國立中山大學學位論文典藏.PDF

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1 國 立 中 山 大 學 海 洋 生 物 科 技 暨 資 源 學 系 博 士 論 文 建 立 禽 畜 水 產 品 中 之 喹 諾 酮 類 藥 物 分 析 方 法 及 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 在 吳 郭 魚 中 藥 物 動 力 學 之 研 究 Simultaneous Determination of Quinolones in Marine and Livestock Products and Pharmacokinetics of Enrofloxacin in Tilapia 研 究 生 : 張 菊 香 撰 指 導 教 授 : 王 維 賢 中 華 民 國 九 十 八 年 七 月 1

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4 謝 誌 隨 著 論 文 的 如 期 完 成 和 付 梓, 四 年 來 於 辦 公 室 學 校 穿 梭 往 返 的 忙 碌 生 涯 也 即 將 劃 下 美 麗 的 句 點 首 先 要 衷 心 感 謝 恩 師 王 維 賢 教 授 的 悉 心 指 導 與 鼓 勵, 也 適 時 在 關 鍵 之 處 給 我 提 點, 使 我 終 能 完 成 學 業 拓 展 我 的 學 術 視 野, 同 時 感 謝 師 母 平 時 的 關 懷 與 鼓 勵 論 文 審 查 期 間 承 蒙 陳 景 川 教 授 郭 茂 松 教 授 陳 一 鳴 教 授 與 蔡 清 恩 教 授 於 百 忙 之 中 撥 冗 費 心 斧 正, 並 惠 賜 諸 多 寶 貴 意 見, 使 本 論 文 更 加 豐 富 與 完 整, 學 生 受 惠 良 多, 謹 致 以 最 誠 摯 之 謝 忱 特 別 要 感 謝 的 是 蔡 清 恩 老 師 引 領 我 進 入 藥 物 動 力 學 專 業 領 域, 不 斷 地 予 以 指 導 啟 迪, 每 每 討 論 耗 時 費 力, 著 實 讓 我 銘 感 五 內 此 外 感 謝 蔡 師 母 亮 諧 於 吳 郭 魚 飼 養 及 給 藥 期 間 不 辭 辛 勞 協 助 完 成 試 驗, 感 謝 學 弟 妹 們 : 仲 偉 秉 彰 禹 潔 楊 平 於 研 究 期 間 一 路 走 來 之 協 助 與 照 顧, 王 耀 宏 老 師 對 論 文 提 供 寶 貴 的 意 見 有 助 於 本 論 文 之 完 成, 特 此 一 併 致 謝 遙 想 在 職 進 修 過 程 中, 感 謝 吳 分 局 長 明 德 廖 課 長 永 瑛 及 四 課 的 同 事 在 公 務 上 不 時 地 給 予 我 支 持 與 鼓 勵, 讓 我 能 兼 顧 學 業 與 公 務 在 我 一 路 辛 勤 走 來, 感 謝 的 人 很 多 : 家 翁 羅 海 賢 將 軍 的 鼓 勵 與 包 容 居 首 功, 外 子 俊 良 默 默 呵 護 暐 知 張 知 的 成 長, 使 我 在 衝 刺 學 業 認 真 於 工 作 崗 位 上 無 後 顧 之 憂, 母 親 大 人 的 關 懷 及 宅 急 便 的 愛 心 食 物 最 後, 僅 以 此 論 文 獻 給 我 最 親 愛 的 家 人 與 關 心 我 的 長 官 及 同 事, 感 謝 你 們 的 包 容 與 愛 護, 願 與 你 們 分 享 這 份 榮 耀 菊 香 謹 誌

5 摘 要 本 研 究 分 為 三 個 章 節 探 討 : 第 一 部 份 是 建 立 液 相 層 析 螢 光 檢 測 方 法 同 步 分 析 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 中 11 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 (marbofloxacin norfloxacin ciprofloxacin lomefloxcain danofloxacin enrofloxacin sarafloxacin difloxacin oxolinic acid nalidixic acid flumequine) 樣 品 以 0.3% 偏 磷 酸 : 氰 甲 烷 (1:1, v/v) 萃 取, 經 減 壓 濃 縮 去 除 氰 甲 烷 後 注 入 HLB 固 相 萃 取 匣 淨 化 液 相 層 析 分 析 條 件 使 用 以 symmetry column C18 (250 x 4.5 mm i.d., 5 μm) 管 柱 分 離, 配 合 三 段 式 程 式 螢 光 偵 檢 器 偵 測, 移 動 相 由 0.1 % 甲 酸 水 溶 液 及 氰 甲 烷 組 成 進 行 梯 度 沖 堤 空 白 肌 肉 組 織 添 加 3 種 濃 度 (25 50 及 250 ng/g; 除 了 danofloxacin 添 加 濃 度 為 6.25, 12.5 及 62.5 ng/g) 建 立 線 性 偵 測 極 限 定 量 極 限 精 密 度 及 精 確 度 之 確 效 試 驗 11 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 之 添 加 試 驗 之 平 均 回 收 率 為 71.7 至 105.3%, 定 量 極 限 為 5.0 至 28.0 ng/g 結 果 顯 示 本 方 法 簡 單 快 速 靈 敏 且 適 合 例 行 性 分 析 工 作 第 二 部 份 是 建 立 液 相 層 析 - 電 噴 灑 - 串 聯 式 質 譜 儀 方 法 檢 測 牛 奶 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 中 18 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 殘 留, 此 方 法 能 篩 檢 及 確 認 包 括 12 種 兩 性 的 喹 諾 酮 抗 菌 劑 (marbofloxacin norfloxacin enrofloxacin ciprofloxacin desethylene ciprofloxacin lomefloxacin danofloxacin sarfloxacin difloxacin ofloxacin orbifloxacin enoxacin) 及 6 種 酸 性 的 喹 諾 酮 抗 菌 劑 (oxolinic acid nalidixic acid flumequine cinoxacin piromidic acid pipemidic acid) 樣 品 之 萃 取 液 為 含 1% 甲 酸 之 氰 甲 烷 溶 液, 經 減 壓 濃 縮 後 以 10% 氰 甲 烷 定 容, 再 以 正 己 烷 去 脂 高 效 能 液 相 層 析 分 析 條 件 為 XDB C8 (150 x 4.6 mm, 5μm) 分 離 管 柱, 移 動 相 由 20 mm 甲 酸 銨 0.1% 甲 酸 水 溶 液 及 氰 甲 烷 組 成 進 行 梯 度 沖 堤, 質 譜 儀 使 用 正 離 子 多 重 反 應 (MRM) 模 式 CCα 及 CCβ 之 測 定 乃 參 考 歐 盟 2002/657/EC 指 令 及 ISO 號 標 準, 使 用 禁 用 物 質 之 模 式 本 實 驗 條 件 下 所 測 得 之 CCα 範 圍 為 0.18 至 0.68 I

6 ng/g,ccβ 範 圍 為 0.24 至 0.96 ng/g 第 三 部 份 是 研 究 吳 郭 魚 體 內 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 (enrofloxacin;enr) 及 其 代 謝 物 (ciprofloxacin;cip 及 des-cip) 藥 物 動 力 學, 吳 郭 魚 以 口 服 血 管 給 藥 單 一 劑 量 分 別 為 10 及 2.5 mg/kg 魚 重, 給 藥 後 定 時 採 樣 ( 小 時 採 樣 ), 每 一 採 樣 點 採 4 隻 魚 體, 使 用 LC/MS/MS 分 析 其 全 血 及 主 要 臟 器 組 織 ( 肝 腎 胆 汁 及 肌 肉 ) 中 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP, des-cip) 殘 留 量,LOQ 為 0.01 μg/g 口 服 及 血 管 兩 種 給 藥 途 徑 後, 吳 郭 魚 的 藥 物 動 力 學 過 程 符 合 一 級 吸 收 二 室 性 開 放 模 式 血 管 給 ENR 藥 的 主 要 藥 物 動 力 學 參 數 為 : 血 中 濃 度 - 時 間 曲 線 下 面 積 (AUC) 消 除 半 衰 期 (t 1/2β ) 最 高 血 中 濃 度 (C max ) 清 除 率 (Cl tot ) 及 表 現 分 佈 容 積 (V dss ) 分 別 為 ± μg.h/ml ± h 4.70 ± 0.36 μg/ml ± L/h/kg ± L/kg 口 服 給 ENR 藥 的 主 要 藥 物 動 力 學 參 數 為 : AUC 消 除 半 衰 期 最 高 血 中 濃 度 出 現 的 時 間 點 (T max ) 最 高 血 中 濃 度 (C max ) 分 別 為 ± μg.h/ml ± h 0.601±0.06h ± μg/ ml 口 服 給 ENR 藥 後 可 在 肝 腎 及 胆 汁 中 測 到 CIP(ENR 的 活 性 代 謝 物 ) 而 des-cip(cip 的 主 要 代 謝 物 ) 僅 在 口 服 給 ENR 藥 後 第 120 ~168 h 的 膽 汁 中 測 到 0.01 ~0.03 μg/ g ENR 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 為 典 型 的 腸 肝 循 環 且 會 大 量 累 積 在 胆 汁 中 這 現 象 可 以 解 釋 吳 郭 魚 在 口 服 ENR 後 到 第 7 天 血 液 及 肌 肉 尚 維 持 在 高 濃 度 的 原 因 中 文 關 鍵 字 : 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 ; 殘 留 ; 液 相 層 析 儀 螢 光 分 析 ; 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 ; 吳 郭 魚 ; 藥 物 動 力 學 II

7 Abstract The study felld into three sections. The first section that a liquid chromatography method with fluorescence detection was developed for simultaneous determination of 11 quinolones (QNs; marbofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, difloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid and flumequine) in chicken, pork, fish and shrimp. The analytes were extracted with 0.3% metaphosphoric acid: acetonitrile (1:1, v/v), followed by a HLB cartridge clean-up procedure. The HPLC separation was carried out on a symmetry column C18 (250 mm x 4.5 mm i.d., 5 μm) with linear gradient elution of 0.1% formic acid: acetonitrile as mobile phase and programmable fluorescence detection. The method was validated by spiking blank animals tissues at three different levels (25, 50 and 250 ng/g; except 6.25, 12.5 and 62.5 ng/g for DAN) and linearity, detection limit, quantification limit, precision and accuracy were checked. Mean recoveries of 11 QNs from edible animal tissues were %. The limits of quantification in different muscle tissues ranged from 5.0 to 28.0 ng/g. The results showed it was simple, rapid, sensitive and suitable for routine test. The second section that a LC-ESI-MS/MS method was developed for determining 18 (fluoro)quinolone (QNs) residues in milk, chicken, pork, fish and shrimp. This method is capable of screening and confirming the presence of 12 amphoteric QNs (marbofloxacin, norfloxacin, enrofloxacin, ciprofloxacin, desethylene ciprofloxacin, lomefloxacin, danofloxacin, sarfloxacin, difloxacin, ofloxacin, orbifloxacin and enoxacin) and 6 acidic QNs (oxolinic acid, nalidixic acid, flumequine, cinoxacin, piromidic acid and pipemidic acid). The drugs were extracted from matrix using acetonitrile with 1% formic acid, diluted in 10% acetonitrile and defatted by extraction with hexane. The LC separation was conducted on a XDB C8 (150 x 4.6 mm, 5μm) column with gradient elution of 20 mm ammonium formate with 0.1% formic acid acetonitrile as the mobile phase. Mass spectral acquisition was completed in the positive ion mode by applying multiple reaction mode (MRM). The decision limit (CCα) and detection capability (CCβ) stated in the Decision No. 2002/657/EC and the ISO III

8 standard No.11843, has been calculated in the case of the nonauthorized substance. The values of CCα ranged from 0.18 to 0.68 ng/g and CCβ ranged from 0.24 to 0.96 ng/g under specified conditions. The third section that the pharmacokinetics of ENR and its active metabolite (CIP and des-cip) were estimated in tilapia after intravenous (i.v.) and oral (p.o.) administration of a single dose of 2.5 and 10 mg/kg body weigh, respectively. At prefixed time points, from 0.25 h to 7 days after administration, whole blood and main tissue (liver, kidney, bile and muscle) from 4 individuals in each were collected. The concentration of ENR and its active metabolites in the main tissue were simultaneously detected by LC/MS/MS method. Limited of quantitation (LOQ) of this method were 0.01μg/g. Pharmacokinetic parameters from both routes were described to have a two- compartment open model with first-order elimination. After i.v. administration, the area under the drug concentration-time (AUC), elimination half-life (t 1/2β ), maximum plasma concentration (C max ), total body clearance (Cl tot ) and apparent volume of distribution at steady-state (V ss ) of ENR were ± μg.h/ml, ± h, 4.70 ± 0.36 μg/ml, ± 4.24 L/h/kg, 1105 ± L/kg,respectively. After oral administration, the AUC, t 1/2β, T max, C max of ENR were ± 76.19μg.h/mL, ± h, 0.601±0.06h, 9.75 ± 0.46μg/mL, respectively. After p.o. administration, CIP could be detected in liver, kidney and bile. Regarding des-cip, the main active metabolite of CIP, could be detected in 120~168 h bile among tissue. ENR and CIP had significance enterohepatic cycle in Tilapia and easily accumulated in bile. It seems reasonable to explain the phenomenon of ENR and CIP maintenance of high concentration in blood and muscle during the test time. Keywords:: quinolones; residue; HPLC-FLD; LC/MS/MS; tilapia; pharmacokinetics IV

