 紊 乱 88 三. 糖 尿 病 的 免 疫 学 检 测 胰 岛 素 91 2.C 肽 胰 岛 素 抗 体 谷 氨 酸 脱 羧 酶 抗 体 (GAD-Ab) 胰 高 血 糖 素 94 第 七 章. 性 激 素 及 其 免 疫 分 析 第 一 节. 概 论 96

7 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 一. 性 激 素 的 生 物 合 成 及 代 谢 96 二. 性 激 素 的 生 理 功 能 与 分 泌 调 节 97 三. 性 激 素 分 泌 功 能 的 动 态 试 验 99 四. 常 见 性 激 素 紊 乱 性 疾 病 100 第 二 节. 妊 娠 期 的 内 分 泌 特 点 102 一. 妊 娠 黄 体 102 二. 胎 盘 激 素 103 三. 其 它 内 分 泌 腺 104 四. 与 妊 娠 相 关 的 免 疫 分 析 104 第 三 节. 常 见 性 激 素 的 免 疫 学 检 测 105 一. 促 黄 体 生 成 素 105 二. 卵 泡 刺 激 素 106 三. 垂 体 泌 乳 素 107 四. 睾 酮 108 五. 孕 酮 109 六. 雌 二 醇 (E 2 ) 109 七. 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 (hcg) 110 第 八 章. 肾 上 腺 激 素 及 其 免 疫 分 析 第 一 节. 肾 上 腺 髓 质 激 素 113 一. 儿 茶 酚 胺 类 激 素 及 其 代 谢 物 测 定 113 二. 动 态 功 能 试 验 114 第 二 节. 肾 上 腺 皮 质 激 素 114 一. 肾 上 腺 皮 质 激 素 的 合 成 114 二. 盐 皮 质 激 素 的 功 能 及 调 节 115 三. 糖 皮 质 激 素 的 运 输 及 代 谢 115 四. 糖 皮 质 激 素 的 生 理 生 化 功 能 115 五. 糖 皮 质 激 素 分 泌 的 调 节 116 六. 肾 上 腺 皮 质 功 能 紊 乱 116

8 七. 肾 上 腺 皮 质 功 能 紊 乱 的 实 验 室 诊 断 118 第 九 章. 甲 状 旁 腺 功 能 及 钙 磷 代 谢 相 关 免 疫 学 检 验 一. 甲 状 旁 腺 激 素 (PTH) 122 二. 降 钙 素 (CT) 123 三. 维 生 素 D 123 第 十 章. 肿 瘤 标 志 物 及 其 免 疫 分 析 第 一 节. 概 述 125 第 二 节. 常 见 肿 瘤 标 志 物 及 其 检 测 126 一. 胚 胎 性 肿 瘤 标 志 物 126 二. 含 糖 物 质 类 标 志 物 129 三. 酶 类 标 志 物 131 四. 激 素 类 标 志 物 135 五 其 它 蛋 白 类 标 志 物 137 第 三 节. 肿 瘤 标 志 物 的 联 合 应 用 140 一. 肺 癌 140 二. 乳 腺 癌 140 三. 肝 癌 140 四. 胰 腺 癌 140 五. 卵 巢 癌 140 第 十 一 章. 治 疗 性 药 物 的 浓 度 监 测 第 一 节. 概 论 142 一. 药 物 在 体 内 的 基 本 代 谢 142 二. 药 物 在 体 内 的 代 谢 动 力 学 145

9 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 三. 血 药 浓 度 与 药 效 145 第 二 节. 临 床 常 见 药 物 的 体 液 浓 度 检 测 147 一. 强 心 甙 类 147 二. 抗 癫 痫 药 148 三. 三 环 类 抗 抑 郁 药 149 四. 茶 碱 150 五. 抗 心 律 失 常 药 150 六. 氨 基 甙 类 抗 生 素 151 七. 环 孢 素 A 151 第 十 二 章. 常 见 传 染 性 疾 病 的 免 疫 检 测 第 一 节. 病 毒 性 肝 炎 153 一. 甲 型 病 毒 性 肝 炎 153 二. 乙 型 病 毒 性 肝 炎 153 三. 丙 型 病 毒 性 肝 炎 157 第 二 节.HIV 感 染 及 艾 滋 病 (AIDS) 159 一. 概 述 159 二. 常 见 HIV 感 染 的 检 测 指 标 及 临 床 意 义 160 第 三 节. 严 重 急 性 呼 吸 综 合 征 (SARS) 164 一. 概 述 164 二.SARS 冠 状 病 毒 感 染 的 相 关 实 验 室 检 验 164 第 十 三 章. 常 见 出 生 缺 陷 的 产 前 诊 断 第 一 节. 唐 氏 综 合 征 167 一. 概 述 167 二. 常 见 检 测 指 标 167 三. 唐 氏 综 合 征 的 产 前 诊 断 策 略 168

10 第 二 节. 感 染 筛 查 169 一. 概 述 169 二. 弓 形 虫 (TOXO) 169 三. 风 疹 病 毒 (RV) 169 四. 巨 细 胞 病 毒 (CMV) 169 五. 单 纯 疱 疹 病 毒 (HSV) 169 第 三 节. 叶 酸 与 出 生 缺 陷 171 第 十 四 章. 巨 幼 细 胞 性 贫 血 及 其 相 关 免 疫 检 测 一. 维 生 素 B 12 缺 乏 的 检 查 172 二. 叶 酸 缺 乏 的 检 查 172 三. 有 助 于 区 别 叶 酸 或 维 生 素 B12 缺 乏 的 其 他 检 查 173 四. 其 它 注 意 事 项 173

11 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 第 一 章. 发 光 免 疫 分 析 技 术 的 原 理 和 特 点 第 一 节. 生 物 发 光 和 化 学 发 光 技 术 的 基 本 原 理 生 物 发 光 (Bioluminescence,BL) 及 化 学 发 光 (Chemiluminescence,CL) 作 为 两 个 古 老 而 又 年 轻 的 技 术, 近 二 十 年 来 得 到 了 很 大 的 发 展, 尤 其 在 生 物 医 学 领 域 得 到 了 广 泛 的 应 用, 已 成 为 现 代 生 物 技 术 的 一 个 组 成 部 分 特 别 是 发 光 免 疫 分 析 技 术 及 荧 光 素 酶 报 告 基 因 的 应 用 已 逐 步 形 成 一 个 产 业 而 近 几 年 来, 由 于 在 某 些 关 键 技 术, 如 生 物 传 感 器 基 因 序 列 分 析 活 体 细 胞 ATP 测 定 等 方 面 取 得 了 一 些 突 破, 其 应 用 范 围 更 进 一 步 扩 大, 几 乎 涵 盖 了 生 物 医 学 的 各 个 领 域 一. 生 物 发 光 一 提 起 生 物 发 光, 人 们 会 很 自 然 地 联 想 起 夜 幕 下 萤 火 虫 跳 动 的 靓 影 其 实 地 球 上 可 发 光 的 昆 虫 种 类 繁 多 ; 而 且 许 多 海 洋 生 物 美 丽 的 光 环 更 加 引 人 入 胜 ; 还 有 许 多 不 起 眼 的 微 生 物 也 能 放 射 出 绚 丽 的 光 芒 所 谓 生 物 发 光, 就 是 生 物 体 内 发 光 蛋 白 通 过 消 耗 能 量 物 质 而 产 生 的 发 光 现 象 其 特 点 为 只 消 耗 能 量 物 质, 不 消 耗 发 光 物 质 其 中 萤 火 虫 发 光 系 统 的 量 子 效 率, 即 产 生 光 子 数 与 消 耗 能 量 物 质 (ATP) 分 子 数 之 比 接 近 百 分 之 百, 这 是 迄 今 为 止 发 光 效 率 的 最 高 记 录 ; 因 为 即 使 是 目 前 最 先 进 的 节 能 灯, 其 发 光 效 率 仅 为 20-30% 左 右 生 物 发 光 和 化 学 发 光 均 属 于 冷 光 范 畴, 即 发 光 不 是 由 于 发 光 体 温 度 升 高 所 至, 发 射 波 长 也 与 其 温 度 无 关 自 从 萤 火 虫 发 光 系 统 被 揭 示 以 来, 经 过 多 年 的 努 力, 目 前 已 经 被 发 现 存 在 发 光 现 象 的 生 物 包 括 细 菌 真 菌 昆 虫 蠕 虫 水 母 乌 贼 鱼 类 虾 类 等 总 共 约 有 700 多 个 物 种, 涉 及 17 个 门, 其 中 绝 大 部 分 生 活 在 海 洋, 特 别 是 深 海, 有 报 道 说 在 海 平 面 数 百 米 以 下 大 部 分 的 物 种 都 具 有 生 物 发 光 现 象 这 些 发 光 生 物 大 部 分 为 自 身 表 达 发 光 蛋 白, 而 某 些 鱼 类 则 利 用 共 生 菌 发 光 生 物 发 光 的 波 长 范 围 几 乎 覆 盖 了 所 有 的 可 见 光 区 域 发 光 对 于 动 物 的 主 要 意 义 包 括 求 偶 觅 食 防 御 进 攻 等, 有 人 认 为 细 菌 发 光 可 能 也 属 于 一 种 自 身 保 护 机 制, 目 的 在 于 消 耗 细 胞 内 过 多 的 氧 化 性 物 质 近 年 来, 发 现 许 多 物 种 发 光 强 度 波 长 和 闪 烁 频 率 1

12 的 变 化 具 有 其 特 定 的 含 义, 说 明 生 物 发 光 也 许 是 生 物 个 体 间 相 互 交 换 信 息 的 一 种 手 段 近 年 来, 随 着 越 来 越 多 的 发 光 蛋 白 被 提 纯 其 编 码 基 因 序 列 被 测 定 表 达, 其 发 光 底 物 被 人 工 合 成, 相 关 的 基 础 研 究 和 产 品 的 商 业 化 进 展 迅 速 已 经 发 现 的 发 光 蛋 白 及 其 结 构 活 性 部 位 催 化 机 理 如 下 : (1) 细 菌 荧 光 素 酶 (luciferase,lux): 由 两 个 对 称 的 杂 合 二 聚 体 构 成, 底 物 为 FMNH 2 和 醛 (2) 虫 荧 光 素 酶 (LUC): 活 性 位 点 在 两 个 结 构 域 (domain) 之 间, 底 物 为 虫 荧 光 素 (Luciferin) 及 ATP, 并 需 要 Mg 2+ 参 与 (3) 腰 鞭 毛 虫 (Dinoflagellate) 荧 光 素 酶 : 含 有 三 个 结 构 域, 每 个 都 具 有 发 光 活 性, 底 物 为 腰 鞭 毛 虫 荧 光 素, 同 时 需 要 O 2 参 与 ; 比 较 有 特 点 的 是 : 该 荧 光 素 在 中 性 ph 条 件 下 与 一 种 特 定 的 荧 光 素 结 合 蛋 白 (LBP) 结 合 并 被 持 续 氧 化, 当 ph 下 降 时 荧 光 素 与 结 合 蛋 白 解 离 并 与 上 述 荧 光 素 酶 结 合, 因 此 改 变 ph 可 调 控 其 发 光 强 度 变 化 (4) 水 母 素 (Aequorin) 及 奥 贝 林 (Obelin): 含 腔 肠 素 (Coelenterazine) 过 氧 化 物 生 色 团, 因 此 只 需 要 Ca 2+ 激 活 (5) 绿 色 荧 光 蛋 白 (GFP): 来 自 水 母, 以 共 价 结 合 自 催 化 方 式 形 成 发 色 团, 通 过 接 受 其 它 分 子 提 供 的 能 量 产 生 荧 光, 其 机 理 被 称 为 生 物 发 光 共 振 能 量 转 移 (Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET), 类 似 的 荧 光 蛋 白 还 有 橙 色 荧 光 蛋 白 (OFP) 黄 色 荧 光 蛋 白 ( YFP) 红 色 荧 光 蛋 白 (RFP) 蓝 绿 荧 光 蛋 白 (CFP) 等 另 外, 目 前 已 经 被 发 现 的 生 物 发 光 底 物 有 : 虫 荧 光 素 腔 肠 素 FMNH 2 腰 鞭 毛 虫 荧 光 素 种 虾 素 ( Vargulin) 等 二. 化 学 发 光 化 学 发 光 是 由 于 化 学 反 应, 通 常 是 氧 化 反 应 产 生 电 子 能 级 处 于 激 发 态 的 物 质, 后 者 通 过 跃 迁 释 放 能 量 产 生 光 子, 从 而 导 致 的 发 光 现 象, 其 特 点 为 消 耗 发 光 剂, 同 时 量 子 效 率 相 对 较 低 化 学 发 光 按 化 学 反 应 类 型 可 分 为 酶 促 化 学 发 光 和 非 酶 促 化 学 发 光 两 类 其 中 酶 促 化 学 发 光 包 括 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 系 统 碱 性 磷 酸 酶 (AP) 系 统 黄 嘌 呤 氧 化 酶 系 统 等 其 中, 在 碱 性 磷 酸 酶 反 应 体 系 中, 螺 旋 金 刚 烷 环 氧 化 物 苯 磷 酸 酯 (AMPPD) 及 其 衍 生 物 既 可 作 为 发 光 剂, 又 可 作 为 氧 化 剂, 即 它 可 通 过 自 身 内 氧 化 启 动 发 光 反 应, 而 无 需 氧 化 剂 而 非 酶 促 化 学 发 光 包 括 吖 啶 酯 系 统 草 酸 酯 系 统 三 价 铁 - 鲁 米 诺 系 统 等 如 果 按 发 光 持 续 时 间 分 类, 可 分 为 闪 光 (Flash) 和 辉 光 (Glow) 其 中 闪 光 型 发 光 时 间 在 数 秒 内, 如 吖 啶 酯 系 统 其 检 测 方 式 一 般 采 用 原 位 进 样 (In Situ Injector) 和 时 间 积 分 法 测 量, 即 在 检 测 器 部 位 加 装 进 样 器, 并 保 证 加 入 发 光 剂 和 检 测 两 个 过 程 同 步 进 行 ; 同 时 以 整 个 发 光 信 号 峰 的 面 积 为 发 光 强 度 而 辉 光 型 发 光 时 间 在 数 分 钟 至 数 十 分 钟 以 上, 如 辣 根 过 氧 化 物 酶 - 鲁 米 诺 系 统 碱 性 磷 酸 酶 -AMPPD 系 统 黄 嘌 呤 氧 化 酶 - 鲁 米 诺 系 统 等 其 信 号 检 测 无 须 原 位 进 样, 一 般 以 速 率 法 测 量, 即 在 发 光 信 号 相 对 稳 定 的 区 域 ( 坪 区 ) 任 意 点 测 量 单 位 时 间 的 发 光 强 度 2

