1622 张 海 燕, 等 Bcl 2 相 关 抗 凋 亡 基 因 3 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 抗 肿 瘤 作 用 影 响 的 观 察 自 相 矛 盾 地 激 发 甚 或 新 合 成 抗 凋 亡 因 子, 减 弱 药 物 细 胞 毒 效 应 有 人 证 实, 抗 凋 亡 蛋 白 Bcl 2

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1 中华肿瘤防治杂志 ２００９ 年 １１ 月第 １６ 卷第 ２１ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｎｍｂ Ｖ １６ Ｎ ２１ １６２１ 前沿报道 Ｂ ２ 相关抗凋亡基因 ３ 对蛋白酶体抑制剂 抗肿瘤作用影响的观察 张海燕１ 高雁艳２ 刘宝琴２ 邓娓娓１ 刘国良１ 王华芹２ １ 中国医科大学附属第一医院 老年病科 张海燕 邓娓娓 内分泌科 刘国良 辽宁 沈阳 １１０００１ ２ 中国医科大学基础医学院生化与分子生物教研室 辽宁 沈阳 １１０００１ Ｅ ＢＡＧ３ｐｐ ｂｐ ｍ ｂ 犣犎犃犖犌 犎 狔狀１ 犌犃犗犢狀 狔狀２ 犔犐犝犅狅 狀２ 犇犈犖犌 犠 狑 １ 犔犐犝犌狌狅 犔 狀犵１ 犠犃犖犌 犎狌 狀２ 狇 狇 １ 犉 狉 狊 犃犳犳 犱 犎狅 狊狆 狀犕犱 犮 犝狀 狏 狉 狊 犚 狀 狔 犛犺狀狔狀犵１１０００１ 犘 ２ 犇狆狉 犿狀 狅犳 犅 狅 犮犺犿 狊 狉狔狀犱 犕狅 犮狌 狉犅 狅 狅犵狔 狀犕犱 犮 犝狀 狏 狉 狊 犚 狀 狔 犛犺狀狔狀犵１１０００１ 犘 摘要 目 的 探 讨 Ｂ ２相关抗凋亡基因３ 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ Ｂ ｇ Ｂ ２ ｇ３ ＢＡＧ３ 在 蛋 白 ２ ｇ ＢＡＧ ｍ ｐｐ 酶体抑制 剂 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 中 的 作 用 方 ｂｐ ｍ ｂ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｄ 法 选 取 不 同 组 织 来 源 的 人 肿 瘤 细 胞 系 分 别 ｍ ｂ ｇ ｍ ｗ ｗ ｐ 设 空 白 对 照 组 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 ＭＧ１３２ 处 理 ＭＧ１３２ ｍ ＲＮＡ ｐ ｍ ｗ 组 衣霉素 处 理 组 及 特 异 性 ＢＡＧ３ 随 机 序 列 ＲＮＡ ｗ ｍｂ ＲＮＡ ｐ 核酸 ＲＮＡ 和 错 位 型 ＢＡＧ３ 组 利 用 实 时 定 ＢＡＧ３ ＢＡＧ３ ｍ ＲＮＡ ｇ 量 ＲＴＰＣＲ 法检测各组细胞 ＢＡＧ３ 及葡萄 糖 调 ｍ ＢＡＧ３ Ｔｘｐ ＢＡＧ３ ＢＡＧ３ ｇ 节 蛋 白 ７８ ｇ ｇ ｐ ７８ ＧＲＰ７８ｐｐ ｗ ｂ ｇ ｍ ｇ ＧＲＰ７８ ｍｒｎａ 表 达 流 式 细 胞 仪 ＦＣＭ 检 测 ＦＣＭ ｐ ＰＣＲ ｗ ｍ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｉ 细胞 凋 亡 结 果 与 空 白 对 照 组 相 比 ＭＧ１３２ ＭＧ１３２ ＢＡＧ３ｍＲ ｇ 能显著增加有关细胞 ＢＡＧ３ 基因表达水平 犘 ＮＡｘｐ ｍｐ ｗ ｇ ｐ 犘 ０ ０１ 而衣霉素处理 组 细 胞 ＢＡＧ３ 表 达 变 化 差 ０ ０１ ｍ ＢＡＧ３ｘｐ 犘 异无统计学意义 犘 ０ ０５ 但 明 显 增 加 ＧＲＰ７８ ０ ０５ ｗ ＧＲＰ７８ｘｐ 犘 ｇ 表达 犘 ０ ０１ ＢＡＧ３ 组 细 胞 ＢＡＧ３ 表 达 水 ０ ０１ ＢＡＧ３ ｍ ｍ ｋ 平显 著 低 于 随 机 序 列 核 酸 ＲＮＡ 和 ｍ ＢＡＧ３ ｍｐ ｗ ｍｂ ｍ ＢＡＧ ＢＡＧ３ 组 犘 ０ ０１ ＢＡＧ３ 组 细 胞 凋 亡 率 差 ｇ ｐ 犘 ０ ０１ ＢＡＧ３ ｍ 异有统计学意 义 犘 ０ ０１ 结 论 ＢＡＧ３ 是 影 犘 ０ ０１ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖 ＢＡＧ３ ｐ ｐｐ 响蛋白酶体 抑 制 剂 凋 亡 效 应 的 一 类 破 坏 因 子 ｗ ｍ ｇ ｍ ｗ ｐ ｍ 下调其 表 达 有 望 增 加 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 抗 肿 瘤 ｂ ｗ ｇ ＢＡＧ３ｘｐ ｍ ｇ 活性 ｍ 中华肿瘤防治杂志 １６２１ １６２４ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 １６２１ １６２４ 关键词 基因 Ｂ ２ 基因 肿瘤抑制 酶抑制剂 细胞凋亡 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｇ Ｂ ２ ｇ ｐｐ ｚ ｂ ｐｐ ｍ 中图分类号 Ｒ７３ ３ 文献标识码 Ａ 文章编号 １６７３ ５２６９ ２００９ ２１ １６２４ ０４ 基金项目 国家自然科学基金 ３０８７０５２２ 辽宁省科技攻关 ２ 相关抗凋亡基因 ３ Ｂ ２ Ｂ 作 为 能 与 组 成 复 合 物 的 蛋 白 ＨＳＰ７０ ｇ３ ＢＡＧ３ 项目 ２００７２２５０２１ 被发现 是 一 种 抗 凋 亡 基 因 １２ 有 报 道 证 实 ＢＡＧ３ 通讯作者简介 张海燕 女 辽宁 沈 阳 人 博 士 副 教 授 主 要 能够结合抗细胞凋亡蛋白 Ｂ ２ 在抑制细胞死 亡中与 从事内分泌与代谢性疾病的分子生物学研究工作 其起协同作用 ３５ 近期研究表明 蛋白酶体抑 制剂可 Ｔ ８６ ２４ ８３２８３２５８ 能通过影响许多细胞 死 亡 相 关 信 号 转 导 通 路 促 进 肿 Ｅ ｍ ｚ ｍ ｍ 瘤 细 胞 凋 亡 然 而 新 近 观 察 到 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 也 能

2 1622 张 海 燕, 等 Bcl 2 相 关 抗 凋 亡 基 因 3 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 抗 肿 瘤 作 用 影 响 的 观 察 自 相 矛 盾 地 激 发 甚 或 新 合 成 抗 凋 亡 因 子, 减 弱 药 物 细 胞 毒 效 应 有 人 证 实, 抗 凋 亡 蛋 白 Bcl 2 家 族 成 员 Mcl 1 可 被 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 上 调, 从 而 减 弱 它 们 的 细 [6 7] 胞 毒 活 性 为 此, 本 研 究 检 测 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 对 多 种 组 织 来 源 肿 瘤 细 胞 系 中 BAG3 的 影 响, 并 利 用 RNA 干 扰 技 术 下 调 BAG3 基 因 表 达, 旨 在 探 讨 BAG3 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 中 的 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 细 胞 株 及 其 培 养 人 甲 状 腺 未 分 化 癌 细 胞 系 ARO, 由 日 本 长 崎 大 学 大 学 院 生 物 医 学 研 究 科 山 下 俊 一 先 生 赠 予 人 结 肠 癌 HCT116 人 类 纤 维 肉 瘤 HT1080 人 宫 颈 癌 HeLa 人 乳 腺 癌 MCF7 人 卵 巢 癌 OVCAR8 和 人 神 经 母 细 胞 瘤 SHSY 5Y 细 胞 系 均 购 于 美 国 标 准 生 物 品 收 藏 中 心 (ATCC) 和 欧 洲 标 准 生 物 品 收 藏 中 心 (ETCC) 所 有 细 胞 均 于 含 10% 胎 牛 血 清 DMEM1640(sigma 公 司 ) 培 养 基 37 5% CO 2 饱 和 湿 度 下 培 养,2~3d 传 代 1 次, 选 用 对 数 生 长 期 细 胞 进 行 实 验 1.2 细 胞 分 组 及 干 预 处 理 为 明 确 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 对 肿 瘤 细 胞 中 BAG3 诱 导 作 用 : 设 培 养 液 处 理 空 白 对 照 组 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 处 理 组, 分 别 向 各 组 细 胞 中 加 入 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 (1μmol/L), 作 用 24h; 为 明 确 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 调 节 内 质 网 应 激 是 否 对 BAG3 起 诱 导 作 用 : 设 培 养 液 处 理 空 白 对 照 组 衣 霉 素 处 理 组, 分 别 向 各 组 细 胞 中 加 入 衣 霉 素 (5μg/mL), 作 用 24h; 为 明 确 沉 默 BAG3 表 达 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 细 胞 凋 亡 敏 感 性 的 影 响 : 采 用 微 小 RNA 干 扰 (SmalinterferingRNA,siRNA) 技 术, 设 计 sirna 序 列 :sibag3(aagaaccagcagag GUCACAA) 随 机 序 列 核 酸 (CCGUAUCGUAAG CAGUACU) 和 错 位 sibag3 (simutbag3,aa GAACCAGCAGACCUCACAA); 分 别 设 sibag3 随 机 序 列 核 酸 sirna 和 错 位 型 BAG3 组, 应 用 脂 质 转 染 体 2000, 参 照 有 关 说 明 书 操 作, 分 别 用 sibag3 随 机 序 列 核 酸 sibag3 simutbag3 同 步 进 行 细 胞 转 染 24h 后 ; 以 MG132(1 μmol/l) 或 培 养 液 继 续 培 养 24h 所 有 试 剂 均 购 于 Calbiochem 公 司 1.3 实 时 定 量 RT PCR 法 检 测 各 组 细 胞 BAG3 及 GRP78mRNA 表 达 收 集 各 组 细 胞, 参 照 说 明 书, 采 用 异 硫 氰 酸 肌 法 提 取 总 RNA, 用 的 oligo(dt) 和 superscripti 进 行 逆 转 录, 用 双 标 记 荧 光 探 针 混 合 物 (SYBR Green PCR Mastermix) 在 ABIprism7000 自 动 序 列 分 析 系 统 (Biosystems) 中 进 行 实 时 PCR 分 析, 每 组 重 复 3 次 BAG3 基 因 引 物 特 异 序 列 为 5 ATGCAGCGAT TCCGAACTGAG 3 ( 上 游 ) 和 5 AGGATGAGCAG TCAGAGGCAG 3 ( 下 游 ), 扩 增 产 物 大 小 为 191bp GRP78 基 因 引 物 特 异 序 列 为 5 GTTCTTGCCGT TCAAGGTGG 3 ( 上 游 ) 和 5 TGGTACAGTAA CAACTGCATG 3 ( 下 游 ); 扩 增 产 物 大 小 为 181bp β actin 作 为 内 参 照, 其 引 物 特 异 序 列 为 5 GAGAC CTTCAACACCCCAGCC 3 ( 上 游 ) 和 5 GGATCT TCATGAGGTAGTCAG 3 ( 下 游 ); 扩 增 产 物 大 小 为 205bp 1.4 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 用 胰 蛋 白 酶 消 化 并 收 集 各 组 细 胞, 以 PBS 清 洗 2 次, 加 入 膜 联 蛋 白 V 和 碘 化 丙 啶 双 标 记 试 剂 (BD 生 命 科 学 公 司 ), 按 试 剂 盒 说 明 书 对 样 本 进 行 处 理 后, 避 光 15min 通 过 流 式 细 胞 仪 (FCM,BD 公 司 的 FAC Scan) 检 测 细 胞 凋 亡, 每 一 组 至 少 检 测 500 个 细 胞, 重 复 3 次 1.5 统 计 学 方 法 数 据 分 析 采 用 SPSS13.0 软 件, 结 果 以 狓 - ± 狊 表 示 对 各 指 标 进 行 单 因 素 方 差 分 析 (one wayano VA), 检 验 水 准 α= 结 果 2.1 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 对 BAG3 基 因 表 达 的 影 响 实 时 定 量 RT PCR 法 检 测 结 果 表 明, 在 包 括 ARO HCT116 HT1080 HeLa MCF7 OVACR8 和 SHSY 5Y 各 种 组 织 肿 瘤 细 胞 中, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 处 理 组 BAG3mRNA 表 达 水 平 均 不 同 程 度 明 显 高 于 空 白 对 照 组, 犘 <0.01( 图 1A) 2.2 衣 霉 素 对 BAG3 基 因 表 达 的 影 响 实 时 定 量 RT PCR 法 检 测 结 果 表 明, 衣 霉 素 处 理 组 各 种 肿 瘤 细 胞 内 质 网 应 激 标 志 GRP78mRNA 表 达 水 平 显 著 高 于 空 白 对 照 组, 犘 <0.01( 图 1B); 而 BAG3 mrna 表 达 水 平 与 空 白 对 照 组 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05 ( 图 1C) 2.3 sibag3 抑 制 BAG3mRNA 表 达 并 提 高 肿 瘤 细 胞 对 MG132 诱 导 凋 亡 敏 感 性 实 时 定 量 RT PCR 法 检 测 结 果 表 明, 转 染 24h 后,siBAG3 组 细 胞 BAG3 mrna 表 达 水 平 显 著 低 于 随 机 序 列 核 酸 sirna 和 simutbag3 组, 犘 <0.01 ( 图 2A), 表 明 sibag3 封 闭 BAG3 表 达 具 有 特 异 作 用 FCM 检 测 结 果 显 示, 当 sibag3 靶 向 沉 默 BAG3 表 达 后,MG132 诱 导 各 种 细 胞 凋 亡 率 显 著 增 加, 犘 < 0.01( 图 2B) 提 示 下 调 BAG3 表 达 明 显 增 加 细 胞 对 MG132 促 凋 亡 活 性