9 目 錄 頁 次 摘 要...Ⅰ Abstract.. Ⅲ 目 錄...Ⅴ 表 目 錄...Ⅶ 圖 目 錄...Ⅸ 第 一 章 前 言 第 一 節 引 言. 1 第 二 節 喹 諾 酮 類 藥 物 的 特 性 及 其 用..3 第 三 節 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 問 題 第 四 節 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 檢 測.. 18 第 五 節 喹 諾 酮 類 藥 物 於 水 生 生 物 之 藥 物 動 力 學 研 究.. 25 第 六 節 吳 郭 魚 之 簡 介 第 二 章 高 效 能 液 相 層 析 螢 光 法 分 析 喹 諾 酮 類 殘 留 之 研 究 37 第 一 節 引 言 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 第 三 節 結 果 第 四 節 討 論 第 三 章 LC-ESI/MS/MS 分 析 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 之 研 究.. 58 第 一 節 引 言 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 第 三 節 結 果.. 65 第 四 節 討 論 V

10 第 四 章 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 之 研 究 79 第 一 節 引 言 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 第 三 節 結 果 第 四 節 討 論 103 第 五 章 總 結..105 參 考 文 獻 109 附 錄 一 圖 1~ 附 錄 二 個 人 簡 歷 137 VI

11 表 目 錄 頁 次 表 1-1 台 灣 日 本 歐 盟 之 喹 諾 酮 類 藥 最 大 殘 留 容 許 量 (MRL)...15 表 1-2 喹 諾 酮 類 合 成 抗 菌 劑 殘 留 分 析 方 法.23 表 1-3 氟 滅 菌 使 用 規 範.27 表 1-4 歐 索 磷 酸 用 規 範.28 表 1-5 吳 郭 魚 特 性.36 表 2-1 分 析 11 種 QNs 移 動 相 之 梯 度 設 定 42 表 2-2 螢 光 偵 測 器 激 發 / 放 射 波 長 設 定...42 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 其 紫 外 光 及 螢 光 最 佳 偵 測 波 長 44 表 2-4 比 較 3 種 萃 取 方 法 之 回 收 率 46 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 標 準 曲 線 之 線 性 方 程 式 及 相 關 係 數..46 表 2-6 添 加 組 織 ( 豬 肉 雞 肉 魚 及 蝦 )11 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 之 回 收 率...49 表 2-7 添 加 喹 酮 類 抗 菌 劑 之 精 密 度 確 效 試 驗.50 表 2-8 添 加 喹 酮 類 抗 菌 劑 於 魚 肉 之 LOD 及 LOQ..51 表 2-9 烏 骨 雞 肉 中 ENR 及 CIP 殘 留..51 表 3-1 分 析 18 種 QNs 移 動 相 之 梯 度 設 定 表 3-2 最 佳 化 二 次 質 譜 MRM 之 參 數 設 定.64 表 3-3 相 對 離 子 強 度 之 最 大 可 容 許 範 圍.68 表 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 的 質 譜 碎 片 相 對 離 子 強 度 比 68 表 種 QNs 於 吳 郭 魚 ( 魚 片 ) 之 基 質 效 應 與 絕 對 回 收 率...72 表 種 QNs 於 牛 奶 魚 蝦 豬 肉 雞 肉 之 CCα 及 CCβ 值 73 表 3-7 LC-ESI /MS/MS 及 HPLC-FLD 方 法 檢 測 FAPAS 能 力 試 驗 結 果 73 表 4-1 分 析 ENR CIP 及 des-cip 藥 物 移 動 相 之 梯 度 設 定 82 表 4-2 最 佳 化 二 次 質 譜 MRM 之 參 數 設 定.82 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 標 準 曲 線 之 線 性 方 程 式 及 相 關 係 數..90 表 4-4 全 血 添 加 ENR CIP des-cip 回 收 率 及 方 法 精 密 度.90 表 4-5 魚 肉 添 加 ENR CIP des-cip 回 收 率 及 精 密 度.90 VII

12 表 4-6 口 服 給 藥 後 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 ENR 的 濃 度 92 表 4-7 口 服 給 藥 後 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 CIP 的 濃 度..92 表 4-8 血 管 注 射 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 ENR 的 濃 度 93 表 4-9 血 管 注 射 ENR 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 CIP 濃 度 93 表 4-10 口 服 給 藥 ENR 在 各 組 織 中 CIP 轉 換 率 94 表 4-11 血 管 注 射 ENR 在 各 組 織 中 CIP 轉 換 率.94 表 4-12 口 服 給 藥 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 參 數 102 表 4-13 血 管 注 射 給 藥 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 參 數 102 VIII

13 圖 目 錄 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式..8 頁 次 圖 1-2 喹 諾 酮 類 藥 物 污 染 環 境 可 能 之 途 徑..17 圖 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 HPLC 層 析 圖..44 圖 2-2 HPLC 層 析 圖 (A) 空 白 魚 肉 (B) 魚 肉 添 加 250 ng/g 喹 酮 類 抗 菌 劑. 48 圖 2-3 白 蝦 殘 留 CIP (21 ng/g) 及 ENR (368 ng/g) HPLC 層 析 圖 圖 2-4 烏 骨 雞 殘 留 CIP (16 ng/g) 及 ENR (428 ng/g) HPLC 層 析 圖 圖 2-5 烏 骨 雞 肉 LC-MS/MS 層 析 圖 53 圖 3-1 Norfloxacin 之 二 級 質 譜 圖 及 質 譜 碎 片 可 能 之 裂 解 途 徑..67 圖 3-2 NAL 於 吳 郭 魚 之 基 質 效 應...69 圖 3-3 能 力 試 驗 魚 肉 樣 品 OXO 及 FLU 之 LC/MS/MS 離 子 層 析 圖 74 圖 4-1 吳 郭 魚 以 尾 部 血 管 進 行 注 射 給 藥...85 圖 4-2 吳 郭 魚 以 塑 膠 軟 管 口 服 投 藥...85 圖 4-3 吳 郭 魚 採 樣 組 織 ( 肌 肉 肝 臟 胆 汁 及 腎 臟 )...86 圖 4-4 口 服 第 5 天 膽 汁 ENR CIP 及 des-cip 之 LC/MS/MS 層 析 圖..97 圖 4-5 吳 郭 魚 口 服 給 藥 (0 至 24 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化..98 圖 4-6 吳 郭 魚 口 服 給 藥 (0 至 168 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化 98 圖 4-7 吳 郭 魚 血 管 給 藥 (0 至 24 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化..99 圖 4-8 血 管 給 藥 後 (0 至 168 小 時 ) 組 織 中 ENR 濃 度 變 化 99 圖 4-9 吳 郭 魚 血 管 給 藥 ENR 後 血 藥 濃 度 變 化 IX

14 圖 4-10 以 WinNonlin 預 測 吳 郭 魚 血 管 給 藥 ENR 後 在 血 液 內 的 分 佈..101 圖 4-11 以 WinNonlin 預 測 吳 郭 魚 口 服 給 藥 ENR 後 在 血 液 內 的 分 佈..101 X

15 第 一 章 前 言 第 一 節 引 言 隨 著 國 人 生 活 水 準 提 高, 水 產 品 需 求 量 亦 逐 漸 增 加, 且 對 於 水 產 品 的 食 用 安 全 觀 念 也 愈 來 愈 重 視, 畜 禽 水 產 品 中 藥 物 殘 留 已 成 為 全 世 界 注 目 的 問 題, 此 外 加 入 世 界 貿 易 組 織 (World Trade Organization, WTO) 後, 已 遭 遇 外 國 畜 禽 水 產 品 輸 入 我 國 大 量 販 售, 然 而 在 眾 多 良 莠 不 齊 的 外 來 畜 禽 水 產 品 中, 如 何 兼 顧 產 品 生 鮮 度 與 檢 測 時 效 性, 又 不 讓 有 藥 物 殘 留 污 染 之 劣 質 品 魚 目 混 珠 通 關, 藥 物 殘 留 的 檢 驗 為 一 把 關 的 門 檻, 可 將 藥 物 污 染 之 家 禽 產 品 擋 於 國 門 外, 需 建 立 一 套 健 全 之 藥 物 檢 驗 方 法, 方 可 對 進 口 家 禽 及 水 產 品 把 關, 進 而 保 障 國 民 健 康 及 國 產 優 良 家 禽 及 水 產 品 的 銷 售 而 台 灣 每 年 養 殖 水 產 品 出 口 量 約 10 餘 萬 公 噸, 出 口 價 值 約 100 億 元 ( 農 委 會 漁 業 署, 民 國 91 年 年 報 ) 是 相 當 重 要 的 外 銷 產 業 ; 此 外 歐 美 日 本 等 國 家 對 動 物 用 藥 殘 留 檢 測 標 準 嚴 苛, 在 水 產 品 出 口 前 需 有 效 建 立 檢 驗 監 控 制 度, 一 旦 被 輸 入 國 檢 測 出 過 量 或 不 當 的 藥 物 殘 留, 不 只 是 面 臨 退 運 或 銷 毀 之 財 物 損 失, 更 會 賠 上 國 家 長 久 以 來 努 力 經 營 之 良 好 形 象, 造 成 國 內 水 產 養 殖 魚 類 外 銷 障 礙 為 了 提 昇 檢 測 效 益 應 需 不 斷 研 究 更 準 確 更 有 效 的 殘 留 檢 測 方 法, 而 發 展 多 重 殘 留 檢 測 分 析 是 目 前 趨 勢 本 研 究 主 要 目 的 研 發 靈 敏 度 高 準 確 且 快 速 之 HPLC-FLD 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 (Quinolones, QNs) 殘 留 多 重 分 析 方 法 適 用 於 實 驗 室 例 行 篩 檢 工 作, 檢 測 項 目 及 靈 敏 度 可 涵 蓋 歐 盟 美 國 日 本 及 台 灣 的 殘 留 標 準, 建 立 之 分 析 方 法 可 提 供 國 內 檢 測 實 驗 室 檢 測 QNs 殘 留 方 法 之 參 考 近 年 來 由 於 檢 驗 儀 器 不 斷 推 陳 出 新, 歐 盟 美 國 日 本 先 進 國 家 使 1

16 用 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 (LC-MS/MS) 檢 測 動 物 用 藥 殘 留 之 研 究 相 當 多, 而 國 內 尚 處 於 萌 芽 階 段, 建 立 LC-MS/MS 標 準 檢 驗 方 法 很 有 限, 此 外 HPLC-FLD 檢 測 有 共 析 (co-elute) 問 題, 檢 出 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 QNs 殘 留 需 用 其 它 方 法 確 認, 而 目 前 確 認 食 品 中 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 最 佳 利 器 是 LC/MS/MS 方 法 ; 其 方 法 靈 敏 度 高 選 擇 性 高, 使 用 簡 單 有 機 溶 劑 萃 取 及 去 脂 步 驟, 建 立 簡 單 及 有 效 之 液 相 層 析 - 電 噴 灑 - 串 聯 式 質 譜 儀 方 法 檢 測 不 同 生 物 基 質 18 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 殘 留, 參 考 ISO 標 準 No 及 歐 盟 2002/657/EC 指 令 建 立 LC/MS/MS 方 法 確 效 (CCα, CCβ, LOD, LOQ, 選 擇 性 ); 並 使 用 建 立 HPLC-FLD 及 LC/MS/MS 方 法 進 行 實 驗 室 間 能 力 試 驗 (FAPAS test) 驗 證 建 立 方 法 之 正 確 性 國 內 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 研 究 少 見, 研 究 的 藥 物 及 物 種 有 限, 且 常 侷 限 於 探 討 停 藥 期 半 衰 期 藥 物 動 力 學 研 究 在 水 產 動 物 疾 病 防 治 中, 具 有 十 分 重 要 的 理 論 意 義 和 實 用 價 值 本 研 究 在 建 立 完 整 分 析 方 法, 使 用 口 服 及 血 管 注 射 方 式 給 藥, 除 了 瞭 解 藥 物 代 謝 模 式 外, 進 而 探 討 enrofloxacin 及 其 代 謝 物 (ciprofloxacin des-ciprofloxacin ) 在 吳 郭 魚 體 內 的 分 佈 及 相 關 藥 物 動 力 學 參 數, 並 與 文 獻 中 不 同 水 產 動 物 做 比 較, 建 立 完 整 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 研 究 模 式, 提 供 國 內 研 究 單 位 參 考 2