13 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 O H 2 O 2 + NH 2 O NH HRP NH OH - N 2 CO 2 - CO - 2 NH 2 +Photon (425nm) Enhancer R OH B R OH OH R N S OH AM PPD O O O CH 3 AP O O O CH O CH 3 O PO 3 2- O - O + O OCH 3 * 3 O - (477nm ) C H 3 N + O H - C = O O R C H 3 N H + H 2 O 2 + H 2 O H O C = O H O O C = O O O R C H 3 N R 3

14 O PO 3 O O - O (477nm ) + O OCH 3 * O - C H 3 N + O H - C = O O R + C O 2 + H 2 O 2 + H H + 2 O H O C = O H O O C = O O O C H 3 C H 3 R C H 3 N + C O 2 + (477nm ) + N N N O H - R H + R H 2 O 2 + H 2 O C = O O H O C = O O H O O C = O O C H 3 N O R O C = O O C H 3 N C H 3 O C = O O R O (AMPPD) 事 实 上, 许 多 物 质 既 是 生 物 发 光 底 物, 同 时 也 是 化 学 发 光 底 物, 甚 至 是 化 学 发 光 增 强 剂, 因 此 1,2-1,2-dioxetane 生 物 发 光 和 化 学 发 光 在 分 子 和 量 子 机 理 方 面 存 在 着 许 多 相 似 性 近 年 来 在 常 见 化 学 发 光 底 物, 特 别 是 螺 旋 金 刚 烷 环 氧 化 (AMPPD) 物 苯 磷 酸 酯 类 和 吖 啶 酯 类 的 发 光 机 理 研 究 中 发 现, 大 多 数 化 学 发 光 底 物 及 其 CIEEL 中 间 产 物 中 均 存 在 1,2- 二 氧 四 环 (1,2-dioxetane) 结 构, 而 且 该 结 构 的 存 在 似 乎 对 于 生 1,2-1,2-dioxetane 物 发 光 底 物 也 具 有 非 常 重 要 的 意 义 同 时 对 于 其 化 学 发 光 过 程 中 的 量 子 机 制, 也 提 出 了 所 谓 的 化 学 起 始 的 电 子 交 换 发 光 (CIEEL) 学 说 基 于 上 述 理 论, 人 类 模 拟 自 然 界 生 物 发 光 底 物 的 某 些 结 构, 已 经 合 成 了 多 个 高 CIEEL 效 化 学 发 光 底 物, 其 发 光 波 长 几 乎 覆 盖 了 所 有 的 可 见 光 区 域, 量 子 效 率 也 达 到 了 空 前 水 平 可 以 说, 生 物 发 光 是 人 类 推 动 化 学 发 光 技 术 进 步 的 智 慧 源 泉 C H 3 R C H 3 N N C H 3 N + O H R + O H 三. 发 光 信 号 的 检 测 4 以 往 的 光 信 号 检 测 仪 器 大 多 采 用 光 敏 二 极 管 光 敏 电 池 电 荷 偶 合 器 (CCD), 或 者 以 光 电 流 放 大 4 方 式 工 作 的 常 规 光 电 倍 增 管 作 为 检 测 器 件 其 原 理 为 : 通 过 光 电 转 换 器 件 将 光 信 号 转 换 为 电 压 或 电 流 信 号, 再 加 以 放 大 其 主 要 特 点 为 : 结 构 简 单 性 能 稳 定, 但 灵 敏 度 低 线 性 范 围 较 窄 随 着 现 代 量 子 物 理 学 的 发 展, 以 及 人 们 对 光 的 微 观 特 性 认 识 的 逐 步 深 入, 一 种 被 称 为 单 光 子 计 数 器 的 新 型 高 敏 感 度 光 电 检 测 器 在 近 期 问 世, 其 灵 敏 度 及 线 性 范 围 均 大 大 超 过 其 它 常 规 技 术 因 此 被 迅 速 应 用 于 航 空 航 天 军 事 公 安 科 研 医 疗 环 保 农 业 工 业 等 各 个 领 域 4

15 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 其 核 心 部 件 是 一 个 光 电 倍 增 管 它 是 一 个 超 高 度 真 空 的 玻 璃 容 器, 其 中 向 光 的 一 面 ( 称 为 窗 口 ) 涂 有 一 层 特 殊 的 具 有 光 电 效 应 的 稀 有 金 属, 称 为 光 阴 极 ; 而 内 部 还 装 有 多 个 以 特 殊 方 式 排 列 的 电 极, 称 为 打 拿 极 或 加 速 极 ; 其 后 部 另 有 一 个 电 极 称 为 阳 极 上 述 各 个 电 极 之 间 均 加 有 直 流 高 压 (RLU) 当 光 子 打 到 光 阴 极 时, 由 于 光 电 效 应, 其 表 面 可 以 产 生 能 量 微 弱 的 游 离 电 子, 称 为 光 电 子 ; 该 电 子 由 于 直 流 高 压 的 作 用 离 开 光 阴 极 再 次 打 到 第 一 打 拿 极 上, 由 于 其 获 得 了 直 流 高 压 提 供 的 能 量, 因 而 在 第 一 打 拿 极 上 又 制 造 出 了 能 量 更 大 数 量 更 多 的 电 子, 就 这 样 经 过 多 个 打 拿 极 的 反 复 放 大, 最 后 使 阳 极 产 生 了 一 个 能 量 远 远 高 于 最 初 光 子 的 电 脉 冲 信 号 该 信 号 经 前 置 放 大 器 放 大, 再 经 过 比 较 器 去 除 噪 声 信 号, 最 后 由 分 频 器 换 算 出 光 子 脉 冲 数 通 常 以 相 对 发 光 单 位, 即 RLU 为 单 位, 一 个 RLU 相 当 于 10 个 光 子 由 于 单 光 子 计 数 器 具 有 的 卓 越 性 能, 它 已 成 为 现 代 光 学 仪 器 中 最 重 要 的 部 分 之 一 也 是 今 后 临 床 检 验 仪 器 发 展 的 方 向 之 一 事 实 上, 正 是 由 于 它 的 发 明 及 应 用, 使 现 代 免 疫 及 基 因 分 析 技 术 才 能 从 放 射 性 同 位 素 的 束 缚 中 解 放 出 来, 真 正 步 入 安 全 化 非 同 位 素 化 的 新 时 代 上 述 装 置 之 所 以 称 之 为 单 光 子 计 数 器, 是 因 为 它 仅 用 于 单 光 子 事 件 的 测 量, 即 待 测 物 的 辐 射 跃 迁 仅 存 在 一 种 可 能 性 ; 换 句 话 讲, 其 检 测 的 光 子 能 级 是 一 样 的 通 常 化 学 发 光 生 物 发 光 荧 光 等 均 属 单 光 子 事 件, 因 此 一 般 都 用 单 光 子 计 数 器 测 量 而 以 往 在 放 射 性 免 疫 分 析 中 常 用 的 液 体 或 固 体 闪 烁 计 数 仪 均 使 用 多 光 子 计 数 器, 其 原 因 为 放 射 性 同 位 素 导 致 的 液 体 或 固 体 闪 烁 为 多 光 子 事 件, 即 辐 射 跃 迁 存 在 多 种 可 能 性 换 句 话 讲, 其 光 子 的 能 级 是 多 样 的, 而 且 不 同 的 同 位 素 具 有 各 自 不 同 的 多 个 能 级 和 跃 迁 方 式 ; 因 此 其 测 量 方 式 为 多 能 级 符 合 方 式 所 以 在 闪 烁 测 定 时, 不 同 类 型 的 放 射 性 同 位 素 要 选 择 与 之 相 应 的 通 道 5 5

16 以 单 光 子 计 数 器 为 核 心 的 发 光 分 析 仪, 其 基 本 构 成 及 工 作 原 理 如 下 / / 值 得 一 提 的 是, 对 于 一 般 的 酶 促 化 学 发 光, 如 以 过 氧 化 物 酶 和 碱 性 磷 酸 酶 为 催 化 剂 的 发 光, 由 于 其 发 光 时 间 较 长, 又 有 较 持 久 的 坪 区 ( 发 光 信 号 稳 定 期 ), 因 此 一 般 采 取 速 率 法 测 定, 即 在 坪 区 任 意 时 间 点 测 定 发 光 信 号 强 度 而 以 吖 啶 酯 和 鲁 米 诺 及 其 衍 生 物 直 接 标 记 为 代 表 的 非 酶 促 化 学 发 光, 由 于 其 发 光 时 间 极 短, 且 无 稳 定 的 坪 区, 因 此 一 般 采 取 时 间 积 分 的 方 式, 即 描 记 整 个 发 光 周 期 内 的 完 整 信 号 峰 ; 此 时 一 定 要 在 发 光 分 析 系 统 中 加 入 一 套 原 位 进 样 泵 (In situ injector), 并 与 检 测 器 协 同 配 合, 以 保 证 发 光 信 号 峰 的 完 整 描 记, 但 其 加 工 精 度 和 控 制 技 术 要 求 很 高 第 二 节. 免 疫 分 析 技 术 原 理 所 谓 免 疫 分 析 (Immunoassay), 就 是 利 用 抗 原 抗 体 之 间 的 特 异 性 结 合 来 测 定 分 析 特 定 物 质 的 方 法 其 中 抗 原 一 般 指 可 诱 导 动 物 免 疫 系 统 产 生 免 疫 应 答 的 物 质 ; 而 抗 体 则 是 由 动 物 免 疫 系 统 产 生, 可 特 异 性 结 合 某 种 物 质 的 球 蛋 白 免 疫 分 析 技 术 与 其 它 检 测 技 术 相 比 较, 其 突 出 的 特 点 是 : 灵 敏 度 高 操 作 简 单 成 本 低 样 品 前 处 理 要 求 不 高, 尤 其 特 别 适 合 生 物 大 分 子 的 检 测 等 因 此 被 广 泛 应 用 于 生 物 医 学 研 究 临 床 检 验 卫 生 检 疫 食 品 安 全 环 境 检 测 法 医 刑 侦 体 育 药 检 及 吸 毒 侦 测 等 各 个 方 面 一. 抗 体 的 获 得 无 论 采 用 什 么 样 的 免 疫 分 析 方 法, 都 必 须 得 到 针 对 待 测 物 的 抗 体 而 抗 体 又 分 为 多 克 隆 抗 体 和 单 克 隆 抗 体 以 往 采 用 免 疫 动 物 后 获 取 血 清 的 方 法 得 到 的 均 为 多 克 隆 抗 体, 因 此 又 称 为 抗 血 清 ; 而 单 克 隆 抗 体 是 通 过 获 取 免 疫 动 物 的 B 淋 巴 细 胞, 并 采 用 细 胞 融 合 和 筛 选 技 术 建 立 分 泌 抗 体 的 杂 交 瘤 细 胞 株 而 获 得 的 单 克 隆 抗 体 的 特 异 性 大 大 高 于 多 克 隆 抗 体 6 6

17 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 B () + B 二. 常 见 免 疫 分 析 法 的 分 类 免 疫 分 析 技 术 的 主 要 类 型 包 括 均 相 法 (Homogeneous) 和 非 均 相 法 (Heterogeneous) 两 类 所 谓 均 相 法 就 是 在 检 测 前 无 需 分 离 未 结 合 的 物 质 的 方 法, 例 如 常 见 的 免 疫 凝 集 法 免 疫 电 泳 法 免 疫 扩 散 法 等 凝 集 法 中 最 经 典 的 是 自 然 凝 集 法, 即 凝 集 过 程 完 全 由 抗 原 和 抗 体 的 结 合 反 应 自 然 形 成, 其 中 被 人 们 熟 知 的 血 型 测 定 和 肥 达 氏 反 应 就 属 此 类 后 来 在 此 基 础 上 发 展 了 敏 化 凝 集, 即 通 过 其 它 方 式 强 化 凝 集 反 应 以 提 高 灵 敏 度, 如 血 球 凝 集 法, 凝 胶 ( 微 粒 ) 比 浊 法 等 近 几 年 来, 随 着 科 学 技 术 的 进 步, 一 大 批 新 兴 均 相 测 定 技 术 已 经 被 广 泛 地 应 用 到 临 床 检 验 中, 如 近 场 液 闪 法 酶 -- 辅 酶 ( 亚 基 ) 配 位 法 荧 光 偏 振 法 荧 光 共 振 法 吖 啶 酯 水 解 法, 以 及 多 种 类 型 的 生 物 传 感 器 等 有 关 这 些 技 术 的 原 理 将 在 本 书 的 其 它 相 关 章 节 中 加 以 介 绍 这 些 新 兴 均 相 检 测 技 术 的 最 大 优 点 是 操 作 步 骤 少 而 简 单 测 定 速 度 快, 结 果 稳 定 ; 但 其 检 测 灵 敏 度 和 线 性 范 围 目 前 尚 无 法 与 非 均 相 方 法 相 比, 而 且 大 多 仅 限 于 小 分 子 药 物 和 激 素 的 检 测 7 而 非 均 相 法 (Heterogeneous) 则 需 要 在 检 测 前 分 离 未 结 合 物 质 目 前 临 床 上 应 用 的 免 疫 分 析 方 法 大 多 属 于 此 类 其 基 本 实 验 模 式 完 全 相 同 : 即 不 仅 大 多 需 要 将 其 中 一 种 免 疫 活 性 物 质 固 化 到 载 体 上, 而 且 也 均 需 要 将 另 一 种 免 疫 活 性 物 质 与 可 产 生 特 定 信 号 的 标 记 物 分 子 联 结, 而 其 检 测 信 号 正 是 来 源 于 这 个 标 记 物 其 中 又 包 括 : 免 疫 组 织 化 学 法 免 疫 印 迹 (Western-blot) 法 免 疫 纸 片 法 放 射 免 疫 沉 降 法 ( 放 免,RIA) 固 相 放 射 免 疫 法 ( 免 放,IRMA) 荧 光 免 疫 法 (FIA) 酶 联 免 疫 法 (EIA,ELISA) 酶 联 荧 光 法 (FEIA) 化 学 发 光 法 (LIA) 酶 联 化 学 发 光 法 (ELIA) 时 间 分 辨 荧 光 法 (DELFIA) 电 化 学 发 光 法 (ECLIA) 等 等 其 中, 免 疫 印 迹 主 要 用 于 基 因 表 达 分 析 HIV 感 染 确 认 实 验 基 因 表 达 分 析 等 ; 纸 片 法 主 要 用 于 排 卵 早 孕 吸 毒 的 快 速 筛 查 或 检 测, 以 及 献 血 员 病 毒 感 染 的 快 速 检 测 其 它 方 法 则 主 要 用 于 临 床 实 验 室 的 常 规 检 查 7

