《四川动物》2014年第33卷第1期

Size: px

Start display at page:

Download "《四川动物》2014年第33卷第1期"

梯崩邢
7 years ago
Views:

1 ./0 + #" 四川白鹅铁蛋白重链基因克隆及其 + 表达研究易治鑫姜冬梅康波何珲马容四川农业大学动物科技学院四川雅安摘要目的研究四川白鹅铁蛋白重链 B&)" $&:$"B 基因编码区序列特征及其组织表达差异方法应用分子生物学技术克隆, 编码区序列并分析预测其编码蛋白质的结构和功能实时荧光定量 = 技术定量检测四川白鹅种组织中, 的表达量结果四川白鹅, 编码区序列为 -( 编码个氨基酸其蛋白质分子质量为理论 (0 值为四川白鹅, 氨基酸序列与北京鸭和原鸡的相似性最高分别为和与北京鸭具有最近的亲缘关系 B 是稳定的可溶性蛋白质含有高度保守的个铁蛋白铁离子结合结构域标签和个亚铁氧化酶双铁离子结合位点在所检测的四川白鹅种组织中, 基因均有表达并且不同组织中, 表达量存在明显差异四川白鹅脾脏和视网膜中, 的表达量显著高于其他各组织 * 肝脏垂体和肾脏次之肌肉中, 表达量最低结论四川白鹅, 是高度保守的组织特异性表达的基因具有维持铁稳态和参与抗氧化的双重功能这为阐明鹅, 功能和铁代谢机制的研究奠定了理论基础关键词四川白鹅铁蛋白重链克隆组织表达中图分类号文献标志码文章编号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铁元素是机体多种代谢途径和氧化还原反应所必需的微量元素 / )&" $&! 其在维持酶生物活性细胞. 合成电子传递以及氧气运输等过程中发挥重要作用 &"# 然而如果机体内铁过量可诱导产生氧自由基导致细胞损伤铁蛋白 B&)" 是进化保守的多亚基蛋白质在维持细胞内铁稳态中发挥着双重作用张勇等!*$)&&- "" >)&&, 如果细胞内铁含量增多铁蛋白会螯合过剩的游离铁保护细胞免受游离金属的毒性损伤如果铁不足收稿日期接受日期基金项目国家自然科学基金资助项目编号高等学校博士学科点专项科研基金资助课题编号作者简介易治鑫男本科生主要从事特种经济动物养殖通讯作者 &#("% "')$!+"'%!-&)*-

和原鸡的相似性最高分别为和与北京鸭具有最近的亲缘关系 B 是稳定的可溶性蛋白质含有高度保守的个铁蛋白铁离子结合结构域标签和个亚铁氧化酶双铁离子结合位点在所检测的四川白鹅种组织中, 基因均有表达并且不同组织中,