17 第 二 節 喹 諾 酮 類 藥 物 的 特 性 及 其 應 用 一 喹 諾 酮 類 藥 物 的 分 類 結 構 喹 諾 酮 類 (quinolones, QNs) 藥 物 是 近 20 年 來 迅 速 發 展 重 要 的 合 成 抗 菌 劑, 是 繼 磺 胺 劑 (sulfa drugs) 類 藥 物 之 後 在 合 成 抗 菌 劑 方 面 重 要 的 突 破, 廣 泛 地 使 用 於 人 類 與 畜 牧 水 產 養 殖 的 疾 病 治 療, 在 化 學 結 構 上 屬 吡 酮 酸 衍 生 物 (pyridonecarboxylic acid, PCAs), 俗 稱 喹 諾 酮 類 QNs 均 含 有 吡 酮 酸 (1,4 二 氫 4 氧 吡 啶 3 羧 酸 ) 基 本 結 構, 圖 1-1 為 常 用 的 18 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 最 早 使 用 於 醫 療 上 的 第 一 代 QNs 是 萘 啶 酸 (nalidixic acid, NAL), 於 1962 年 美 國 Sterling Wintrop 研 究 所 的 Lesher 等 將 抗 瘧 疾 藥 氯 喹 (chloroquine) 加 以 修 飾 而 來, 之 後 又 相 繼 合 成 許 多 類 似 化 合 物 : 歐 索 林 酸 (oxolinic acid, OXO) 吡 咯 酸 (piromidic acid, PIR) (cinoxacin, CIN) 等 稱 為 第 一 代 QNs 由 於 第 一 代 QNs 其 抗 菌 作 用 範 圍 狹 窄 只 能 對 抗 革 蘭 氏 陰 性 腸 內 菌 半 衰 期 短 副 作 用 大 細 菌 易 產 生 耐 藥 性, 此 類 藥 物 僅 限 於 治 療 泌 尿 道 感 染, 目 前 已 很 少 使 用 氟 喹 諾 酮 類 (fluoroquinolones, FQNs) 共 同 特 點 是 喹 啉 環 ( 萘 啶 環 ) 的 C-6 位 上 有 氟 (fluorine),c-7 位 上 piperazine 基 或 吡 咯 基 第 一 個 FQs 應 用 在 臨 床 治 療 的 是 Ito 等 (1980) 合 成 的 諾 氟 喹 啉 羧 酸 (norfloxacin, NOR) ( 中 國 大 陸 稱 為 諾 氟 沙 星 ), 其 抗 菌 效 果 勝 過 第 一 代 QNs 百 倍 以 上, 美 國 專 門 負 責 藥 物 命 名 的 機 構 規 定 QNs 非 專 利 名 稱 藥 名 均 稱 為 xacin( 沙 星 ) ( 李 等, 2002), 這 些 帶 有 氟 基 的 第 二 代 QNs 還 包 括 環 丙 沙 星 (ciprofloxacin, CIP) 恩 氟 喹 啉 羧 酸 ( 恩 諾 沙 星 ) (enrofloxacin, ENR) marbofloxacin (MAR) danofloxacin (DAN) 及 ofloxacin (OFL) 等, 抗 菌 活 性 比 第 一 代 QNs 更 好 且 對 於 治 療 腸 內 菌 (Enterbacteriaceae) 其 它 革 蘭 氏 陰 性 菌 例 如 :Pseudomonas aeruginosa 以 3

18 及 一 些 革 蘭 氏 陽 性 球 菌 感 染 有 良 好 效 果, 同 時 增 加 口 服 藥 物 的 吸 收 組 織 分 佈 性 以 及 較 長 體 內 半 衰 期, 此 外 對 治 療 生 物 體 之 中 樞 神 經 毒 性 減 弱 (Ball et al., 2002) 接 著 開 發 第 三 代 QNs 包 括 orbifloxacin (ORB) levofloxacin sparfloxacin 及 grepafloxacin 等 藥 物, 更 顯 著 強 化 對 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 活 性,levofloxacin 為 OFL 的 左 旋 異 構 物, 此 結 構 上 的 差 異 使 levofloxacin 較 OFL 有 更 廣 更 強 的 殺 菌 力 (Ambrose et al., 1997) 而 第 四 代 QNs 包 括 trovafloxacin gatifloxacin moxifloxacin 及 gemifloxacin 除 了 保 有 第 三 代 QNs 的 優 點 外, 同 時 增 加 對 抗 厭 氧 菌 的 效 果 (Owens et al., 2002 ) 大 多 數 原 形 藥 物 經 生 物 體 內 代 謝 後, 其 代 謝 產 物 的 抗 菌 活 性 一 般 較 原 形 藥 物 大 大 降 低, 但 CIP NOR 及 SAR 均 為 代 謝 產 物 卻 仍 俱 有 良 好 抗 菌 活 性, 故 CIP NOR 及 Sarfloxacin (SAR) 均 開 發 為 藥 效 佳 之 氟 喹 諾 酮 類 藥 品 原 形 藥 物 與 代 謝 物 :1.ENR 為 原 形 藥 物,ENR 脫 乙 烷 基 產 物 為 CIP, 而 CIP 脫 烷 基 產 物 為 des-cip,2. pefloxacin (PEF) 為 原 形 藥 物,PEF 脫 甲 烷 基 產 物 為 NOR,3. Difloxacin (DIF) 為 原 形 藥 物,DIF 脫 甲 烷 基 產 物 為 SAR QNs 僅 在 C-3 位 有 羧 基 稱 為 酸 性 QNs (OXO, NAL, FLU, CIN, PIR 及 PIP); 同 時 俱 有 C-3 位 有 羧 基 及 C-7 連 接 piperazinyl 等 含 氮 鹼 基 稱 為 兩 性 QNs (amphoteric QNs), 如 MAR, NOR, ENR, CIP, des- CIP, LOM, DAN, SAR, DIF, OFL, ORB 及 ENO 二 QNs 藥 物 的 作 用 機 轉 QNs 主 要 作 用 機 轉 是 藉 由 與 DNA 螺 旋 酶 (DNA gyrase) 或 topoisomerase IV 之 結 合, 進 而 抑 制 細 菌 DNA 之 合 成 DNA 螺 旋 酶 亦 稱 拓 樸 異 構 酶 Π (Topoisomerase Π, Topo Π) 是 由 兩 個 次 單 元 (A B) 組 成 的 4

19 四 聚 體 (A 2 B 2 ) A B 次 單 元 分 別 是 由 gyr A 及 gyr B 染 色 體 基 因 轉 譯 成 A 次 單 元 具 有 切 斷 雙 股 DNA 的 功 能, 使 DNA 發 生 超 螺 旋 (supercoiling) 環 化 打 結 或 解 結 等 (Gellert,1977) B 次 單 元 具 有 ATP 酶 活 性, 催 化 水 解 ATP 而 釋 出 能 量 提 供 DNA 切 斷 和 重 新 連 接 所 需 之 能 量 故 DNA 螺 旋 酶 參 與 DNA 複 製 起 始 鏈 的 延 長 及 終 止 的 全 部 過 程, 任 何 使 Topo Π 活 性 改 變 的 因 素 對 細 菌 均 是 致 命 (Norris,1988) Topo Ⅳ 由 兩 個 次 單 元 (C E) 組 成 的 四 聚 體 (C 2 E 2 ) C E 次 單 元 分 別 是 由 par C 及 par E 染 色 體 基 因 轉 譯 成, 新 一 代 FQs 可 抑 制 Topo Ⅳ 活 性 (Zechiedrich et al., 1995) DNA gyrase 與 革 蘭 氏 陰 性 菌 有 關, 而 topoisomerase IV 與 G(+) 有 關, 不 同 的 QNs 對 DNA gyrase 及 topoisomerase IV 之 親 和 力 不 同, 因 此 可 解 釋 不 同 的 QNs 對 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 陰 性 菌 抗 菌 範 圍 之 差 異 決 定 QNs 藥 效 的 關 鍵 因 素 :1.QNs 與 細 菌 DNA 螺 旋 酶 的 結 合 力, 2.QNs 對 組 織 的 通 透 性 (QNs 必 須 進 入 細 菌 內 部 才 能 發 揮 藥 效 ) 4-quinolone 母 核 :C-3 羧 基 C-4 羰 基 是 QNs 與 細 菌 螺 旋 酶 結 合 的 基 團, C-6 位 上 有 氟 可 增 強 QNs 與 細 菌 螺 旋 酶 的 結 合 力 及 對 細 胞 的 滲 透 性 C-7 位 上 piperazinyl 鹼 性 且 有 適 當 水 溶 性 的 基 團 有 利 於 提 高 抗 菌 活 性 和 改 善 藥 物 動 力 學 性 質 新 喹 諾 酮 類 藥 物 進 入 細 菌 體 內 的 量 較 NAL 多 倍, 這 也 證 明 了 新 喹 諾 酮 類 藥 物 對 細 菌 體 內 通 透 性 優 良 ( 李 等, 2002) 自 1990 年 ENR 對 於 魚 病 治 療 漸 漸 受 到 注 目 由 於 ENR 在 體 內 體 外 對 於 養 殖 場 及 水 族 箱 觀 賞 魚 之 細 菌 性 疾 病 感 染 均 有 效, 包 括 鲑 產 氣 單 胞 菌 (Aeromonas salmonicida), 弧 鰻 菌 (Vibro angiillarum), 鳟 魚 紅 嘴 病 耶 氏 桿 菌 (Yersinia ruckeri), 鮭 魚 腎 菌 (Renibacterium salmonicida ) Pastyeurella piscida; 然 而 ENR 尚 未 核 准 於 水 產 養 殖 (Rocca et al., 2004) 5

20 三 QNs 藥 物 的 毒 性 QNs 藥 物 的 毒 性 (Berino et al, 2000):1. 藥 物 之 間 的 結 合 : 抗 酸 藥 ( 氫 氣 化 鋁 氫 氣 化 鎂 ) 中 含 Mg 2+ Al 3+ 易 與 QNs 形 成 螯 合 物, 會 降 低 QNs 吸 收,2. 光 敏 性 (photosensitivity),3. 消 化 道 不 適 ( 腹 痛 下 瀉 ), 在 尿 中 形 成 結 晶 產 生 抗 藥 性 菌 株 四 抗 藥 性 的 問 題 目 前 QNs 殘 留 最 受 關 注 的 危 害 是 動 物 的 抗 藥 性 菌 株, 可 經 由 產 品 的 運 輸 交 易 的 過 程 或 人 與 動 物 的 移 動 而 導 致 抗 藥 性 菌 株 傳 播 抗 藥 性 菌 株 (resistance clones) 的 產 生, 是 因 為 人 們 使 用 這 些 能 對 抗 微 生 物 的 抗 生 素 藥 物 時, 在 殺 死 特 定 微 生 物 的 同 時, 也 保 留 了 一 些 突 變 種, 而 這 些 突 變 種 菌 株 即 使 有 藥 物 存 在 時 亦 能 殘 留 下 來, 並 且 繼 續 繁 殖 ; 而 當 人 們 使 用 抗 生 素 藥 物 達 到 濫 用 的 地 步 時, 這 些 能 抗 藥 的 菌 株 就 更 能 被 選 擇 出 來 並 加 以 繁 殖 增 生, 造 成 抗 藥 性 菌 株 大 幅 增 加, 不 僅 擾 亂 了 生 物 界 的 恆 定, 也 使 得 嚴 重 感 染 的 病 人 之 治 療 更 加 困 難 抗 藥 性 的 機 轉 : 細 菌 體 對 FQNs 產 生 抗 藥 性 的 機 轉 有 兩 種 方 式 第 一 種 方 式 是 利 用 染 色 體 突 變 製 造 出 變 異 的 DNA-gyrase 或 Topo IV, 使 得 FQNs 與 gyr A 或 Par C 親 合 力 降 低, 以 減 低 FQNs 對 DNA 重 新 密 合 (resealed) 動 作 的 阻 礙 能 力 (Katsuda et al., 2004) 第 二 種 方 式 是 利 用 主 動 排 出 藥 物 (active efflux) 將 藥 物 排 出 細 胞 外, 以 減 少 FQNs 蓄 積 在 細 菌 細 胞 內 的 濃 度 對 抗 藥 性 較 嚴 重 的 人 畜 共 通 細 菌 (Zoonotic bacteria) 有 沙 門 氏 菌 (Salmonella) 彎 曲 桿 菌 (Campylobacter) 和 腸 球 菌 (Enterococcus) 等 之 細 菌 公 共 衛 生 學 家 均 嚴 密 監 測 Charles (2005) 指 出 家 禽 業 使 用 抗 生 素 提 高 了 導 致 人 類 感 染 食 源 性 病 菌 的 耐 藥 性, 其 中 6

21 彎 曲 桿 菌 普 遍 存 在 於 雞 肉 中 的 病 原 體, 由 於 食 用 未 煮 熟 的 雞 肉, 每 年 有 100 多 萬 美 國 人 發 生 由 彎 曲 桿 菌 污 染 而 導 致 的 食 物 中 毒 耐 藥 性 彎 曲 桿 菌 正 日 益 威 脅 公 眾 的 健 康, 尤 其 是 對 老 年 人 和 免 疫 力 低 的 病 人 監 測 食 品 中 氟 喹 諾 酮 耐 藥 菌 株 的 流 行 率 和 來 源 非 常 重 要 由 於 ENR 會 造 成 彎 曲 桿 菌 對 FQNs 有 抗 藥 性 的 危 害, 美 國 FDA (U.S.A., FDA, 2005) 撤 銷 ENR 使 用 於 家 禽 之 許 可 證 Delsol 等 人 (2009) 指 出 濫 用 ENR 會 造 成 彎 曲 桿 菌 對 FQNs 有 抗 藥 性 的 危 害 7

22 F O N COOH Flumequine (FLU) 氟 滅 菌 C 14 H 12 NFO 3 分 子 量 O O O N COOH Oxolinic acid (OXO) 歐 索 林 酸 C 13 H 11 NO 5 分 子 量 O COOH H 3 C N N C 2 H 5 Nalidixic acid (NAL) 奈 啶 酸 C 12 H 12 N 2 O 3 分 子 量 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 8