18 三 常见的固相免疫法实验模式 8 固相放免法 荧光免疫法 酶联免疫法 酶联荧光免疫法 化学发光免疫法 酶联化学发光免疫 法 时间分辨荧光免疫法 电化学发光免疫法等等 均属固相免疫法的范畴 所不同的 仅仅是信号的 产生和检测方式而已 常见的固相免疫法实验模式如下 8 客服热线 网址 电子邮件 yuande@yuande.com

19 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 上 述 各 种 方 法 的 量 效 关 系 均 为 正 向 剂 量 -- 反 应 关 系 曲 线, 即 随 着 待 测 物 浓 度 的 升 高, 所 得 到 的 标 记 信 号 逐 渐 增 强 ( 见 下 图 ) 其 最 低 检 测 限 如 果 以 95% 可 信 度 为 标 准, 则 等 于 零 剂 量 信 号 强 度 均 值 加 2 倍 标 准 差 在 该 曲 线 上 所 对 应 的 浓 度 值, 通 常 也 将 其 称 为 分 析 灵 敏 度 可 见 免 疫 分 析 方 法 的 灵 敏 度 不 仅 取 决 于 标 记 信 号 的 强 度 ; 更 取 决 于 该 标 记 信 号 的 稳 定 性, 即 检 测 信 号 受 其 它 干 扰 因 素 影 响 的 程 度 另 外, 如 果 采 用 一 步 反 应 法 ( 详 见 后 面 有 关 内 容 ), 当 待 测 物 浓 度 达 到 一 定 程 度 时, 由 于 标 记 物 的 相 对 不 足 造 成 了 待 测 物 与 标 记 物 的 结 合 率 急 剧 下 降, 从 而 使 标 记 信 号 反 而 减 弱, 这 种 现 象 通 常 称 为 前 滞 (Hook) 效 应 如 果 前 滞 效 应 出 现 在 病 人 标 本 的 检 测 中, 将 会 导 致 非 常 错 误 甚 至 荒 谬 的 实 验 结 果, 其 后 果 非 常 严 重 解 决 这 一 问 题 的 办 法 有 三 个 : 一 是 尽 可 能 调 整 实 验 条 件, 使 绝 大 部 分 标 本 中 的 待 测 物 浓 度 远 离 出 现 前 滞 效 应 的 临 界 点 ; 二 是 采 用 两 步 反 应 法 ( 详 见 后 面 有 关 内 容 ); 三 是 稀 释 样 品 9

20 Y -- Hook() X 除 上 述 具 有 正 向 剂 量 - 反 应 关 系 曲 线 的 方 法 以 外, 还 有 一 类 实 验 模 式, 通 常 称 为 竞 争 法 或 抑 制 法, 其 原 理 如 下 图 所 谓 反 向 剂 量 -- 反 应 关 系 曲 线, 就 是 随 着 待 测 物 浓 度 的 升 高, 所 得 到 的 标 记 信 号 反 而 逐 渐 减 弱 ( 见 下 图 ) 其 最 低 检 测 限 如 果 以 95% 可 信 度 为 标 准, 则 等 于 零 剂 量 信 号 强 度 均 值 减 去 2 倍 标 准 差 在 该 曲 线 上 所 对 应 的 浓 度 值, 通 常 也 将 其 称 为 分 析 灵 敏 度 可 见 该 方 法 的 灵 敏 度 也 不 仅 取 决 于 标 记 信 号 的 强 度 ; 更 取 决 于 该 标 记 信 号 的 稳 定 性, 即 检 测 信 号 受 其 它 干 扰 因 素 影 响 的 程 度 通 常 这 类 方 法 主 要 用 于 小 分 子 物 质 和 抗 体 的 检 测, 其 灵 敏 度 和 线 性 范 围 通 常 也 低 于 其 它 具 有 正 向 曲 线 的 方 法 Y -- 近 年 来, 随 着 诊 断 试 剂 生 产 的 产 业 化 和 规 模 化, 特 别 是 全 自 动 免 疫 分 析 仪 器 的 使 用, 许 多 免 疫 检 测 试 剂 采 用 了 间 接 包 被 技 术 其 特 点 为 : 所 有 试 剂 盒 的 反 应 杯 或 固 相 支 持 物 均 采 X 用 同 一 种 包 被 物, 如 亲 合 素, 以 及 各 自 之 间 完 全 相 同 的 包 被 工 艺 ; 而 原 先 的 包 被 抗 体 或 抗 原 则 通 过 与 其 联 结 的 另 外 一 种 小 分 子 物 质, 如 生 物 素, 与 上 述 包 被 物 特 异 结 合 ( 见 下 图 ) 这 种 方 式 的 最 大 优 点 是 : 批 量 生 产 工 艺 简 单 质 量 稳 定, 其 产 品 也 更 适 合 全 自 动 免 疫 分 析 仪 器 ; 但 标 本 中 的 生 物 素 等 内 源 性 物 质 的 干 扰 不 容 忽 视 10

21 发光免疫分析技术临床应用手册 四 固相免疫法实验步骤 不论上述采用哪一种实验模式 其实验操作步骤均可分为一步反应法和两步反应法两种 见下 图 个别的还有三步反应法 其区别在于免疫结合反应的步骤 即一步法为结合反应一步完成 而两 步法时结合反应被分成两步 通常采用两步法可提高灵敏度并杜绝前滞效应 但在竞争法中 采用两步 法可使其线性范围大大缩短 因此定量分析实验中一般将一步法作为首选 11 客服热线 网址 电子邮件 11

22 第 三 节. 发 光 检 测 技 术 的 特 点 与 优 势 包 括 生 物 发 光 化 学 发 光 荧 光 及 时 间 分 辨 荧 光 电 化 学 发 光 在 内 的 光 生 物 学 技 术, 目 前 已 成 为 现 代 生 物 技 术 中 最 活 跃 的 领 域 之 一, 其 应 用 范 围 包 括 : 军 事 侦 测 公 安 稽 查 卫 生 检 疫 药 物 筛 查 医 学 诊 断 环 境 检 测 航 天 遥 感 生 命 科 学 研 究 等 诸 多 领 域 这 些 光 生 物 学 检 测 技 术 之 所 以 在 短 短 的 十 几 年 内 得 到 了 迅 速 的 发 展, 原 因 在 于 其 诸 多 的 显 著 优 越 性 例 如 : 彻 底 消 除 了 放 射 性 等 有 害 物 对 操 作 者 和 环 境 的 危 害 ; 无 半 衰 期 限 制, 使 试 剂 的 稳 定 性 和 有 效 期 大 大 延 长 ; 信 号 自 行 祛 除, 容 易 实 现 连 续 动 态 重 复 测 定 ; 适 合 于 利 用 复 合 标 记 系 统 进 行 多 指 标 并 行 测 定 ; 操 作 简 单, 反 应 速 度 快, 容 易 实 现 自 动 化 ; 灵 敏 度 和 线 性 范 围 超 过 以 往 技 术 等 等 一. 非 放 射 性 以 往 在 生 物 分 析 的 定 量 检 测 中 使 用 最 普 遍 的 当 属 放 射 性 同 位 素 标 记 及 检 测 技 术, 它 存 在 诸 多 的 不 足 包 括 : 某 些 放 射 性 同 位 素 由 于 半 衰 期 短 不 利 于 贮 存 和 运 输 ; 同 时 由 于 放 射 性 物 质 的 污 染 对 工 作 人 员 的 健 康 及 环 境 造 成 一 定 危 害 需 要 特 殊 的 防 护 及 废 物 处 理 设 备 等 因 此 人 们 一 直 在 寻 找 非 同 位 素 的 标 记 及 检 测 方 法 而 上 述 光 生 物 学 技 术 恰 恰 正 是 在 这 个 时 候 应 酝 而 生 由 于 其 完 全 抛 弃 了 放 射 性 同 位 素, 因 此 不 仅 消 除 了 对 环 境 和 操 作 者 的 危 害 ; 而 且 也 使 试 剂 的 稳 定 性 和 有 效 期 大 大 延 长 同 时 由 于 发 光 信 号 可 以 在 短 时 间 内 自 行 消 失, 因 此 非 常 容 易 实 现 连 续 动 态 重 复 测 定, 这 一 点 特 别 适 合 于 生 物 医 学 研 究 法 医 鉴 定 等 领 域 中 的 多 标 记 多 指 标 并 行 测 定 ; 如 果 加 上 波 长 延 迟 时 间 以 及 反 应 底 物 的 差 别, 其 分 辨 能 力 更 高 另 外, 由 于 其 操 作 更 加 简 单, 反 应 速 度 更 快, 因 此, 容 易 实 现 自 动 化 事 实 上, 正 是 由 于 光 生 物 学 技 术 的 出 现, 才 使 得 免 疫 分 析 真 正 走 上 自 动 化 的 道 路 12

23 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 二. 高 灵 敏 度 通 常 酶 联 免 疫 技 术 的 分 析 灵 敏 度 可 达 到 mol/l; 新 型 的 微 珠 包 被 酶 放 大 免 疫 技 术 的 分 析 灵 敏 度 可 达 到 mol/l; 荧 光 免 疫 及 采 用 沉 降 法 的 普 通 放 免 技 术 可 达 到 mol/l; 固 相 放 免 技 术 可 达 到 mol/l 而 发 光 免 疫 分 析 技 术 的 分 析 灵 敏 度 已 经 达 到 mol/l( 见 下 图 ) 如 果 以 每 次 实 验 的 加 样 量 为 50ul, 按 摩 尔 常 数 为 计 算, 此 时 样 品 中 仅 有 几 十 个 待 测 物 分 子 这 个 灵 敏 度 已 经 接 近 了 免 疫 检 测 技 术 的 理 论 极 限 ; 换 句 话 讲, 在 现 有 的 实 验 模 式 下, 试 图 检 测 更 少 的 待 测 物 分 子 是 不 现 实 的 因 为 更 高 的 灵 敏 度, 必 须 要 求 加 入 反 应 的 样 品 中 存 在 数 量 非 常 恒 定 的 待 测 物 分 子, 以 保 证 其 检 测 结 果 的 稳 定 性 ; 但 由 于 分 子 运 动 的 存 在, 这 显 然 是 一 个 很 不 确 定 的 随 机 事 件 因 此, 即 使 存 在 这 样 的 方 法, 其 检 测 结 果 的 可 靠 性 也 是 根 本 无 法 接 受 的 所 以, 除 目 前 尚 未 应 用 于 临 床 诊 断 的 单 分 子 检 测 技 术 以 外, 任 何 宣 称 采 用 常 规 加 样 方 式 的 免 疫 分 析 技 术 能 够 在 分 析 灵 敏 度 上 超 越 这 一 极 限 的 论 调, 显 然 是 荒 谬 的 ; 因 为 溶 液 中 分 子 的 随 机 运 动 会 毫 不 留 情 地 扼 杀 这 样 的 图 谋 (mol/l) 事 实 上, 上 述 灵 敏 度 只 是 各 个 检 测 技 术 所 能 达 到 的 极 限 在 实 际 应 用 中, 由 于 受 抗 体 亲 合 力 的 限 制 以 及 干 扰 免 疫 反 应 的 因 素 影 响, 免 疫 检 测 试 剂 的 分 析 灵 敏 度 往 往 无 法 达 到 上 述 指 标 特 别 是 对 发 光 免 疫 分 析 技 术 来 讲, 提 高 其 检 测 灵 敏 度 的 瓶 颈 在 于 抗 体 亲 合 力 和 干 扰 免 疫 反 应 的 因 素, 而 不 是 检 测 技 术 本 身 目 前, 发 光 免 疫 分 析 技 术 不 仅 已 经 能 够 完 全 满 足 临 床 检 验 对 于 分 析 灵 敏 度 的 要 求 ; 而 且 正 是 由 于 发 光 免 疫 技 术 的 出 现, 使 得 许 多 临 床 检 验 项 目 的 检 测 灵 敏 度 和 线 性 范 围 大 大 提 高, 从 而 极 大 地 拓 宽 了 其 临 床 应 用 价 值 和 范 围, 甚 至 做 出 了 具 有 划 时 代 意 义 的 贡 献 这 一 点 在 TSH 检 测 试 剂 盒 的 更 新 换 代 中 表 现 的 尤 为 突 出 : 第 一 代 TSH 检 测 试 剂 盒 : 采 用 离 心 沉 降 技 术 的 普 通 放 免 试 剂, 其 分 析 灵 敏 度 为 1-2mIU/L; 由 于 它 基 本 上 无 法 测 到 正 常 值 下 限 以 下 的 血 清 TSH 浓 度, 因 此 它 对 甲 亢 的 诊 断 中 意 义 不 大 第 二 代 TSH 检 测 试 剂 盒 : 采 用 固 相 放 免 技 术, 其 分 析 灵 敏 度 为 mIU/L; 由 于 它 可 以 测 到 正 常 值 下 限 以 下 的 血 清 TSH 浓 度, 因 此 在 甲 亢 的 诊 断 中 开 始 发 挥 作 用 第 三 四 代 TSH 检 测 试 剂 盒 : 均 采 用 发 光 免 疫 分 析 技 术, 其 分 析 灵 敏 度 分 别 达 到 mIU/L 和 mIU/L, 比 放 免 提 高 了 2-3 个 数 量 级 由 于 它 极 大 地 拓 宽 了 正 常 值 下 限 以 下 的 血 清 TSH 浓 度 测 定 范 围, 不 仅 在 甲 亢 的 诊 断 中 发 挥 了 重 要 作 用, 使 其 成 为 13 首 选 指 标 之 一 ; 而 且 通 过 其 临 床 应 用 发 现 了 一 13