3 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 11 月 第 16 卷 第 21 期 CHINJCANCERPREV TREAT,November2009,Vol.16 No 低 BAG3 表 达 可 提 高 一 些 恶 性 肿 瘤 细 胞 对 化 疗 药 物 [4,10] 的 凋 亡 反 应, 从 而 提 示 BAG3 具 有 抗 凋 亡 功 能 图 2 sibag3 下 调 BAG3mRNA 提 高 肿 瘤 细 胞 对 图 1 各 组 肿 瘤 细 胞 系 中 BAG3mRNA GRP78mRNA 的 表 达 A: 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 对 BAG3 mrna 表 达 的 影 响 ;B: 衣 霉 素 对 BAG3mRNA 表 达 的 影 响 ;C: 衣 霉 素 对 GRP78 mrna 表 达 的 影 响 数 据 用 狓 - ± 狊 表 示, 与 对 照 组 相 比, 犘 <0.01 MG132 的 敏 感 性 A:siBAG3 下 调 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 诱 导 BAG3 mrna 的 表 达 ; B:siBAG3 促 进 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 数 据 用 狓 - ± 狊 表 示, 与 对 照 组 相 比, 犘 < 讨 论 对 于 多 发 性 骨 髓 瘤 及 某 些 实 体 肿 瘤 治 疗, 蛋 白 酶 [7] 体 抑 制 剂 代 表 了 一 类 很 有 前 景 的 新 兴 抗 肿 瘤 药 物 但 矛 盾 的 是, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 也 会 激 活 某 些 生 存 信 号 途 径 显 而 易 见, 后 者 可 能 减 弱 其 对 肿 瘤 的 细 胞 毒 效 [8 9] 应 因 此, 发 现 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 激 活 的 存 活 信 号 途 径, 对 指 导 设 计 合 理 的 辅 助 治 疗 方 案, 提 高 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 抗 肿 瘤 效 果 具 有 重 要 意 义 具 有 BAG 域 的 分 子 伴 侣 蛋 白 是 一 类 进 化 中 保 守 的 HSP70 结 合 伴 侣 蛋 白, 它 们 以 在 各 种 组 分 之 间 相 互 作 用 为 特 征, 调 节 蛋 白 折 [10] 叠 及 一 些 细 胞 过 程 如 增 殖 和 凋 亡 在 一 些 白 血 病 [3 4,11] 和 实 体 肿 瘤 中 发 现,BAG3 表 达 水 平 增 高, 而 降 本 研 究 首 次 证 实, 来 源 于 不 同 组 织 的 癌 细 胞 中 BAG3 可 被 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 诱 导 有 报 道, BAG3 表 达 可 以 保 护 细 胞 免 受 应 激 危 害, 如 热 休 克 暴 露 于 重 金 属 的 危 害, 即 BAG3 在 抗 应 激 反 应 中 起 作 [3,12] 用 诸 多 证 据 表 明, 内 质 网 应 激 能 够 被 蛋 白 酶 体 [13] 抑 制 剂 诱 导 为 明 确 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 调 节 的 内 质 网 应 激 能 否 对 BAG3 诱 导 起 作 用, 本 研 究 应 用 一 种 公 认 的 内 质 网 应 激 诱 导 剂 衣 霉 素 来 诱 导 内 质 网 应 激, 结 果 并 未 上 调 BAG3 表 达, 这 表 明 BAG3 并 非 对 所 有 应 激 产 生 反 应 作 为 一 种 应 激 诱 导 的 抗 凋 亡 分 子, 本 研 究 推 测,BAG3 诱 导 可 能 代 表 细 胞 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 的 适 应 性 反 应,BAG3 上 调 可 能 减 弱 该 类 药 物 的 抗 肿 瘤 活 性 从 本 研 究 进 而 采 用 微 小 RNA 干 扰 技 术, 通

4 张海燕 等 Ｂ ２ 相关抗凋亡基因 ３ 对蛋白酶体抑制剂抗肿瘤作用影响的观察 １６２４ 过 ＲＮＡ 抑制 ＢＡＧ３ 表 达 得以增 加 了 ＭＧ１３２ 细 胞 毒效应 可见 ＢＡＧ３ 是 应 用 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 中 影 响 凋亡效应的一类破坏因子 本研究结果表明 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 在 转 录 水 平 上 诱导抗凋亡分子 ＢＡＧ３ 表 达 增 加 其 可 能 消 减 凋 亡 级 联反应的某些环节 从而降低该类药物的凋亡效应 而 下 调 ＢＡＧ３ 表 达 可 增 加 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 抗 肿 瘤 活性 参考文献 Ｊ ＪＢ ｐ ｂ ｇ ｂ Ｍ １ ｐｐ Ｃ ｍ ２００４ ２７９ ２６ ２６９１５ ２６９２１ ７ 刘桐宇 叶建新 蛋白酶体抑制剂 治 疗 多 药 耐 药 肿 瘤 机 制 的 研 究 进展 Ｊ 中华肿瘤防治杂志 ２００７ １４ １５ １１８７ １１９０ ８ Ｎ Ａ ＨＦ Ｄ ＣＰ Ｅ ｐ Ｊ Ｍ １ ｐ ｍ ｂ ｐｐ Ｂ ２００５ １０５ ８ ３２５５ ３２６２ ９ ＭｍｇＥ Ｇ Ｘ Ｗ Ｖ Ｍ Ｓ ｍ ｂ ｐ９０ ｐ ｍｐ ｍ ｐ ｂ ｑ ｐ ｍ ｍ ｚ ｍ Ｊ Ｍ Ｃ Ｔ ２００４ ３ ５ ５５１ ５６６ １ Ｄｇ Ｈ Ｐ Ｊ Ｋｍ Ｙ Ｓ ＣＡＩＲ １ ＢＡＧ ３ ｍ １０ ＴｋｍＳ Ｒ ＪＣ Ｍ ｐ ｇ ｇ ｇ ＥＧＦ ｇ ｍｐ ｘ ｗ ｐ ｐ Ｃ ｐ ｇｍｍ ｂｂａｇ ｍ Ｊ Ｎ Ｃ Ｂ ２００１ ３ １０ ｐ Ｈｐ７０ Ｈ ７０ Ｊ Ｏ ｇ ２０００ １９ ３８ ４３８５ ４３９５ ２３７ ２４１ ２ Ａ ｋｋ Ｍ ＲＳ Ｓ Ｉ Ｂ ２ Ｗ ＪＪ １１ Ｃ ｐｐ Ｇ Ａｍｍ Ｍ Ｂ Ａ Ｔ ｐｐ ｂ ｇｐ ｘ ｂ ｍ ｇｗ ＢＡＧ １ｐｐ ＢＡＧ３ ｘｐ ｍ ｍ ｐ Ｊ Ｂ ｍ Ｂ ｐ Ｒ Ｃｍ ｍ ｐ ｐｐ ｍ ｂ ｍ ｐｐ ｍ ２００１ ２８６ ５ １００３ １０１０ ３ Ｌ Ｑ Ｏｚ ｗｆ Ｆ Ｈ Ｔ ｐｐ ｐ ｇ Ｊ ＪＣ Ｅ Ｍ ｂ ２００７ ９２ ３ １１５９ ｇ １１６３ ＢＡＧ ３ ｘｐ ｐ ｂ １２ Ｐｇ Ｍ Ｇ Ｌ Ｒ Ｃ Ｓ Ｒｇ ｂ ｇ Ｊ ＦＥＢＳＬ ２００１ ５０３ ｐ ｍ ｍｐ ｍｂａｇ ３ｇ ｍ ２ ３ １５１ １５７ Ｈｐ７０ Ｊ ＦＥＢＳＬ ２００３ ５４１ １ ３ １１ １５ ４ Ｒｍ Ｍ Ｆ Ｆ Ｍ Ｐｇ Ｇ ＢＡＧ３ｐ １３ ＷｇＨ Ｑ ＤＺＸ Ｚｇ Ｈ Ｙ Ｄ Ｂ ｋ ｍ ｐｐ Ｊ Ｃ ｍｐ ＧＲＰ７８ＣＨＯＰ ｐ ｐ ｍ １０ ３ ３８３ ３８５ Ｄ Ｄ ２００３ Ｊ Ｅ ｇ ２００７ １４８ ｂ ５ Ｌ Ｍ Ｙ ＫｍＳＹ Ｓ ＳＬ Ｒ ｘｐ ７ ３２５８ ３２７０ ｂ ｂ ２ ｂ ｇｐ ｂ ｍ Ｊ ＥｘｐＮ ２００２ １７５ ２ ３３８ ３４６ 收稿日期 ２００９ ０６ １５ 修回日期 ２００９ ０９ ２０ ６ Ｄ Ｍ Ｔｍ Ｌ Ｃ Ａ Ｇ ｍ ｐ ｇ 编辑 刘翠玲 櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥毣 ｍ ｇ ｇ ｐ ｍ ｂ ｇ 櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥毣 櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥毣 动态 简讯 中华临床医师杂志 电子版 征稿征订启事 中华临床医师杂志 电子版 由国家卫生部主管 中华医 学会 主办 是中 国科 技论 文统 计源 期刊 中国科技核心期刊 月刊 国内 刊 号 ＣＮ１１ ９１４７ Ｒ 邮 发 代 号 ８０ ７２８ 以 电 子 版 纸 版 导 读 同 时 面 向 全国公开出版发行 被万方数据 中国知网 美国化学文摘等数据库全文收录 本刊辟有述评 专家笔谈 临床研究 实验研究 综述 短篇论著 临床 经验 病例 报告 视频 讲座 疑 难病例讨论等栏目 欢迎全国医务 工 作 者 投 稿 本 刊 审 稿 高 效 对 国 家 重 大 项 目 各 基 金 项 目 手 术 视 频录像 专家讲座等 优先录用刊登 本刊特别欢迎图片影像资料 丰富 的优 秀稿 件 欢迎 广大 临床 医师 积极投稿并订阅杂志 投稿信箱 北京市 １０００３５ ５０ 信箱 编辑部 收 邮编 １０００３５ Ｅｍ Ｌ １６３ ｍ 电话 ０１０ ６２２１９２１１ 传真 ０１０ ６２２３４７０１ 网址 ｗｗｗ ｍ 櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥毣

5 中华肿瘤防治杂志 ２００９ 年 １１ 月第 １６ 卷第 ２１ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｎｍｂ Ｖ １６ Ｎ ２１ １６２５ 前沿报道 利用 ＭＡＬＤ Ｉ ＴＯＦ ＭＳ 分析 ＲＡＥＢ 型骨髓增生异常 综合征患者血清蛋白质组学特征 钟立业１ 刘天浩２ 耿素霞１ 陆泽生１ 翁建宇１ 吴穗晶１ 罗成伟１ 杜欣１ １ 广东省医学科学院 广东省人民医院肿瘤中心血液科 广东 广州 ５１００８０ ２ 中山大学附属第二医院肿瘤科 广东 广州 ５１０１２０ Ｓ ｍｐ ｍ ｐ ｗ ＲＡＥＢｍ ｍ ｚ ｗ ＭＡＬＤ Ｉ ＴＯＦ ＭＳ ｐ 犣犎犗犖犌犔 狔 １ 犔犐犝犜 狀 犺 狅２ 犌犈犖犌犛狌 狓 １ 犔犝犣 狊 犺 狀犵１ 犠犈犖犌犑 狀 狔狌１ 犠犝犛狌 狀犵１ 犔犝犗 狀犵 狑 １ 犇犝犡 狀１ 犼 １ 犌狌狀犵犱狅狀犵犃犮犱犿狔狅犳 犕犱 犮 犛犮 狀犮 狊 犇狆狉 犿狀 狅犳 犎犿 狅 狅犵狔 犆狀 狉狅犳狅狀犮 狅 狅犵狔 犌狌狀犵犱狅狀犵犌狀 狉 犚 狀 犎狅 狊狆 犌狌狀犵狕犺狅狌５１００８０犘 ２ 犇狆狉 犿狀 狅犳狅狀犮 狅 狅犵狔 犛 犮 狅狀犱犃犳犳 犱 犎狅 狊狆 犛狌狀犢 犛狀犝狀 狏 狉 狊 犚 狀 狔 犌狌狀犵狕犺狅狌５１０１２０ 犘 摘 要 目 的 利 用 铜 螯 合 磁 珠 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｗ Ｍｇ ｇ ＭＢ ＩＭＡＣＣ 和 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 ＩＭＡＣ Ｃ Ｂ ｂ Ｉｍｍｂ ｚ Ｍ Ａ Ｃ ＭＢ Ｃｐ 离 飞 行 时 间 质 谱 ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ 技 ｍｐ ｍｐ ｇ ｍ ｐ ｍ 术 对比 分 析 难 治 性 贫 血 伴 幼 稚 细 胞 增 ｐ ｂ ｍ ｘｐ 多 型 ＲＡＥＢ 骨 髓 增 生 异 常 综 合 征 ｍ ｇ ｇ ｗ ｘ ｂ ｐ ｍ ＭＤＳ 患 者 血 清 蛋 白 质 谱 特 征 寻 找 差 ＲＡＥＢ ｗ ｂ ｍ ｐ ｍ ＭＤＳ ｐ 异表达蛋白 构建 ＲＡＥＢ 型 ＭＤＳ 辅 助 诊 犕犈犜犎犗犇犛 Ｓ ｍ ｍｐ ｗ ｍ１０ｒａｅｂｐ 断的 血 清 蛋 白 质 组 学 模 型 方 法 根 据 １０ ｍ ｋｍ ｐ １０ ｇ ｘ ｍ 性别 及 年 龄 配 比 收 集 ＲＡＥＢ 型 ＭＤＳ ｂ Ｓ ｍ ｐｐ ｗ ｐ ｐ ｗ ｊ 急性髓性白血病 ＡＭＬ 和 正 常 人 的 血 清 ｋ ＭＢ ＩＭＡＣＣ Ｗｇ ｍｐ ｍｐ ｐ 蛋白标本各 １０ 例 利 用 铜 螯 合 磁 珠 进 行 ｚ ｍ ｂ ｍ ｘ ｇ ｐ 蛋白分离 通过 ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ 测定标 ｍ ｐ ｍ ＴＯＦ ＭＳ ｐ ＭＡＬＤＩ 本的蛋白质谱 图 对 比 分 析 差 异 蛋 白 峰 ｇ ＲＡＥＢ ｐ ｍ ＡＭＬ ｐ ｂ 并构 建 诊 断 模 型 结 果 与 正 常 对 照 比 ｇ ｍ ｗ ｂ ｂ ｊ 较 在 ＲＡＥＢ 患者血 清 发 现 ４７ 个 异 常 表 ｂ ｐ ｐ ｋ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｆ ｘｐ 达峰 犘 ０ ０５ 其 中 高 表 达 峰 １６ 个 低 ｐ ｋｗ ｗ ＲＡＥＢｐ ｐ ｇ ｂ 表达峰 ３１ 个 以 ＡＭＬ 患 者 为 疾 病 对 照 ｗ １６ｐ ｐ ｋｗ ｂ ｇ ｘｐ ｊ 获得 ３３ 个 异 常 表 达 峰 犘 ０ ０５ 在 ３１ｐ ｐ ｋｗ ｗ ｋ ＲＡＥＢ 犘 ０ ０５ Ｃｍ ｘｐ ＲＡＥＢ 中呈低表 达 的 １２ 个 呈 高 表 达 的 ｗ ＡＭＬ ３３ ｐ ｐ ｋ ｗ ｐ ｇ ２１ 个 以基 因 遗 传 法 构 建 诊 断 模 型 结 ｗ ２１ｐ ｐ ｋ ｗ １２ｐ ｐ ｋ ｇ ｘｐ 果提示 模 型 的 识 别 准 确 率 均 达 １００ ｗ ｗ ｋ ＲＡＥＢ 犘 ０ ０５ Ｔ ｇ ｍ ｘｐ 敏感性 达 ８９ ４２ 结 论 ＭＢ ＩＭＡＣ Ｃ ｇ ｗ ｂ ｂｇ ｍ ｐｐ ｇ 和 ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ 技 术 平 台 有 助 于 ｐｂ ｍ ｗ １００ ＲＡＥＢ 型 ＭＤＳ 相 关 的 血 清 异 常 表 达 蛋 ｗ ８９ ４２ Ｐ ｗ ＲＡＥＢ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖犛 ＭＡＬＤＩ 白 的 研 究 并 且 能 够 有 效 地 区 分 ＲＡＥＢ ＴＯＦ ＭＳ ｍ ｐ ｑ ｐ 患者 ＡＭＬ 患 者 和 正 常 人 根 据 血 清 差 ＲＡＥＢｂ ｇ ｍ ｍ ｐ ＭＤＳ Ｔ 异蛋白质的组 合 峰 所 构 建 的 诊 断 模 型 可 ＲＡＥＢｐ ｍ ＡＭＬｐ ｂ ｊ 辅助 ＲＡＥＢ 型 ＭＤＳ 的诊断 ｐ ＲＡＥＢ 中华肿瘤防治杂志 １６２５ １６２８ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 １６２５ １６２８ 基金项目 十一五 国家科技支撑计划项目 ２００８ＢＡＩ ６１Ｂ０２ 广东科技计划基金项目 ２００６Ｂ３６００５００９ 通讯作者简介 钟立业 男 辽宁营口人 博士 副主任医师 主要从事髓系肿瘤的基础及临床研究工作 Ｔ ８６ ２０ ８３８２７８１２ ６２１２１ Ｅ ｍ ｚｇ ９９ １６３ ｍ