2 时铁蛋白存储的铁可释放以供细胞利用除了维持机体内铁平衡功能之外铁蛋白还参与机体免疫调节并与神经变性疾病和肿瘤疾病有密切关系 6"$ 高等真核生物铁蛋白是由重链 B&")" $&:$" B 和轻链 B&)"!'$)$"B 两种亚基组成的含个亚基的球形蛋白质最多可储存约个铁原子 B&%" B 是铁蛋白储存铁离子的重要亚基在细胞铁离子稳态调节中发挥关键调控作用 # 能催化 B& L 氧化成 B& L 而 B 参与铁蛋白内铁核的形成家禽只表达, 而缺乏完整的 B#" )=)$ B&& 等研究发现, 基因缺失小鼠在胚胎发育 % 后死亡表明, 在小鼠早期发育过程中具有重要作用然而 #&' 等研究发现过表达, 的转基因鼠表现为生长迟缓毛发暂时性的丧失这些研究共同证实, 还具有参与调控动物生长发育等其他功能另等研究发现产蛋期鹅肝脏组织中, 表达水平显著高于产蛋前期而我们前期研究也表明产蛋期鹅卵巢组织, 表达水平显著高于产蛋前期提示, 可能对鹅卵巢发育和功能具有重要调控作用 6"' 然而目前有关鹅, 基因的结构和组织分布仍不清楚因此本研究克隆了四川白鹅, 基因的编码区序列并对其结构和功能进行分析预测同时定量检测了四川白鹅种组织中, 的表达量为研究并阐明, 功能以及家禽体内铁稳态的分子机理提供基础数据 ( 材料与方法 )( 试验动物及样品采集月龄性成熟四川白鹅母鹅选自四川农业大学家禽育种场选取只健康四川白鹅颈部放血致死采集心脏肝脏脾脏肾脏肾上腺胸肌腿肌大脑小脑垂体下丘脑卵巢和视网膜共计种组织样品液氮冷冻后置于 C 冰箱保存备用 )*( 总 + 提取及反转录 + 参照 =#!# 试剂盒说明书提取所采集的种组织总 = 参照反转录试剂盒说明书反转录四川白鹅组织总 =. 模板置于 C 冰箱中保存备用根据 0 中原鸡火鸡和斑胸草雀, 序列选取保守区应用 /!' 和 & 设计并合成用于克隆, 编码区的, 和用于实时荧光定量 = 试验的, 引物, 引物为 B%D>>> >>>>D =&&#&D>>>>> >>>DC -(, 引物为 B% D>>>>>>>>>D =&&#& D>>>>>>>>>D C -( 内参基因 '* 引物为 B% D>>>> >>>>>D =&&#& D>> >>>>D C -( = 反应体系为 & K B %=&&#& 引物! 各. 模板无 =#& 水补充至反应条件为 C 预变性 "C 变性 #C 或 C 退火 #C 延伸 # 个循环 C " 取的 = 产物用琼脂糖凝胶电泳检测 ),( 四川白鹅基因克隆 = 产物经琼脂糖凝胶电泳后采用. 凝胶回收纯化试剂盒回收目的片段回收产物与 (. 载体在. 连接酶作用下 C 连接 $ 后将连接产物全部加入感受态细胞进行转化摇菌待感受态细胞复苏后涂布于预先配制在培养皿中的固体培养基表面中含有 ' 的 0> ' 的 '! 和 ' 的 ( 在 C 恒温培养箱中培养 $ 挑取白色的阳性克隆菌落置于液体培养基中摇菌 $ 采用质粒. 提取试剂盒提取质粒 = 鉴定为阳性的质粒送宝生物工程大连有限公司测序 ).( 四川白鹅序列分析, 序列经 0 网站 $ )( "- "! " $' 的 /=BB"%& 查询获得, 编码区序列和氨基酸序列!#) 分析 B 氨基酸序列相似性 )( 在线软件预测, 基因编码蛋白质的理化性质 $ )( &-&(#:'()( 利用 )!& 软件分析 B 氨基酸疏水性 $ )( &-&(#:'()#!&&% )" &&# 蛋白序列分析工具 $ )( -#%)%* #&&# 预测 B 糖基化位点和磷酸化位点利用 /= 软件 $ )( (#)$'+( $)! 对 B 蛋白质进行亚细胞定位分析利用 )" 软件 $) )( $ )##-#-$ '- " B 分析 B 蛋白质的结构域和功能最后利用 > 软件构建 &'$-+" "' 系统进化树 )#)( E

乏完整的 B#" )=)$ B&& 等研究发现, 基因缺失小鼠在胚胎发育 % 后死亡表明, 在小鼠早期发育过程中具有重要作用然而 #&' 等研究发现过表达, 的转基因鼠表现为生长迟缓毛发暂时性的丧失这些研究共同证实, 还具有参与调控动物

3 图四川白鹅, 和 '* 基因的 = 电泳图 B'!&)($&##"!:##=(%)# $" $ )&'#&,"% '*'&"& )( 实时荧光定量 + 用 '* 作为内参基因定量检测种组织样品中, 表达量每个样品设个重复实时荧光定量 = 反应体系 & 0!=#&!# K B% =&&#& 引物! 各. 模板用 =#&B&& 水补充至反应条件为 C 预变性 "C 变性 #C 退火 # C 延伸 # 采集荧光个循环并绘制溶解曲线应用 ) 法对实时荧光定量结果进行分析 )( 数据处理分析应用统计分析软件中的过程进行描述性统计分析 / 过程进行方差分析和."" 多重比较显著水平为 * *( 结果与分析 *)( 四川白鹅和 ( 基因的反转录 + 如图所示 = 扩增目的基因片段大小与预期片段相一致并且条带单一特异性较好说明反转录 = 获得了 -( -( 的, 基因片段和 -( 的 '* 基因片段可用于后续试验 *)*( 四川白鹅氨基酸序列分析生物信息学分析表明四川白鹅, 基因完整编码区为 -( 编码个氨基酸 B 蛋白质分子质量为理论 (0 值分子式为 / 不稳定系数为总平均亲水性为亚细胞定位预测结果表明鹅 B 主要分布于线粒体约占细胞核约占细胞质约占囊泡约占和液泡约占中 B 蛋白质二级结构以螺旋为主约占其次是无规卷曲结构约占延伸链和转角结构比例较少分别为和疏水性分析结果显示 B 氨基酸序列中亲水性区域明显大于疏水性区域 B 属亲水性蛋白质糖基化和磷酸化位点预测结果表明 B 蛋白质中含有个丝氨酸位点分别位于第和位个苏氨酸位点分别位于第和位个酪氨酸位点分别位于第和位氨基酸另外在第位点存在个糖基化位点 *),( 氨基酸序列比对及其结构域四川白鹅 B 氨基酸序列与北京鸭 >. 原鸡人猕猴褐家鼠小家鼠和非洲爪蟾序列相似性分别为和四川白鹅存在个铁蛋白铁离子结合结构域标签和个亚铁氧化酶双铁离子结合位点并且这些结构域的氨基酸序列在人和家禽之间高度保守另外四川白鹅 B 铁蛋白样双铁结构域和铁蛋白结构域在家禽原鸡北京鸭和四川白鹅中高度保守但与人 B 氨基酸序列