24 系 列 新 的 临 床 现 象, 甚 至 使 得 众 多 内 分 泌 专 著 中 有 关 垂 体 甲 状 腺 轴 调 控 状 态 的 描 述 得 以 改 写, 具 体 内 容 详 见 本 书 有 关 章 节 三. 宽 线 性 范 围 所 谓 线 性 范 围 是 指 能 够 较 为 准 确 地 检 测 的 待 测 物 浓 度 范 围 在 免 疫 分 析 中, 有 人 用 相 关 系 数 不 低 于 0.99 的 参 比 品 浓 度 范 围 表 示 ; 但 该 方 法 受 拟 合 方 式 的 影 响, 且 实 际 测 定 和 计 算 过 程 比 较 麻 烦 目 前 很 多 人 建 议 用 功 能 灵 敏 度 作 为 其 下 限, 而 以 测 定 变 异 不 超 过 20% 的 最 高 待 测 物 浓 度 作 为 上 限, 这 样 的 定 义 比 较 符 合 临 床 的 实 际 需 求 通 常, 酶 联 免 疫 技 术, 包 括 新 型 的 微 珠 包 被 酶 放 大 免 疫 技 术, 由 于 受 比 色 测 量 的 线 性 关 系 只 在 稀 溶 液 中 成 立 的 限 制, 加 上 反 应 杯 透 光 率 差 异 及 浑 浊 样 品 的 散 射 吸 收 作 用, 其 线 性 范 围 不 超 过 两 个 数 量 级, 即 所 谓 散 射 吸 收 作 用 是 浑 浊 样 品 中 的 微 粒 对 光 信 号 的 多 次 随 机 反 射 和 吸 收 放 免 技 术 的 线 性 范 围 可 达 到 四 个 数 量 级, 即 ; 其 瓶 颈 为 检 测 器 性 能 和 放 化 灭 活 作 用 所 谓 放 化 灭 活 作 用, 是 指 在 放 射 性 标 记 过 强 时, 射 线 能 量 作 用 与 抗 原 抗 体 分 子, 通 过 影 响 其 结 构 稳 定 性 使 其 生 物 活 性 下 降 的 现 象 因 此, 放 化 灭 活 现 象 的 存 在 往 往 限 制 了 放 免 技 术 灵 敏 度 和 线 性 范 围 的 提 高 荧 光 免 疫 的 线 性 范 围 可 超 过 四 个 数 量 级, 即 大 于 ; 其 瓶 颈 为 浓 度 淬 灭 和 荧 光 漂 白 作 用 所 谓 浓 度 淬 灭 是 指 在 高 浓 度 荧 光 素 条 件 下, 由 于 靠 近 光 源 的 荧 光 素 大 量 吸 收 激 发 光 能 量, 使 得 远 离 光 源 的 荧 光 素 可 吸 收 的 能 量 减 少, 从 而 造 成 荧 光 效 率 下 降 而 荧 光 漂 白 是 在 过 强 激 发 光 作 用 下, 由 于 荧 光 素 结 构 的 变 化, 使 其 暂 时 或 永 久 失 去 发 射 荧 光 能 力 的 现 象 所 以, 上 述 两 种 现 象 的 存 在 均 造 成 了 对 荧 光 技 术 灵 敏 度 和 线 性 范 围 的 限 制 而 发 光 免 疫 分 析 技 术, 其 线 性 范 围 已 经 达 到 六 个 数 量 级, 即 , 其 瓶 颈 为 检 测 器 性 能 因 此, 如 果 采 用 最 新 的 双 量 程 自 动 转 换 单 光 子 计 数 器, 其 线 性 范 围 还 可 以 达 到 八 个 数 量 级, 即 事 实 上, 上 述 线 性 范 围 只 是 各 个 检 测 技 术 所 能 达 到 的 极 限 在 实 际 应 用 中, 由 于 受 抗 体 亲 合 力 的 限 制 以 及 干 扰 免 疫 反 应 的 因 素 影 响, 免 疫 检 测 试 剂 的 线 性 范 围 往 往 无 法 达 到 上 述 指 标 例 如, 发 光 和 荧 光 技 术 均 会 受 到 无 辐 射 跃 迁 和 散 射 吸 收 作 用 的 影 响 所 谓 无 辐 射 跃 迁 是 指 处 于 激 发 态 的 荧 光 或 发 光 底 物 以 不 发 射 光 子 的 方 式 回 到 基 态 的 现 象 ; 其 原 因 是 能 量 通 过 产 热 被 释 放, 或 者 将 能 量 传 递 给 了 其 它 分 子 上 述 两 种 现 象 在 高 浓 度 杂 质 存 在 时 尤 其 明 显, 尤 其 在 使 用 微 粒 包 被 时, 散 射 吸 收 就 会 变 得 十 分 显 著 特 别 是 由 于 前 滞 效 应 的 存 在, 某 些 采 用 一 步 法 的 免 疫 检 测 试 剂 线 性 范 围 更 窄 通 常 抗 体 亲 合 力 越 强 其 检 测 灵 敏 度 越 高, 但 由 于 其 结 合 反 应 更 容 易 达 到 饱 和, 因 此 线 性 范 围 也 就 越 窄 14

25 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 四. 长 有 效 期 发 光 技 术 完 全 抛 弃 了 放 射 性 同 位 素, 因 此 彻 底 摆 脱 了 半 衰 期 的 限 制, 使 试 剂 的 稳 定 性 和 有 效 期 大 大 延 长 同 时 由 于 在 发 光 液 抗 体 及 标 记 物 贮 存 方 面 采 用 了 玻 璃 化 及 抗 氧 化 稳 定 剂 等 相 关 配 套 技 术, 使 试 剂 盒 的 有 效 期 和 稳 定 性 远 远 超 过 以 往 的 产 品, 达 到 了 空 前 水 平 有 些 产 品 的 实 际 有 效 期 甚 至 可 达 到 常 温 保 存 18 个 月 五. 低 运 行 成 本 光 生 物 学 技 术 完 全 抛 弃 了 放 射 性 同 位 素, 因 此 不 仅 省 去 了 放 射 性 实 验 室 的 基 础 建 设 投 资 和 操 作 者 的 日 常 保 健 费 用 而 且 也 降 低 了 相 关 的 贮 存 运 输 防 护 及 废 物 处 理 成 本 而 按 照 国 际 通 行 标 准, 上 述 费 用 相 当 于 试 剂 盒 本 身 价 格 的 倍 左 右 所 以 采 用 发 光 免 疫 分 析 技 术, 可 使 整 体 运 行 成 本 大 大 降 低, 特 别 适 合 于 在 基 层 边 远 地 区 推 广 ,000 80,000 60,000 40,000 20,

26 第 四 节. 发 光 免 疫 分 析 技 术 的 现 状 与 特 点 一. 常 见 的 商 品 化 发 光 免 疫 技 术 及 其 分 析 比 较 目 前 在 国 际 上 已 经 实 现 商 品 化 和 产 业 化 的 发 光 免 疫 分 析 产 品, 基 本 上 可 以 分 为 : 化 学 发 光 ( Chemiluminescence) 时 间 分 辨 荧 光 (Time Resolved Fluorescence, 也 称 时 间 延 迟 光 致 发 光, 即 Time Delayed Photoluminescence) 电 化 学 发 光 (Electrochemiluminescence, 也 称 场 致 发 光 Electroluminescence) 几 种 1. 化 学 发 光 化 学 发 光 按 化 学 反 应 类 型 可 分 为 酶 促 化 学 发 光 和 非 酶 促 化 学 发 光 两 种 类 型 其 中, 酶 促 化 学 发 光 主 要 包 括 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 系 统 和 碱 性 磷 酸 酶 (AP) 系 统 两 类 ; 而 非 酶 促 化 学 发 光 主 要 包 括 吖 啶 酯 系 统 前 两 种 酶 促 化 学 发 光 系 统 分 别 以 过 氧 化 物 酶 鲁 米 诺 氧 化 剂 增 强 剂 ; 以 及 螺 旋 金 刚 烷 环 氧 化 物 和 碱 性 磷 酸 酶 为 反 应 体 系 其 中, 在 碱 性 磷 酸 酶 反 应 体 系 中, 螺 旋 金 刚 烷 环 氧 化 物 苯 磷 酸 酯 (AMPPD) 及 其 衍 生 物 既 可 作 为 发 光 剂, 又 可 作 为 氧 化 剂, 即 它 可 通 过 自 身 内 氧 化 启 动 发 光 反 应, 而 无 需 氧 化 剂 酶 促 发 光 的 共 同 特 点 为 : 发 光 过 程 中 作 为 标 记 物 的 酶 基 本 不 被 消 耗, 而 反 应 体 系 中 发 光 剂 充 分 过 量, 因 此 发 光 信 号 强 而 稳 定, 且 发 光 时 间 较 长 因 此 可 采 用 速 率 法 测 量, 故 检 测 方 式 简 单 成 本 较 低 以 往 认 为 酶 作 为 大 分 子, 在 标 记 小 分 子 抗 原 时 可 能 会 影 响 其 分 子 运 动 ; 但 近 年 来, 由 于 各 种 新 型 长 臂 双 功 能 基 团 用 于 标 记, 以 及 多 种 高 效 间 接 标 记 技 术 的 发 展, 这 些 已 经 不 是 问 题 而 酶 促 反 应 的 主 要 缺 点 为 工 作 曲 线 可 能 随 时 间 漂 移, 而 且 低 端 斜 率 容 易 呈 非 线 性 下 移 吖 啶 酯 非 酶 促 化 学 发 光 以 吖 啶 酯 过 氧 化 氢 为 发 光 系 统 非 酶 促 发 光 的 共 同 特 点 为 : 发 光 过 程 中 标 记 物 被 消 耗, 同 时 作 为 标 记 物 的 发 光 剂 是 发 光 反 应 的 瓶 颈, 即 含 量 总 是 相 对 不 足, 因 此 发 光 信 号 持 续 时 间 较 短 ; 如 果 直 接 在 免 疫 反 应 杯 中 启 动 发 光 反 应, 由 于 发 光 剂 被 很 快 消 耗, 故 只 能 进 行 一 次 性 测 量, 所 以 重 复 性 较 差 为 降 低 检 测 成 本 并 实 现 重 复 测 量, 目 前 普 遍 采 用 原 位 进 样 (In Situ Injector) 加 流 动 池 的 时 间 积 分 测 量 方 式 因 此 仪 器 成 本 及 维 护 费 用 较 高, 而 且 反 复 使 用 的 流 动 池 可 能 导 致 交 叉 污 染 ; 而 冲 洗 或 进 样 中 产 生 的 气 泡 也 会 干 扰 测 定 ; 同 时 烦 琐 冗 长 的 冲 洗 过 程 也 会 成 为 提 高 检 测 效 率 的 瓶 颈 另 外, 使 用 磁 性 或 非 磁 性 微 粒 时, 强 烈 的 散 射 吸 收 作 用 也 会 降 低 灵 敏 度 2. 时 间 分 辨 荧 光 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 分 析 (TRFIA) 要 是 将 三 价 稀 土 离 子 铕 (Eu 3+ ) 镝 (Dy 3+ ) 钐 (Sm 3+ ) 铽 ( Tb 3+ ) 等 通 过 络 合 物 标 记 到 抗 原 或 抗 体 分 子 上, 并 通 过 检 测 其 荧 光 实 现 免 疫 分 析 由 于 稀 土 离 子 荧 光 的 激 发 光 波 长 范 围 较 宽, 而 发 射 光 波 长 范 围 较 窄, 而 且 激 发 光 和 发 射 光 之 间 的 波 长 差 距, 即 所 谓 Stokes 位 移 较 大, 特 别 是 荧 光 寿 命 大 大 长 于 常 规 荧 光 ; 因 此 它 采 用 了 与 常 规 荧 光 免 疫 不 同 的 检 测 方 式, 即 通 过 脉 冲 激 光 器 间 歇 激 发 样 品, 同 时 检 测 器 在 其 激 发 的 间 隙 测 定 特 定 波 长 的 荧 光 强 度 这 样 不 仅 消 除 了 杂 散 光 的 干 扰, 而 且 也 大 大 减 弱 了 样 品 及 反 应 杯 中 杂 质 所 产 生 的 背 景 荧 光 干 扰 所 以 其 检 测 灵 敏 度 和 线 性 范 围 大 大 高 于 常 规 荧 光 但 由 于 稀 土 离 子 在 水 相 中 的 荧 光 效 率 很 低, 因 此 需 要 将 其 包 裹 在 一 个 非 水 相 的 环 境 中 才 能 检 测 到 理 想 的 荧 光 强 度 最 常 见 的 做 法 是 : 在 检 测 前 先 用 酸 将 稀 土 离 子 从 标 记 抗 原 或 抗 体 上 解 离 出 来 ; 然 后 再 用 16