6 1626 钟 立 业, 等 利 用 MALDI TOF MS 分 析 RAEB 型 骨 髓 增 生 异 常 综 合 征 患 者 血 清 蛋 白 质 组 学 特 征 关 键 词 骨 髓 增 生 异 常 综 合 征 ; 蛋 白 质 组 学 ; 血 蛋 白 质 类 / 分 析 [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] myelodysplasticsyndromes;proteomics;bloodproteins/analytical 中 图 分 类 号 R733.3 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (2009) 骨 髓 增 生 异 常 综 合 征 (myelodysplasticsyn dromes,mds) 是 一 组 常 见 的 血 液 系 统 肿 瘤 性 疾 病, 高 发 于 老 年 人, 其 具 有 鲜 明 的 异 质 性, 临 床 特 征 和 疾 病 发 展 差 异 显 著, 患 者 的 生 存 时 间 可 以 从 10 余 年 到 数 个 星 [1 2] 期 或 数 个 月 MDS 的 诊 断 困 难, 无 论 是 原 来 的 FAB 分 型 还 是 2008 年 的 WHO 分 型, 仍 主 要 依 赖 于 [3] 细 胞 细 胞 学, 临 床 诊 断 缺 少 客 观 性 诊 断 指 标 难 治 性 贫 血 伴 幼 稚 细 胞 增 多 型 (refractoryanemiawithex cessblasts,raeb) 是 MDS 的 一 种 进 展 类 型, 易 转 变 为 急 性 髓 性 白 血 病 (acutemyeloidleukemia,aml), 但 转 白 后 治 疗 困 难, 其 表 现 出 与 新 发 的 AML 明 显 不 同 的 临 床 特 征 ; 而 且 10% ~40% 早 期 的 惰 性 类 型 [1 2] MDS 可 以 转 化 为 RAEB 型 故 本 研 究 以 MDS 的 进 展 型 RAEB 患 者 为 对 象, 应 用 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 (matrix assistedlaserdesorption/ioniza tiontime of flightmassspectrometry,maldi TOF MS) [4] 技 术, 分 析 了 RAEB 型 MDS 的 血 清 蛋 白 质 组 学 特 征, 并 通 过 建 立 诊 断 模 型 的 方 法, 探 索 客 观 的 临 床 诊 断 指 标 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 标 本 所 有 血 清 标 本 均 来 自 广 东 省 人 民 医 院 本 研 究 分 为 RAEB 型 MDS 组 AML 疾 病 对 照 组 及 正 常 对 照 组, 共 30 例, 每 组 均 10 例 MDS 组 及 AML 对 照 组 标 本 为 广 东 省 人 民 医 院 住 院 患 者, 诊 断 标 准 按 照 2001 年 WHO 的 血 液 髓 性 肿 瘤 的 诊 断 及 分 型 标 准 正 常 对 照 组 为 研 究 期 间 的 正 常 体 检 人 员 参 照 RAEB 组 患 者 资 料, 对 照 进 行 性 别 及 年 龄 配 对, 性 别 相 同, 年 龄 相 差 <5 岁, 故 各 组 中 男 性 均 为 6 例, 女 4 例 MDS 组 患 者 平 均 年 龄 63 岁,7 例 RAEBⅠ 和 3 例 RAEBⅡ;AML 组 患 者 平 均 年 龄 62 岁,4 例 确 诊 为 M6 型,6 例 为 M2 型 ; 正 常 对 照 组 平 均 年 龄 58 岁 ; 各 组 患 者 均 无 影 响 血 清 蛋 白 质 含 量 的 其 他 疾 病 试 剂 及 主 要 仪 器 MB IMACCu 试 剂 盒 购 德 国 布 鲁 克 道 尔 顿 公 司 ;AutoFlex MALDI TOF/ TOF 质 谱 仪 产 于 德 国 布 鲁 克 道 尔 顿 公 司 1.2 方 法 血 清 标 本 制 备 晨 起 空 腹, 干 燥 管 采 集 研 究 对 象 静 脉 血 5 ml, 立 即 1500r/min, 离 心 10 min(r= 6cm), 分 装 后 置 于 -80 冰 箱 中 待 用, 避 免 反 复 冻 溶 使 用 时 取 出 分 装 的 血 清 样 品, 冰 上 融 化, r/min, 离 心 10min(r=6cm), 除 去 血 清 中 的 不 溶 物 血 清 蛋 白 分 离 1)4 冰 箱 取 出 磁 珠 试 剂 盒, 取 出 铜 螯 合 磁 珠 悬 浮 液 一 管, 摇 动 混 匀 磁 珠 悬 浮 液 1min;2) 取 出 5μL 磁 珠 加 入 200μL 样 品 管, 再 加 入 50μL 铜 螯 合 磁 珠 结 合 缓 冲 液, 将 样 品 管 放 入 磁 珠 分 离 器, 在 前 后 相 邻 两 孔 间 反 复 移 动 样 品 管 10 次 ;3) 样 品 管 在 磁 珠 分 离 器 上 停 留 20s, 使 磁 珠 富 集 于 管 壁 ; 4) 小 心 吸 去 样 品 管 中 的 溶 液 ;5) 重 复 2~4 步 骤 2 次 ; 6) 向 样 品 管 中 加 入 20μL 铜 螯 合 结 合 缓 冲 液 使 磁 珠 重 新 悬 浮, 再 加 5μL 血 清, 吸 打 至 少 5 次, 混 匀, 室 温 放 置 5min;7) 将 样 品 管 再 放 入 磁 珠 分 离 器 静 置 20s, 使 磁 珠 与 悬 浮 的 液 体 分 开, 吸 去 悬 浮 的 液 体 ;8) 再 向 样 品 管 中 加 入 100μL 铜 螯 合 磁 珠 清 洗 缓 冲 液, 在 磁 珠 分 离 器 前 后 相 邻 两 孔 间 反 复 移 动 样 品 管 10 次 ;9) 样 品 管 在 磁 珠 分 离 器 上 静 置 20s, 吸 去 悬 浮 的 液 体 ;10) 重 复 8~ 9 步 骤 两 次, 最 后 完 全 吸 去 悬 浮 的 液 体 ;11) 从 磁 珠 分 离 器 上 取 下 样 品 管, 并 向 样 品 管 中 加 入 10μL 铜 螯 合 磁 珠 洗 脱 缓 冲 液, 混 匀 贴 壁 的 磁 珠, 反 复 吸 打 10 次 混 匀, 室 温 静 置 5min;12) 样 品 管 放 入 磁 珠 分 离 器, 磁 珠 贴 壁 20s, 磁 珠 与 洗 脱 液 分 离 ;13) 将 洗 脱 下 来 的 多 肽 样 品 溶 液 移 入 干 净 的 0.5 ml 样 品 管, 可 用 于 直 接 质 谱 分 析 或 冻 存 h 之 内 质 谱 分 析 质 谱 检 测 取 磁 珠 处 理 最 后 得 到 的 洗 脱 样 品 溶 液, 先 点 1μL, 室 温 放 干 ; 再 点 1μL 基 质, 室 温 放 干 后 即 可 进 行 质 谱 分 析 ; 每 个 样 品 任 取 16 个 点, 每 个 点 轰 击 50 个 激 光 脉 冲, 共 采 集 800 个 激 光 脉 冲 累 加 得 到 各 个 样 品 的 质 谱 图 用 多 肽 和 蛋 白 的 标 准 混 合 物 进 行 外 标 较 正 质 谱 数 据 的 分 析 和 诊 断 模 型 建 立 应 用 MALDI TOF MS 专 门 的 统 计 分 析 软 件 ClinProTools 进 行 分 析, 首 先 调 入 各 组 样 品 的 数 据, 经 过 谱 图 的 平 滑 和 基 线 扣 除, 产 生 一 张 所 有 样 品 的 平 均 谱 图, 在 该 平 均 谱 图 上 标 出 大 于 一 定 信 噪 比 7 的 谱 峰. 再 对 这 些 谱 峰 的 强 度 在 各 组 进 行 统 计 分 析, 以 方 差 分 析 或 检 验 对 3 组 及 不 同 两 组 间 进 行 比 较, 组 间 差 异 犘 <0.05 的 峰 确 定 为 差 异 有 统 计 学 意 义 按 照 分 析 软 件 所 提 供 的 模 型 构 建 方 法, 分 别 应 用 基 因 遗 传 法, 神 经 网 络 法 及 快 速 分 类 法 建 立 诊 断 模 型, 并 计 算 各 模 型 的 识 别 准 确 率 和 交 叉 验 证 敏 感 性

7 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 11 月 第 16 卷 第 21 期 CHINJCANCERPREV TREAT,November2009,Vol.16 No 结 果 2.1 RAEB 型 MDS 与 正 常 人 比 较 MDS 患 者 和 正 常 对 照 的 血 清 蛋 白 指 纹 图 谱 经 标 准 化 后, 经 peakstatistic 对 两 组 人 群 血 清 中 蛋 白 峰 的 数 量 和 相 对 强 度 进 行 统 计 分 析 比 较 结 果 在 相 对 分 子 质 量 1.02~10.25ku 范 围 内 共 检 测 到 信 噪 比 >7 的 峰 87 个, 其 中 REAB 组 与 正 常 对 照 组 之 间 有 统 计 学 意 义 的 显 著 性 差 异 蛋 白 峰 47 个 ( 犘 <0.05); 其 中 在 RAEB 组 中 的 高 表 达 蛋 白 峰 16 个, 低 表 达 蛋 白 峰 31 个 ( 表 1) 在 RAEB 患 者 中, 分 别 呈 低 表 达 的 1 个 蛋 白 峰 ( ) 和 高 表 达 的 1 个 蛋 白 峰 ( ) 对 比 质 谱 图 ( 图 1) 表 1 与 正 常 对 照 比 较 RAEB 患 者 低 高 表 达 的 蛋 白 质 峰 ( 狓 - ± 狊 ) 相 对 分 子 质 量 异 常 低 表 达 RAEB 组 平 均 蛋 白 峰 面 积 正 常 对 照 组 平 均 蛋 白 峰 面 积 犘 值 ± ±10.02 < ± ±1.41 < ± ±1.91 < ± ±1.19 < ± ±9.55 < 异 常 高 表 达 ± ± E ± ± E ± ± ± ± ± ± 血 清 差 异 蛋 白 质 峰 对 比 谱 图 示 例, 所 显 示 两 差 异 峰 ( 相 对 分 子 质 量 分 别 为 和 ) 在 RAEB 中 均 呈 低 表 达 ( 图 2) 表 2 与 AML 组 比 较 RAEB 组 呈 的 蛋 白 质 峰 ( 狓 - ± 狊 ) 相 对 分 子 质 量 异 常 低 表 达 RAEB 组 平 均 蛋 白 峰 面 积 AML 组 平 均 蛋 白 峰 面 积 犘 值 ± ±5.11 < ± ± E ± ± ± ± ± ± 异 常 高 表 达 ± ± E ± ± ± ± ± ± ± ± 图 2 RAEB 患 者 与 AML 患 者 的 蛋 白 质 谱 图 图 1 RAEB 患 者 与 正 常 对 照 者 的 蛋 白 质 谱 图 2.2 RAEB 型 MDS 与 AML 比 较 RAEB 组 和 AML 组 患 者 的 血 清 蛋 白 指 纹 图 谱 分 析 比 较, 相 对 分 子 质 量 在 1.02~10.25ku 范 围 内 信 噪 比 >7 的 峰 85 个, 根 据 统 计 学 主 要 参 数 分 析,REAB 组 和 AML 组 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义, 蛋 白 峰 33 个 ( 犘 <0.05); 其 中 在 RAEB 组 中 的 高 表 达 蛋 白 峰 21 个, 低 表 达 蛋 白 峰 12 个 ( 表 2) RAEB 患 者 与 AML 2.3 RAEB 诊 断 模 型 构 建 将 RAEB 组 与 正 常 对 照 和 AML 组 共 同 统 计 分 析, 得 到 有 统 计 学 意 义 的 差 异 峰 9 个 ( 犘 <0.05) 按 实 验 方 法 所 述 的 3 种 建 模 算 法, 根 据 这 些 显 著 差 异 峰 构 建 诊 断 模 型 ; 经 分 析 显 示, 基 因 遗 传 算 法 效 率 最 高, 诊 断 模 型 的 识 别 准 确 率 和 交 叉 验 证 敏 感 性 分 别 达 100% 和 89.42%; 构 建 模 型 所 用 的 具 有 统 计 学 显 著 差 异 的 蛋 白 峰 ( 表 3) 3 讨 论 自 从 1994 年 蛋 白 质 组 学 方 法 问 世 以 来, 极 大 地 提 升 了 各 领 域 的 蛋 白 质 研 究 水 平, 对 肿 瘤 性 疾 病 的 研 究 [5 7] 贡 献 尤 为 突 出 利 用 蛋 白 质 组 学 的 技 术 平 台, 人 们 能 够 较 容 易 地 得 到 高 通 量 的 蛋 白 信 息, 有 助 于 筛 选 出 与 疾 病 高 度 相 关 的 特 异 性 蛋 白 质, 进 而 将 其 作 为 一 种 监 测 指 标, 用 于 临 床 的 诊 疗 中 而 且, 在 对 诸 多 疾 病 的

8 1628 钟 立 业, 等 利 用 MALDI TOF MS 分 析 RAEB 型 骨 髓 增 生 异 常 综 合 征 患 者 血 清 蛋 白 质 组 学 特 征 蛋 白 质 组 学 研 究 中 发 现, 不 同 类 型 疾 病 其 特 异 性 蛋 白 [8 9] 质 峰 的 组 合 明 显 不 同 因 此, 发 展 出 通 过 构 建 蛋 白 质 组 学 模 型 对 疾 病 进 行 辅 助 诊 断 及 判 断 预 后 的 方 法, 这 种 模 型 构 建 着 眼 点 于 选 择 具 有 最 佳 诊 断 效 力 的 蛋 白 质 组 合 峰, 而 不 是 评 价 单 个 蛋 白 质 峰 的 诊 断 效 力 此 [10] 方 法 在 MDS 的 研 究 中 也 得 到 了 应 用,Manuel 等 利 用 SELDI TOF MS 方 法, 分 析 了 218 例 MDS 患 者 血 清 蛋 白 质 组 学 的 特 征, 结 果 发 现,MDS 患 者 血 清 蛋 白 质 谱 型 明 显 有 别 于 正 常 人, 具 有 鲜 明 的 特 征 ; 并 发 现 在 进 展 型 MDS(RAEB) 中,CXC 家 族 趋 化 因 子 4 和 CXC 家 族 趋 化 因 子 7, 表 达 明 显 下 降, 也 提 示 了 RAEB 的 异 [10] 质 性 表 3 3 组 对 比 的 差 异 蛋 白 质 峰 ( 狓 - ± 狊 ) 相 对 分 子 质 量 RAEB 组 平 均 蛋 白 峰 面 积 AML 组 平 均 蛋 白 峰 面 积 正 常 对 照 组 平 均 蛋 白 峰 面 积 犉 值 犘 值 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± E ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 作 为 一 种 新 发 展 起 来 的 比 较 蛋 白 质 组 学 技 术, MALDI TOF MS 整 合 了 磁 珠 蛋 白 分 离 和 质 谱 的 优 点, 操 作 简 单, 结 果 的 重 现 性 好, 尤 其 对 某 些 相 对 分 子 质 量 小 的 低 丰 度 蛋 白 的 检 测, 作 用 更 为 明 显 在 本 研 究 中, 我 们 利 用 MB IMAC Cu 和 质 谱 分 析, 发 现 RAEB 患 者 血 清 存 在 着 大 量 的 不 同 于 两 个 对 照 组 的 差 异 表 达 蛋 白, 为 进 一 步 蛋 白 质 鉴 定 及 RAEB 型 MDS 相 关 致 病 分 子 的 研 究 奠 定 了 基 础 ; 同 时 也 证 明 了, MALDI TOF MS 技 术 平 台 可 用 于 MDS 相 关 的 血 清 异 常 表 达 蛋 白 的 研 究 另 外, 本 研 究 结 果 提 示, 与 正 常 人 相 比,RAEB 患 者 血 清 中 蛋 白 表 达 差 异 显 著, 有 力 地 [10] [10] 验 证 了 Manuel 等 的 研 究 结 果 ; 但 与 Manuel 等 的 研 究 方 案 不 同, 本 研 究 增 加 了 AML 疾 病 对 照 组, AML 与 RAEB 的 原 始 细 胞 在 形 态 学 上 十 分 相 像, 而 且 RAEB 最 终 可 以 转 变 为 AML, 临 床 的 鉴 别 诊 断 存 在 着 一 定 的 困 难 本 研 究 结 果 显 示, 两 者 血 清 的 蛋 白 质 谱 存 在 明 显 差 异, 表 明 两 种 疾 病 具 有 各 自 不 同 的 血 清 蛋 白 质 表 达 特 征, 进 而 证 明 血 清 蛋 白 质 组 学 方 法 不 仅 能 够 区 别 RAEB 与 正 常 对 照, 也 可 以 将 AML 与 RAEB 区 分 开 来, 能 够 协 助 诊 断, 并 有 助 于 RAEB 型 MDS 相 关 致 病 蛋 白 的 研 究 根 据 显 著 性 差 异 蛋 白 峰 的 组 合, 本 研 究 构 建 了 RAEB 的 诊 断 模 型 ( 需 通 过 ClinProTools 软 件 完 成 ), 统 计 分 析 提 示, 其 诊 断 的 敏 感 性 及 特 异 性 均 较 高 ; 但 由 于 本 研 究 标 本 量 较 小, 尚 需 进 一 步 扩 大 临 床 病 例, 从 而 使 其 更 加 完 善 cidenceandsurvivalintheunitedstates[j].cancer,2007,109 (8): [2] AulC,GiagounidisA,GermingU.Epidemiologicalfeaturesofmyel odysplasticsyndromes:resultsfromregionalcancersurveysandhos pital basedstatistics[j].intjhematol,2001,73(4): [3] VardimanJW,ThieleJ,ArberDA,etal.The2008revisionof theworldhealthorganization (WHO)classificationofmyeloid neoplasmsandacuteleukemia:rationaleandimportantchanges [J].Blood,2009,114(5): [4] VilanuevaJ,LawlorK,Toledo Crow R,etal.Automatedser umpeptideprofiling[j].natprotoc,2006,1(2): [5] KongF,Nicole WhiteC,XiaoX,etal.Usingproteomicapproa chestoidentifynewbiomarkersfordetectionand monitoringof ovariancancer[j].gynecoloncol,2006,100(2): [6] RenH,DuN,LiuG,etal.Analysisofvariabilitiesofserumpro teomicspectrainpatientswithgastriccancerbeforeandafterop eration[j].worldjgastroenterol,2006,12(17): [7] NakagawaT,HuangSK,MartinezSR,etal.Proteomicprofiling ofprimarybreastcancerpredictsaxilarylymphnodemetastasis [J].CancerRes,2006,66(24): [8] RajcevicU,NiclouSP,JimenezCR.Proteomicsstrategiesfor targetidentificationandbiomarkerdiscoveryincancer[j].front Biosci,2009,14: [9] VilanuevalJ,PhilipJ,DeNoyerL,etal.Dataanalysisofassort edserum peptidomeprofiles[j].natprotoc,2007,2(3): [10] ManuelA,DimitriosS,UlrichG,etal.Serumproteomeprofi lingdetectsmyelodysplasticsyndromesandidentifiescxcche mokineligands4and7as markersforadvanceddisease[j]. PNAS,2007,104(4): 参 考 文 献 [1] MaX,DoesM,RazaA,etal.Myelodysplasticsyndromes:in 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 王 秀 华 )