23 O O O N N COOH Cinoxacin (CIN) C 12 H 10 N 2 O 5 分 子 量 N O COOH N N N Piromidic acid (PIR) 吡 咯 酸 C 14 H 16 N 4 O 3 分 子 量 N O COOH N N HN Pipemidic acid (PIP) C 14 H 17 N 5 O 3 分 子 量 N 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 9

24 F O COOH N N N Enrofloxacin (ENR) 恩 氟 喹 林 羧 酸 C 19 H 22 FN 3 O 3 分 子 量 F O COOH HN N N Ciprofloxacin (CIP) C 17 H 18 FN 3 O 3 分 子 量 F O COOH H 2 N HN N Desethylene ciprofloxacin (des-cip) C 15 H 16 FN 3 O 3 分 子 量 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 10

25 F O COOH HN N N F Sarafloxacin (SAR) C 20 H 17 F 2 N 3 O 3 分 子 量 F O COOH N N N F Difloxacin (DIF) C 21 H 19 F 2 N 3 O 3 分 子 量 F O COOH N N N Danofloxacin (DAN) 大 安 氟 喹 林 羧 酸 C 19 H 20 FN 3 O 3 分 子 量 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 11

26 F O COOH N N HN Norfloxacin (NOR) C 16 H 18 FN 3 O 3 分 子 量 F O COOH N N N O N Marbofloxacin (MAR) C 17 H 19 FN 4 O 4 分 子 量 F F O COOH HN N F N Orbifloxacin (ORB) C 19 H 20 F 3 N 3 O 3 分 子 量 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 12

27 F O COOH HN N F N Lomefloxacin (LOM) C 17 H 19 F 2 N 3 O 3 分 子 量 F O COOH N N N HN Enoxacin (ENO) C 15 H 17 FN 4 O 3 分 子 量 F O COOH N N O N Ofloxacin (OFL) C 18 H 20 FN 3 O 4 分 子 量 361,14 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 13

28 第 三 節 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 問 題 由 於 少 數 畜 牧 業 者 用 藥 觀 念 不 正 確 或 未 遵 守 停 藥 期, 近 年 來 藥 物 殘 留 事 件 層 出 不 窮, 藥 物 殘 留 問 題 已 漸 受 全 世 界 及 國 人 的 重 視 世 界 各 國 對 食 品 中 動 物 用 藥 殘 留 均 訂 定 最 大 殘 留 容 許 量 (maximum residue limits, MRLs) 或 稱 允 許 殘 留 量 (tolerance level) MRLs: 指 允 許 在 食 品 中 藥 物 或 其 它 化 學 物 質 殘 留 的 最 高 量, 是 國 家 公 布 的 強 制 性 標 準, 決 定 了 公 眾 消 費 的 安 全 性 和 動 物 用 藥 的 停 藥 期, 其 重 要 性 是 顯 而 易 見 的, 故 世 界 各 國 對 於 禽 畜 水 產 品 訂 出 嚴 格 的 殘 留 容 許 標 準, 畜 禽 水 產 品 中 所 殘 留 之 藥 物 的 量, 如 低 於 設 定 之 殘 留 容 許 量, 即 表 示 消 費 此 種 畜 禽 水 產 品 是 無 礙 人 體 健 康 且 是 安 全 的 然 而, 其 殘 留 量 如 超 過 法 定 容 許 量 者, 不 但 違 法 且 有 礙 安 全, 且 須 銷 毀 不 得 銷 售 喹 諾 酮 類 藥 物 (QNs) 抗 菌 範 圍 廣 高 效 能 低 毒 性 組 織 穿 透 強 及 價 格 低 廉 等 特 性, 廣 泛 使 用 於 防 治 家 畜 及 水 產 養 殖 業 治 療 細 菌 性 感 染, 然 而 該 類 藥 物 長 期 和 廣 泛 使 用, 衍 生 出 家 畜 禽 水 產 品 藥 物 殘 留 及 產 生 抗 藥 性 問 題, 不 但 對 人 類 健 康 帶 來 極 大 危 害, 也 影 響 相 關 產 業 的 發 展, 因 此 台 灣 歐 盟 日 本 等 國 家 均 對 QNs 藥 物 嚴 格 限 制 使 用 甚 至 禁 止 使 用, 並 對 QNs 藥 物 制 定 出 MRLs, 表 1-1 台 灣 ( 衛 生 署, 2008) 日 本 (Japan, 2008) 歐 盟 (EU 2377/1990, 2008) 之 喹 諾 酮 類 藥 物 MRLs, 組 織 中 QNs 藥 物 殘 留 物 主 要 是 原 形 藥 物, 故 一 般 選 擇 以 原 形 藥 物 作 標 的 殘 留, 多 數 QNs 藥 物 之 代 謝 物 代 謝 很 快, 排 泄 物 中 主 要 是 脫 甲 基 產 物 ENR 的 主 要 代 謝 物 為 CIP(ENR 脫 烷 基 ) 仍 具 有 較 強 之 生 物 活 性, 應 列 入 總 殘 留 量, 故 歐 盟 日 本 的 標 的 殘 留 物 為 ENR 及 CIP 總 合 14

29 表 1-1 台 灣 日 本 歐 盟 之 喹 諾 酮 類 藥 最 大 殘 留 容 許 量 (MRL)(ppm) 藥 物 禽 畜 種 類 台 灣 日 本 歐 盟 NAL 牛 肉 魚 肉 牛 肉 FLU 豬 肉 綿 羊 雞 肉 OXO NOR DAN ENR 與 CIP 之 總 合 牛 肉 豬 肉 雞 肉 魚 肉 牛 肉 雞 肉 牛 肉 雞 肉 豬 肉 牛 奶 牛 肉 雞 肉 豬 肉 牛 奶 OFL 雞 肉 MAR 牛 肉 豬 肉 牛 奶 雞 肉 SAR 火 雞 鮭 魚 牛 肉 雞 肉 ORB 豬 肉 牛 奶 牛 肉 雞 肉 DIF 豬 肉 魚 肉 - : 為 未 訂 容 許 量

30 每 年 有 數 噸 醫 療 用 藥 使 用 於 診 斷 治 療 預 防 疾 病 (Andreu et al,2007), 造 成 醫 藥 及 動 物 用 藥 持 續 釋 入 環 境 中, 透 過 途 徑 為 製 造 過 程 丟 棄 不 要 或 過 期 產 品 及 排 泄 物 很 多 物 質 或 它 們 的 生 物 活 性 代 謝 物 最 後 進 入 泥 土 及 水 域 環 境 ( 有 些 未 代 謝 或 具 有 活 性 的 代 謝 藥 物 進 入 污 水 處 理 場 不 會 消 失, 甚 至 於 抗 菌 活 性 會 被 濃 縮 ), 因 其 具 有 的 物 理 或 化 學 性 質 會 累 積 進 而 危 害 陸 生 生 物 或 水 產 動 物, 在 這 些 有 害 反 應 中 以 細 菌 持 續 產 生 抗 藥 性 最 為 被 關 注, 其 原 因 是 畜 牧 場 及 水 產 養 殖 場 大 規 模 使 用 抗 生 素 及 持 續 增 加 使 用 水 產 養 殖 常 用 投 藥 途 徑 包 括 投 予 含 喹 諾 酮 類 藥 物 (QNs) 飼 料 顆 粒 方 式 或 藥 浴 之 方 式, 但 剩 餘 未 被 魚 吃 的 餌 料 及 含 藥 排 泄 物 與 魚 糞 便 混 合 到 達 底 泥 後 藥 物, 約 有 70-80% 藥 物 最 後 會 進 入 環 境 中, 此 外 養 殖 池 水 中 未 分 解 之 殘 留 藥 物 也 可 能 會 經 由 鰓 部 吸 收 而 增 加 體 內 藥 物 蓄 積 量 長 期 濫 用 QNs 之 養 殖 池 水 與 底 泥 均 會 受 QNs 藥 物 污 染, 除 了 殘 留 在 食 品 也 會 經 由 家 庭 及 醫 院 廢 棄 物 人 及 動 物 排 泄 物 養 殖 池 水 及 底 泥 污 染, 經 由 地 表 水 河 水 污 泥 等 途 徑 進 入 造 成 飲 用 水 殘 留 問 題 ( 圖 1-2) 16

31 圖 1-2 喹 諾 酮 類 藥 物 污 染 環 境 可 能 之 途 徑 (Andreu et al,2007) 17

32 第 四 節 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 檢 測 一 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 檢 測 方 法 喹 諾 酮 類 藥 物 (QNs) 殘 留 直 接 危 害 人 體 健 康, 近 年 來 畜 禽 水 產 品 中 藥 物 殘 留 問 題 倍 受 矚 目, 美 國 日 本 台 灣 歐 盟 等 國 家 均 嚴 格 監 控 QNs 殘 留 並 發 展 檢 測 方 法 檢 測 QNs 在 動 物 性 食 品 中 的 殘 留, 必 須 選 擇 特 異 性 強 靈 敏 度 高 高 效 及 快 速 的 檢 驗 方 法 常 使 用 之 QNs 殘 留 檢 測 方 法 有 微 生 物 分 析 法 酵 素 免 疫 分 析 方 法 高 效 毛 細 管 電 泳 法 高 效 液 相 層 析 法 及 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 法 1. 微 生 物 分 析 法 (Microbiological assays) 微 生 物 法 適 用 於 禽 畜 組 織 中 殘 留 的 抗 菌 藥 物 之 初 步 篩 檢, 但 由 於 缺 乏 特 異 性 及 較 難 定 量, 檢 出 抗 生 物 質 陽 性 樣 品 需 再 使 用 其 它 方 法 確 認 及 定 量 Okerman 等 (1988) 使 用 改 良 式 歐 洲 四 個 平 板 法 (four plate test) 檢 測 市 售 肉 中 殘 留 ENR 及 CIP 之 殘 留 Althaus 等 (2008) 採 用 6 種 培 養 基 發 展 檢 測 牛 奶 中 抗 菌 劑 殘 留 之 多 重 分 析 方 法, 其 中 使 用 Escherichia coli CECT 4201(ATCC 11303) 檢 測 QNs 殘 留 2. 酵 素 免 疫 分 析 方 法 (Enzyme-linked immunosorbent assay;elisa) ELISA 方 法 比 微 生 物 分 析 法 靈 敏 簡 便 快 速 不 需 昂 貴 儀 器 設 備, 可 做 為 多 件 檢 體 快 速 篩 檢, 惟 試 劑 套 組 費 用 較 高 且 試 劑 有 效 期 限 約 半 年 由 於 QNs 主 要 結 構 部 分 相 同 或 相 近, 某 一 QN 抗 體 與 其 它 QNs 存 在 一 定 的 交 叉 反 應 (cross-reactivity) 也 無 法 確 認 QNs 殘 留 種 類, 檢 出 陽 性 樣 品 需 再 使 用 其 它 方 法 確 認 及 定 量 Scortichini 等 人 (2008) 使 用 5101FLUM1p 及 5101FLUQG1p 兩 組 ELISA 試 劑 檢 測 蛋 禽 肉 及 飼 料 中 QNs 殘 留,ELISA 試 劑 對 QNs 交 叉 反 應 分 別 為 (FLU:100% CIP:124% NOR:100% ENR:92% ENO 及 OXO:57% MAR: 18

33 16% SAR:4% DIF:1%) 3. 毛 細 管 電 泳 (Capillary electrophoresis;cze) CE 也 屬 於 高 效 液 相 層 析 的 一 種, 主 要 是 利 用 粒 子 會 受 到 電 場 作 用 而 移 動, 利 用 電 位 的 差 異 來 分 離 藥 物 以 毛 細 管 介 質 作 固 定 相, 將 待 測 樣 品 置 於 V 之 電 位 差 作 用 下, 藉 由 樣 品 內 各 物 質 電 荷 質 量 比 不 同 而 產 生 不 同 的 移 動 速 率 CE 具 有 操 作 簡 單 分 析 快 速 分 離 效 率 高 之 優 點, 與 HPLC 方 法 比 較, 進 樣 之 注 射 量 較 少, 儀 器 感 度 較 HPLC 差 Hernadez 等 人 (2000) 使 用 C18 管 柱 以 固 相 萃 取 法 淨 化, 配 合 Capillary zone electrophoresis (CZE) 檢 測 10 種 QNs 藥 物, 在 豬 血 漿 樣 品 偵 測 極 限 為 1.1 到 2.4 ppm Hernadez 等 (2004) 使 用 C18 管 柱 以 固 相 萃 取 法 淨 化, 配 合 CZE 檢 測 雞 肉 中 8 種 QNs 藥 物, 其 中 CIP 及 SAR 波 峰 會 重 疊 (overlapped peak) 無 法 有 效 分 離 4. 高 效 液 相 層 析 法 (HPLC) QNs 具 有 強 的 紫 外 光 吸 收 (UV) 和 螢 光 (FLD) 性 質, 故 分 析 QNs 以 HPLC 最 常 搭 配 檢 測 器 為 UV 或 FLD 18 種 QNs 之 LOD 均 在 10 ng/g 以 下, 能 滿 足 多 數 QNs 檢 測 需 求, 層 析 圖 基 線 (base line) 穩 定, 干 擾 較 UV 少, 靈 敏 度 較 UV 檢 測 法 高 倍 而 由 於 第 一 代 QNs 與 氟 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 (FQNs) 在 紫 外 光 光 譜 或 螢 光 光 譜 上 有 些 差 異, 因 此 很 多 文 獻 將 第 一 代 QNs 與 FQNs 分 開 進 行 檢 測 (Sue et al., 2002) 一 般 FQNs (Pecorelli et al., 2003;Zhao et al., 2007) 採 用 λex( 激 發 波 長 )= 280 ~ 297 nm,λem( 放 射 波 長 )= 450 ~ 510 nm, 其 它 QNs (OXO NAL FLU) 則 採 用 λex= 320 nm,λem= 365 ~ 445 nm,pir 的 螢 光 強 度 較 弱, 多 採 用 UV 280 nm 檢 測 ;FQNs 使 用 280 nm 偵 測,OXO NAL FLU 則 採 用 255 nm 偵 測 19