27 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 由 一 系 列 表 面 活 性 剂 构 成 的 微 囊 吸 收 并 包 裹 稀 土 离 子 这 种 方 式 称 为 解 离 增 强 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 分 析 法 (DELFIA), 其 中 的 酸 和 表 面 活 性 剂 等 被 称 为 增 强 剂 由 于 迄 今 为 止, 在 所 有 的 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 分 析 法 中, 这 种 方 法 的 灵 敏 度 是 最 高 的, 因 此 近 年 来 得 到 了 广 泛 应 用, 已 经 成 为 目 前 最 常 见 的 时 间 分 辨 免 疫 分 析 技 术 但 由 于 该 方 法 需 要 在 常 规 免 疫 分 析 中 的 洗 涤 步 骤 后, 还 要 进 行 荧 光 素 的 解 离 和 增 强 操 作, 因 此 分 析 步 骤 有 些 冗 长 繁 琐 除 上 述 方 法 外, 还 有 一 种 固 相 时 间 分 辨 荧 光 法 (DSLFIA), 它 使 用 一 种 特 殊 的 络 合 物 将 三 价 稀 土 离 子 标 记 到 抗 原 或 抗 体 分 子 上 ; 同 时 该 络 合 物 还 可 以 维 持 三 价 稀 土 离 子 周 围 的 非 水 相 环 境, 因 此 也 充 当 了 增 强 剂 的 角 色 该 方 法 的 特 点 是 无 需 增 强 剂, 故 操 作 简 单 ; 但 灵 敏 度 度 低 于 上 述 DELFIA 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 分 析 最 大 的 不 足, 是 环 境 及 样 品 中 同 类 元 素 导 致 的 本 底 干 扰 作 为 稀 土 资 源 大 国 的 中 国, 这 一 点 尤 其 不 容 忽 视, 特 别 对 北 方 地 区 更 为 重 要 虽 然 可 以 通 过 实 验 用 水 和 实 验 室 环 境 的 特 殊 净 化 杜 绝 一 部 分 干 扰, 但 会 带 来 运 行 成 本 的 提 高 ; 况 且 由 于 病 人 体 内 这 类 元 素 的 积 累 而 造 成 的 临 床 标 本 污 染 根 本 无 法 消 除 因 此 人 们 研 究 开 发 了 另 一 种 称 为 直 接 时 间 分 辨 荧 光 测 量 法 的 技 术, 也 有 人 称 之 为 后 标 记 技 术 它 首 先 使 用 一 种 不 含 稀 土 元 素 的 特 殊 络 合 物 标 记 抗 原 或 抗 体, 等 常 规 免 疫 分 析 中 的 洗 涤 完 成 后, 再 加 入 稀 土 元 素 并 进 行 测 定 ; 这 样 就 基 本 掩 蔽 了 同 类 元 素 导 致 的 本 底 干 扰 但 其 灵 敏 度 较 低, 目 前 还 不 能 与 上 述 两 种 方 法 相 抗 衡 总 之, 时 间 分 辨 荧 光 技 术 的 不 足 为 测 量 方 式 复 杂 仪 器 成 本 及 维 护 费 用 高, 环 境 及 样 品 中 同 类 元 素 可 导 致 本 底 干 扰 等 3. 电 化 学 发 光 电 化 学 发 光 在 原 理 上 与 上 述 化 学 发 光 有 所 不 同, 其 差 异 在 于 氧 化 反 应 是 通 过 电 极 上 的 电 化 学 反 应 产 生 的, 而 不 是 由 氧 化 剂 或 发 光 剂 自 身 内 氧 化 产 生 其 标 记 物 为 三 联 双 吡 啶 钌 及 其 衍 生 物 [Ru(bpy) 3 ] 2+, 并 以 三 丙 胺 (TPA) 为 还 原 剂 为 降 低 检 测 成 本 并 保 证 测 量 结 果 的 重 复 性, 目 前 普 遍 采 用 流 动 池 测 量 方 式 因 此 在 启 动 发 光 时, 首 先 [Ru(bpy) 3 ] 2+ 和 TPA 被 泵 入 流 动 池, 并 在 流 动 池 的 阳 性 电 极 表 面 发 生 氧 化 反 应, 形 成 [Ru(bpy) 3 ] 3+ 和 阳 离 子 TPA + ; 后 者 再 形 成 自 由 基 TPA, 并 将 [Ru(bpy) 3 ] 3+ 还 原 为 激 发 态 的 [Ru(bpy) 3 ] 2+* ; 而 激 发 态 的 [Ru(bpy) 3 ] 2+* 通 过 能 量 跃 迁 发 射 出 一 个 波 长 620nm 的 光 子, 并 重 新 生 成 基 态 的 [Ru(bpy) 3 ] 2+ ( 见 下 图 ) 电 化 学 发 光 的 特 点 是 : 发 光 过 程 中 的 标 记 物 基 本 不 被 消 耗, 而 反 应 体 系 中 其 它 成 分 充 分 过 量, 因 此 发 光 信 号 强 而 稳 定, 且 发 光 时 间 较 长 其 缺 点 为 测 量 方 式 复 杂 仪 器 成 本 及 维 护 费 用 高 ; 同 时 环 境 及 样 品 中 同 类 元 素 也 存 在 较 弱 的 本 底 干 扰 另 外, 反 复 使 用 的 流 动 池 可 能 导 致 交 叉 污 染 ; 而 冲 洗 或 进 样 中 产 生 的 气 泡 也 会 干 扰 测 定 ; 同 时 烦 琐 冗 长 的 冲 洗 过 程 也 会 成 为 提 高 检 测 效 率 的 瓶 颈 另 外, 使 用 磁 性 或 非 磁 性 微 粒 时, 强 烈 的 散 射 吸 收 作 用 也 会 降 低 灵 敏 度 17

28 4. 各 种 常 见 的 光 信 号 检 测 器 以 往 的 光 信 号 检 测 仪 器 大 多 采 用 光 敏 二 极 管 光 敏 电 池 电 荷 偶 合 器 (CCD), 或 者 以 光 电 流 放 大 方 式 工 作 的 常 规 光 电 倍 增 管 作 为 检 测 器 件 其 原 理 为 : 通 过 光 电 转 换 器 件 将 光 信 号 转 换 为 电 压 或 电 流 信 号, 再 加 以 放 大 其 主 要 特 点 为 : 结 构 简 单 性 能 稳 定, 但 灵 敏 度 低 线 性 范 围 较 窄 随 着 现 代 量 子 物 理 学 的 发 展, 以 及 人 们 对 光 的 微 观 特 性 认 识 的 逐 步 深 入, 一 种 被 称 为 单 光 子 计 数 器 的 新 型 高 敏 感 度 光 电 检 测 器 在 已 经 问 世, 其 灵 敏 度 及 线 性 范 围 均 大 大 超 过 其 它 常 规 技 术 因 此 目 前 较 先 进 的 发 光 检 测 仪 均 使 用 单 光 子 计 数 器 但 在 某 些 廉 价 的 小 型 发 光 检 测 设 备 中, 仍 然 使 用 CCD 和 光 敏 二 极 管 阵 列 ; 其 特 点 为 体 积 小 测 定 速 度 快, 甚 至 可 以 实 现 微 孔 板 的 成 排 测 量 ; 但 灵 敏 度 低 线 性 范 围 窄, 因 此 基 本 无 法 满 足 高 灵 敏 度 免 疫 检 测 的 要 求 随 着 光 电 子 技 术 的 发 展, 一 种 被 称 为 电 子 轰 炸 电 荷 偶 合 器 (Electron Bombardment CCD, EB-CCD) 的 高 灵 敏 度 半 导 体 器 件 已 经 问 世, 其 灵 敏 度 虽 然 无 法 与 单 光 子 计 数 器 相 比, 而 且 成 本 很 高, 但 在 大 量 信 4 号 的 平 行 批 处 理 方 面 优 势 明 显 ; 因 此 目 前 被 广 泛 地 应 用 到 高 档 发 光 成 像 仪 器 中, 如 组 织 细 胞 的 发 光 成 像 生 物 芯 片 的 阅 读 等 另 外 一 个 值 得 注 意 的 问 题 是, 由 于 单 光 子 计 数 灵 敏 度 很 高, 使 得 它 在 检 测 较 强 信 号 时, 往 往 达 到 甚 至 超 出 自 己 的 工 作 范 围, 这 可 能 会 在 一 定 程 18 度 上 影 响 结 果 的 准 确 性 换 言 之, 单 光 子 计 数 器 有 时 显 得 灵 敏 度 太 高 了 近 年 来, 国 际 上 有 人 提 出 了 双 量 程 自 动 转 换 单 光 子 计 数 器 的 设 计 思 想, 即 一 个 单 光 子 计 数 器 中 同 时 存 在 两 套 检 测 电 路, 分 别 负 责 强 信 号 和 弱 信 号 的 检 测, 二 者 在 运 行 过 程 中 可 自 动 切 换 这 样, 弱 信 号 由 高 灵 敏 度 检 测 器 负 责 接 受, 从 而 充 分 保 持 了 仪 器 的 高 灵 敏 度 特 性 ; 同 时, 强 信 号 由 低 灵 敏 度 检 测 器 负 责 接 受, 也 就 完 全 保 证 了 仪 器 检 测 强 信 号 时 的 可 靠 性 在 这 种 情 况 下, 不 仅 可 以 使 检 测 灵 敏 度 再 提 高 半 个 数 量 级, 即 3-5 倍 ; 而 且 更 可 使 线 性 范 围 达 到 之 多 5. 各 种 发 光 免 疫 分 析 技 术 的 性 能 比 较 通 常, 酶 联 免 疫 技 术 的 分 析 灵 敏 度 可 达 到 mol/l; 新 型 的 微 珠 包 被 酶 放 大 免 疫 技 术 的 分 析 灵 敏 度 可 达 到 mol/l 其 瓶 颈 是 受 比 色 测 量 的 线 性 关 系 只 在 稀 溶 液 中 成 立 的 限 制, 以 及 反 应 杯 透 光 率 差 异 和 浑 浊 样 品 的 散 射 吸 收 作 用 普 通 放 免 技 术 的 分 析 灵 敏 度 可 达 到 mol/l; 固 相 放 免 技 术 可 达 到 mol/l 其 瓶 颈 为 检 测 器 性 能 和 放 化 灭 活 作 用 所 谓 放 化 灭 活 作 用, 是 指 在 放 射 性 标 记 过 强 时, 射 线 能 量 作 用 与 抗 原 抗 体 分 子, 18

29 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 通 过 影 响 其 结 构 稳 定 性 使 其 生 物 活 性 下 降 的 现 象 因 此, 放 化 灭 活 现 象 的 存 在 往 往 限 制 了 放 免 技 术 灵 敏 度 和 线 性 范 围 的 提 高 荧 光 免 疫 的 分 析 灵 敏 度 稍 逊 于 放 免, 其 瓶 颈 为 浓 度 淬 灭 和 荧 光 漂 白 作 用 所 谓 浓 度 淬 灭 是 指 在 高 浓 度 荧 光 素 条 件 下, 由 于 靠 近 光 源 的 荧 光 素 大 量 吸 收 激 发 光 能 量, 使 得 远 离 光 源 的 荧 光 素 可 吸 收 的 能 量 减 少, 从 而 造 成 荧 光 效 率 下 降 而 荧 光 漂 白 是 在 过 强 激 发 光 作 用 下, 由 于 荧 光 素 结 构 的 变 化, 使 其 暂 时 或 永 久 失 去 发 射 荧 光 能 力 的 现 象 所 以, 上 述 两 种 现 象 的 存 在 均 造 成 了 对 荧 光 技 术 灵 敏 度 和 线 性 范 围 的 限 制 而 近 年 来 出 现 的 发 光 免 疫 分 析 技 术, 其 分 析 灵 敏 度 已 经 达 到 mol/l 如 果 以 每 次 实 验 的 加 样 量 为 50ul, 按 摩 尔 常 数 为 计 算, 此 时 样 品 中 仅 有 几 十 个 待 测 物 分 子 这 个 灵 敏 度 已 经 接 近 了 免 疫 检 测 技 术 的 理 论 极 限 ; 换 句 话 讲, 在 现 有 的 实 验 模 式 下, 试 图 检 测 更 少 的 待 测 物 分 子 是 不 现 实 的 因 为 更 高 的 灵 敏 度, 必 须 要 求 加 入 反 应 的 样 品 中 存 在 数 量 非 常 恒 定 的 待 测 物 分 子, 以 保 证 其 检 测 结 果 的 稳 定 性 ; 但 由 于 分 子 运 动 的 存 在, 这 显 然 是 一 个 很 不 确 定 的 随 机 事 件 因 此, 即 使 存 在 这 样 的 方 法, 其 检 测 结 果 的 可 靠 性 也 是 根 本 无 法 接 受 的 所 以, 除 目 前 尚 未 应 用 于 临 床 诊 断 的 单 分 子 检 测 技 术 以 外, 任 何 宣 称 采 用 常 规 加 样 方 式 的 免 疫 分 析 技 术 能 够 在 分 析 灵 敏 度 上 超 越 这 一 极 限 的 论 调, 显 然 是 荒 谬 的 ; 因 为 溶 液 中 分 子 的 随 机 运 动 会 毫 不 留 情 地 扼 杀 这 样 的 图 谋 事 实 上, 发 光 和 荧 光 技 术 均 会 受 到 无 辐 射 跃 迁 和 散 射 吸 收 作 用 的 影 响 所 谓 无 辐 射 跃 迁 是 指 处 于 激 发 态 的 荧 光 或 发 光 底 物 以 不 发 射 光 子 的 方 式 回 到 基 态 的 现 象 ; 其 原 因 是 能 量 通 过 产 热 被 释 放, 或 者 将 能 量 传 递 给 了 其 它 物 质 而 散 射 吸 收 作 用 是 浑 浊 样 品 中 的 微 粒 对 光 信 号 的 多 次 随 机 反 射 和 吸 收 上 述 两 种 现 象 在 使 用 磁 性 或 非 磁 性 微 粒, 或 者 存 在 高 浓 度 杂 质 时 尤 其 明 显 因 此, 上 述 灵 敏 度 只 是 各 个 检 测 技 术 所 能 达 到 的 极 限 在 实 际 应 用 中, 由 于 受 抗 体 亲 合 力 的 限 制 以 及 干 扰 免 疫 反 应 的 因 素 影 响, 免 疫 检 测 试 剂 的 分 析 灵 敏 度 往 往 无 法 达 到 上 述 指 标 特 别 是 对 发 光 免 疫 分 析 技 术 来 讲, 提 高 其 检 测 灵 敏 度 的 瓶 颈 在 于 抗 体 亲 合 力 和 干 扰 免 疫 反 应 的 因 素, 而 不 是 检 测 技 术 本 身 例 如, 电 化 学 发 光 TSH 分 析 试 剂 的 灵 敏 度 为 0.005mIU/L, 而 第 四 代 化 学 发 光 免 疫 TSH 分 析 试 剂 的 分 析 灵 敏 度 为 0.001mIU/L 其 原 因 在 于 抗 体 的 亲 合 力, 而 不 是 检 测 技 术 灵 敏 度 的 差 异 综 合 上 述 内 容 不 难 看 出, 对 于 现 有 的 新 型 发 光 免 疫 分 析 技 术 来 讲, 片 面 宣 扬 这 些 检 测 技 术 的 灵 敏 度 和 线 性 范 围 谁 强 谁 弱, 不 仅 毫 无 意 义, 而 且 也 是 荒 谬 的 而 真 正 影 响 其 技 术 性 能 的 瓶 颈, 恰 恰 是 那 些 被 有 意 无 意 地 掩 盖 的 问 题, 如 : 抗 体 亲 合 力 和 特 异 性 干 扰 物 质 的 作 用 前 滞 效 应 的 存 在, 以 及 企 业 的 生 产 工 艺 和 管 理 水 平, 乃 至 对 用 户 进 行 技 术 服 务 的 意 识 和 能 力 ; 而 这 些 也 是 目 前 所 有 免 疫 分 析 产 品 所 面 临 的 共 同 问 题 事 实 上, 综 观 科 学 发 展 的 历 程, 几 乎 所 有 的 新 技 术 最 终 所 遇 到 的 最 大 障 碍, 往 往 还 是 那 些 以 往 技 术 尚 未 解 决 的 难 题 所 以, 人 们 常 说 新 技 术 最 怕 遇 到 老 问 题, 免 疫 分 析 也 不 例 外 因 此, 任 何 明 智 而 又 负 责 的 专 家 和 企 业, 都 不 应 当 纠 缠 在 灵 敏 度 的 伯 仲 上 夸 夸 其 谈, 甚 至 误 导 大 众 ; 而 应 当 踏 踏 实 实 地 将 精 力 集 中 到 筛 选 抗 体 屏 蔽 干 扰, 以 及 提 高 生 产 工 艺 和 管 理 水 平, 并 确 实 加 强 行 技 术 服 务 上 二. 现 有 发 光 免 疫 分 析 技 术 的 共 同 特 点 现 状 及 应 注 意 的 问 题 1. 现 有 发 光 免 疫 分 析 产 品 的 特 点 由 由 于 发 光 免 疫 分 析 操 作 简 单, 反 应 速 度 快, 比 较 容 易 实 现 自 动 化, 因 此 目 前 大 多 采 用 全 自 动 工 作 方 式 ; 而 部 分 适 合 基 层 使 用 的 普 及 型 仪 器, 以 及 用 于 特 定 化 验 项 目 的 小 型 仪 器 也 采 用 微 孔 板 或 其 它 形 式 的 半 自 动 方 式 无 论 采 用 哪 种 方 式, 整 个 实 验 过 程 均 在 1-2 小 时 内 完 成 为 进 一 步 提 高 反 应 速 度 并 增 加 灵 敏 度, 还 有 很 多 机 型 采 用 磁 性 或 非 磁 性 微 粒 包 被, 以 增 加 表 面 积 ; 此 时 反 应 时 间 可 缩 短 至 20 分 钟 左 19