9 中华肿瘤防治杂志 ２００９ 年 １１ 月第 １６ 卷第 ２１ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｎｍｂ Ｖ １６ Ｎ ２１ １６２９ 流行病学研究 广西肝癌高发区人群 ＸＲＣＣ３ 基因多态性 与肝癌易感性研究 曾小云 余红平 仇小强 纪龙 李龙? 广西医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室 广西 南宁 ５３００２１ Ｃ ｐ ｍ ＤＮＡ ｐ ｇｘｒｃｃ３ｗ ｐ ｂ ｐ ｍ ｐ ｍ ｇ Ｇｇｘ ｇｈｃｃ 犣犈犖犌犡 狅 狔狌狀 犢犝 犎狅狀犵 狆 狀犵 犙犐犝犡 狅 狀犵 犑犐犔狅狀犵 犔犐犔狅狀犵 犿狀 狇 犇狆狉 犿狀 狅犳 犈狆犱犿 狅 狅犵狔狀犱 犎 犺犛 狊 犮 狊 犛犮犺狅 狅 狅犳 犘狌犫 犮犎 犺 犌狌狀犵狓犕犱 犮 犝狀 狏 狉 狊 狔 犖狀狀 狀犵５３００２１ 犘 犚 狀 摘要 目 的 探 讨 ＸＲＣＣ３ 基 因 多 态 性 与 广 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔｘｐ ｐ ｂ 西肝癌高发区人群肝癌易感 性 的 关 系 方 法 ｗ ｐ ｍ ＸＲＣＣ３ ｐ ｂ ｐ ｍ ｐ 采用以医 院 为 基 础 的 病 例 对 照 研 究 方 法 选 ｍ ＨＣＣ ｇ ｇ ＨＣＣ 择来自广 西 肝 癌 高 发 区 的 肝 癌 新 发 病 例 ５４５ Ｇｇｘ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｔ ｗ ｇ 例 对照组按年龄 性别频数匹 配 且 与 病 例 来 ｂ ｐ ５４５ｗ ｐ ｇ 自相同地区 的 非 肿 瘤 患 者 ５１５ 例 运 用 高 通 ｇ ＨＣＣ ｐ ｍ ＨＣＣ ｇ 量的 ＴｑＭ ＭＧＢ 荧 光 定 量 实 时 ＰＣＲ 实 验 Ｇｇｘ ｗ Ａ５１５ ｐ 方法 检测 ＸＲＣＣ３ ２４１ 位点 单 核 苷 酸 多 态 性 ｗ Ｔ ｗ ｍ 比较其不 同 基 因 型 与 肝 癌 易 感 性 的 关 系 结 ｘ ｂ Ｔ ｐ ｍ ｍ ｇ ｍ ｐ 果 本研究共 纳 入 符 合 要 求 资 料 完 整 的 肝 癌 ＸＲＣＣ３ｇ ｗ ｍ ｗ ｘ ＴｑＭ ＭＧＢ ｇ 病例组 ５００ 例 对照组 ５０７ 例 ＸＲＣＣ３ ２４１ 位 ｑ ｍｐｃｒ ｍ 犚犈犛犝犔犜犛 Ａ 点 ３ 种基因型 ＣＣ ＣＴ 和 ＴＴ 在 病 例 组 的 分 布 １００７ ｑ ｐ ｗ ｍｐ ｍ 频率分 别 为 ８５ ８ １３ ２ 和 １ ０ 在 对 照 ｗ ｗ ５００ ｇ ｐ５０７ 组的 分 布 频 率 分 别 为 ８７ ２ １１ ８ 和 Ｔ ｂ ＸＲＣＣ３ ２４１ ＣＣ ＣＴ ｑ ２ １ ０ 但两组差异无统 计 学 意 义 ４３１ χ ０ ＴＴ ｗ ８５ ８ １３ ２ １ ０ ｇ ｐ ｐ 犘 ０ ８０６ ＸＲＣＣ３ ２４１ 基 因 多 态 性 与 ＨＣＣ ｍｐ ｗ ８７ ２ １１ ８ １ ０ 在调整民族 年 龄 性 别 职 业 吸 烟 和 饮 酒 状 ｗ ｂ ｇ ｐ Ｓ 态等因素 前 后 均 无 统 计 学 关 联 按 是 否 有 肝 ｇ ｗ ｗ ｐ ｍｋ 炎病史 吸烟 饮酒和是否有 ＨＢＡｇ 慢性感染 ｋ ｇ ＨＢＡｇｐ ｋ ｇｇ ｐ ｗ 进行分层 均 未 能 发 现 ＸＲＣＣ３ ２４１ 基 因 多 态 Ｓ ｍｋ ｇ ＯＲ ７ ９４９ ＣＩ ２ ３０８ ２７ ３８２ 性 与 ＨＣＣ 发 病 风 险 有 关 与 吸 烟 饮 酒 和 ｋ ｇ ＯＲ ５ ９５０ ＣＩ ２ ５５４ １３ ８６５ ＨＢＡｇ ＨＢＡｇ 慢性感染 ３ 种环境 危 险 因 素 均 存 在 交 ＯＲ ２４ ７０９ ＣＩ １１ ８６１ ５１ ４７７ ｘ 互作用 ＯＲ 值分 别 为 ７ ９４９ ２ ３０８ ２７ ３８２ ｂ ｗ ＸＲＣＣ３ｇｐ ｍ ｍ ｐ ５ ９５０ ２ ５５４ １３ ８６５ 和 ２４ ７０９ １１ ８６１ ｍ ｋ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖犛 Ｎ ｇ ５１ ４７７ 结论 ＸＲＣＣ３ ２４１ 基因多态性与肝癌 ｂ ｗ ＸＲＣＣ３ ２４１ｐ ｍｈｃｃ Ｍｂ ｍ ｐ 易感性无关联 可 能 不 是 广 西 肝 癌 高 发 区 人 群 ｋ ＨＣＣ Ｇｇｘ ｐｐ ｇ 的高危因素 但存在基因与环境的交互作用 ｂ ｂ ｗ ｇ ｍ 中华肿瘤防治杂志 １６２９ １６３３ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 １６２９ １６３３ 基金项目 国家自然科学基金 ３０６６０１６２ 广西科 技 厅 青 年 基 金 项 目 桂 科 青 ０７２８０６６ 广 西 科 学 研 究 与 技 术 开 发 计划 桂科攻 ０７１９００６ ２ １３ 第一作者简介 曾小云 女 湖南邵阳人 博士 副教授 主要从事慢性病预防与控制的研究工作 Ｔ ８６ ７７１ ５３５８８４７ Ｅ ｍ ｚｘｘ ｍ ｊｗ ２１ 通讯作者简介 余红平 女 河南桐柏人 博士 教授 主要从事分子流行病学和慢性病流行病学的研究工作 Ｔ ８６ ７７１ ５３５８８４７ Ｅ ｍ ｍ ｐ２６８ １６３

10 1630 曾 小 云, 等 广 西 肝 癌 高 发 区 人 群 XRCC3 基 因 多 态 性 与 肝 癌 易 感 性 研 究 关 键 词 肝 肿 瘤 / 流 行 病 学 ; 广 西 [ 壮 族 自 治 区 ]/ 流 行 病 学 ;DNA 修 复 ; 多 态 现 象 ( 遗 传 学 ); 疾 病 易 感 性 [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] liverneoplasms/epidemiology;guangxi/epidemiology;dnarepair;polymorphism(genetics);disease susceptibility 中 图 分 类 号 R735.7;R73-31 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (2009) 广 西 是 我 国 肝 癌 (hepatocelularcarcinoma, HCC) 的 高 发 区, 其 死 亡 率 为 27.31/10 万, 高 居 广 西 肿 瘤 死 因 谱 首 位 以 往 研 究 表 明 肝 癌 的 主 要 环 境 危 险 因 素 包 括 慢 性 乙 型 丙 型 肝 炎 病 毒 感 染 食 物 中 AFB1 的 摄 入 等 但 是, 面 临 同 样 的 暴 露 因 素, 如 同 样 的 水 源 粮 食 中 同 样 的 AFB1 污 染, 也 只 有 少 数 一 部 分 人 罹 [1] 患 肝 癌 研 究 表 明,DNA 修 复 基 因 的 单 核 苷 酸 多 态 性 (singlenucleotidepolymorphism,snp) 可 导 致 个 体 [2] 发 生 癌 症 的 危 险 性 增 高 人 类 X 线 修 复 交 叉 互 补 基 因 3(X rayrepaircross complementing group3, XRCC3) 主 要 参 与 DNA 双 链 断 裂 / 重 组 修 复, 它 的 突 [3] 变 或 缺 失 可 增 加 机 体 对 DNA 损 伤 因 子 的 易 感 性 位 于 XRCC3 第 七 外 显 子 位 核 苷 酸 的 C T 突 变 使 第 241 位 密 码 子 由 含 氢 基 的 苏 氨 酸 残 基 (Thr) 变 为 含 硫 的 蛋 氨 酸 残 基 (Met), 前 者 可 能 对 维 持 蛋 白 的 正 常 构 象 有 重 要 作 用 XRCC3Met/Met 基 因 型 在 不 同 类 型 肿 瘤 中 作 用 不 同, 能 明 显 地 增 加 乳 腺 癌 的 发 病 风 险, 与 头 颈 部 膀 胱 肿 瘤 无 关, 而 降 低 非 黑 色 素 瘤 皮 肤 癌 的 发 病 风 险 本 研 究 探 讨 XRCC3 241 多 态 性 与 肝 癌 的 易 感 性, 并 进 一 步 分 析 XRCC3 241 位 点 各 基 因 型 与 环 境 因 素 在 肝 癌 发 生 中 的 交 互 作 用, 为 进 行 肝 癌 的 一 二 级 预 防 提 供 参 考 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 研 究 对 象 采 用 以 医 院 为 基 础 的 病 例 对 照 研 究 方 法 所 有 研 究 对 象 来 自 具 有 相 似 暴 露 背 景 的 广 西 肝 癌 高 发 区 广 西 南 部 地 区 的 扶 绥 县 武 鸣 县 和 隆 安 县 等 病 例 组 选 择 参 照 在 广 州 召 开 的 第 八 届 全 国 肝 癌 学 术 会 议 上 正 式 通 过 的 原 发 性 肝 癌 的 临 床 诊 断 与 分 期 标 准, 来 自 广 西 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 (500 例 ) 广 西 中 医 学 院 第 一 附 属 医 院 (45 例 ) 住 院 的 并 同 意 参 与 调 查 经 组 织 学 病 理 确 诊 未 接 受 化 疗 和 放 射 治 疗 的 HCC 新 发 病 例, 共 收 集 HCC 患 者 545 例 ; 对 照 组 选 自 同 一 医 院 同 期 住 院 的 脊 柱 骨 科 和 创 伤 外 科 并 且 无 肿 瘤 家 族 史 的 非 肿 瘤 患 者, 按 年 龄 性 别 频 数 匹 配, 且 与 病 例 来 自 相 同 地 区 并 且 居 住 >10 年, 共 收 集 对 照 515 例 1.2 方 法 现 场 调 查 采 用 统 一 的 调 查 表, 经 患 者 知 情 同 意 后, 由 经 过 专 门 培 训 的 调 查 员 对 研 究 对 象 进 行 面 对 面 调 查 内 容 包 括 基 本 情 况 既 往 史 个 人 史 家 族 史 吸 烟 史 和 饮 酒 史 等 并 于 研 究 对 象 入 院 次 日 清 晨 采 集 空 腹 静 脉 血 3 ml, 置 于 真 空 ACD 抗 凝 管 中, 混 匀 备 用, 于 当 日 提 取 基 因 组 DNA 基 因 分 型 采 用 常 规 酚 / 氯 仿 法 提 取 基 因 组 DNA,- 20 保 存 备 用 XRCC3 Thr241Met (rs861539) 基 因 分 型 应 用 TaqMan MGB 荧 光 定 量 实 时 PCR 技 术,PCR 反 应 体 系 总 体 积 为 25μL, 包 括 2 TaqMan UniversalPCR Mix μl 20 SNP GenotypingAssayMix1.25μL 模 板 DNA1.00μL H 2O10.25μL PCR 反 应 条 件 为 min (92 15s 60 1 min) 40 个 循 环 基 因 分 型 试 剂 盒 7500Fast 实 时 定 量 PCR 仪 及 基 因 分 型 分 析 软 件 均 购 于 美 国 应 用 生 物 系 统 (ABI) 公 司 1.3 质 量 控 制 1) 调 查 表 是 在 广 泛 查 阅 文 献 的 基 础 上 并 结 合 临 床 实 际 设 计 的, 并 经 过 预 调 查 ( 病 例 对 照 各 调 查 20 例 ) 修 订 而 成 ;2) 调 查 征 得 研 究 对 象 的 同 意 后, 由 经 严 格 专 门 培 训 的 调 查 员 按 照 统 一 方 法 进 行 调 查 ;3) 实 验 严 格 按 操 作 规 程 进 行, 并 在 所 有 样 品 中 随 机 抽 取 5% 的 样 本 进 行 重 复 检 测, 检 测 结 果 一 致 率 为 100%;4) 对 实 验 中 不 能 分 型 的 样 品, 可 结 合 实 时 定 量 PCR 的 结 果 来 寻 找 原 因, 然 后 重 复 检 测, 重 复 检 测 不 出 结 果 的 样 本 剔 除 1.4 统 计 学 方 法 应 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 统 计 分 析 样 本 均 数 的 比 较 采 用 检 验, 计 数 资 料 的 比 较 采 用 χ 2 检 验 或 确 切 概 率 法 以 比 值 比 (oddsratio,or) 及 其 95% 可 信 区 间 (confidenceinterval,ci) 表 示 相 对 危 险 度,OR 及 其 95%CI 因 素 间 的 交 互 作 用 以 非 条 件 Logistic 回 归 模 型 进 行 分 析 所 有 统 计 检 验 均 为 双 侧 概 率 检 验, 检 验 水 准 α= 结 果 2.1 研 究 对 象 的 一 般 情 况 本 研 究 共 收 集 到 符 合 要 求 资 料 完 整 的 病 例 组 和 对 照 组 共 1007 例, 其 中 病 例 组 500 例, 对 照 组 507 例 所 有 研 究 对 象 来 自 广 西 南 部 地 区, 年 龄 20~83 岁, 病 例 组 平 均 年 龄 (48.73 士 11.08) 岁, 对 照 组 平 均