34 由 於 QNs 為 兩 性 化 合 物, 同 時 具 有 酸 性 基 (COOH 基 ) 及 鹼 性 基 (piperazine), 逆 相 HPLC 方 法 操 作 簡 單, 為 殘 留 QNs 檢 測 主 要 的 分 析 方 法 常 使 用 C18 管 柱 分 析, 早 期 發 展 之 C18 管 柱 固 定 相 表 面 殘 存 大 量 矽 醇 基 呈 游 離 態 與 QNs 結 構 之 -NH 或 -COOH 基 結 合, 造 成 peak 拖 尾 或 滯 留 時 間 不 穩 定 或 過 長 為 了 解 決 上 述 問 題, 最 佳 化 移 動 相 組 成 是 最 方 便 的 方 法 這 些 方 法 包 括 :1. 調 整 有 機 溶 劑 ( 甲 醇 氰 甲 烷 ) 之 比 例, 2. 加 入 三 甲 胺 調 整 ph( 離 子 抑 制 )3. 加 入 離 子 對 試 劑 (ion pair reagon 如 : 1-heptane sulfonic acid 及 sodium dodecyl sulfate ) 目 前 有 許 多 C18 管 柱 在 表 面 結 構 已 改 良 可 用 簡 單 移 動 相 (0.01% 甲 酸 溶 於 水 氰 甲 烷 ) 即 可 達 到 非 常 好 之 分 離 效 果 Turiel 等 人 (2003) 使 用 C18 styrenedivinylbenzene(sdb) C18 cation -exchange SDB-cation -exchange 固 相 萃 取 方 法 檢 測 地 表 水 中 QNs 藥 物 殘 留, 所 使 用 之 移 動 相 為 0.01% 甲 酸 溶 於 水 與 氰 甲 烷, HPLC-UV nm 檢 測 9 種 QNs 藥 物 (ENO NOR CIP DAN ENR CIN OXO FLU NAA) 殘 留 Pecorelli 等 人 (2003) 建 立 飼 料 中 13 種 QNs 藥 物 殘 留 檢 測 方 法, 樣 品 以 0.2% 偏 磷 酸 / 氰 甲 烷 (7:3) ph 2.6 萃 取, 選 用 HPLC UV 278 nm 檢 測 或 FLD 278/446 nm 檢 測 10 種 QNs (PIP rufloxacin ENO OFL NOR CIP DAN ENR DIF CIN) 320/365 nm 檢 測 3 種 QNs (OXO NAL FLU) 5. 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 (Liquid chromatography /tandem mass spectrometry ;LC/MS/MS) LC/MS/MS 選 擇 性 和 靈 敏 度 最 佳, 即 使 滯 留 時 間 相 同 但 質 荷 比 m/z 不 同 亦 可 分 離 HPLC 雖 分 離 效 果 佳, 但 FQNs 有 許 多 結 構 非 常 接 近, 即 使 調 整 至 最 佳 化 分 離 條 件 亦 無 法 用 滯 留 時 間 (retention time;rt) 20

35 分 離, 在 QNs 殘 留 確 認 分 析 方 法 中 LC/MS/MS 是 5 種 分 析 方 法 中 最 理 想 之 方 法 Hermo 等 人 (2006) 建 立 豬 肉 中 QNs 殘 留 的 多 重 分 析 方 法, 比 較 LC/MS 方 法 之 LOQ(quantification limit; 定 量 偵 測 極 限 ) 比 HPLC -UV 方 法 低 倍,LC/MS/MS 方 法 之 LOQ 比 HPLC-UV 方 法 低 35 倍 二 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 樣 品 前 處 理 動 物 用 藥 殘 留 分 析 的 複 雜 性 主 要 原 因 是 :1. 生 物 樣 品 基 質 的 複 雜 性, 須 去 除 基 質 中 油 脂 蛋 白 質 碳 水 化 合 物 及 有 機 酸 等 物 質,2. 待 測 成 分 的 濃 度 很 低 ( 低 於 百 萬 分 之 一 ) 分 離 和 檢 測 是 設 計 殘 留 分 析 方 法 的 兩 個 主 要 步 驟 Posyniak 等 人 (2001) 以 雞 肉 添 加 FQNs 探 討 用 水 溶 液 - 溶 劑 蛋 白 分 解 酵 素 (protease) 水 解 超 音 波 及 固 相 萃 取 (C8 C18 或 SDB1) 等 步 驟 除 去 雜 質 之 效 應 首 先 用 5% 三 氯 醋 酸 (TCA) 不 同 比 例 5% TCA 及 氰 甲 烷 萃 取 液 試 驗, 水 溶 液 - 溶 劑 萃 取 以 5% TCA: 氰 甲 烷 (8:2) 回 收 率 最 佳, 選 用 5% TCA: 氰 甲 烷 (8:2) 萃 取 再 以 固 相 萃 取 SDB1 淨 化 回 收 率 最 高 1. 萃 取 溶 劑 QNs 殘 留 分 析 方 法 絕 大 多 數 樣 品 使 用 酸 化 或 鹼 化 溶 劑 萃 取 ( 表 1-2), 如 氰 甲 烷 - 氫 氧 化 氨 溶 液 氰 甲 烷 - 偏 磷 酸 溶 液 甲 醇 - 乙 酸 溶 液 乙 醇 - 乙 酸 溶 液 等, 由 於 QNs 與 蛋 白 質 結 合 較 緊 密, 上 述 之 萃 取 溶 劑 對 QNs 俱 有 較 高 的 溶 解 性, 兼 有 良 好 的 組 織 滲 透 性 去 蛋 白 質 和 釋 放 藥 物 的 作 用 ; 萃 取 溶 劑 中 有 機 溶 劑 ( 甲 醇 氰 甲 烷 ) 的 含 量 和 ph 影 響 萃 取 效 率 及 雜 質 的 共 萃 取, 提 高 有 機 溶 劑 比 率 和 酸 度 則 QNs 回 收 率 增 加, 但 同 時 萃 取 雜 質 增 加 ( 李 等, 2002) 21

36 2. 淨 化 方 法 使 用 酸 化 溶 劑 或 鹼 化 溶 劑 萃 取 並 經 適 當 稀 釋 後, 可 直 接 用 固 相 萃 取 管 柱 (SPE) C18 HLB 或 陽 離 子 交 換 ( 如 SCX 苯 磺 酸 基 PRS 丙 磺 酸 基 ) 進 行 純 化 濃 縮 後, 獲 得 較 少 干 擾 之 主 要 分 析 藥 物 之 樣 品 液 供 分 析 Bailac 等 人 (2004) 建 立 HPLC-UV 方 法 檢 測 雞 肉 中 7 種 QNs 殘 留, 採 用 NOR 當 內 標, 比 較 3 種 固 相 萃 取 (HLB MAX SDB-RPS) 及 直 接 萃 取 法 之 最 低 偵 測 極 限 (LOQ) 及 回 收 率,3 種 固 相 萃 取 回 收 率 66 ~ 91%( 除 了 CIP 選 用 MAX 回 收 率 只 有 25%) LOQ 5~ 10 ng/g, 直 接 萃 取 法 回 收 率 42-80% LOQ 10 ~ 30 ng/g ; 使 用 HLB 固 相 萃 取 在 HPLC 層 析 圖 中 DAN 有 不 純 物 共 析 問 題 Mazaruela 等 (2004) 建 立 HPLC-UV 及 HPLC-FLD 方 法 檢 測 牛 奶 中 5 種 FQNs 殘 留, 比 較 2 種 固 相 萃 取 (Strata X Strata Screen A) 回 收 率, Strata X 不 論 萃 取 液 ph 值 改 變 回 收 率 為 %,Strata Screen A 為 混 合 型 疏 水 性 - 陰 離 子 型 固 相 萃 取 ph 值 9.0 回 收 率 最 佳 為 86 ~106% 22

37 表 1-2 喹 諾 酮 類 合 成 抗 菌 劑 殘 留 分 析 方 法 樣 品 種 類 萃 取 淨 化 方 法 分 析 條 件 偵 測 條 件 回 收 率 LODs % μg/kg HPLC: 家 禽 豬 肉 0.3% 偏 磷 酸 : 氰 甲 烷 SPE ENV+ 分 別 以 水 1 % 甲 酸 : 甲 醇 及 正 己 烷 水 清 洗, 使 用 2 %TFA: 氰 甲 烷 (25:75) 沖 堤 雞 肉 二 氯 甲 烷 再 以 1M 氫 氧 化 鈉 萃 取 後 磷 酸 中 和,SPE C18 4%TFA: 氰 甲 烷 (25:75) 沖 堤 雞 肉 二 氯 甲 烷 再 以 1M NaOH 萃 取 磷 酸 中 和, SDB-PRS 4%TFA: 氰 甲 烷 (25:75) 沖 堤 豬 腎 動 物 組 織 豬 腎 蛋 動 物 組 織 蛋 雞 肉 蝦 肉 豬 肉 動 物 組 織 魚 肉 氰 甲 烷 ph 4.0 1M 鹽 酸 1M 鹽 酸 磷 酸 緩 衝 液 ph % 偏 磷 酸 : 氰 甲 烷 (1:10) SDB-RPS 甲 醇 :1M 氨 水 (75:25) 沖 堤 C18 1mM 磷 酸 鉀 : 甲 醇 (1:1) 沖 堤 C18 1 mm 磷 酸 鉀 : 甲 醇 (1:1) 沖 堤 HLB 甲 醇 :10% 氨 水 (19:1) 沖 堤 C18 甲 醇 : 磷 緩 衝 液 (7:3) XDB-C8 (10mM 檸 檬 酸 氰 甲 烷 ph 4.5 ) LC/MS XDB-C8 (20 mm 醋 酸 銨 氰 甲 烷 ) 毛 細 管 電 泳 fused silica capillary 總 長 47cm 50 mm 磷 酸 緩 衝 液 ph 8.4 XDB-C8 (10 mm 檸 檬 酸 氰 甲 烷 ph 4.5 ) C18 0.1% 甲 酸 氰 甲 烷 C 磷 酸 ph 3.5: 甲 醇 (85:15) 沖 堤 C18 0.1M 磷 酸 緩 衝 液 加 三 乙 胺 氰 甲 烷 C % 甲 酸 氰 甲 烷 C18 氰 甲 烷 磷 緩 緩 液 含 SDS UV 250/280 nm MS ESI (+) SIM mode MS QqQ ESI (+) MRM UV nm UV 250/280 nm MS QqQ SRM UV 280 nm UV 280 nm <0.2 參 考 文 獻 Clemente (2006) Hermo (2006) Beltran (2004) Bailac (2004) Toussaint (2005) Gigosos (2000) Gigosos (2003) FLD Zhao (2007) UV FLD Su (2003) 23

38 續 表 1-2 樣 品 種 類 萃 取 淨 化 方 法 分 析 條 件 偵 測 條 件 回 收 率 % 動 物 組 織 5% TCA C18 牛 奶 0.1% 甲 酸 魚 氰 甲 烷 蛋 牛 奶 牛 奶 TFA 沉 澱 蛋 白 質 NH4Cl 緩 衝 液 ph 9 Strata X Screen A 甲 醇 含 4% 磷 酸 沖 堤 Strata X ENV+ MAX 1% TFA: 甲 醇 (25:75) 沖 堤 AQUA TM C18 25 mm 磷 酸 緩 衝 液 氰 甲 烷 LODs μg/kg 參 考 文 獻 FLD Verdon (2005) UV 280 nm FLD 280/440 UV 250/280 FLD MS ESI (+) SIM mode Marazuela (2004) <1 Hermo (2008) 蛋 魚 肉 2% 醋 酸 溶 於 氰 甲 烷 0.1N 氫 氣 化 鈉 0.2 g 氯 化 鈉 HLB 甲 醇 : 氰 甲 烷 (8:2) 沖 堤 HLB 含 1% TFA 之 氰 甲 烷 XTerra MS C18 1% 甲 酸 氰 甲 烷 C18 0.2% 甲 酸 氰 甲 烷 甲 醇 MS QqQ ESI (+) MRM MS QqQ ESI (+) MRM 內 標 : LOM NOR MS QqQ ESI (+) MRM Durden (2007) Samanidou (2008) Oasis HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance):copolymer of N-vinylpyrrolidone and divinylbenzene Oasis MAX: mixed-mode polymeric sorbent with strong anion-exchange quaternary amine group in the surface of the copolymer ( 混 合 型 疏 水 性 - 強 陰 離 子 交 換 ) SDB-RPS : poly(styrene-divinylbenzene) copolymer sorbent that plays slight cation- exchange interation due to sulphonic group ( 陽 離 子 交 換 ) Strata X: modified strene-divinylbenzene Strata Screen A : mixed- anion-exchange/c8 sorbent 24