模板用 =#&B&& 水补充至反应条件为 C 预变性 "C 变性 #C 退火 # C 延伸 # 采集荧光个循环并绘制溶解曲线应用 ) 法对实时荧光定量结果进行分析 )( 数据处理分析应用统计分析软件中的过程进行描述性统计分析 / 过程进行方差分析

4 四川动物!"#+ 年第 $$ 卷第 # 期&&&&&&&&&&&&&&&&&7" * '(:-% (' &=-0 K $$&>-K #&!"#+ 图!&四川白鹅 fl)氨基酸序列关键功能结构域 f K!&T X : fl) M: 4 0\ 6: 4 `6 &&铁蛋白样双铁结构域$/铁蛋白结构域$&铁蛋白铁离子结合域标签 #$ & &铁蛋白铁离子结合域标签!$( 亚铁氧化酶双铁离子结合位点 && f B $/ f B7 0 4$ & f 4 E : #$ && f 4 E :!$( f Q E 47 4 图 $&四川白鹅 fl)系统进化树! N]树" f >$&^6X 4 fl)! N 6E % ] 4 4 " 存在 P 处氨基酸残基的差异& B\ F@JKM系统进化树分析将四川白鹅 fl)氨基酸序列与人'猕猴'褐家鼠'小家鼠'原鸡'北京鸭和非洲爪蟾序列进行比对$ 采用邻接法构建系统进化树& 如图 $ 所示$四川白鹅与北京鸭具有最近的亲缘关系$与原鸡的亲缘关系稍远$与灵长类和啮齿类更远& B\ I@四川白鹅 =组织表达差异图 +&四川白鹅 #$ 种组织中 OLD的相对表达量 f >+&a Z 4 OLD 4 4 #$ : \ 6: 4 `6 L>心脏$ S>肝脏$ \>脾脏$ T>肾脏$ O>肾上腺$ *[>胸肌$ _[> 腿肌$ )a>大脑$ )/>小脑$ ^>垂体$ L^>下丘脑$ G>卵巢$ a>视网膜不同小写字母表示差异显著! Bk"> "P" L>L $ S>S Z $ \>\@ 4$ T>T 74 X $ O>O7 4 $ *[>* 0: $ _[>_6 6 0: $ )a>) E :0$ )/>) E :0$ ^>^ : % X $ 6 0: $ G>GZ X $ a>a 4 "P" * ` ` 4 4 X7 4! Bk"> +! OLD基因 0aNO在所检测的四川白鹅 #$ 种组织中均有表达$且不同组织中 OLD表达量差异明显! 图 +" & 四川白鹅脾脏和视网膜中 OLD的表达量显著高于其他各组织! Bk"> "P" $肝脏'垂体和肾脏 OLD表达量之间无显著差异$但均显著高于肾上腺! Bk"> "P"$而肾上腺 OLD表达量显著高于心脏'下丘脑'大脑'小脑和卵巢组织!Bk"> "P"$在所检测的

$N 6E % ] 4 4 " 存在 P 处氨基酸残基的差异& B\ F@JKM系统进化树分析将四川白鹅 fl)氨基酸序列与人'猕猴'褐家鼠'小家鼠'原鸡'北京鸭和非洲爪蟾序列进行比对$ 采用邻接法构建系统进化树& 如图 $ 所示$四川白鹅与北京鸭具有最近的亲缘关系$与原鸡的亲缘关系稍远$与灵长类和啮齿类更远& B\ I@四川白鹅 =组织表达差异图 +&四川白鹅 #$ 种组织中$