11 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 11 月 第 16 卷 第 21 期 CHINJCANCERPREV TREAT,November2009,Vol.16 No 年 龄 (48.86 士 11.19) 岁, 两 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05 病 例 组 男 394 例, 女 106 例 ; 对 照 组 男 374 例, 女 133 例, 两 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05 病 例 组 与 对 照 组 在 民 族 婚 姻 状 况 及 职 业 方 面 差 异 均 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05( 表 1) 表 1 病 例 组 和 对 照 组 的 一 般 情 况 比 较 狀 (%) 变 量 病 例 组 ( 狀 =500) 对 照 组 ( 狀 =507) 犘 值 年 龄 ( 狓 - ± 狊 ) 48.73± ± 性 别 女 106(21.2) 133(26.2) 男 394(78.8) 374(73.8) 民 族 汉 378(75.6) 360(71.0) 壮 119(23.8) 140(27.6) 其 他 3(0.6) 7(1.4) 婚 姻 状 况 未 婚 13(2.6) 12(2.4) 已 婚 486(97.2) 493(97.2) 其 他 1(0.2) 2(0.4) 职 业 工 人 70(14.0) 63(12.4) 农 民 162(32.4) 203(40.0) 公 务 员 72(14.4) 56(11.0) 教 师 44(8.8) 31(6.2) 其 他 152(30.4) 154(30.4) 2.2 XRCC3 基 因 多 态 性 分 布 和 HCC 的 关 联 XRCC3 241 位 点 3 种 基 因 型 CC CT 和 TT 在 病 例 组 的 分 布 频 率 分 别 为 85.8% 13.2% 和 1.0%, 在 对 照 组 的 分 布 频 率 分 别 为 87.2% 11.8% 和 1.0%, 但 两 组 差 异 无 统 计 学 意 义, χ 2 =0.431, 犘 =0.806 XRCC3 241 位 点 C 和 T 等 位 基 因 频 率 在 病 例 组 中 分 别 为 92.4% 和 7.6%, 在 对 照 组 中 分 别 为 93.1% 和 6.9%, 等 位 基 因 频 率 在 病 例 组 和 对 照 组 中 的 分 布 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05 XRCC3 241 基 因 多 态 性 与 HCC 在 调 整 民 族 年 龄 性 别 职 业 吸 烟 和 饮 酒 状 态 等 因 素 前 后 差 异 均 无 统 计 学 关 联 ( 表 2) 2.3 分 层 分 析 按 是 否 有 肝 炎 病 史 吸 烟 饮 酒 和 是 否 有 HBsAg 慢 性 感 染 进 行 分 层, 均 未 能 发 现 XRCC3 241 基 因 多 态 性 与 HCC 发 病 风 险 有 关 ( 表 3) 2.4 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 的 交 互 作 用 分 析 利 用 叉 生 分 析 原 理, 分 别 计 算 同 时 暴 露 于 遗 传 与 环 境 因 素 或 单 独 暴 露 于 遗 传 或 环 境 因 素 的 危 险 性, 即 OR 值, 遗 传 与 环 境 因 素 均 未 暴 露 的 病 例 和 对 照 组 作 为 共 同 参 比 组, 即 OR=1, 从 而 判 别 基 于 不 同 模 型 的 两 因 素 间 交 互 作 用 是 否 存 在 及 其 作 用 大 小 通 过 对 XRCC3 241 基 因 多 态 性 与 肝 癌 家 族 史 吸 烟 饮 酒 和 HBsAg 慢 性 感 染 等 可 疑 危 险 因 素 进 行 叉 生 分 析, 结 果 显 示, 该 多 态 位 点 分 别 与 吸 烟 饮 酒 和 HBsAg 慢 性 感 染 3 种 环 境 危 险 因 素 均 存 在 交 互 作 用 ( 因 为 有 肝 癌 家 族 史 在 对 照 组 中 只 有 1 例, 所 以 没 能 做 进 一 步 分 析 ) 具 体 结 果 见 表 4 表 2 XRCC3 241 基 因 型 构 成 与 HCC 的 关 联 分 析 XRCC3 241 基 因 型 病 例 组 狀 (%) 对 照 组 狀 (%) OR a (95% CI) OR b (95%CI) CC 429(85.8) 442(87.2) CT 66(13.2) 60(11.8) 0.971(0.279~3.376) 0.456(0.067~3.082) TT 5(1.0) 5(1.0) 1.100(0.303~3.988) 0.277(0.037~2.080) CT/TT 71(14.2) 65(12.8) 1.125(0.784~1.616) 0.682(0.352~1.320) 注 :a: 粗 OR 值 ;b: 校 正 OR 值 ; 校 正 因 素 为 民 族 年 龄 性 别 职 业 吸 烟 和 饮 酒 状 态 3 讨 论 本 研 究 建 立 在 以 医 院 为 基 础 的 病 例 对 照 研 究 上, 选 择 具 有 相 似 暴 露 背 景 的 中 国 广 西 肝 癌 高 发 区 人 群 为 研 究 对 象, 样 本 量 较 大, 病 例 组 和 对 照 组 在 年 龄 性 别 民 族 职 业 和 婚 姻 状 况 等 方 面 均 衡 可 比 采 用 高 通 量 的 TaqMan MGB 荧 光 定 量 实 时 PCR 实 验 方 法 检 测 XRCC3 241 位 点 SNP, 研 究 过 程 质 量 控 制 严 格, 分 析 过 程 引 入 了 多 因 素 Logistic 分 析 和 分 层 分 析, 并 考 虑 了 基 因 环 境 交 互 作 用 的 影 响, 探 讨 了 DNA 修 复 基 因 XRCC3 241 单 核 苷 酸 多 态 性 与 HCC 易 感 性 XRCC3Thr241Met 突 变 等 位 基 因 频 率 范 围 为 5%~45%, 本 研 究 发 现 XRCC3 241 位 点 T 等 位 基 因 频 率 为 6.9%, 与 Hapmap 计 划 数 据 显 示 XRCC3 241 位 点 T 等 位 基 因 在 中 国 北 京 汉 族 人 群 中 的 分 布 频 率 (6.7%) 相 近 而 与 国 外 研 究 报 道 结 果 不 一 致, 波 兰 人 为 33% [4], 美 国 黑 人 为 22.2% [5], 意 大 利 人 为 35% [6], 均 明 显 高 于 中 国 汉 族 人 群 说 明 XRCC3 241 位 点 T 等 位 基 因 在 不 同 种 族 中 的 分 布 频 率 存 在 差 异 XRCC3 基 因 目 前 被 高 度 怀 疑 为 癌 症 遗 传 易 感 相 [7] 关 候 选 基 因 之 一, 也 是 DNA 损 伤 修 复 中 的 一 个 重 要 基 因, 但 其 与 肿 瘤 发 生 之 间 的 确 切 关 系 及 具 体 机 制 尚 不 清 楚 关 于 XRCC3Thr241Met 多 态 与 肿 瘤 易 感 性 的 研 究 已 有 不 少 报 道, 但 相 关 研 究 结 果 并 不 一 致

12 1632 曾 小 云, 等 广 西 肝 癌 高 发 区 人 群 XRCC3 基 因 多 态 性 与 肝 癌 易 感 性 研 究 [8] Lee 等 的 Meta 分 析 表 明,XRCC3 Thr/Met 和 Met/Met 只 是 微 弱 地 提 高 了 乳 腺 癌 的 危 险 性 (OR= 1.08,95%CI:1.00~1.17), 以 上 研 究 表 明,XRCC3 [7] 基 因 可 能 是 一 个 低 外 显 率 癌 症 遗 传 易 感 基 因 但 也 有 研 究 表 明,XRCC3 241 基 因 多 态 使 头 颈 部 鳞 状 细 胞 癌 发 病 风 险 增 加, 与 肺 癌 非 黑 色 素 皮 肤 癌 无 关 联, 在 乳 腺 癌 前 列 腺 癌 结 肠 癌 和 黑 色 素 皮 肤 癌 研 究 中 得 到 [9] 了 矛 盾 的 结 果 本 研 究 中,XRCC3 241 位 点 3 种 基 因 型 CC CT 和 TT 在 病 例 组 的 分 布 频 率 分 别 为 85.8% 13.2% 和 1.0%, 在 对 照 组 的 分 布 频 率 分 别 为 87.2% 11.8% 和 1.0%, 但 两 组 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05, 按 是 否 有 肝 炎 病 史 是 否 吸 烟 是 否 饮 酒 和 是 否 有 HBsAg 慢 性 感 染 进 行 分 层 分 析 以 及 多 因 素 Logistic 回 归 分 析 结 果 显 示,XRCC3 241 基 因 多 态 与 HCC 发 病 风 险 无 关 由 于 XRCC3 241 基 因 多 态 在 人 群 的 发 生 频 率 较 低, 且 不 同 种 族 人 群 突 变 频 率 存 在 差 异, 目 前 未 见 XRCC3 241 基 因 多 态 与 HCC 易 感 性 相 关 研 究 文 献 报 道, 它 们 之 间 是 否 有 真 实 关 联 有 待 进 一 步 在 不 同 人 群 中 的 大 样 本 研 究 表 3 按 有 无 肝 炎 病 史 吸 烟 饮 酒 和 HBsAg 慢 性 感 染 分 层 分 析 XRCC3 241 基 因 型 与 HCC 的 关 系 变 量 基 因 型 狀 对 照 ( 狀 ) 犘 值 OR 总 OR 95%CI 肝 炎 病 史 无 CC CT/TT 有 CC CT/TT 53 3 吸 烟 无 CC CT/TT 有 CC CT/TT 17 3 饮 酒 无 CC CT/TT 有 CC CT/TT 27 7 HBsAg 慢 性 感 染 无 CC CT/TT 有 CC CT/TT ~ ~ ~ ~1.449 表 4 XRCC3 241 多 态 与 肝 癌 家 族 史 吸 烟 饮 酒 和 乙 肝 表 面 抗 原 阳 性 的 交 互 作 用 分 析 因 素 狀 对 照 ( 狀 ) 犘 值 OR(95%CI) 家 族 史 (-)+CC 家 族 史 (-)+CT/TT (0.708~ 1.514) 家 族 史 (+)+CC (7.815~ ) 家 族 史 (+)+CT/TT 吸 烟 (-)+CC 吸 烟 (-)+CT/TT (0.823~ 1.814) 吸 烟 (+)+CC (3.152~ 6.572) 吸 烟 (+)+CT/TT (2.308~ ) 饮 酒 (-)+CC 饮 酒 (-)+CT/TT (0.767~ 1.785) 饮 酒 (+)+CC (4.156~ 8.649) 饮 酒 (+)+CT/TT (2.554~ ) HBsAg(-)+CC HBsAg(-)+CT/TT (0.418~ 1.563) HBsAg(+)+CC (16.958~35.397) HBsAg(+)+CT/TT (11.861~51.477)

13 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 11 月 第 16 卷 第 21 期 CHINJCANCERPREV TREAT,November2009,Vol.16 No 有 研 究 显 示, 单 独 突 变 基 因 型 对 肿 瘤 危 险 性 或 许 并 不 明 显, 但 是 携 带 突 变 基 因 者 暴 露 于 环 境 危 险 因 素 后 可 能 发 生 肿 瘤 的 危 险 性 极 大 提 高, 环 境 因 素 可 能 通 过 基 因 突 变 的 机 制 来 影 响 肿 瘤 的 发 生 本 研 究 结 果 显 示,XRCC3 241 基 因 多 态 性 分 别 与 吸 烟 饮 酒 和 HB sag 慢 性 感 染 3 种 环 境 危 险 因 素 均 存 在 交 互 作 用 烟 草 中 含 有 多 种 有 毒 有 害 物 质 并 可 产 生 活 性 氧 化 自 由 基, 从 而 可 导 致 DNA 双 链 断 裂, 该 损 伤 由 包 括 XRCC3 在 内 的 DSBR 系 统 修 复 本 研 究 发 现, 吸 烟 且 携 带 XRCC3 变 异 基 因 型 的 个 体 罹 患 HCC 的 风 险 是 不 吸 烟 且 携 带 CC 基 因 型 个 体 的 7.95 倍 饮 酒 是 肝 癌 的 重 要 危 险 因 素 之 一, 已 知 乙 醇 在 体 内 的 代 谢 过 程 主 要 为 乙 醇 转 化 为 乙 醛, 乙 醛 转 化 为 乙 酸, 乙 醛 已 被 证 实 有 明 显 的 致 癌 作 用 本 研 究 发 现, 饮 酒 且 携 带 XRCC3 变 异 基 因 型 的 个 体 罹 患 HCC 的 风 险 是 不 饮 酒 且 携 带 CC 基 因 型 个 体 的 5.95 倍 HBV 感 染 作 为 HCC 的 主 要 病 因 已 被 世 界 公 认, 估 计 全 球 60% ~ [10] 80% 的 HCC 由 HBV 引 起, 本 研 究 发 现,HBsAg 慢 性 感 染 且 携 带 XRCC3 变 异 基 因 型 的 个 体 罹 患 HCC 的 风 险 是 无 HBsAg 慢 性 感 染 且 携 带 CC 基 因 型 个 体 的 24.7 倍 交 互 作 用 分 析 的 结 果 对 制 定 肝 癌 的 一 级 预 防 非 常 重 要, 可 以 根 据 基 因 与 环 境 因 素 交 互 作 用 的 特 点, 采 取 相 应 的 环 境 暴 露 控 制 措 施, 如 通 过 个 人 戒 烟 限 酒 公 共 场 所 控 烟 对 高 危 人 群 进 行 乙 肝 疫 苗 的 接 种 等 措 施 来 达 到 有 效 预 防 肝 癌 的 目 的 参 考 文 献 2009,16(13): [2] DuelEJ,WienckeJK,ChengTJ,etal.Polymorphismsinthe DNArepairgenesXRCCIandERCC2andbiomarkersofDNA damageinhumanblood mononuclearcels[j].carcinogenesis, 2000,21(5): [3] KanaarR,HoeijmakersJ H,Van GentD.Molecularmecha nismsof DNA double strandedrepair[j].trends CelBiol, 1998,8(12): [4] ButkiewiczD,Rusin M,EnewoldL,etal.Geneticpolymor phismsindnarepairgenesandriskoflungcancer[j].carcino genesis,2001,22(4): [5] WangYF,LiangD,SpitzM R,etal.XRCC3geneticpolymor phism,smokingandlungcarcinomariskinminoritypopulations [J].Cancer,2003,98(8): [6] MatuloG,GuarreraS,CarturanS,etal.DNArepairgenepol ymorphisms,bulkydnaadductsinwhitebloodcelsandblad dercancerinacase controlstudy[j].intj Cancer,2001, 92(4): [7] HanS,Zhang H T,WangZ,etal.DNArepairgeneXRCC3 polymorphismsandcancerrisk,ameta analysisof48case con trolstudies[j].eurjhum Genet,2006,14(10): [8] LeeSA,LeeK M,ParkSK,etal.Geneticpolymorphismof XRCC3Thr241Metandbreastcancerrisk:case controlstudyin Koreanwomenandmeta analysisof12studies[j].breastcanc errestreat,2007,103(1): [9] JacobsenNR,Raaschou NielsenO,NexoB,etal.XRCC3pol ymorphismsandriskoflungcancer [J].CancerLet,2004, 213(1): [10] LavanchyD.WorldwideepidemiologyofHBVinfection,disease burden,andvaccineprevention[j].jclinvirol,2005,34(sup pl1):1 3. [1] 杨 志 国, 谢 裕 安, 匡 志 鹏, 等. 广 西 扶 绥 人 群 GSTM1 和 GSTT1 基 因 多 态 性 与 肝 癌 易 感 性 关 系 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志, 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 史 本 玲 )