39 第 五 節 喹 諾 酮 類 藥 物 於 水 產 動 物 之 藥 物 動 力 學 研 究 一 水 產 養 殖 投 藥 途 徑 房 等 人 (2004) 及 Samuelsen 等 人 (2006) 比 較 藥 浴 法 肌 肉 注 射 法 口 服 法 血 管 注 射 法 等 不 同 投 藥 途 徑 在 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 研 究 中 的 優 缺 點 給 藥 途 徑 不 同 會 影 響 藥 物 的 吸 收 速 度 吸 收 量 血 管 注 射 法 之 給 藥 途 徑 藥 物 直 接 通 過 血 液 循 環 進 入 分 佈 相, 沒 有 吸 收 過 程 而 以 藥 浴 法 肌 肉 注 射 法 及 口 服 法 等 方 式 給 藥, 藥 物 需 通 過 吸 收 過 程 才 能 進 入 血 液 循 環, 有 些 通 過 胃 腸 道 吸 收 的 藥 物 會 產 生 首 途 效 應 (first-pass effect) 1. 藥 浴 法 (bath treatment) 藥 浴 係 將 指 定 之 藥 品, 添 加 於 養 殖 池 或 容 器 內 之 水 中 以 浸 泡 投 藥, 藥 浴 適 於 容 易 得 弧 菌 病 鰓 病 及 寄 生 蟲 病 的 稚 魚 值 得 注 意 : 喹 諾 酮 類 藥 物 會 與 海 水 中 陽 離 子 結 合 因 而 降 低 魚 體 吸 收 速 度 不 同 藥 物 即 使 藥 浴 濃 度 相 同 但 在 不 同 組 織 中 的 濃 度 中 的 濃 度 相 差 很 大, 藥 浴 時 需 考 慮 於 水 產 動 物 在 不 同 組 織 對 藥 物 的 吸 收 率 及 在 體 內 的 殘 留 情 況 2. 肌 肉 注 射 法 (intramuscular injection) 是 通 過 毛 細 血 管 壁 被 吸 收, 具 有 給 藥 量 準 確 吸 收 迅 速 療 效 可 靠 等 特 點 此 外, 藥 物 的 水 溶 性 血 液 循 環 速 度 及 注 射 部 位 毛 細 血 管 分 佈 量 均 會 影 響 藥 物 吸 收 速 率 Nouws 等 人 (1988) 以 鯉 魚 及 虹 鳟 進 行 肌 肉 注 射 CIP 劑 量 15 mg/kg,1 小 時 血 中 濃 度 達 到 最 高, 分 別 為 3.49 和 2.37 μg/ml; 房 等 人 (2003) 以 對 蝦 進 行 肌 肉 注 射 NOR 劑 量 10 mg/kg,2 分 鐘 血 中 濃 度 達 到 最 高 25

40 3. 口 服 法 (oral administration) 經 口 係 將 指 定 之 藥 品, 添 加 混 合 或 浸 潤 於 水 產 飼 料 中 或 以 其 他 方 式 經 口 投 藥 口 服 法 分 為 投 餵 法 與 口 灌 法, 純 藥 液 給 藥 與 藥 餌 給 藥 之 藥 物 動 力 學 並 不 相 同, 甚 至 藥 物 使 用 不 同 的 載 體 (carrier) 進 行 給 藥 其 藥 物 動 力 學 也 不 相 同 藥 物 經 口 服 後 通 過 吸 收 進 入 淋 巴 和 血 液, 有 些 藥 物 成 分 會 在 消 化 道 被 破 壞, 有 些 不 能 被 消 化 道 吸 收, 有 些 還 可 能 會 與 飼 料 中 的 某 些 成 分 起 拮 抗 作 用, 都 會 影 響 藥 物 的 療 效 楊 等 人 (2003) 比 較 不 同 口 服 方 式 CIP 的 生 物 利 用 率, 口 服 CIP 水 溶 液 的 生 物 利 用 率 為 %, 口 服 CIP 飼 料 糊 的 生 物 利 用 率 為 6.22 % 投 餵 法 ( 飼 料 添 加 劑 ) 給 藥 方 式 最 貼 近 現 場 水 產 動 物 治 療 方 式, 投 餵 法 給 藥 之 藥 物 動 力 學 最 貼 近 體 內 吸 收 分 佈 代 謝 和 排 泄 過 程 ; 當 水 產 動 物 患 病, 食 慾 下 降 甚 至 不 攝 食 時, 口 服 法 就 不 能 實 施, 且 該 法 不 可 避 免 在 水 中 有 部 分 的 溶 失 口 灌 法 是 強 制 性 口 服 法, 其 操 作 方 法 為 使 用 麻 醉 劑 (MS-222 benzocaine 等 ) 將 魚 麻 醉 ( 避 免 傷 害 魚 ), 用 塑 膠 導 管 將 調 製 好 的 藥 液 或 藥 餌 灌 入 魚 的 胃 或 腸 道, 可 以 確 保 定 時 給 藥 及 給 藥 量 口 灌 法 的 缺 點 為 :1. 有 時 會 出 現 藥 物 回 吐 現 象,2. 使 用 麻 醉 劑 可 能 會 降 低 藥 物 的 吸 收, 影 響 藥 物 動 力 學 4. 血 管 注 射 法 血 管 注 射 法 是 研 究 藥 物 動 力 學 最 多 的 方 法, 常 用 於 評 價 一 種 藥 物 劑 型 的 生 物 利 用 率 水 產 動 物 血 管 注 射 法 包 括 動 脈 注 射 (intraarterial administration) 靜 脈 注 射 (intra-venous administration) 血 管 內 給 藥 (intra-vascular administration) 血 管 注 射 法 較 費 時 適 用 於 高 單 價 之 魚 種 26

41 二 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 的 施 用 方 式 由 於 抗 藥 或 耐 藥 性 微 生 物 的 廣 泛 性 出 現, 對 環 境 產 生 衝 擊 以 及 在 水 產 養 殖 生 物 體 內 藥 物 殘 留 等, 使 得 施 用 FQNs 藥 物 處 理 養 殖 生 物 疾 病 相 關 問 題 日 漸 不 被 鼓 勵 或 禁 止 美 國 於 2005 年 撤 銷 ENR 治 療 家 禽 疾 病 使 用 執 照, 農 委 會 於 民 94 國 年 公 告 停 止 製 造 及 輸 入 口 服 液 劑 及 飲 水 散 劑 劑 型 之 FQNs 類 動 物 藥 品 的 措 施,ENR 則 僅 准 以 注 射 方 式 治 療 對 微 生 物 引 起 的 感 染 ( 農 委 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局,2006) 為 防 止 藥 物 的 濫 用 及 加 強 管 理, 農 委 會 於 民 國 85 年 即 公 告 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 為 毒 劇 藥 品 品 目 ( 農 業 委 員 會,1996) 之 一, 另 依 據 農 委 會 公 告 之 動 物 用 藥 品 使 用 手 冊 ( 農 委 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局,2006) 規 定 可 使 用 於 動 物 之 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 品 項 DAN ENR FLU NAL OFL OXO; 水 產 動 物 用 藥 使 用 規 範 只 有 允 許 使 用 包 含 氟 滅 菌 及 歐 索 林 酸 等 15 種 藥 物, 其 使 用 規 範 列 於 表 1-3 及 表 1-4, 使 用 對 象 用 途 用 法 用 量 停 藥 期 及 使 用 上 應 注 意 事 項 1. 氟 滅 菌 (flumequine) 使 用 規 範 性 狀 : 白 色 微 細 結 晶 性 粉 末, 無 臭 而 帶 有 微 苦, 不 溶 於 水, 溶 於 氯 仿 及 乙 醇 作 用 : 對 於 革 蘭 陰 性 菌 具 有 抗 菌 作 用 魚 病 上 主 要 用 於 巴 斯 德 桿 菌 運 動 性 產 氣 單 胞 菌 愛 德 華 氏 菌 感 染 之 治 療 注 意 事 項 : 本 劑 不 可 連 續 使 用 7 日 以 上 表 1-3 氟 滅 菌 使 用 規 範 對 象 水 產 動 物 投 藥 途 徑 劑 量 或 濃 度 及 用 法 用 途 吳 郭 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 使 用 3~5 日 鰻 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 投 藥 3~5 日 停 藥 期 ( 日 ) 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 巴 斯 8 德 桿 菌 或 親 水 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 20 27

42 2. 歐 索 磷 酸 (oxolinic acid) 使 用 規 範 性 狀 : 白 色 至 帶 白 色 柱 狀 結 晶 或 結 晶 性 粉 末, 無 味, 無 臭 易 溶 於 蟻 酸, 可 溶 於 鹼 性 水, 幾 乎 不 溶 於 水 及 其 他 有 機 溶 劑 作 用 : 對 革 蘭 陰 性 菌 有 抗 菌 作 用 魚 病 上 主 要 用 於 運 動 性 產 氣 單 胞 菌 愛 德 華 氏 菌 弧 菌 或 巴 斯 德 桿 菌 感 染 之 治 療 注 意 事 項 : 本 劑 不 可 連 續 使 用 7 日 以 上 表 1-4 歐 索 磷 酸 使 用 規 範 對 象 水 產 動 物 投 藥 途 徑 劑 量 或 濃 度 及 用 法 用 途 停 藥 期 ( 日 ) 吳 郭 魚 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 或 巴 斯 德 桿 菌 之 感 染 鯉 魚 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 鯽 魚 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 草 魚 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 大 頭 鰱 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 鰻 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 25 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 藥 浴 5 ppm, 連 續 藥 浴 3~胞 菌 或 鰻 敗 血 症 假 單 胞 菌 或 5 日 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 淡 水 鲶 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 虹 鱒 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 鮭 屬 21 投 藥 3~5 日 產 氣 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 香 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 14 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 藥 浴 10 ppm, 連 續 藥 浴 3 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 ~5 日 虱 目 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 弧 菌 14 投 藥 3~5 日 之 感 染 草 蝦 經 口 50mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 30 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 假 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 斑 節 蝦 經 口 50mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 30 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 假 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 28

43 續 表 1-4 對 象 水 產 動 物 投 藥 途 徑 劑 量 或 濃 度 及 用 法 用 途 停 藥 期 ( 日 ) 經 口 50mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 30 長 腳 大 蝦 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 假 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 蛙 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 弧 菌 或 產 黃 色 素 菌 屬 之 感 染 鱉 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 三 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 及 分 析 模 式 藥 物 動 力 學 (pharmacokinetics) 或 稱 藥 物 動 態 學, 藥 物 在 經 由 不 同 方 式 投 予 動 物 後, 其 血 中 或 體 內 藥 物 濃 度 的 變 化, 會 因 藥 物 在 進 入 體 內 後 與 血 漿 蛋 白 結 合 能 力 的 不 同 與 動 物 種 類 而 有 所 差 異, 運 用 數 學 原 理 和 方 法 闡 述 藥 物 在 生 物 體 內 量 的 變 化 規 律 ( 吸 收 分 佈 代 謝 與 排 泄 的 情 形 ) 藥 物 動 力 學 研 究 在 水 產 動 物 疾 病 防 治 提 供 實 用 價 值, 可 作 為 制 定 用 藥 方 案 確 定 給 藥 劑 量 用 藥 週 期 與 停 藥 期 提 供 科 學 依 據 目 前 研 究 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 模 式 為 房 室 模 式, 房 室 模 式 是 把 藥 物 在 體 內 的 藥 物 動 力 學 狀 況 按 轉 換 速 度 不 同 分 成 若 干 個 分 室 (compartment), 但 不 具 有 解 剖 生 理 學 之 意 義 房 室 模 式 可 再 被 分 為 單 室 模 式 (one- compartment model) 二 室 模 式 (two- compartment model) 與 多 室 模 式 (multi- compartment model) 單 室 模 式 中 血 漿 內 藥 物 排 除 曲 線 為 一 級 指 數 排 除 速 率 排 除, 將 全 身 視 為 同 一 個 房 室, 藥 物 能 快 速 分 佈 所 有 組 織 內 並 達 到 平 衡 二 室 模 式 其 藥 物 曲 線 為 雙 指 數 衰 減, 藥 物 分 別 分 佈 進 入 中 央 室 (central compartment) 與 周 邊 室 (peripheral compartment) 兩 個 房 室, 中 央 室 ( 第 一 室 ) 包 括 血 液 細 胞 外 液 肝 與 腎 等 高 血 流 灌 注 組 29