30 右 由 于 检 测 试 剂 的 稳 定 性 提 高, 加 上 采 用 自 动 化 仪 器 更 使 实 验 误 差 降 低, 故 目 前 普 遍 使 用 厂 家 内 建 标 准 曲 线 加 校 正 的 方 法 产 生 工 作 曲 线, 从 而 减 轻 了 工 作 量 并 降 低 运 行 成 本 在 闪 光 型 化 学 发 光 或 电 化 学 发 光 试 剂 的 配 套 仪 器 中, 普 遍 采 用 流 动 池 测 定 方 式 ( 见 下 图 ) 2. 应 用 发 光 免 疫 分 析 产 品 存 在 的 问 题 由 于 发 光 免 疫 的 检 测 模 式 与 放 免 不 同, 因 此 其 测 定 结 果 和 临 床 正 常 值 都 会 有 所 差 异 特 别 是 这 些 产 品 多 采 用 单 抗, 因 此 交 叉 反 应 与 多 采 用 多 抗 的 放 免 相 比 大 大 降 低, 所 以 其 样 品 测 定 值 往 往 比 放 免 要 低 即 使 是 选 用 同 一 原 理 的 发 光 免 疫 产 品, 不 同 厂 家 的 产 品 之 间 测 定 结 果 都 会 有 所 差 异 ; 其 原 因 是 抗 体 的 特 异 性 差 异 和 参 比 品 的 系 统 误 差 另 外, 目 前 可 用 于 免 疫 分 析 试 剂 的 标 准 品 较 少, 室 间 质 控 也 开 展 的 不 够, 因 此 试 剂 的 标 准 化 还 远 没 有 实 现 ; 所 以 不 同 产 品 间 测 定 结 果 的 系 统 误 差 几 乎 处 于 失 控 状 态 国 家 药 品 生 物 制 品 鉴 定 所 曾 选 送 数 份 质 控 血 清, 在 北 京 六 个 知 名 医 院 分 别 检 测 甲 状 腺 素 及 三 碘 甲 状 腺 素, 这 些 医 院 均 使 用 最 先 进 的 进 口 设 备 和 试 剂, 涵 盖 了 酶 促 及 非 酶 促 化 学 发 光 时 间 分 辨 荧 光 电 化 学 发 光 等 各 种 实 验 模 式 ; 而 检 测 结 果 却 发 现 其 最 高 和 最 低 测 定 值 的 差 异 超 过 三 倍 事 实 上, 由 于 抗 体 的 交 叉 反 应 千 差 万 别, 加 上 个 体 间 代 谢 状 况 的 不 同, 即 使 通 过 设 定 参 比 标 准 使 上 述 系 统 误 差 趋 于 一 致, 也 无 法 保 证 临 床 标 本 的 测 定 结 果 完 全 一 致 例 如 对 于 测 定 激 素 的 试 剂, 其 抗 体 均 或 多 或 少 地 与 激 素 前 体 或 代 谢 物 之 间 存 在 交 叉, 而 这 种 交 叉 反 应 的 强 度 在 不 同 厂 家 选 用 的 抗 体 间 存 在 差 异 ; 因 此 个 体 间 代 谢 水 平 的 差 异 必 然 导 致 交 叉 反 应 物 质 的 差 异, 从 而 干 扰 检 测 结 果 的 一 致 性 其 中 最 常 见 的 交 叉 反 应 有 : 胰 岛 素 C- 肽 胰 岛 素 原 之 间 的 交 叉 反 应 ;TSH FSH LH HCG 之 间 的 交 叉 反 应 ; 甾 体 激 素 之 间 及 与 其 前 体 和 代 谢 物 的 交 叉 反 应 ; 甲 状 腺 激 素 之 间 的 交 叉 反 应 等 其 次, 目 前 普 遍 使 用 厂 家 内 建 标 准 曲 线 加 校 正 的 方 法 产 生 工 作 曲 线 ; 这 虽 然 减 轻 了 工 作 量 并 降 低 运 行 成 本, 但 其 科 学 性 和 准 确 性 值 得 探 讨 但 遗 憾 的 是, 许 多 厂 家 均 将 校 正 方 法 视 为 技 术 秘 密 而 没 有 公 开, 因 此 无 从 考 证 其 合 理 性 甚 至 有 些 厂 家 为 了 保 证 质 控 品 的 测 定 结 果 稳 定, 让 质 控 品 参 与 曲 线 校 正 ; 即 只 要 用 户 输 入 该 质 控 品 的 标 定 值, 则 工 作 曲 线 将 会 随 着 该 标 定 值 移 动 其 结 果 是 : 虽 然 质 控 品 测 定 结 果 每 次 都 非 常 完 美, 但 实 验 误 差 却 被 无 情 地 掩 盖 了 还 有 部 分 检 测 仪 器 只 向 用 户 提 供 化 验 结 果, 而 21 不 显 示 原 始 数 据 ; 因 此 用 户 无 法 监 控 实 验 数 据 是 否 正 确 ; 甚 至 当 试 剂 几 乎 失 活 导 致 信 号 很 弱 时, 用 户 也 更 本 无 法 察 觉 20

31 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 另 外, 某 些 因 素 对 发 光 或 荧 光 存 在 干 扰, 但 尚 未 引 起 充 分 注 意 如 温 度 的 波 动 会 影 响 发 光 反 应 和 荧 光 效 率 金 属 离 子 也 会 严 重 干 扰 发 光 反 应 和 荧 光 效 率, 这 对 于 使 用 磁 珠 的 试 剂 更 为 重 要 因 为 目 前 普 遍 使 用 聚 合 物 包 裹 的 磁 珠, 而 磁 珠 质 量 的 微 小 瑕 疵 和 不 当 操 作 所 造 成 的 金 属 物 质 泄 露 将 导 致 严 重 后 果 同 时 标 本 中 常 用 的 防 腐 剂 和 抗 凝 剂 也 会 干 扰 免 疫 反 应, 或 者 通 过 抑 制 酶 活 性 及 发 光 或 荧 光 效 率 干 扰 结 果 的 稳 定 性 还 有 一 些 卟 啉 等 内 源 性 物 质 浑 浊 杂 质 氧 化 剂 还 原 剂 等 均 会 干 扰 结 果 的 准 确 性 而 且, 由 于 上 述 测 定 仪 器 的 灵 敏 度 极 高, 因 此 过 强 的 光 线 磁 场 电 网 波 动 等 均 会 造 成 检 测 信 号 的 扰 动 而 环 境 及 样 品 中 的 稀 土 元 素 对 时 间 分 辨 荧 光 及 电 化 学 发 光 的 干 扰 也 是 一 个 值 得 注 意 的 因 素 还 有 一 个 值 得 注 意 的 问 题 是, 目 前 我 国 很 多 地 方 还 在 使 用 普 通 放 免 技 术, 而 该 技 术 采 用 沉 降 法 获 得 免 疫 复 合 物 ; 而 固 相 放 免 化 学 发 光 时 间 分 辨 荧 光 电 化 学 发 光 等 均 采 用 固 相 包 被 和 洗 涤 法 获 得 免 疫 复 合 物 因 此 使 用 竞 争 法 测 定 小 分 子 物 质 时, 如 果 标 本 中 存 在 可 结 合 该 物 质 的 大 分 子 蛋 白, 则 该 蛋 白 对 于 上 述 两 类 方 法 造 成 的 干 扰 是 不 同 的, 其 误 差 产 生 的 方 向 恰 恰 相 反 ; 即 其 中 一 个 方 法 的 测 定 结 果 偏 低 时, 另 一 种 方 法 的 结 果 却 偏 高 由 于 这 种 情 况 在 测 定 甲 状 腺 激 素 甾 体 激 素, 以 及 各 种 药 物 时 非 常 常 见, 而 这 种 差 异 又 往 往 会 导 致 临 床 上 相 互 矛 盾 的 解 释, 因 此 必 须 非 常 认 真 地 加 以 对 待 下 面 仅 以 甲 状 腺 素 结 合 蛋 白 (TBG) 干 扰 竞 争 法 测 定 T 3 为 例, 解 释 这 种 现 象 的 产 生 根 源 假 定 某 一 病 人 因 个 体 原 因 使 标 本 中 TBG 含 量 比 正 常 人 高, 则 在 普 通 放 免 法 中 TBG 会 结 合 过 多 的 放 射 性 标 记 T 3, 其 行 为 类 似 于 加 入 的 抗 体, 即 该 复 合 物 最 终 与 抗 体 一 起 被 沉 淀 下 来 ; 这 相 当 于 在 该 反 应 管 中 加 入 了 过 多 的 抗 体 ; 显 然, 后 果 是 检 测 信 号 被 加 强 因 为 竞 争 法 的 剂 量 - 反 应 关 系 为 反 向 曲 线, 因 此 测 定 结 果 将 偏 低 而 在 固 相 放 免 和 发 光 免 疫 法 中, 虽 然 TBG 也 会 结 合 过 多 的 标 记 T 3, 但 该 复 合 物 最 终 在 洗 涤 过 程 中 被 清 除, 因 此 标 记 物 被 异 常 消 耗 ; 这 相 当 于 在 该 反 应 管 中 少 加 入 了 标 记 物 ; 显 然, 后 果 是 检 测 信 号 被 减 弱 同 样 基 于 竞 争 法 的 剂 量 - 反 应 关 系 为 反 向 曲 线 的 原 理, 测 定 结 果 将 偏 高 3. 使 用 发 光 免 疫 分 析 产 品 必 须 做 好 的 几 个 工 作 首 先, 应 当 在 厂 家 提 供 的 数 据 基 础 上, 尽 可 能 自 行 建 立 正 常 参 考 值 系 统, 以 消 除 实 验 室 和 人 群 差 异 其 次, 应 当 明 确 各 个 试 剂 盒 的 特 异 性 及 交 叉 反 应 情 况, 如 : 小 分 子 激 素 之 间, 以 及 与 自 身 前 体 或 代 21

32 谢 物 之 间 的 交 叉 ; 胰 岛 素 与 C- 肽 胰 岛 素 原 之 间 的 交 叉 ;TSH 与 FSH LH HCG 之 间 的 交 叉 应 充 分 利 用 现 有 国 标 参 考 品 校 正 结 果, 而 这 些 参 考 品 可 以 从 国 家 药 品 生 物 制 品 检 定 所 或 临 床 检 验 中 心 得 到 但 由 于 这 些 参 考 品 多 数 仅 适 合 放 免, 其 中 的 防 腐 剂 虽 然 对 免 疫 反 应 没 有 影 响, 但 可 能 会 干 扰 发 光 或 荧 光, 因 此 必 须 慎 重 选 择 建 议 对 每 个 检 测 项 目 自 行 建 立 2-3 点 质 控, 其 标 定 值 尽 可 能 分 别 接 近 正 常 值 上 下 限 ; 每 次 实 验 时 随 样 品 一 起 检 测, 以 监 控 实 验 结 果 的 稳 定 性 和 准 确 性 同 时 注 意 质 控 的 保 存 条 件 和 稳 定 性, 如 果 需 要 加 入 防 腐 剂, 则 必 须 保 证 其 不 会 干 扰 发 光 或 荧 光 应 尽 可 能 避 免 干 扰 因 素, 如 : 采 样 时 选 用 一 次 性 清 洁 样 品 管, 并 注 意 塑 料 中 的 抗 氧 化 剂 干 扰, 保 存 标 本 时 尽 量 不 使 用 酶 抑 制 剂 和 防 腐 剂 由 于 待 测 物 质 的 降 解 及 其 与 血 清 蛋 白 结 合 状 态 的 改 变, 某 些 化 验 项 目 的 检 测 结 果 往 往 受 标 本 存 放 时 间 及 其 贮 存 条 件 的 影 响 ; 因 此, 应 当 尽 可 能 要 求 临 床 部 门 及 时 采 样 送 检, 实 验 室 也 应 当 尽 量 及 时 完 成 化 验 ; 的 确 需 要 存 放 时, 也 必 须 严 格 按 照 相 关 试 剂 盒 说 明 书 进 行 另 外, 实 验 室 应 恒 温 避 免 强 光 和 强 磁 场, 操 作 人 员 严 格 按 照 操 作 规 程 工 作, 并 对 设 备 及 时 维 护 和 报 修 22