14 高赛君 等 广东省 ０ １８ 岁人群恶性肿瘤谱分析 １６３４ 流行病学研究 广东省 ０ １８ 岁人群恶性肿瘤谱分析 高赛君１ 梁洁芳１ 叶铁真１ 关镜明２ 何映谊１ 陈滢３ 林丽丹４ 李彦媚１ １ 广州市妇女儿童医疗中心儿童血液肿瘤科 广东 广州 ５１０１２０ ２ 广州医学院第一附属医院儿科 广东 广州 ５１０１２０ ３ 深圳市宝安区妇幼保健院儿科 广东 深圳 ５１８０２８ ４ 江门市中心医院儿科 广东 江门 ５２９０７０ Ｄ ｂ ｍｇ Ｇｇｇｐ １ 犌犃犗犛 犳狀犵１ 犢犈 犜 狕犺狀１ 犌犝犃犖犑 狀犵 犿 狀犵２ 犎犈犢 狀犵 狔 １ 犆犎犈犖犢 狀犵３ 犔犐犖犔 犱狀４ 犼狌狀 犔犐犃犖犌犑 犔犐犢狀 犿 １ １ 犇狆狉 犿狀 狅犳 犎犿 狅 狅犵狔狀犱犜狌犿狅 狉 犌狌狀犵狕犺狅狌犠狅犿狀狀犱 犱狉 狀 狊犎狅 狊狆 犌狌狀犵狕犺狅狌５１０１２０ 犘 犚 狀 ２ 犇狆狉 犿狀 狅犳 犘狉 犱 狉 犮 狊 犉 狉 狊 犃犳犳 犱 犎狅 狊狆 狅犳 犌狌狀犵狕犺狅狌 犕犱 犮 犆狅 犵 犌狌狀犵狕犺狅狌５１０１２０ 犘 犚 狀 ３ 犇狆狉 犿狀 狅犳 犘犱 狉 犮 狊 犅狅 狀犠狅犿狀狀犱 犱狉 狀 狊犎狅 狊狆 犛犺狀狕犺狀５１８０２８ 犘 犚 狀 ４ 犇狆狉 犿狀 狅犳 犘犱 狉 犮 狊 犑 狀犵犿狀犆狀 狉 犎狅 狊狆 犑 狀犵犿狀５２９０７０ 犘 犚 狀 摘要 目的 了解 广 东 省 ０ １８ 岁 人 群 恶 性 肿 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔｘｐ ｂ 瘤谱 为儿 童 恶 性 肿 瘤 的 防 治 提 供 方 向 和 思 路 ｍｇ １９ Ｇｇｇ 方法 收集 ２００２ １２ ２００５ ０５ 广 东 省 ０ １８ 岁 人 Ｐ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｔ ｇ ｂ ｗ 群恶性 肿 瘤 基 本 信 息 用 ＳＰＳＳ１３ ０ 统 计 软 件 分 Ｄ ｍｂ ２００２ Ｍ２００５ｍｇ ｇｂ 析各种恶性肿 瘤 在 不 同 年 龄 性 别 的 构 成 比 结 １９ ｗ ｍ ＧｇｇＰ Ｐｂ 果 符合入 选 条 件 的 儿 童 青 少 年 恶 性 肿 瘤 ２５２８ Ｈ Ｂ ｐ ｐ ｗ ｗ ｚ ｂ 例 其中男 性 占 ６３ ２ 女 性 占 ３６ ８ 男 女 比 ＳＰＳＳ１３ ０ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｔｐ ｐ ｐ 例１ ７ １ 广东 省 ０ １８ 岁 人 群 恶 性 肿 瘤 构 成 ｗ ｋｍ ４２ ０ ｍ ｍ 比前 ５ 位 依 次 为 白 血 病 ４２ ０ 中 枢 神 经 系 １１ ７ ８ １ ｂ ｐ ｍ ７ ３ ｍｐｍ 统 ＣＮＳ 肿 瘤 １１ ７ 恶 性 淋 巴 瘤 ８ １ 骨 ｍ ｍ ３ ４ Ｌｋｍ ｗ ｇ ｇ 肿瘤 ７ ３ 和 生 殖 细 胞 肿 瘤 ３ ４ 白 血 病 ３３ ０ ４８ ２ Ｔ ｗ ｇ ｇｇ ｐ 的构成比在各年龄组均最 高 其 范 围 从 ３３ ０ ｇｇ ｐｗ ｍ ｍ ４８ ２ 排列第 ２ 和第 ３ 位的肿瘤 在不同年龄段 ７ ９ ｐ ｍ ７ ８ ｇｂ ４ 依次 为 ０ ４ 岁 为 ＣＮＳ 肿 瘤 ７ ９ 和 肾 肿 瘤 ｍ ｍ １４ ９ ｍ ｇ ｍ ７ ８ ５ ９ 岁为 ＣＮＳ 肿 瘤 １４ ９ 和 恶 性 淋 １０ ７ ｇ５ ９ ｍ ｐｍ 巴瘤 １０ ７ １０ １４ 岁 为 ＣＮＳ 肿 瘤 １４ ７ ｍ １４ ７ ｂ ｐ ｍ １１ ０ ｇ１０ １４ 和骨肿瘤 １１ ０ １５ １８ 岁 为 骨 肿 瘤 １２ １ ｂ ｐ ｍ １２ １ ｍ 和 ＣＮＳ 肿 瘤 １０ ２ 男 性 肿 瘤 构 成 比 排 前 ３ ｍ １０ ２ ｇ１５ １８ Ｔ ｇ 位者依次为白血 病 ４２ ３ ＣＮＳ 肿 瘤 １０ ９ ｍ ｗ ｋｍ ４２ ３ ｍ 和恶 性 淋 巴 瘤 ９ ６ 女 性 则 为 白 血 病 ｍ １０ ９ ９ ６ ｗ ｍｐｍ ４１ ６ ＣＮＳ 肿 瘤 １３ ２ 和 骨 肿 瘤 ７ ５ ｍ ｗ ｋｍ ４１ ６ ｍ ｍ 结论 广东省儿童青 少 年 恶 性 肿 瘤 谱 与 香 港 地 区 １３ ２ ｂ ｐ ｍ ７ ５ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖 Ｔ 一致 与天津 上 海 等 地 接 近 但 与 欧 洲 美 洲 非 ｂ ｗ ｇ ｘ ｗ ｐ 洲和亚洲其他国家有差异 ｐ ｍ ｇ 中华肿瘤防治杂志 １６３４ １６３７ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 １６３４ １６３７ 关键词 肿瘤 流行病学 广东 流行病学 年龄因素 性别因素 儿童 ｐ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｐ ｍ ｍ ｇ ｇｇｇ ｐ ｍ ｇ ｇ ｘ 基金项目 广东省自然科学基金 ７００３０８６ 第一作者简介 高赛君 女 江西丰城人 硕士 住院医师 主要从事儿童血液肿瘤方面的临床与研究工作 Ｅ ｍ ｇ １６３ ｍ ｊ 通讯作者简介 叶铁真 女 广东东莞人 硕士 教授 主任医师 主要从事儿童血液肿瘤方面的临床与研究工作 ｚ １６３ Ｔ ８６ ２０ ３８０７６０５０ Ｅ ｍ ｍ

15 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 11 月 第 16 卷 第 21 期 CHINJCANCERPREV TREAT,November2009,Vol.16 No 中 图 分 类 号 R73-31 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (2009) 目 前, 恶 性 肿 瘤 已 成 为 威 胁 儿 童 青 少 年 健 康 的 严 重 疾 病 之 一 世 界 各 地 儿 童 青 少 年 恶 性 肿 瘤 谱 存 在 性 别 年 龄 地 域 种 族 和 时 间 的 差 异, 分 析 儿 童 青 少 年 恶 性 肿 瘤 谱 的 特 点, 有 助 于 进 一 步 探 讨 其 病 因 和 防 治 策 略 广 东 省 位 于 中 国 南 方 沿 海 地 区, 具 有 独 特 的 地 理 文 化 环 境 和 生 活 方 式 为 了 加 强 地 区 间 比 较, 掌 握 广 东 省 0~18 岁 人 群 恶 性 肿 瘤 谱 特 征, 本 研 究 对 广 东 省 0~18 岁 儿 童 青 少 年 恶 性 肿 瘤 发 病 资 料 进 行 了 分 析 1 资 料 与 方 法 1.1 资 料 来 源 分 析 初 诊 年 龄 为 0~18 岁 的 恶 性 肿 瘤 病 例, 资 料 来 源 于 广 东 省 县 及 县 以 上 医 疗 保 健 机 构 和 专 科 医 院 ( 含 各 大 专 院 校 附 属 医 院 军 队 驻 粤 医 院 ) 上 报 的 广 东 省 青 少 年 儿 童 恶 性 肿 瘤 基 本 信 息 ( 由 广 东 省 卫 生 厅 提 供 ) 入 选 病 例 均 需 经 病 理 或 骨 髓 细 胞 涂 片 检 查 确 诊 广 东 省 人 口 资 料 来 源 于 2000 年 第 5 次 全 国 人 口 普 查 数 据 1.2 数 据 筛 选 利 用 EXCEL2003 进 行 数 据 录 入 剔 除 不 符 合 年 龄 范 围 诊 断 标 准 和 信 息 资 料 不 齐 的 病 例, 并 将 2 家 医 疗 机 构 重 复 上 报 的 同 一 病 例 合 并 计 算 为 1 例 根 据 2001 年 国 际 疾 病 分 类 (ICD 10) 应 用 指 导 手 册 进 行 肿 瘤 分 类 1.3 统 计 学 方 法 统 计 指 标 为 各 种 恶 性 肿 瘤 的 构 成 比, 不 同 年 龄 性 别 各 种 肿 瘤 的 构 成 比, 以 及 各 种 恶 性 肿 瘤 在 不 同 年 龄 组 的 构 成 比, 以 百 分 比 表 示 统 计 学 方 法 采 用 配 对 检 验 用 SPSS13.0 统 计 分 析 软 件 进 行 数 据 处 理 检 验 水 准 α= 结 果 2.1 一 般 情 况 上 述 各 医 疗 机 构 上 报 恶 性 肿 瘤 共 2848 例, 经 数 据 清 洗 后, 剔 除 320 例, 其 中 不 符 合 年 龄 范 围 的 97 例 2 家 医 疗 机 构 重 复 上 报 的 21 例, 诊 断 标 准 和 信 息 资 料 不 齐 的 202 例, 符 合 入 选 条 件 的 2528 例, 其 中 男 性 1597 例, 占 63.2%, 女 性 931 例, 占 36.8%, 男 女 比 例 初 诊 年 龄 最 小 4 个 月, 最 大 为 17 岁 9 个 月, 中 位 年 龄 10.3 岁 2.2 恶 性 肿 瘤 构 成 比 各 种 肿 瘤 构 成 比 依 次 为 白 血 病 (42.0%) 中 枢 神 经 系 统 (CNS) 肿 瘤 (11.7%) 恶 性 淋 巴 瘤 (8.1%) 骨 肿 瘤 (7.3%) 生 殖 细 胞 肿 瘤 (3.4%) 软 组 织 肉 瘤 (3.2%) 肝 肿 瘤 (2.6%) 肾 恶 性 肿 瘤 (2.9%) 神 经 母 细 胞 瘤 (1.0%) 视 网 膜 母 细 胞 瘤 (0.7%), 见 表 1 表 1 广 东 省 0~18 岁 人 群 恶 性 肿 瘤 构 成 比 (%) 肿 瘤 组 别 狀 总 构 成 比 组 内 构 成 比 白 血 病 急 性 淋 巴 细 胞 性 白 血 病 急 性 髓 细 胞 性 白 血 病 慢 性 髓 细 胞 性 白 血 病 其 他 类 型 及 未 分 类 CNS 肿 瘤 室 管 膜 细 胞 瘤 星 形 细 胞 瘤 髓 母 细 胞 瘤 其 他 类 型 及 未 分 类 恶 性 淋 巴 瘤 霍 奇 金 淋 巴 瘤 非 霍 奇 金 淋 巴 瘤 其 他 类 型 及 未 分 类 骨 肿 瘤 骨 肉 瘤 软 骨 肉 瘤 尤 文 氏 肉 瘤 其 他 类 型 及 未 分 类 生 殖 细 胞 肿 瘤 颅 内 和 脊 柱 内 生 殖 细 胞 瘤 性 腺 生 殖 细 胞 瘤 性 腺 以 外 生 殖 细 胞 瘤 软 组 织 肉 瘤 横 纹 肌 肉 瘤 纤 维 肉 瘤 其 他 类 型 及 未 分 类 肝 肿 瘤 肝 母 细 胞 瘤 肝 细 胞 癌 其 他 类 型 及 未 分 类 肾 恶 性 肿 瘤 肾 母 细 胞 瘤 肾 细 胞 癌 其 他 类 型 及 未 分 类 神 经 母 细 胞 瘤 视 网 膜 母 细 胞 瘤 其 他 肾 上 腺 肿 瘤 甲 状 腺 癌 鼻 烟 癌 其 他 类 型 合 计 不 同 年 龄 性 别 各 种 恶 性 肿 瘤 的 构 成 比 不 同 年 龄 组 恶 性 肿 瘤 的 构 成 比 不 同 ( 表 2) 0~4 岁 组 构 成 比 排 前 3 位 的 恶 性 肿 瘤 均 依 次 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 和 肾 肿 瘤,5~9 岁 组 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 和 恶 性 淋 巴 瘤,10~14 岁 组 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 和 骨 肿 瘤,15~18 岁 组 则 为 白 血 病 骨 肿 瘤 和 CNS 肿 瘤