44 織, 藥 物 在 中 央 室 分 佈 快 速 均 勻 ; 周 邊 室 又 稱 第 二 室, 代 表 藥 物 平 衡 較 慢 的 組 織 ( 肌 肉 與 脂 肪 ), 藥 物 在 體 內 出 現 分 佈 相 (distribution, phase Ι,α phase) 與 排 除 相 (elimination, phaseⅡ,β phase), 可 視 為 二 個 一 級 指 數 速 率 過 程 的 總 和 ( 呂 等,1995) 非 室 性 模 式 (noncompartment) 是 假 設 無 數 個 周 邊 腔 室 和 中 央 腔 室 所 組 成, 藥 物 可 在 中 央 腔 室 和 周 邊 腔 室 以 不 同 的 速 率 來 回 移 動 非 室 室 模 式 分 析 較 為 簡 便, 不 需 要 進 行 隔 室 設 定, 同 樣 能 描 述 藥 物 在 生 物 體 內 吸 收 分 佈 消 除 等, 但 因 能 提 供 藥 物 動 力 學 參 數 較 少, 可 用 來 評 估 :1. 生 體 可 利 用 率,2. 清 除 率,3. 擬 似 分 布 體 積,4. 藥 物 半 衰 期,5. 藥 物 與 代 謝 物 平 均 穩 定 濃 度 及 所 需 時 間, 故 在 目 前 水 產 動 物 毒 理 學 中 應 用 較 少 ( 房 等,2004) 此 外 還 有 生 理 藥 物 動 力 學 模 式 (physiologically based pharmacokinetics, PBPK), 也 稱 血 流 或 灌 流 模 式, 是 最 理 想 的 藥 物 動 力 學 模 式, 可 以 完 全 表 達 最 真 實 的 藥 物 代 謝 情 況, 但 需 要 關 於 生 物 體 完 整 之 生 理 學 資 料, 如 組 織 容 積 藥 物 在 血 液 和 組 織 的 分 配 係 數 和 擴 散 係 數 等 PBPK 模 式 最 大 優 點 是 可 提 供 動 物 類 比 法 的 可 能 性, 可 將 既 有 某 一 藥 物 之 模 式 透 過 合 理 的 參 數 設 定 推 論 至 其 它 條 件 或 其 它 種 類 動 物 ( 房 等,2004) 四 一 般 常 用 藥 物 動 力 學 參 數 A: 吸 收 相 的 零 時 截 距 B: 排 除 相 的 零 時 截 距 分 室 1: 中 央 室 分 室 2: 周 邊 室 或 組 織 室 K01: 藥 物 在 中 央 室 之 吸 收 速 率 常 數 K10: 藥 物 在 中 央 室 之 排 除 速 率 常 數 K12: 藥 物 從 中 央 室 向 周 邊 室 移 動 之 速 率 常 數 30

45 K21: 藥 物 從 周 邊 室 向 中 央 室 移 動 之 速 率 常 數 α: 藥 物 之 分 佈 速 率 常 數 β: 藥 物 之 末 端 排 除 速 率 常 數 C max (maximum concentration): 血 中 藥 物 最 高 濃 度 T max (time to maximum concentration): 達 血 中 藥 物 最 高 濃 度 之 時 間 t 1/2α (distribution half life): 藥 物 分 佈 半 衰 期 t 1/2α = 0.693/α t 1/2β (elimination half life): 藥 物 排 除 半 衰 期 t 1/2β =0.693/β AUC (aera under curve): 血 中 藥 物 濃 度 對 時 間 曲 線 下 面 積 Cl tot (total body clearance): 整 體 藥 物 清 除 率 ( 生 物 體 消 除 器 官 在 單 位 時 間 內 清 除 藥 物 的 血 漿 容 積 ) V dss (volume of distribution): 體 內 藥 物 分 佈 達 穩 定 狀 態 之 分 佈 體 積 MRT (mean residence time) 平 均 滯 留 時 間 : 所 有 藥 物 分 子 在 體 內 滯 留 之 平 均 時 間 Fabs 絕 對 可 用 率 ( absolute availability): Fabs %= ( AUCoral / AUC i.v x t 1/2 i.v / t 1/2 oral ) 100 五 治 療 策 略 治 療 策 略 的 擬 定 著 重 於 發 揮 最 大 的 藥 效 及 產 生 抗 藥 性 的 風 險 最 低, 選 擇 適 當 投 藥 方 式 及 施 用 正 確 的 劑 量 重 要 參 考 依 據 是 藥 物 動 力 學 的 研 究 結 合 敏 感 性 試 驗 (susceptibility) Shojaee 等 (2000) 研 究 使 用 抗 菌 劑 治 療 動 物 之 最 大 效 應 之 治 療 策 略 為 AUIC 值 ( AUC/MIC ) 需 大 於 100 以 及 Cmax/ MIC 值 需 大 於 8 細 菌 敏 感 性 試 驗 主 要 是 檢 測 最 低 抑 菌 濃 度 (minimum inhibitory concentration;mic),dalsgaad 等 人 (1991) 分 離 最 容 易 感 染 魚 隻 的 菌 株 並 檢 測 ENR 之 MIC 值 μg/ml 鳟 魚 紅 嘴 病 耶 氏 桿 菌 (Yersinia 31

46 ruckeri) 0.032μg/mL 鰻 弧 菌 (Vibrio anguillarum) 0.012μg/mL 鲑 產 氣 單 胞 器 菌 (Aeromonas salmonicida ), 即 使 對 最 不 敏 感 的 鏈 球 菌 株 (Streptococcus spp.) 其 MIC 值 也 在 μg/ml 六 影 響 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 的 因 素 許 多 因 素 會 影 響 藥 物 在 動 物 體 內 之 動 力 學, 包 括 種 屬 差 異 性 別 健 康 狀 況 溫 度 鹽 度 給 藥 途 徑 等 都 會 產 生 不 同 的 藥 物 動 力 學 分 佈 1. 種 屬 差 異 Barron 等 人 (1988) 認 為 不 同 種 類 水 產 動 物 之 間 藥 物 動 力 學 參 數 的 差 異 可 能 是 解 剖 學 上 的 體 積 差 異 藥 物 與 血 漿 蛋 白 及 組 織 結 合 的 差 異 所 致 Hansen 等 人 (2000) 同 時 以 靜 脈 注 射 口 服 與 藥 浴 10 mg/kg BW 之 FLU 發 現 鱈 魚 (Gadus morhua) 與 梳 隆 頭 魚 (Ctenolabrus rupestris) 之 生 物 可 利 用 率 分 別 為 65% 41% 楊 等 (2003) 列 出 CIP 在 不 同 動 物 之 t 1/2β 消 除 半 衰 期 ( 鯉 魚 :16.47 h 中 華 絨 毛 蟹 :40.34 h 鼠 :3.30 h 兔 1.63 h 狗 : 2.56 h 豬 :3.15 h 馬 :2.63 h 牛 :2.44 h 山 羊 :1.46 h 綿 羊 :1.20 h 雞 :9.01 h ), 該 藥 物 在 不 同 動 物 體 內 消 除 半 衰 期 的 差 異 的 原 因 可 能 是 : 不 同 動 物 對 藥 物 進 行 排 泄 的 機 制 不 同, 如 中 華 絨 毛 蟹 是 無 脊 椎 動 物, 主 要 是 通 過 觸 角 腺 和 肝 胰 腺 對 藥 物 進 行 降 解 或 排 泄, 而 魚 類 是 通 過 腎 臟 和 呼 吸 器 官 ( 鰓 鰓 上 腺 肺 等 ) 進 行 擴 散 消 除, 哺 乳 動 物 還 可 通 過 腎 臟 的 主 動 運 輸 予 以 消 除 經 濟 水 產 養 殖 動 物 有 蝦 類 ( 對 蝦 斑 節 蝦 ) 蟹 類 ( 中 華 絨 毛 蟹 ) 魚 類 ( 鯉 科 魚 鱸 形 目 鯛 科 等 ) 以 及 爬 行 類 ( 鱉 ), 不 可 貿 然 將 某 一 種 藥 物 在 一 種 水 產 動 物 的 藥 物 動 力 學 結 果 應 用 於 不 同 種 水 產 動 物 2. 性 別 性 別 差 異 對 藥 物 動 力 學 影 響 的 研 究 較 少 Poher 等 人 (1998) 研 究 鰈 魚 32

47 (Scophthalmus americanus) 單 劑 量 口 服 OXO 的 藥 物 動 力 學 時 發 現 性 別 對 OXO 藥 物 動 力 學 過 程 沒 有 影 響 3. 健 康 狀 況 研 究 水 產 動 物 的 藥 物 動 力 學, 絕 大 多 數 是 選 用 健 康 活 潑 的 動 物 進 行, 然 而 在 水 產 動 物 用 藥 施 用 對 象 多 為 染 病 的 個 體, 理 論 上 研 究 感 染 疾 病 的 生 物 的 藥 物 動 力 學 最 為 真 實, 但 實 際 操 作 上 較 困 難 Uno(1996) 研 究 健 康 的 香 魚 及 感 染 弧 菌 的 香 魚 之 羥 四 環 素 (OTC) 藥 物 動 力 和 生 物 利 用 率, 兩 組 魚 的 消 除 半 衰 期 相 近, 但 生 物 利 用 有 明 顯 差 別, 可 能 是 健 康 狀 況 較 差 時 影 響 了 藥 物 的 分 佈 與 血 漿 蛋 白 的 結 合 率 及 代 謝 藥 物 之 酵 素 的 活 性 4. 溫 度 水 溫 在 水 產 動 物 是 影 響 藥 物 動 力 學 的 重 要 因 素, 由 於 魚 體 會 隨 著 環 境 溫 度 變 化 而 改 變 體 溫, 水 溫 低 水 產 動 物 體 內 酵 素 活 性 較 低, 藥 物 需 要 更 長 的 時 間 來 排 除 虹 鳟 透 過 飼 料 投 予 10 mg/kg. BW 之 ENR 後 (Lucchetti et al., 2004) 在 12~13.25 的 水 溫 下, 經 過 日 ( 每 日 水 均 溫 日 數 ), 可 食 部 位 殘 留 ENR 濃 度 仍 達 170 μg/kg, 仍 高 於 EU 最 高 容 許 量 100 μg/kg, 因 此 Lucchetti 建 議 要 將 停 藥 期 延 長, 最 好 可 到 日 以 上 5. 鹽 度 鹽 度 對 藥 動 學 的 影 響 在 不 同 的 水 產 動 物 中 結 果 不 同 房 等 人 (2006) 研 究 鹽 度 1 和 15 下 進 行 南 美 白 對 蝦 肌 肉 注 射 NOR 劑 量 10 mg/kg BW 藥 物 動 力 學 研 究, 消 除 半 衰 期 分 別 為 4.21 h 和 1.14 h Ishida (1992) 研 究 海 水 虹 鳟 和 淡 水 虹 鳟 口 服 OXO 40 mg/kg BW, 在 24 小 時 後 OXO 在 海 水 虹 鳟 的 消 除 速 率 明 顯 大 於 淡 水 虹 鳟 七 受 試 藥 物 目 前 研 究 喹 諾 酮 類 藥 物 於 水 產 動 物 之 藥 物 動 力 學 有 OXO( 梁 33

48 等,2006;Ishida, 1992; Samuelsen et al., 2000) FLU (Plakas et al., 2000) ENR(Bowser et al., 1992 ; Intorre et al., 2000; Lucchetti et al., 2004; Stoffregen et al., 1997 ;Fang et al., 2007 ) CIP(Guo et al., 2005; 楊 等, 2003) SAR(Martinsen et al., 1995) DIF(Ding et al 2006) NOR ( 房 等, 2003; 房 等, 2006; Wang et al., 2008 ) 等 藥 物 梁 等 人 (2006) 研 究 單 次 血 管 注 射 10 mg/kg BW 之 OXO FLU, 在 鰻 魚 (Muanesox cinereus) 體 內 代 謝 過 程 為 一 級 代 謝 二 室 模 型, 兩 種 藥 物 在 鰻 魚 體 內 都 有 很 強 的 首 途 效 應, 易 在 胆 汁 中 累 積 Martinsen 等 人 (1955) 同 時 比 較 四 種 QNs 包 含 OXO FLU NER SAR 單 一 劑 量 各 自 投 予 大 西 洋 鮭 (Atlantic salmon) 後 之 變 化, 在 10 的 飼 養 環 境 下, 四 種 藥 物 的 生 物 利 用 率 分 別 為 與 2.2% 表 示 在 大 西 洋 鮭 體 內 FLU 與 NER 藥 物 動 力 學 分 佈 比 OXO 或 SAR 藥 物 好 Intorre 等 人 (2000) 研 究 鱸 魚 (Dicentrarchus labrax)enr 之 藥 物 動 力 學, 比 較 口 服 5 mg/kg b.w 及 藥 浴 (5 10 或 50 ppm 進 行 4 8 小 時 ), 研 究 顯 示 口 服 吸 收 較 慢 (C max =1.39 ± 0.67 μg/ml 在 8 小 時 ) 且 消 除 也 較 慢 (t 1/ 2 為 25 小 時 ),CIP(ENR 主 要 代 謝 物 ) 在 肝 臟 中 常 檢 測 到, 在 血 清 中 偶 而 會 檢 出 但 不 會 在 肌 肉 中 出 現, 所 以 ENR 在 鱸 魚 體 內 代 謝 成 CIP 的 轉 換 程 度 較 低 Wu 等 人 (2006) Tang 等 人 (2006) 均 利 用 肌 肉 注 射 給 予 中 華 絨 毛 蟹 ENR, 前 者 給 予 10 或 20 mg/kg BW, 後 者 劑 量 為 5 mg/kg b.w, 兩 者 均 可 發 現 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP) 在 鰓 肌 肉 肝 胰 腺 與 性 腺 各 組 織 中 殘 留, 血 淋 巴 液 中 ENR 之 代 謝 屬 於 二 室 開 放 模 式, 組 織 中 藥 物 分 佈 均 以 肝 胰 腺 之 含 量 最 高, 然 而 Wu 等 人 (2006) 認 為 雖 然 CIP 可 在 所 有 組 織 中 被 檢 測 出, 但 因 其 濃 度 甚 低, 無 法 單 室 或 二 室 模 式 解 釋 血 淋 巴 液 中 藥 物 動 力 學 分 佈 34