33 发光免疫分析技术临床应用手册 第二章 光生物学检测技术在医学领域中的应用 第一节 化学发光和生物发光技术的应用范围 由于近年来有关生物发光机理的基础研究进展迅速 加上生物发光作为一种非放射性 非创伤损害 性 高灵敏度 实时动态的检测技术 其优势十分显著 因此生物发光检测技术在生物医学研究 临床 诊断 食品及环境检测等方面的应用越来越广泛 相关产品也逐步实现产业化 规模化 ATP ATP 一 微生物快速检测 由于ATP是维持细胞存活的基本物质 因此利用ATP启动的虫荧光素酶发光测定样品中的活细胞数 或者检测细胞的增殖是发光技术在生物学中最成功的应用领域之一 因此 虫荧光素酶发光系统作为发 现最早 研究工作最完整的生物发光体系 其最具商业价值的应用无疑是细菌总数 TBC 及可同化有 机碳 AOC 的快速测定 其原理是利用虫荧光素酶测定活细菌细胞内的ATP 由于活细菌胞内的ATP含 量总是相对稳定 因此很容易以此计算出标本中的细菌数 见下图 ATP ADP 如果该方法应用于新鲜食品 如肉 蛋 奶及蔬菜水果的检测 则需要用滤膜或特殊试剂 通常是 AMP脱氨酶及三磷酸双磷酸酶去除标本中天然存在的内源性ATP 然后使用裂解剂释放细菌内部的ATP并 测定发光 国外已经将这种技术用于环境和食品卫生检测 并生产出了手持式检测仪和采样器 能在数 十秒内完成微生物污染的分析 见下图 客服热线 网址 电子邮件 yuande@yuande.com 23

34 目 前 随 着 稳 定 的 液 态 ATP 标 准 的 出 现, 这 一 方 法 日 见 标 准 化 为 进 一 步 提 高 检 测 灵 敏 度, 可 是 用 滤 膜 浓 缩 细 菌 ; 同 时 也 可 以 用 免 疫 捕 获 法 测 定 特 定 微 生 物, 从 而 实 现 特 定 病 原 体 的 鉴 定 用 上 述 方 法 进 行 临 床 标 本 细 菌 总 数 的 快 速 测 定 时, 与 传 统 的 培 养 法 有 很 好 的 相 关 性, 却 可 在 一 小 时 内 完 成 的 病 原 体 的 鉴 定 和 药 敏 实 验 目 前 该 方 法 也 派 生 出 一 些 可 进 一 步 提 高 灵 敏 度 和 抗 干 扰 性 的 变 型 技 术 美 国 国 家 航 天 局 甚 至 已 经 利 用 该 技 术 研 发 出 检 测 航 天 设 备 及 其 安 装 车 间 内 地 球 微 生 物 污 染 的 方 法 近 年 来, 基 于 反 恐 战 争 中 防 止 生 化 袭 击 的 要 求, 西 方 国 家 建 立 了 快 速 检 测 烈 性 病 原 体 的 生 物 发 光 技 术 方 法 之 一 是 使 用 炭 疽 杆 菌 的 特 异 噬 菌 体 产 生 的 炭 疽 孢 子 特 异 溶 素 (Lysin) 以 及 虫 荧 光 素 酶 检 测 炭 疽 孢 子, 其 原 理 是 : 当 被 检 测 物 中 存 在 炭 疽 孢 子 时, 特 异 溶 素 将 溶 解 该 孢 子 并 释 放 其 内 部 ATP, 从 而 导 致 发 光 ( 见 下 图 ) 方 法 之 二 是 利 用 具 有 特 异 表 面 抗 体 并 表 达 水 母 素 的 重 组 小 鼠 B 淋 巴 细 胞, 一 旦 该 细 胞 与 特 定 抗 原 结 合, 则 离 子 通 道 开 放, 使 钙 离 子 进 入 细 胞 内, 激 发 水 母 素 发 光, 目 前 该 方 法 已 经 用 于 炭 疽 天 花 鼠 疫 兔 热 病 (Tularemia) 等 病 原 体 的 检 测 ATP +Lysin + + Lysin + ATP- + Lysin + + AMP + 除 上 述 方 法 外, 还 可 将 发 光 技 术 结 合 免 疫 分 析 以 及 PCR 分 子 杂 交 等 分 子 生 物 学 技 术 进 行 微 生 物 的 检 测 如 发 光 免 疫 法 结 合 磁 珠 分 离 技 术 测 定 食 物 中 的 大 肠 杆 菌 O157 沙 门 氏 菌 肉 毒 杆 菌 A 药 物 残 留 2 等 另 外, 还 有 人 利 用 海 洋 发 光 菌 制 备 生 物 芯 片 测 定 水 体 生 化 耗 氧 量 (BOD), 其 可 检 测 范 围 达 到 0-50ppm 同 时 越 来 越 多 的 人 利 用 发 光 基 因 重 组 的 病 原 菌 评 估 食 品 灭 菌 效 果, 或 者 将 其 作 为 实 验 菌 株, 用 于 测 试 新 型 药 物 的 药 效 和 潜 在 耐 药 几 率 上 述 萤 火 虫 生 物 发 光 系 统 在 生 物 医 学 研 究 中 的 另 外 一 个 应 用 是 替 代 常 规 的 染 色 法 进 行 细 胞 毒 性 测 定 其 基 本 原 理 也 是 测 定 溶 解 细 胞 释 放 的 ATP, 其 最 低 检 测 限 可 以 达 到 10 个 细 胞 以 下, 大 大 超 过 染 色 法 1000 细 胞 的 水 平 二. 生 物 传 感 器 所 谓 生 物 传 感 器, 就 是 通 过 非 创 伤 或 非 损 害 性 的 办 法, 连 续 实 时 动 态 地 检 测 生 物 体 内 的 某 一 种 或 几 种 物 质 浓 度 的 技 术 目 前, 利 用 生 物 发 光 和 化 学 发 光 的 生 物 传 感 器 已 经 成 为 生 物 传 感 器 领 域 内 的 主 力 军 一 般 常 见 的 有 三 种 类 型 : 一 是 将 酶 等 固 化 到 载 体 上, 通 过 其 与 样 品 中 的 待 测 物 反 应 产 生 光 信 号 或 24

35 发光免疫分析技术临床应用手册 使光信号发生改变 二是利用免疫学原理将抗体或抗原固化到载体上 通过其与待测物的特异结合引发 光信号 三是利用类似报告基因的原理 将荧光素酶基因与特定启动子重组 并导入细菌 从而培育出 可被特定物质诱导表达荧光素酶 并产生生物发光的微生物 称为微生物传感器 近年来 尤其在环境 检测方面 此类生物传感器的研究及应用有了很大进展 第一类传感器主要用于环境或食品中有机磷农药残留的检测 其灵敏度可达20ng/ml 其原理是等 将乙酰胆碱酯酶 胆碱氧化酶 过氧化物酶组合 构成鲁米诺/H 2O 2/过氧化物酶发光体系 正常情况 下 由乙酰胆碱酯酶分解乙酰胆碱产生胆碱 再由胆碱氧化酶氧化胆碱产生H2O2 在过氧化物酶催化下 H2O2氧化鲁米诺产生化学发光 而当有机磷农药存在时抑制乙酰胆碱酯酶 从而使发光信号改变 另外 一种将FMN:NAD(P)H氧化还原酶 苯丙氨酸脱氢酶 荧光素酶组合构成的生物传感器 用于遗传性苯丙 酮尿症 PKU 病人自我检测尿中的苯丙氨酸 其检测限为1μmol/L 完全可以满足临床要求 还有利 用半乳糖激酶磷酸化半乳糖时消耗ATP的原理建立的测定血清及牛奶中的半乳糖的生物传感器 以此诊 断遗传性半乳糖苷酶缺乏症并对病情及饮食进行监控 见下图 H2O2 Luminol FMN:NAD(P)H ATP 第二类是利用免疫反应的生物传感器 用于测定H2O2 二氯苯氧基乙酸 2,4-D 人微球蛋白 农 药残留等 经过进一步改进的方法可将多种半抗原固化到微玻璃片的不同部位 制造出所谓的 生物芯 H2O22,4-D 片 它可与同一样品中的多种待测物同时反应 实现 并行处理 即多种待测物的连续 同时确认及 定量 将某种特定基因序列作为表达标记,用于检测特定基因位点的表达及其调控 这称之为报告基因技 术 由于发光信号的检测具有高灵敏度 非破坏性和动态连续性 因此发光蛋白报告基因已经成为这一 领域的主流 近几年来 随着荧光素酶基因作为一种报告基因的研究及应用日益深入 人们开始探索利 用类似原理构建微生物传感器 用于环境检测 如利用重组发光菌受某些污染物作用抑制其发光的特点 测定地面水污染 而更多的是将受特定物质诱导的启动子序列与荧光素酶或绿荧光蛋白 GFP 基因重 组 构成特异性的微生物传感器 如专门用于检测汞 铅 砷 锑 镉等重金属的菌种 检测诱变剂的 菌种 测多氯联苯等化合物的菌种等 这类传感器在环境检测中有很大的用武之地 见下图 GFP 客服热线 网址 电子邮件 25

36 GFP 美国国家航天局 NASA 利用高度集成的半导体-生物芯片作为太空舱环境的连续动态检测设备 其中利用含特异启动子的重组发光菌构成各种化学污染物的检测单元 当该化学物存在时诱导该细菌表 达发光蛋白并发光 同时使用可诱导宿主细胞产生酰基同型丝氨酸内酯 AHL 的特异性重组噬菌体和 产生AHL 而AHL则可诱导同一单元内的重组发光菌发光 该检测系统的响应时间小于30分钟 检测限达 重组发光菌一起构成各种病原菌的检测单元 当出现特定病原菌时 特异的噬菌体将感染该细菌并使其 到十亿分之一 ppb 级,且实现低能耗 低质量 低维护和无线遥控的目标 这种装置被称为生物发光 生物检测集成电路 BBIC 见下图 4 mrna O/P 2+ 另外 由于水母素及奥贝林等水母发光蛋白具有高度的Ca 依赖性 因此目前已经成为一个快速 连续 动态 无损测量细胞内外Ca 浓度及其调控的有力工具 目前已经有多种商品化的重组Ca 激活发 光蛋白及其表达载体面市 有人还建立了可在线粒体内表达水母素的重组CHO细胞生物传感器 当存在 某种特定刺激时 离子通道开放使胞内Ca2+增加 从而激活发光 三 分子生物学技术 荧光素酶基因作为报告基因用于分子生物学研究 以及用发光物质或酶为标记并以化学发光或生物 发光检测分子杂交信号 已成为两项被广泛应用的成熟技术 特别是用荧光素酶基因重组技术培育可发 光的转基因动物 肿瘤细胞 致病菌等 并通过连续检测动物活体的发光强度 在活体水平动态观察疾 病的发生 发展过程 这一技术构建的疾病动物模型必将为医学发展开辟全新的领域 见下图 客服热线 网址 电子邮件 yuande@yuande.com

37 发光免疫分析技术临床应用手册 在分子杂交方面 除在常规的斑点和印迹杂交中已广泛应用发光技术以外 还出现了发光原位杂交 和发光免疫组化技术 随着发光成像仪器的普及和完善 利用发光原理的分子病理学技术或许会逐步替 DNA ATP Sulfurylase 最近出现了一种利用生物发光进行快速核酸序列分析的仪器 并迅速占领了大量的市场分额 其原 ATP ATP 理如下 利用一套计算机控制的蠕动泵及其阀门构成连续进样系统 并在DNA聚合反应体系中加入腺苷 dntp 三磷酸双磷酸酶 ATP硫酸化酶 Sulfurylase 及荧光素酶 当聚合反应中产生的焦磷酸被ATP硫酸化 酶转化为ATP时 通过荧光素酶产生发光信号 该信号被发光仪记录 而未参与反应的脱氧核苷酸三磷 DNA ATP Sulfurylase 酸 dntp 被腺苷三磷酸双磷酸酶消化 这样 只要不断通过进样系统将四种脱氧核苷酸三磷酸分别注 DNA () ATP ATP 入反应体系 并同时检测发光信号 就可实现模板DNA序列的快速判读(见下图) 其特点是 操作极其 简单 试剂和仪器的成本均大大低于常规的末端终止法 而测定速度却大大提高 甚至可以实现多个序 dntp 列的同时并行测序 这一技术带来了基因测序技术的又一场革命 代荧光技术 DNA () datp dgtp dctp datp dttp dgtp dctp dcdp dgdp dadp dttp 发光蛋白作为一种非放射性 高灵敏度的标记物 近年来也被应用于免疫及基因标记分析中 例 dcdp 如 利用水母素或虫荧光素酶标记抗原 抗体或者核酸探针 然后进行特异性抗原 抗体或靶基因序列 dgdp dadp 6 客服热线 网址 电子邮件 yuande@yuande.com 27

38 的检测及分析 这种方式和目前常用的放射性同位素 荧光素 酶及化学发光物质标记技术类似 其特 点一是可以通过选择生物发光中必需的两种酶作为标记物实现双标记串联测定 即两种被检测物都存在 时才产生信号 也可以同时选择不同波长的多个标记物进行并联测定 即在一个反应内同时测定两种被 检测物信号 将某种特定基因序列作为表达标记,用于检测特定基因位点的表达及其调控 这称之为报告基因技 术 由于发光信号的检测具有高灵敏度 非破坏性和动态连续性 因此发光蛋白报告基因已经成为这一 领域的主流 ATP Sulfurylase 自上世纪末开始 一种被称为PPi Assay的生物发光检测技术已经逐步成为一项广泛使用的实时基 因分析技术 如快速多序列并行基因测序 实时定量PCR等 其原理如下 利用乙酸激酶和丙酮酸去激 ATP Sulfurylase 化酶或者ATP硫酸化酶 Sulfurylase 将DNA聚合反应中产生的焦磷酸转化为ATP 并用虫荧光素发光系 统检测其发光信号 该技术应用于基因测序已经实现商业化 见上 而目前已经将其作为实时定量 PCR的检测手段 见下图 四 自由基测定 化学发光检测脂质过氧化及自由基是生物学的经典技术之一 其原理是单线态氧 自由基 活 性氧族等可以激发鲁米诺发光 见下图 属于研究较早 技术比较成熟的领域 近年来 其技术的进步 更逐渐向实用化 临床化发展 例如 测定人血浆总脂质过氧化物及自由基水平 评估核事故后受低剂 量辐照人群的损伤程度 测定器官移植后与细胞吞噬有关的活性氧族物质以评价免疫排斥反应 以及抗 自由基及脂质过氧化物质的筛选及鉴定等等 客服热线 网址 电子邮件 yuande@yuande.com