5 四川白鹅组织样品中胸肌和腿肌, 表达量最低,( 讨论本研究获得的四川白鹅, 序列编码个氨基酸在末端比原鸡多个氨基酸而比北京鸭多个氨基酸表明末端的个氨基酸残基对于家禽, 功能不是关键的四川白鹅 B 主要分布于线粒体和细胞核中而细胞质中分布较少而有研究表明大鼠铁蛋白主要定位于细胞质中但线粒体和细胞核中也有铁蛋白存在 -!& 因此有关 B 亚细胞定位结果有待通过试验研究证实四川白鹅 B 存在个磷酸化位点和个糖基化位点表明其具有丰富的翻译后修饰过程!" 四川白鹅 B 氨基酸序列与北京鸭和原鸡序列在以上而与哺乳动物和啮齿动物相似性在以上说明 B 氨基酸序列进化保守细胞内铁过量时铁蛋白可同时识别个 B& L 后者结合于亚铁氧化酶活性中心并被氧化成 B& L 然后 B& L 被转移出亚铁氧化酶活性中心进入到铁蛋白空腔内表面形成矿物化铁核 -%!$ 可见亚铁氧化酶活性中心是保障铁蛋白储存铁离子功能的关键结构域本研究结果表明四川白鹅 B 的个铁蛋白铁离子结合结构域标签和个亚铁氧化酶双铁离子结合位点与人和家禽的完全一致进一步证实 B 亚铁氧化酶活性中心在维持铁蛋白功能中的重要作用另外 B 亚铁氧化酶双铁离子结合位点进化高度保守也说明不同物种铁蛋白储存铁离子的机制是相似的 /")"-&B&%" 虽然四川白鹅, 基因 = 在所检测的种组织中广泛表达但是, 呈现出明显的组织特异性表达脾脏和视网膜中, 的表达量最高而胸肌和腿肌中, 表达量最低脾脏是动物机体重要的免疫器官脾脏中过多的细胞死亡破裂导致铁蛋白释放量增加而且脾脏中巨噬细胞增加也可能增加脾脏中铁蛋白量 /" )"-& 人和鼠脾脏中 B 是优势表达的铁蛋白亚基 "% ">%%% $&"&!% 家禽缺乏 B 本研究发现四川白鹅脾脏, 表达量显著高于其他组织提示家禽, 可能替代 B 发挥形成铁蛋白铁核并长期储存铁离子的功能另有研究发现家禽角膜上皮细胞表达, 但是其主要参与抗氧化调节以避免角膜上皮细胞的. 受损 &,!&: 本研究在四川白鹅视网膜组织中也检测到, 的表达而且其表达量显著高于除脾脏之外的其他组织说明, 对维持视网膜正常结构和功能也具有重要作 % 四川白鹅肝脏肾脏和垂体组织, 呈中度表达这些组织, 表达量之间无显著差异这与等报道的人肾脏和肝脏组织中, 表达量无明显差异的结果相一致四川白鹅肾上腺表达, 并且其表达量显著高于心脏 * 肾上腺铁离子含量较低因此四川白鹅肾上腺, 的高表达可能与其抗氧化功能有关心脏大脑小脑下丘脑和卵巢组织中, 表达量无显著差异但略高于胸肌和腿肌 #" 和 # 研究表明心脏和大脑, 有很高的亚铁氧化酶活性和抗氧化活性并且这两个组织中, 的表达量较高这与本研究结果不一致心脏代谢活动旺盛过多的铁离子可导致慢性氧自由基损伤从而使心脏功能受损 /" )"-& 大脑小脑和下丘脑含有大量神经元 B&% " 等报道神经元也表达, 然而本研究发现四川白鹅心脏大脑小脑和下丘脑, 呈现低度表达其原因有待进一步研究阐明骨骼肌的铁离子含量较少因此四川白鹅胸肌和腿肌中少量表达的, 可能主要参与抗氧化的调控这与!" 等报道的大鼠趾长伸肌胫前肌和比目鱼肌中表达的, 参与调控大鼠肌肉氧化应激但是不参与肌肉动态铁池调控的结论相一致.( 结论本研究克隆并获得了 -( 的四川白鹅, 基因编码区序列 B 氨基酸序列在物种间高度保守尤其是亚铁氧化酶活性位点和铁离子结合结构域与家禽和人的氨基酸序列完全一致另外, 呈组织特异性表达脾脏和视网膜中表达最高而骨骼肌中表达最低, 表达与组织铁离子量之间不存在线性关系说明 B 储存铁离子和抗氧化功能的发挥随组织的不同而不同 ( 参考文献张勇吴建伟付萍等家蝇幼虫血淋巴蛋白组及血淋巴中热稳定蛋白研究四川动物!*$)&&- ""=$&#'" "&&)" " "& ")%)" "!)" "% )'&"&##$ &)- ($:#)

& 因此有关 B 亚细胞定位结果有待通过试验研究证实四川白鹅 B 存在个磷酸化位点和个糖基化位点表明其具有丰富的翻译后修饰过程!

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

:&" "&%&'&"&)"* "#" #&!)&% % #%&# >)&&, -6 &!% ($:#!"% '&"&) "!:##" ())" "'"% &)" ")" ".#($!&!" '#)& &)!# ")&')&% - &)!#&"&!" &!*.%,"," * 7(&'!)" &)" - )")" " #*&!&)!#!&)"#'&" )#-&"')$& >$/.

第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序

第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序河南农业科学王兴涛罗俊滕蔓樊剑鸣鄂巍禹斌刘力张改平利用技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒基因和基因具有高度同源性的预期产物在日龄乳鼠脑内接种种猪