16 1636 高 赛 君, 等 广 东 省 0~18 岁 人 群 恶 性 肿 瘤 谱 分 析 表 2 广 东 省 0~18 岁 人 群 恶 性 肿 瘤 年 龄 与 性 别 分 布 (%) 肿 瘤 分 组 0~4 岁 5~9 岁 10~14 岁 15~18 岁 总 男 女 总 男 女 总 男 女 总 男 女 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 骨 肿 瘤 生 殖 细 胞 肿 瘤 软 组 织 肉 瘤 肝 肿 瘤 肾 肿 瘤 神 经 母 细 胞 瘤 视 网 膜 母 细 胞 瘤 其 他 合 计 男 性 肿 瘤 构 成 比 排 前 3 位 者 依 次 为 白 血 病 (42.3%) CNS 肿 瘤 (10.9%) 和 恶 性 淋 巴 瘤 (9.6%); 女 性 则 为 白 血 病 (41.6%) CNS 肿 瘤 (13.2%) 和 骨 肿 瘤 (7.5%) 2.4 各 种 恶 性 肿 瘤 在 不 同 年 龄 组 的 构 成 比 各 种 恶 性 肿 瘤 在 不 同 年 龄 组 的 构 成 比 不 同 ( 表 3) 白 血 病 发 病 高 峰 在 0~4 岁 组, 且 构 成 比 随 着 年 龄 的 增 加 而 下 降, 各 年 龄 段 间 构 成 比 差 异 有 统 计 学 意 义 ( 犘 = 0.000); 各 年 龄 段 白 血 病 的 构 成 比 均 为 男 性 高 于 女 性 ( 犘 =0.000) CNS 肿 瘤 发 病 高 峰 在 10~14 岁 组, 与 其 他 3 个 年 龄 段 构 成 比 差 异 有 统 计 学 意 义 ( 犘 =0.005), 其 构 成 比 在 各 年 龄 段 亦 为 男 性 高 于 女 性 ( 犘 =0.003) 恶 性 淋 巴 瘤 发 病 高 峰 在 5~9 岁 组, 其 构 成 比 显 著 高 于 其 他 3 个 年 龄 组 ( 犘 =0.024), 各 年 龄 段 的 构 成 比 均 为 男 性 高 于 女 性 ( 犘 =0.000) 骨 肿 瘤 发 病 高 峰 在 15~18 岁 组, 且 构 成 比 随 着 年 龄 的 增 加 而 上 升, 各 年 龄 段 间 构 成 比 差 异 有 统 计 学 意 义 ( 犘 =0.000), 各 年 龄 段 骨 肿 瘤 的 构 成 比 均 为 男 性 高 于 女 性 ( 犘 =0.001) 生 殖 细 胞 肿 瘤 发 病 高 峰 在 15~18 岁 组, 其 构 成 比 显 著 高 于 其 他 3 个 年 龄 组 ( 犘 =0.010), 在 各 年 龄 组 中, 除 10~14 岁 组 男 女 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 ( 犘 =0.564), 其 余 3 个 年 龄 组 构 成 比 均 为 男 性 高 于 女 性 ( 犘 =0.006) 表 3 各 种 肿 瘤 在 不 同 年 龄 组 的 构 成 比 (%) 肿 瘤 分 组 0~4 岁 5~9 岁 10~14 岁 15~18 岁 总 男 女 总 男 女 总 男 女 总 男 女 合 计 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 骨 肿 瘤 生 殖 细 胞 肿 瘤 软 组 织 肉 瘤 肝 肿 瘤 肾 肿 瘤 神 经 母 细 胞 瘤 视 网 膜 母 细 胞 瘤 其 他 注 : 各 年 龄 组 与 其 他 3 个 年 龄 组 相 比, 犘 均 <0.05; 各 年 龄 组 的 男 性 与 女 性 相 比, 犘 均 < 讨 论 儿 童 恶 性 肿 瘤 的 发 病 率 和 肿 瘤 谱 存 在 年 龄 性 别 [1 4] 地 区 和 种 族 等 差 异 综 合 文 献, 不 同 国 家 和 地 区 排 前 5 位 的 儿 童 青 少 年 恶 性 肿 瘤 如 下 : 美 国 白 人 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 神 经 母 细 胞 瘤 和 软 组 织 肉 瘤, 与 英 国 澳 大 利 亚 和 日 本 一 致, 美 国 黑 人 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 软 组 织 肉 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 和 神 经 母 细 胞 瘤, 阿 拉 斯 加 土 著 ( 包 括 印 第 安 人 阿 留 申 人 和 爱 斯 基 摩 人 ) 则 为 白 血 病 肝 脏 肿 瘤 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 和 精 母 细 胞 瘤 非 洲 的 津 巴 布 韦 为 白 血 病 软 组 织 肉 瘤 肾 母 细 胞 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 和 CNS 肿 瘤, 乌 拉 圭 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 神 经 母 细 胞 瘤 和 肾 肿 瘤 亚 洲 的 印 度 为 白 血 病 恶 性 淋 巴 瘤 CNS 肿 瘤 视 网 膜 母 细 胞 瘤 和 肾 肿 瘤, 泰 国 则 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 视 网 膜 母 细 胞 瘤 软 组 织 肉 瘤 而 我 国 天 津 市 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 骨 肿 瘤 和 肾 肿 瘤, 上 海 市 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 软 组 织 肉 瘤 和 骨 肿 瘤, 香 港 地 区 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 骨 肿 瘤 和 生 殖 细 胞 肿 瘤 本 研 究 报 道 广 东 省 0~ 18 岁 人 群 恶 性 肿 瘤 前 5 位 依 次 为 白 血 病 CNS 肿 瘤 恶 性 淋 巴 瘤 骨 肿 瘤 和 生 殖 细 胞 肿 瘤, 与 香 港 地 区 相

17 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 11 月 第 16 卷 第 21 期 CHINJCANCERPREV TREAT,November2009,Vol.16 No 同, 与 我 国 天 津 市 上 海 市 较 为 接 近, 但 与 欧 洲 美 洲 非 洲 和 亚 洲 其 他 国 家 有 差 异 在 各 种 恶 性 肿 瘤 中, 广 东 省 儿 童 青 少 年 白 血 病 占 42.0%, 与 天 津 香 港 美 国 澳 大 利 亚 印 度 泰 国 乌 拉 圭 和 欧 洲 等 地 比 较, 处 于 较 高 水 平, 其 中 0~4 岁 组 最 高 ; 骨 肿 瘤 的 比 例 (7.3%) 则 高 于 上 述 地 区, 发 病 高 峰 年 龄 为 15~18 岁 ; 而 恶 性 淋 巴 瘤 (8.8%) 神 经 母 细 胞 瘤 (1.3%) 和 视 网 [1 4] 膜 母 细 胞 瘤 (0.8%) 的 比 例 均 低 于 上 述 各 地 目 前 认 为, 儿 童 恶 性 肿 瘤 的 发 病 可 能 是 环 境 暴 露 与 遗 传 因 素 交 互 作 用 的 结 果, 前 者 包 括 生 物 物 理 和 化 学 等 因 素 研 究 证 实,EB 病 毒 乙 型 肝 炎 病 毒 人 类 疱 疹 病 毒 8 型 猿 猴 病 毒 40(SV40) 分 别 与 儿 童 淋 巴 瘤 [5] 肝 癌 卡 波 氏 肉 瘤 脑 肿 瘤 和 骨 肉 瘤 的 发 生 有 关 ; 母 亲 怀 孕 期 间 患 肺 炎 流 感 可 明 显 增 加 其 所 生 子 女 患 急 性 淋 巴 细 胞 性 白 血 病 (acutelymphoblasticleukemia, ALL) 的 危 险 (OR=1.89,95%CI=1.24~2.89) [6] 一 项 对 在 英 格 兰 和 威 尔 士 地 区 出 生 的 例 恶 性 肿 瘤 患 儿 的 病 例 对 照 研 究 显 示, 白 血 病 发 病 风 险 与 高 压 输 电 线 的 距 离 的 倒 数 存 在 显 著 正 相 关 性 ( 犘 < [7] 0.01) Evrard 等 的 研 究 则 显 示, 氡 气 的 浓 度 与 儿 童 急 性 髓 细 胞 性 白 血 病 (acute myeloidleukemia, AML) 的 发 病 风 险 存 在 正 相 关 ( 犘 =0.004), 与 儿 童 [8] ALL 的 发 病 风 险 无 关 ( 犘 =0.49) Menegaux 等 报 道 儿 童 期 杀 虫 剂 (OR=2.4,95%CI=1.3~4.3) 和 杀 菌 剂 (OR=1.5,95%CI=1.0~6.2) 暴 露 以 及 怀 孕 期 家 庭 使 用 杀 虫 剂 增 加 儿 童 急 性 白 血 病 发 生 危 险 瑞 典 一 项 前 瞻 性 研 究 结 果 显 示 孕 期 母 亲 吸 烟 与 儿 童 脑 肿 瘤 [9] [10] 发 生 有 关 Chang 等 报 道 母 亲 怀 孕 期 间 父 亲 吸 烟 或 婴 儿 出 生 后 被 动 吸 烟 可 增 加 儿 童 白 血 病 发 生 危 险 与 儿 童 恶 性 肿 瘤 发 病 有 关 的 遗 传 因 素 包 括 某 些 基 因 的 突 变 或 缺 失 易 感 基 因 及 其 多 态 性 等 有 研 究 显 [8] 示, 基 因 的 突 变 缺 失 或 失 活 与 一 些 具 有 家 族 聚 集 性 肿 瘤 的 发 生 有 关, 如 视 网 膜 母 细 胞 瘤 为 抑 癌 基 因 RB1 的 两 条 等 位 基 因 同 时 失 活 所 致, 家 族 性 Wilms' 瘤 与 FWT1 FWT2 基 因 的 变 异 有 关 易 感 基 因 及 其 多 态 性 主 要 包 括 代 谢 酶 DNA 修 复 酶 和 毒 物 受 体 等 基 因 及 [11] 其 多 态 性 AydinSayitoglu 等 的 病 例 对 照 研 究 显 示,Ⅰ 相 代 谢 酶 CYP2E1 5 与 儿 童 ALL 和 AML 的 危 险 性 均 有 关 (ALL 组 :OR=3.4,95%CI=1.3~ 9.1, 犘 =0.01;AML 组 :OR=4.9,95%CI=1.6~ 15.2, 犘 =0.006);Ye 等 [12] 对 278 例 ALL 患 儿 与 303 名 健 康 儿 童 作 病 例 对 照 研 究, 结 果 显 示 携 带 Ⅱ 相 代 谢 酶 GSTP1 B 突 变 体 者 可 增 加 患 儿 童 ALL 的 危 险 性 (OR=1.5,95%CI=1.1~2.0, 犘 =0.02); 并 且 与 GSTM1 纯 合 子 型 有 联 合 效 应, 使 儿 童 ALL 发 病 的 危 险 性 更 大 (OR=2.1,95%CI=1.3~3.4, 犘 =0.003) 另 有 研 究 显 示, 白 血 病 的 发 病 与 细 胞 凋 亡 受 阻 [13] 有 关 目 前, 儿 童 恶 性 肿 瘤 的 病 因 尚 未 明 确 对 儿 童 恶 性 肿 瘤 谱 的 研 究, 将 为 探 索 儿 童 恶 性 肿 瘤 发 病 过 程 的 环 境 - 基 因 交 互 作 用, 进 一 步 揭 示 恶 性 肿 瘤 的 病 因, 提 供 方 向 和 思 路 参 考 文 献 [1] MichelG,vonder Weid N X,Zwahlen M,etal.TheSwiss ChildhoodCancerRegistry:rationale,organisationandresults fortheyears [J].Swiss Med Wkly,2007,137(35 36): [2] LiJ,ThompsonTD,MilerJW,etal.Cancerincidenceamong childrenandadolescentsinthe UnitedStates, [J]. Pediatrics,2008,121(6): [3] Juarez OcanaS,Gonzalez MirandaG,Mejia ArangureJ M,et al.frequencyofcancerinchildrenresidingin MexicoCityand treatedinthehospitalsoftheinstitutomexicanodelseguroso cial( )[J].BMCCancer,2004,13(4):50. [4] SwaminathanR,RamaR,ShantaV.ChildhoodcancersinChennai, India, :incidenceandsurvival[J].IntJCancer,2008,122 (11): [5] StilerC A.Epidemiologyandgeneticsofchildhoodcancer[J]. Oncogene,2004,23(38): [6] Kwan M L,MetayerC,CrouseV,etal.Maternalilnessand drug/medication useduringtheperiodsurroundingpregnancy andriskofchildhoodleukemiaamongofspring[j].amjepide miol,2007,165(1): [7] EvrardAS,HémonD,BilonS,etal.Ecologicalassociationbe tweenindoorradonconcentrationandchildhoodleukaemiainci denceinfrance, [J].EurJCancerPrev,2005,14 (2): [8] MenegauxF,BaruchelA,BertrandY,etal.Householdexpo suretopesticidesandriskofchildhoodacuteleukaemia[j].oc cupenviron Med,2006,63(2): [9] BrooksDR,MucciL A,HatchEE,etal.Maternalsmoking duringpregnancyandriskofbraintumorsintheofspring.a prospectivestudyof1.4milionswedishbirths[j].cancercau sescontrol,2004,15(10): [10] ChangJS,SelvinS,MetayerC,etal.Parentalsmokingand theriskofchildhoodleukemia [J].AmJEpidemiol,2006,163 (12): [11] AydinSayitogluM,HatirnazO,ErensoyN,etal.RoleofCYP2D6, CYP1A1,CYP2E1,GSTT1,andGSTM1genesinthesusceptibility toacuteleukemias[j].amjhematol,2006,81(3): [12] YeZ,SongH.Glutathiones transferasepolymorphisms(gstm1, GSTP1andGSTT1)andtheriskofacuteleukaemia:asystematic reviewandmeta analysis[j].eurjcancer,2005,41(7): [13] 杨 炜 华, 温 培 娥, 范 华, 等. 曲 古 抑 菌 素 A 诱 导 HL 60 细 胞 凋 亡 机 制 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2009,16(4): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 边 莉 )

18 邹敏 等 ８ 溴 ７ 甲氧基白杨素诱导人小细胞肺癌 ＮＣＩ Ｈ４４６ 细胞凋亡及其机制的探讨 １６３８ 实验研究 ８ 溴 ７ 甲氧基白杨素诱导人小细胞肺癌 ＮＣ Ｉ Ｈ４４６ 细胞凋亡及其机制的探讨 邹敏１ 安东建１ ２ 曹建国３ １ 南华大学肿瘤研究所 湖南 衡阳 ４２１００１ ２ 长沙市中心医院肿瘤中心 湖南 长沙 ４１０００４ ３ 湖南师范大学药物工程实验室 湖南 长沙 ４１０００６ Ｉ ｐｐ ｍｍ ｇ ＮＣ Ｉ Ｈ４４６ ｇ Ｎｘ Ｍ １ｂ８ ｂ ｍ ７ ｍ ｘ 犣犗犝 犕 狀１ 犃犖 犇狅狀犵 狀１ ２ 犆犃犗犑 狀 犵狌狅３ 犼 １ 犐狀 狊 狌 狅犳 犆狀犮 狉犚 狊 狉 犮犺 犖狀犺狌犝狀 狏 狉 狊 犚 狀 狔 犎狀犵狔狀犵４２１００１ 犘 ２ 犇狆狉 犿狀 狅犳 犗狀犮 狅 狅犵狔 狀犵狊 犺犆狀 狉 犎狅 狊狆 狀犵狊 犺４１０００４ 犘 犚 狀 ３ 犔犫 狅 狉 狅 狉狔狅犳 犇狉狌犵 犈狀犵 狀 狉 狀犵 犎狌狀狀犖狅 狉犿 犝狀 狏 狊 犺４１０００６ 犘 犚 狀 狔 狀犵狊 摘要 目 的 观 察 ８ 溴 ７ 甲 氧 基 白 杨 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｐｐ ｇ ｇ 素 ＢＭＣＲ 诱 导 人 小 细 胞 肺 癌 ８ ｂ ｍ ７ ｍ ｘ ＢＭＣＲ ｍ ｍ ＮＣＩ Ｈ４４６ 细胞凋亡 作 用 并 探 讨 其 与 ｇ ＮＣＩ Ｈ４４６ 狀狏 狉 狅 ｍ ｍ Ｍ Ｎｘ １ 比值增 高 的 关 系 方 法 以 ｗ ｇ Ｎｘ Ｍ １ｐ 体外培养的 ＮＣＩ Ｈ４４６ 细 胞 和 正 常 小 鼠 犕犈犜犎犗犇犛 Ｈｍｍ ｇ ＮＣＩ Ｈ４４６ 肺上皮 ＣＨＬ 细胞为研究对象 ＭＴＴ 比 Ｃ Ｈｍ ｐ ｍ ＣＨＬ ｗ ｐ 色法测 定 ＮＣＩ Ｈ４４６ 细 胞 和 ＣＨＬ 细 胞 狀狏 狉 狅 Ｔ ｂ ｂ 活性 ＰＩ 染 色 流 式 细 胞 术 ＦＣＭ 分 析 ｘ ＢＭＣＲ ＮＣＩ Ｈ４４６ ＣＨＬ ｗ ｍ ｂ ＮＣＩ Ｈ４４６ 细 胞 凋 亡 率 ＦＩＴＣ 标 志 间 接 ＭＴＴ ｍ ＢＭＣＲ ｐｐ ＮＣＩ Ｈ４４６ 免 疫 荧 光 ＦＣＭ 检 测 ＮＣＩ Ｈ４４６ 细 胞 ＦＣＭ ｗ ＰＩ ｇ Ｔ ｗ ｂ ｂｆ ｗ ｍ ＮＯＸＡ Ｍ １ 和 Ｃ ｐ ３ 蛋白 表 达 水 ＢＭＣＲｐ ｘｐ Ｎｘ 平 结果 ＭＴＴ 分析结 果 显 示 ＢＭＣＲ Ｍ １ Ｃ ｐ ３ ｗ ｚ ｂ ｍｍ 明 显 抑 制 ＮＣＩ Ｈ４４６ 细 胞 活 性 呈 浓 度 ｇ ｗ ｍ ｗ ｑ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｔ ＭＴＴ 依赖性 而对 ＣＨＬ 细胞活性的抑制作用 ＢＭＣＲ ｂ ｇ ｂ ｇ 弱 其选择指数为 ４６ ＰＩ染色 ＦＣＭ 分 析 ＮＣＩ Ｈ４４６ ｐ ｍ ｂ ｗ 显示 ０ Ｌ 的 ＢＭ ３ ３ ０ 和 ３０ ０ μｍ ＣＨＬ Ｔ ｘ ＮＣＩ Ｈ４４６ ｗ ＣＲ 作用于 ＮＣＩ Ｈ４４６ 细 胞 ４８ 后 其 ４６ Ｔ ｗ ｍ ＰＩ ｇ ｐｐ ｗ 凋 亡 率 分 别 为 ８ ８３ ２３ ７ 和 ＬＢＭ ＮＣＩ Ｈ４４６ ｗ ０ ３ ３ ０３０ ０μｍ ３４ ９ 其 中 ＢＭＣＲ ３ ０ 和 ＣＲ ４８ｗ ８ ８３ ２３ ７ ３４ ９ ｐ ｇ Ｌ 组 较 ＣＲ ３０ ０ μｍ Ｌ ３０ ０μｍ ＬＢＭＣＲ ｗ ｗ ３ ０３０ ０μｍ ｇ １９ ７ 高 间接免疫荧光 ＦＣＭ 分析结 ＬＣＲ １９ ７ Ｔ ｍｍ ｗ ３０ ０μｍ 果显示 凋 亡 相 关 基 因 Ｎｘ 表 达 上 调 ｘｐ Ｎｘ ｑｍ 和 Ｍ Ｍ １ 表 达 下 调 Ｎｘ １比值升 Ｃ ｐ ３ Ｃ ｐ ３ ｗ Ｍ １ｗ 高 Ｃ ｐ ３ 活 化 结 论 ＢＭＣＲ 具 ｇ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖 ＢＭＣＲ ｐ ｇ 有诱导人 小 细 胞 肺 癌 细 胞 凋 亡 的 作 用 ｇｐｐ ＮＣＩ Ｈ４４６ ｗ ｍ ｂ 其作 用 机 制 可 能 与 其 增 高 Ｎｘ Ｍ １ Ｍ １ｐ ｗ ｇ Ｎｘ 比值 激活 Ｃ ｐ ３ 蛋白表达有关 ｇｃ ｐ ３ 中华肿瘤防治杂志 ２ ０ ０ ９ １ ６ ２ １ １ ６ ３ ８ １ ６ ４ １ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 １６３８ １６４１ 基金项目 湖南省自然科学基金 ０３ ｊ ｊ ５００９ 第一作者简介 邹敏 女 湖南湘潭人 硕士 主要从事肿瘤内科学的研究工作 Ｔ ８６ ７３１ ８５６６７９０１ Ｅ ｍ ｍ ｚ １５ １２６ ｍ 通讯作者简介 安东建 男 吉林辽源人 教授 硕士生导师 主要从事肿瘤化疗和放疗相关的研究工作 ｍ Ｔ ８６ ７３１ ８５６６７９０１ Ｅ ｍ ４１０００４ ｊ