39 发 光 免 疫 分 析 技 术 临 床 应 用 手 册 第 二 节. 新 型 光 生 物 学 检 测 技 术 展 望 近 几 年 来, 随 着 生 物 技 术 的 迅 速 发 展, 以 及 它 与 光 电 子 微 电 子 信 息 技 术 计 算 机 技 术 等 高 新 技 术 的 不 断 相 互 融 合 和 渗 透, 使 得 新 兴 的 生 物 检 测 方 法 不 断 出 现 这 不 仅 意 味 着 其 技 术 性 能 的 极 大 提 高, 而 且 更 为 生 物 技 术 的 进 一 步 发 展 开 辟 了 极 为 广 阔 的 前 景 ; 甚 至 完 全 改 变 了 以 往 常 规 生 物 技 术 赖 以 生 存 的 基 本 概 念 和 面 貌, 正 在 以 超 乎 人 们 想 象 力 的 方 式 影 响 着 我 们 的 生 活 但 鉴 于 篇 幅 有 限, 以 下 仅 对 相 关 内 容 做 一 简 要 介 绍 一. 均 相 (homogeneous) 检 测 技 术 均 相 检 测 技 术 也 叫 液 相 检 测 技 术, 其 特 点 是 免 疫 结 合 反 应 发 生 在 液 相 环 境 中, 而 且 在 检 测 信 号 前 也 无 需 将 未 结 合 的 靶 分 子 及 抗 体 分 离 出 去 例 如 常 见 的 免 疫 凝 集 法 免 疫 电 泳 法 免 疫 扩 散 法 等 凝 集 法 中 最 经 典 的 是 自 然 凝 集 法, 即 凝 集 过 程 完 全 由 抗 原 和 抗 体 的 结 合 反 应 自 然 形 成, 其 中 被 人 们 熟 知 的 血 型 测 定 和 肥 达 氏 反 应 就 属 此 类 后 来 在 此 基 础 上 发 展 了 敏 化 凝 集, 即 通 过 其 它 方 式 强 化 凝 集 反 应 以 提 高 灵 敏 度, 如 血 球 凝 集 法, 凝 胶 / 微 粒 比 浊 法 等 均 相 检 测 技 术 的 最 大 优 点 是 操 作 步 骤 少 而 简 单 测 定 速 度 快, 结 果 稳 定 ; 但 其 检 测 灵 敏 度 和 线 性 范 围 较 差, 因 此 以 往 只 能 用 于 较 为 粗 糙 的 定 性 实 验 中 近 几 年 来, 随 着 科 学 技 术 的 进 步, 一 大 批 新 兴 均 相 测 定 技 术 已 经 被 广 泛 地 应 用 到 临 床 检 验 中, 其 中 最 常 见 的 是 利 用 荧 光 共 振 能 量 转 移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET) 技 术 的 均 相 实 验 方 法, 以 及 最 近 一 两 年 才 发 展 起 来 的 和 生 物 发 光 共 振 能 量 转 移 (Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET) 技 术 ; 还 有 比 较 常 见 的 荧 光 偏 振 (Fluorescence Polarization,FP), 以 及 方 兴 未 艾 的 吖 啶 酯 差 分 水 解 及 杂 交 保 护 (Hybridization Protection,Different Hydrolysis) 技 术 荧 光 共 振 能 量 转 移 的 基 本 原 理 是 : 用 两 种 荧 光 素 分 别 标 记 两 种 抗 原 或 抗 体, 而 这 两 种 荧 光 素 的 荧 光 激 发 峰 和 发 射 峰 相 互 重 叠 ; 换 句 话 讲, 其 中 一 个 荧 光 素 发 射 的 荧 光 波 长 正 好 接 近 另 一 个 荧 光 素 所 需 的 激 发 光 波 长 ; 其 中, 前 者 称 为 供 体 (Donor), 后 者 称 为 受 体 (Receptor) 此 时, 如 果 通 过 免 疫 结 合 使 得 这 两 种 荧 光 素 相 互 靠 近, 则 在 用 第 一 种 荧 光 素, 即 供 体 的 激 发 光 照 射 样 品 时, 供 体 荧 光 素 吸 收 能 量 处 于 激 发 态 后 会 将 能 量 转 移 给 第 二 种 荧 光 素 ( 即 受 体 荧 光 素 ), 并 导 致 其 也 发 射 荧 光 这 样, 只 要 检 测 受 体 荧 光 素 发 射 的 荧 光 强 度, 或 者 供 体 / 受 体 两 种 波 长 荧 光 的 比 例, 就 可 以 得 知 免 疫 复 合 物 的 含 量, 或 者 免 疫 结 合 反 应 的 效 率 利 用 FERT 产 生 的 衍 生 技 术 很 多, 如 分 子 灯 标 (Molecular Beacon) TaqMan 实 时 定 量 PCR 等 ( 见 下 图 ) 而 所 谓 荧 光 偏 振 的 原 理 是 : 用 一 束 偏 振 光 照 射 荧 光 素, 如 果 荧 光 素 固 定 不 动, 则 其 发 射 的 荧 光 也 是 偏 振 的 ; 但 由 于 溶 液 中 荧 光 素 无 规 则 的 分 子 运 动, 则 产 生 的 荧 光 偏 振 度 大 大 下 降 因 此, 如 果 将 荧 光 素 与 一 个 小 分 子 抗 原 标 记, 此 时 由 于 分 子 运 动 较 快, 其 荧 光 偏 振 度 较 低 ; 如 果 该 分 子 与 一 个 大 分 子 蛋 白, 如 抗 体 等 结 合, 则 其 运 动 大 大 延 缓, 故 荧 光 偏 振 度 会 大 大 增 加 ( 见 下 图 ) 29

40 A A B B OH - (Different Hydrolysis) (Hybridization Protection) 吖 啶 酯 差 分 水 解 或 杂 交 保 护 的 原 理 是 : 吖 啶 酯 很 容 易 在 碱 性 环 境 中 水 解 并 失 去 发 光 能 力, 而 将 其 标 记 到 小 分 子 物 质, 如 抗 原 或 探 针 上 以 后, 如 果 该 分 子 又 被 抗 体 或 目 的 基 因 结 合, 则 在 抗 体 或 核 酸 片 段 的 保 护 下 其 水 解 速 度 会 大 大 降 低 因 此 在 抗 原 抗 体 结 合 反 应 后 加 入 碱 液 即 可 消 除 未 参 与 结 合 的 标 记 物, 从 而 实 现 无 需 洗 涤 和 包 被 的 目 标 ( 见 下 图 ) H 2 O 2 近 年 来, 利 用 生 物 发 光 共 振 能 量 转 移 原 理 (BRET) 以 均 相 反 应 检 测 体 内 及 体 外 的 抗 原 抗 体 反 应 受 体 配 体 反 应 蛋 白 相 互 作 用 也 已 经 成 为 又 一 项 新 兴 生 物 技 术 其 原 理 与 荧 光 共 振 能 量 转 移 类 似, 只 是 供 体 荧 光 素 变 成 了 发 光 蛋 白 其 中 比 较 有 代 表 性 的 工 作 是 测 定 细 胞 内 雌 激 素 受 体 在 雌 激 素 样 物 质 作 用 下 的 二 聚 体 化 ( 见 下 图 ) BRET 目 前, 在 新 近 生 产 的 发 光 检 测 仪 中 已 经 开 始 配 备 相 关 的 配 件 30 9

41 发光免疫分析技术临床应用手册 BRET BRET BRET BRET (nm) (nm) (nm) (nm) 另外一个值得注意的进展是新型化学发光均相测定技术AlphaScreen的出现 其原理是 将抗原 抗体或基因探针分别与两种微球连接 当特异的分子结合发生时 这两种微球就会被连接在一起 此时 如果用特定的光源照射反应体系 则包含在其中一个微球 即供体中的光敏剂就会释放出自由基 并氧 化另一个微球 即受体中的发光剂发光 而如果这两种微球没有结合 则由于其距离较远 寿命较短的 自由基就无法到达另一微球并使其发光 从而实现快速均相测定 见下图 AlphaScreen 680nm 680nm 680nm nm AlphaScreen 680nm nm 但迄今为止 所有均相反应的检测灵敏度和线性范围尚无法与非均相方法相比 而且大多仅限于小 分子药物和激素的检测 二 生物传感器(Biosensor) 所谓生物传感器 就是通过非创伤或非损害性的办法 连续 实时 动态地检测生物体内的某一种 或几种物质浓度的技术 目前 利用生物发光和化学发光的生物传感器已经成为生物传感器领域内的主 力军 这些已经在其它章节中做过介绍 因此以下仅介绍一些非生物发光和化学发光的生物传感器类 型 其中一个研究较早的传感器是酶/抗体电极电位法(Enzyme/Antibody Potentiometric Electrode) 其基本原理是 将特异性很强的酶或抗体包被到一种特殊的电极材料上 当这种电极插入溶液后 如果 其中的待测物与上述酶或抗体发生结合 则该电极的电极电位将发生变化 因此测定其电流或电压变化 客服热线 网址 电子邮件 yuande@yuande.com 10 31

42 即 可 反 映 出 待 测 物 浓 度 这 非 常 接 近 于 测 定 溶 液 ph 值 的 过 程 目 前 这 种 技 术 已 经 应 用 于 某 些 小 型 个 人 监 护 设 备, 如 血 清 胆 固 醇 血 糖 的 快 速 测 定 等 该 方 法 的 特 点 是 测 定 速 度 快 成 本 低, 但 准 确 性 灵 敏 度 线 性 范 围 均 太 不 理 想 ; 因 此 目 前 尚 无 法 应 用 于 临 检 实 验 中 既 需 要 准 确 定 量, 而 含 量 又 很 低 的 指 标 另 外 一 个 新 兴 技 术 称 为 石 英 晶 体 漂 移 (Quartz Crystals Migration,QCM), 其 原 理 是 利 用 了 石 英 晶 体 的 压 电 效 应 和 谐 振 效 应 所 谓 压 电 效 应 是 指 石 英 晶 体 或 某 些 特 殊 陶 瓷 材 料 在 电 压 作 用 下 可 产 生 形 变 ; 反 之 在 压 力 作 用 下 产 生 形 变 时, 又 可 在 该 材 料 两 端 出 现 电 压 差 的 现 象 而 谐 振 效 应 是 说 任 何 一 个 形 状 密 度 和 质 量 固 定 的 物 质 都 具 有 一 个 特 定 的 振 动 频 率, 在 这 个 频 率 下 其 振 动 幅 度 最 大 持 续 时 间 最 久 ; 而 如 果 给 该 物 质 一 个 机 械 刺 激, 其 形 变 造 成 的 振 动 最 终 会 维 持 在 该 频 率 上, 因 此 称 之 为 谐 振 频 率 谐 振 效 应 是 音 叉 和 所 有 乐 器 的 声 学 基 础 用 石 英 晶 体 的 压 电 效 应 和 谐 振 效 应 制 造 的 石 英 晶 体 谐 振 器 早 就 被 广 泛 地 应 用 于 电 子 信 息 行 业, 成 为 当 今 最 重 要 的 电 子 元 件 之 一 如 果 我 们 在 石 英 晶 体 表 面 包 被 上 抗 原 抗 体 或 基 因 探 针, 当 待 测 物 与 其 结 合 时, 石 英 晶 体 表 面 形 状 的 微 小 变 化 将 导 致 其 谐 振 频 率 的 变 化, 故 检 测 其 频 率 变 化 就 可 以 感 知 待 测 物 浓 度 的 变 化 最 近 几 年, 表 面 等 离 子 体 谐 振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 技 术 在 生 物 传 感 器 中 的 应 用 日 新 月 异, 欧 美 一 些 企 业 甚 至 已 经 实 现 了 该 类 产 品 的 批 量 生 产 表 面 等 离 子 体 谐 振 生 物 传 感 器 的 结 构 原 理 见 下 图 : 其 核 心 是 在 玻 璃 表 面 的 一 层 纳 米 厚 度 金 属 膜, 如 果 一 束 激 光 通 过 玻 璃 照 射 到 金 属 膜 上 时, 光 线 必 然 发 生 反 射 ; 但 在 一 个 特 定 的 入 射 角 度 下, 金 属 膜 表 面 会 发 生 等 离 子 谐 振 并 大 量 吸 收 能 量, 使 得 反 射 光 的 强 度 大 大 下 降 如 果 在 该 金 属 膜 表 面 包 被 抗 原 抗 体 或 基 因 探 针, 当 待 测 物 与 其 结 合 时, 表 面 形 状 的 微 小 变 化 将 导 致 其 等 离 子 谐 振 所 需 的 入 射 角 发 生 变 化, 故 检 测 其 角 度 变 化 就 可 以 感 知 待 测 物 浓 度 的 变 化 另 外, 还 有 一 个 称 为 圆 偏 振 光 成 像 (Elliptical Polarization Imaging, EPI) 的 传 感 器 技 术 也 在 迅 速 发 展 其 结 构 原 理 见 下 图 : 传 感 器 核 心 也 是 在 玻 璃 表 面 镀 的 一 层 纳 米 厚 度 薄 膜, 如 果 一 束 椭 圆 偏 振 激 光 通 过 玻 璃 照 射 到 金 属 膜 上 时, 其 反 射 光 或 折 射 光 必 然 也 存 在 偏 振 特 性, 但 其 偏 转 角 与 薄 膜 的 厚 度 有 关 如 果 在 该 薄 膜 表 面 包 被 抗 原 抗 体 或 基 因 探 针, 当 待 测 物 与 其 结 合 时, 薄 膜 厚 度 的 微 小 变 化 将 导 致 其 偏 转 角 度 发 生 变 化 ; 故 检 测 其 偏 振 角 度 变 化 就 可 以 感 知 待 测 物 浓 度 的 变 化 11 32