19 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 11 月 第 16 卷 第 21 期 CHINJCANCERPREV TREAT,November2009,Vol.16 No 关 键 词 肺 肿 瘤 ;8 溴 7 甲 氧 基 白 杨 素 ; 细 胞 凋 亡 ; 细 胞 培 养 [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] lungneoplasms;8 bromo 7 methoxychrysin;apoptosis;celculture 中 图 分 类 号 R73-3 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (2009) 小 细 胞 肺 癌 (smalcellungcancer,sclc) 占 肺 癌 的 12%~15% [1], 具 有 恶 性 程 度 高, 生 长 迅 速, 转 移 早, 预 后 差 的 特 点, 目 前 仍 无 特 效 药 物 治 疗 白 杨 素 (Chrysin) 是 一 种 具 有 多 种 药 理 活 性 的 黄 酮 类 化 合 物, 本 研 究 在 前 期 工 作 基 础 上 [2], 探 讨 BrMChR 抑 制 人 SCLC(NCI H446) 细 胞 增 殖 和 诱 导 细 胞 凋 亡 的 作 用 及 其 可 能 的 分 子 机 制, 为 SCLC 的 新 药 研 究 提 供 实 验 和 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 药 物 与 试 剂 BrMChR 参 照 文 献 [3] 方 法 合 成, 黄 色 晶 体, 相 对 分 子 质 量 为 347, 分 子 式 :C 16 H 11BrO 4, 纯 度 :99% RPMI1640 培 养 基 购 于 美 国 Gibco 公 司 ; 新 生 牛 血 清 购 于 杭 州 四 季 青 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司 ; 甲 基 亚 砜 (DMSO) 购 于 美 国 Amresco 公 司 ; 白 杨 素 MTT 购 于 美 国 Sigma 公 司 ; 顺 铂 (DDP) 购 于 齐 鲁 制 药 有 限 公 司 Noxa Mcl 1 Caspase 3 抗 体 及 FITC 标 志 的 二 抗 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 1.2 细 胞 与 细 胞 培 养 NCI H446 细 胞 和 中 国 仓 鼠 肺 上 皮 CHL 细 胞 均 购 于 上 海 中 科 院 细 胞 库 用 含 10% 小 牛 血 清 的 RPMI 1640, 在 37 5% CO 2 及 饱 合 湿 度 条 件 下 培 养,1~ 2d 传 代 1 次, 取 对 数 生 长 期 细 胞 用 于 实 验 1.3 MTT 比 色 法 NCI H446 细 胞 和 CHL 细 胞 以 每 孔 个 细 胞 接 种 于 96 孔 培 养 板, 培 养 4h, 待 细 胞 贴 壁 后 加 入 20μL 的 ChR,DDP 以 及 不 同 浓 度 的 BrMChR, 使 其 终 浓 度 分 别 为 μmol/L 对 照 组 加 入 等 体 积 PBS, 每 组 设 3 个 复 孔, 培 养 48h 每 孔 加 入 5g/L 的 MTT 液 20μL, 继 续 培 养 4 h 后, 吸 去 培 养 基, 加 入 DMSO 100μL/ 孔, 震 荡 10 min, 用 酶 标 仪 (ELX 800 型 ) 在 570nm 波 长 测 吸 光 度 值 (A 值 ) 计 算 相 对 增 殖 抑 制 率 (IR), 按 寇 氏 改 良 孙 式 综 合 计 算 法 计 算 出 半 数 有 效 浓 度 (IC 50 ), 计 算 药 物 对 人 SCLC 细 胞 的 选 择 指 数 (SI) 实 验 重 复 3 次 实 验 组 A 均 值 IR(%)=(1- 对 照 组 A 均 值 ) 100% SI= CHL 细 胞 的 IC 50 值 NCI H446 细 胞 的 IC 流 式 细 胞 术 分 析 NCI H446 细 胞 传 代 贴 壁 后, 分 别 加 入 不 同 浓 度 BrMChR 使 其 终 浓 度 分 别 为 μmol/L; 阳 性 药 物 对 照 组 加 入 2.0μmol/L 的 DDP; 先 导 化 合 物 对 照 组 加 入 30.0μmol/L 的 ChR; 对 照 组 加 入 等 体 积 PBS, 分 别 处 理 48h 后, 收 集 细 胞, 冷 PBS 洗 2 遍, 用 4 的 70% 乙 醇 固 定 24h 后, 经 碘 化 丙 啶 (PI) 染 色, 用 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 实 验 重 复 3 次 1.5 间 接 免 疫 荧 光 流 式 细 胞 术 收 集 不 同 处 理 组 的 细 胞 制 成 ml -1 的 单 细 胞 悬 液, 用 4% 多 聚 甲 醛 固 定 60 min,pbs 洗 涤 2 次, 离 心 (r=10cm) 弃 上 清 每 份 标 本 分 实 验 管 和 对 照 管, 各 加 入 100μL 细 胞 悬 液 加 入 含 5% 小 牛 血 清 的 破 膜 试 剂 (TritonX 100,Sigma 公 司 产 品 )1mL, 置 于 冰 上 作 用 10min 后 离 心 (r=10cm) 弃 上 清,PBS 洗 涤 2 遍 实 验 管 加 入 50μL 按 1 50 用 PBS 稀 释 的 一 抗 ( 对 照 管 不 加 一 抗 ), 混 匀, 置 于 4 冰 箱 孵 育 45min 实 验 管 和 对 照 管 均 用 500μLPBS 洗 涤 2 次 后, 加 入 按 用 PBS 稀 释 的 带 FITC 标 志 的 二 抗 100μL, 混 匀, 置 于 4 冰 箱 避 光 孵 育 45min, 用 500μLPBS 洗 2 次, 重 悬, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 荧 光 强 度 以 对 照 管 作 为 空 白 定 标, 计 数 个 细 胞, 以 阳 性 细 胞 的 平 均 荧 光 强 度 (meanflourscenceindensity,mfi) 表 示 细 胞 的 蛋 白 表 达 量 实 验 重 复 2 次 1.6 统 计 学 方 法 各 组 实 验 数 据 均 用 狓 - ± 狊 表 示, 采 用 SPSS13.0 软 件 OneWayANOVA 行 方 差 分 析, 两 两 比 较 采 用 检 验, 犘 <0.05 为 差 异 有 统 计 学 意 义 2 结 果 2.1 BrMChR 对 NCI H446 细 胞 活 性 的 影 响 MTT 比 色 法 结 果 显 示, 浓 度 分 别 为 μmol/L 的 BrMChR 和 30.0μmol/L 的 ChR 分 别 处 理 NCI H446 细 胞 48h 后, 其 抑 制 率 分 别 为 13.87% 22.14% 39.05% 51.97% 61.14% 和 48.54%, 呈 浓 度 依 赖 性 10μmol/L 的 BrMChR 的 相 对 抑 制 率 与 30.0μmol/L 的 ChR 的 相 对 抑 制 率 类 似 BrMChR 对 CHL 细 胞 的 活 性 抑 制 作 用 (IC 50 为 μmol/l) 远 小 于 对 NCI H446 细 胞 的 作 用 (IC 50 为 9.87μmol/L), 其 对 NCI H446 细 胞 的 选 择 指 数 达 46 结 果 表 明 BrMChR 对 NCI H446 细 胞 具 有 较 强 的 相 对 选 择 性 毒 性 作 用 ( 图 1)

20 1640 邹 敏, 等 8 溴 7 甲 氧 基 白 杨 素 诱 导 人 小 细 胞 肺 癌 NCI H446 细 胞 凋 亡 及 其 机 制 的 探 讨 术 检 测 Noxa Mcl 1 和 Caspase 3 蛋 白 的 表 达 结 果 显 示,Noxa 蛋 白 的 平 均 荧 光 强 度 分 别 为 (1.18± 0.15)% (1.64±0.19)% 和 (1.95±0.26)%, 呈 浓 度 依 赖 性 地 上 升, 表 明 BrMChR 可 诱 导 Noxa 蛋 白 的 表 达 ;Mcl 1 蛋 白 的 平 均 荧 光 强 度 分 别 为 (0.22± 0.05)% (0.16±0.05)% 和 (0.15±0.09)%, 呈 浓 度 依 赖 性 地 下 降, 表 明 BrMChR 可 抑 制 Mcl 1 蛋 白 的 表 图 1 BrMChR 对 NCI H446 细 胞 和 CHL 细 胞 活 性 抑 制 作 用 比 较 BrMChR 显 著 抑 制 NCI H446 细 胞 的 活 性, 呈 浓 度 依 赖 性, 对 CHL 细 达 ;Noxa/Mcl 1 比 值 分 别 为 (5.6±2.2)% (12.2± 3.7)% 和 (19.5±4.5)%, 呈 浓 度 依 赖 性 地 上 升, 表 明 BrMChR 可 上 调 Noxa/Mcl 1 比 值 Caspase 3 蛋 白 的 平 均 荧 光 强 度 分 别 为 (1.78±0.1)% (2.61± 0.2)% 和 (3.89±0.7)%, 表 达 量 亦 呈 浓 度 依 赖 性 上 升 ( 图 3) 胞 作 用 弱 与 相 同 浓 度 的 BrMChR 处 理 CHL 细 胞 比 较, 犘 < PI 染 色 流 式 细 胞 术 分 析 NCI H446 细 胞 凋 亡 不 同 浓 度 的 BrMChR 处 理 NCI H446 细 胞 48h 后, 采 用 PI 染 色 FCM 对 细 胞 进 行 检 测 结 果 表 明 和 30.0 μmol/l 的 BrMChR 作 用 于 NCI H446 细 胞 48h 后 的 细 胞 凋 亡 率 分 别 为 (7.8± 0.7)% (22.8±1.3)% 和 (33.3±1.3)%, 呈 浓 度 依 赖 性 其 中 30.0μmol/LBrMChR 处 理 的 凋 亡 率 明 显 高 于 空 白 对 照 组 ( 犘 <0.05), 较 30.0μmol/LChR 处 理 的 凋 亡 率 (18.2±1.1)% 高, 犘 <0.05( 图 2) 图 3 间 接 免 疫 荧 光 流 式 细 胞 术 检 测 BrMChR 对 NCI H446 细 胞 Noxa,Mcl 1,Caspase 3 蛋 白 表 达 的 影 响 犘 <0.05 狏 狊 blank 3 讨 论 ChR 是 一 种 具 有 广 泛 生 物 活 性 的 黄 酮 类 化 合 物 前 期 已 有 大 量 体 内 外 实 验 研 究 证 实 了 ChR 对 多 种 肿 瘤 有 抑 制 作 用 后 来 通 过 对 ChR 化 学 结 构 的 改 变, 包 [4 7] 括 甲 基 化 乙 酰 化 卤 化 烯 丙 基 化 氧 化 等, 并 对 其 抗 肿 瘤 活 性 进 行 比 较 研 究, 证 实 了 不 同 取 代 基 团 所 产 [7] 生 药 理 作 用 不 同 Zheng 等 合 成 了 一 系 列 白 杨 素 衍 生 物, 经 比 较 研 究 证 实 了 白 杨 素 衍 生 物 BrMChR 的 抗 图 2 PI 染 色 FCM 检 测 BrMChR 诱 导 NCI H446 细 胞 凋 亡 作 用 A:blank;B:DDP2.0μmol/L;C:ChR 30.0μmol/L;D:BrMChR 0.3μmol/L;E:BrMChR3.0μmol/L;F:BrMChR30.0μmol/L; 柱 形 表 示 3 次 实 验 样 品 测 定 值 的 均 数 与 标 准 差, 狀 =3( 犘 <0.05 狏 狊 blank) 2.3 BrMChR 对 NCI H446 细 胞 Noxa 与 Mcl 1 及 Caspase 3 蛋 白 的 表 达 μmol/l 的 BrMChR 作 用 于 NCI H446 细 胞 48h 后, 采 用 间 接 免 疫 荧 光 流 式 细 胞 [8] 肿 瘤 活 性 优 于 先 导 化 合 物 向 红 琳 等 证 实 了 BrM ChR 可 能 部 分 通 过 活 化 PPARγ 诱 导 SGC 7901 细 胞 凋 亡 本 次 研 究 证 实,BrMChR 具 有 抑 制 NCI H446 细 胞 的 活 性 作 用, 其 特 点 是 :1)BrMChR 的 浓 度 越 高, 抑 制 作 用 就 越 强 2)BrMChR 有 较 强 的 选 择 性 毒 性 作 用, 其 选 择 指 数 为 46 3)BrMChR 比 ChR 作 用 更 强 药 物 诱 导 细 胞 凋 亡 是 治 疗 肿 瘤 的 作 用 方 式 之 一 本 研 究 将 不 同 浓 度 的 BrMChR 处 理 NCI H446 细 胞