49 第 六 節 吳 郭 魚 之 簡 介 吳 郭 魚 (Tilapia) 原 產 於 非 洲, 全 世 界 共 有 100 多 種 吳 振 輝 及 郭 啟 彰 兩 位 先 生 於 1946 年 從 新 加 坡 引 進 俗 稱 土 種 吳 郭 魚 (Oreochromis mossambica), 又 稱 南 洋 鯽 仔 黑 鯽 仔 在 台 灣 為 了 紀 念 兩 位 先 生 引 進 的 功 勞, 特 別 取 其 姓 氏 來 命 名 為 吳 郭 魚 ; 在 中 國 大 陸 其 中 文 名 羅 非 魚 ( 源 自 其 原 產 地 尼 羅 河 非 洲 ); 在 香 港 因 形 狀 和 肉 質 像 鯽 魚 而 叫 非 洲 鯽 吳 郭 魚 由 於 它 具 有 生 長 快 繁 殖 快 食 性 雜 適 應 性 強 等 特 點, 現 在 是 世 界 水 產 業 的 重 點 研 究 培 養 的 淡 水 養 殖 魚 類, 且 被 譽 為 未 來 動 物 性 蛋 白 質 的 主 要 來 源 之 一 台 灣 目 前 主 要 是 莫 三 鼻 口 孵 魚 雌 魚 (Oreochromis mossambicus) 尼 羅 口 孵 魚 雄 魚 (Oreochromis niloticus) 兩 種 魚 的 雜 交 種, 改 良 種 吳 郭 魚 俗 稱 福 壽 魚, 當 初 所 引 進 的 吳 郭 魚 目 前 已 被 淘 汰 台 灣 目 前 主 要 的 養 殖 地 區 分 布 在 嘉 南 平 原 一 帶, 以 2001 年 為 例, 台 南 縣 生 產 超 過 24,000 噸 的 吳 郭 魚, 創 造 超 過 7 億 的 產 值, 位 居 第 二 的 嘉 義 地 區 也 有 18,000 噸, 超 過 4 億 的 產 值, 佔 了 台 灣 吳 郭 魚 產 量 ㄧ 半 以 上 生 產 量 從 1953 年 的 6,301 公 噸 逐 年 增 加, 尤 其 是 1973 年 到 1982 年 呈 現 快 速 上 升 的 趨 勢,1993 年 的 57,570 公 噸 達 到 一 個 高 峰 後 便 開 始 走 下 坡 (1973 年 到 1982 年 生 產 過 剩, 魚 價 暴 跌, 對 吳 郭 魚 養 殖 業 者 造 成 衝 擊 ), 至 2000 年 為 50,000 公 噸, 年 間 穩 定 成 長, 約 有 超 過 8 萬 公 噸 的 產 量 ( 農 委 會 漁 業 署 - 漁 業 統 計 民 國 年 報 ) 近 年 來, 吳 郭 魚 漸 漸 受 到 消 費 者 的 青 睞, 市 場 接 受 度 也 逐 漸 增 加, 台 灣 吳 郭 魚 目 前 以 外 銷 為 主, 在 產 業 界 的 努 力 之 下, 美 國 歐 洲 沙 烏 地 阿 拉 伯 韓 國 加 拿 大 及 日 本 等 國 外 市 場 陸 續 被 開 發 建 立, 特 別 是 美 國 市 場, 開 創 出 吳 郭 魚 另 一 片 天 空 從 民 國 六 十 年 以 後, 價 格 皆 穩 定 地 成 長, 在 2000 年 時, 我 國 輸 歐 盟 水 產 品 被 驗 出 氯 黴 素 及 硝 基 夫 喃 代 謝 物 35

50 殘 留, 暫 停 出 口 至 歐 洲 國 家, 產 量 不 進 反 退, 所 幸 經 過 各 界 努 力, 挽 回 頹 勢 近 年 來 由 於 中 國 大 陸 越 南 等 各 國 開 始 投 入 吳 郭 魚 養 殖, 競 爭 激 烈 波 動 較 大, 如 何 維 持 外 銷 競 爭 優 勢 價 格 已 漸 趨 穩 定, 則 有 賴 於 漁 業 署 漁 民 外 銷 漁 產 加 工 廠 的 努 力 表 1-5 吳 郭 魚 特 性 中 文 名 英 文 名 俗 名 分 類 體 態 食 性 習 性 棲 息 環 境 繁 殖 方 式 吳 郭 魚 Tilapia 南 洋 鯽 仔 福 壽 魚 姬 鯛 潮 鯛 聖 彼 得 魚 台 灣 鯛 屬 於 鱸 型 目 (Perciformes) 慈 鯛 科 (Cichlidae) 體 長 通 常 是 15~30 公 分 左 右, 體 側 扁 胸 鰭 腹 鰭 尾 鰭 都 很 大, 尾 鰭 呈 圓 形 無 分 叉, 背 鰭 有 硬 棘 15~17, 軟 條 10~12, 腹 鰭 1 棘 5 軟 條 ; 臀 鰭 3 硬 棘 10 軟 條 ; 胸 鰭 13 軟 條, 各 鰭 之 硬 棘 均 十 分 銳 利 吳 郭 魚 是 屬 於 雜 食 性 的, 它 的 食 物 包 括 : 水 棲 昆 蟲 有 機 物 碎 屑 浮 游 生 物 人 工 飼 料 大 型 植 物 莖 葉 及 藻 類 吳 郭 魚 原 產 於 非 洲, 性 不 耐 寒, 對 低 溫 抵 抗 力 弱, 一 般 而 言, 水 溫 在 10 以 下 即 易 凍 傷 死 亡 能 耐 高 鹽 度, 在 鹽 度 高 達 的 海 水 中 和 淡 水 中 均 能 正 常 生 活, 是 一 種 廣 鹽 性 的 魚 類 河 川 及 河 口 附 近 的 海 水 域 池 塘 湖 泊 等 繁 殖 期 會 在 池 底 挖 碟 形 的 巢 來 產 卵, 雌 魚 會 利 用 口 孵 卵, 並 照 顧 小 魚 到 可 以 獨 立 生 活 為 止 36

51 第 二 章 液 相 層 析 螢 光 法 分 析 喹 諾 酮 類 殘 留 之 研 究 第 一 節 引 言 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 (QNs) 為 目 前 廣 泛 使 用 於 家 畜 禽 與 水 產 養 殖 業, 若 業 者 用 藥 不 當, 如 : 未 遵 守 藥 品 停 藥 期 或 任 意 將 原 料 直 接 添 加 於 飼 料 或 飲 水 中, 造 成 上 市 販 售 的 畜 禽 水 產 品 藥 物 殘 留 問 題, 因 此 也 成 為 美 國 歐 盟 日 本 及 中 華 民 國 等 國 家 實 施 嚴 格 監 控 的 藥 物 對 象 殘 留 的 監 控 計 畫 包 括 制 定 MRL 和 設 計 殘 留 分 析 方 法, 先 進 國 家 均 發 展 高 效 快 速 靈 敏 及 準 確 的 多 重 殘 留 分 析 方 法, HPLC 方 法 俱 有 上 述 特 性, 目 前 仍 是 多 數 實 驗 室 檢 測 QNs 殘 留 最 常 用 的 方 法 檢 視 國 內 公 告 方 法 : 動 物 用 藥 殘 留 標 準 檢 驗 方 法 -Quinolone 類 多 重 殘 留 分 析 檢 測 7 種 QNs (OXO NAL FLU PIR DAN ENR SAR) 需 同 時 使 用 UV 及 FLD 偵 測 儀 ( 行 政 院 衛 生 署, 2002), 移 動 相 中 需 加 入 SDS( 對 偶 離 子 試 劑 ); 另 一 公 告 方 法 為 檢 測 3 種 QNs (DAN NOR ENR) ( 中 華 民 國 國 家 標 準, 2002), 目 前 公 告 方 法 項 目 及 偵 測 極 限 不 足 以 因 應 進 口 食 品 及 輸 出 水 產 品 檢 測 需 求 參 考 國 內 外 文 獻 中 QNs 之 UV 及 FLD 偵 測 條 件, 找 出 最 佳 化 之 層 析 條 件 結 合 最 有 效 的 樣 品 前 處 理 方 法 去 除 基 質 干 擾, 進 行 方 法 確 效 ( 回 收 率 精 密 度 偵 測 極 限 ), 研 發 敏 感 性 高 準 確 且 快 速 之 HPLC-FLD 多 重 分 析 方 法 檢 測 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 等 禽 畜 水 產 品 中 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 37

52 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 一 藥 品 及 儀 器 設 備 1. 儀 器 設 備 振 盪 器 ( 型 號 KM, 廠 牌 IWAKI); 離 心 機 ( 型 號 himac CF 16RX, 廠 牌 Hitachi Koki) ;12 孔 吹 氮 氣 蒸 發 裝 置 ( 型 號 MG-2000, 廠 牌 EYELY ) ; 真 空 固 相 萃 取 裝 置 (manifold); 液 相 層 析 儀 為 安 捷 倫 110 系 列, 配 合 安 捷 倫 Q1312A 螢 光 檢 出 器, 數 據 處 理 為 Chemstation for LC 3D Res.A (847) 執 行 ; 層 析 管 柱 Symmetry C18 (250 mm x 4.5 mm, 5μm) 購 自 Waters 2. 藥 品 及 溶 液 配 製 本 實 驗 所 使 用 之 藥 品 皆 為 試 藥 級 以 上 的 藥 劑, 其 中 Norfloxacin (NOR, 100.0%), difloxacin (DIF, 100.0%), oxolinic acid (OXO, 100.0%), nalidixic acid (NAL, 100.0%), flumequine (FLU, %) 及 lomefloxacin (LOM, 100.0%) 購 自 Sigma ;Marbofloxacin (MAR, 99.8%), ciprofloxacin (CIP, 100.0%), danofloxacin (DAN, 98.4%), sarafloxacin HCl (SAR, 99.7%) 及 difloxacin HCl (DIF, 98.4%) 購 自 RDH. Enrofloxacin (ENR, 98%) 購 自 Fluka, 氫 氧 化 鈉 (NaOH) 及 偏 磷 酸 (metaphosphoric acid ) 為 試 藥 特 級 購 自 Nacalai Tesque; 甲 酸 (formic acid) 甲 醇 (methanol) 及 氰 甲 烷 (acetonitrile) 為 HPLC 級 購 自 J.T. Backer; 固 相 萃 取 匣 (solid-phase extraction cartridge, SPE) OASIS HLB (3 ml, 60 mg) 購 自 Waters ; 超 純 水 由 Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA) 製 造 38

53 二 分 析 樣 品 採 樣 3 隻 烏 骨 雞 購 自 屏 東 市 超 級 市 場 ;2 隻 烏 骨 雞 由 屏 東 縣 潮 州 鎮 養 雞 場 取 得 ; 25 件 魚 及 15 件 蝦 由 2006 年 檢 驗 進 口 及 出 口 水 產 品 ( 經 濟 部 標 準 檢 驗 局 抽 樣 ), 所 有 分 析 樣 品 均 保 存 在 -20 三 溶 液 配 製 11 種 QNs 標 準 品 以 50% 氰 甲 烷 ( 含 2% 0.1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 ) 配 製 成 200μg/mL 濃 度 (stock solution: 儲 備 溶 液 ), 以 10% 氰 甲 烷 稀 釋 配 製 成 10μg/mL 混 合 標 準 品, 再 以 10% 氰 甲 烷 做 系 列 稀 釋 25 ~ 1000 ng/ml (DAN 濃 度 6.25 至 250 ng/ml) 試 驗 用 標 準 溶 液 (working solution), 標 準 品 溶 液 以 褐 色 定 容 瓶 4 至 少 可 保 存 3 個 月 四 準 確 度 (accuracy) 及 精 密 度 (precision) 之 分 析 添 加 回 收 率 試 驗 : 精 秤 已 均 質 之 空 白 樣 品 添 加 標 準 品 最 終 濃 度 為 及 250 ng/g (DAN 濃 度 為 及 62.5 ng/g), 每 一 濃 度 均 做 4 重 覆 試 驗, 計 算 回 收 率, 作 為 評 估 本 方 法 準 確 度 之 依 據 為 了 了 解 每 次 配 製 的 藥 品 和 儀 器 之 精 密 度 以 確 保 實 驗 有 良 好 再 現 性, 以 吳 郭 魚 片 添 加 及 250 ng/g ( 除 了 DAN 添 加 12.5 ng/g) 進 行 回 收 率 試 驗, 進 行 日 內 精 密 度 (intra-day) 及 日 間 精 密 度 (inter-day) 測 試 日 內 精 密 度 : 吳 郭 魚 片 於 當 次 添 加 3 種 不 同 濃 度 之 QNs 標 準 品 進 行 試 驗, 重 複 檢 測 4 次 計 算 平 均 值 及 標 準 偏 差 ; 日 間 精 密 度 : 連 續 3 天, 分 別 檢 測 添 加 3 種 不 同 濃 度 之 QNs 標 準 (4 重 複 檢 測 ), 計 算 3 天 試 驗 之 平 均 值 及 標 準 偏 差 39

54 五 偵 測 極 限 測 定 空 白 魚 肉 添 加 低 濃 度 15 ng/g ( 七 重 覆 試 驗 ), 最 低 偵 測 極 限 ( the limit of detection;lod) 及 定 量 偵 測 極 限 (the limit of quantification ;LOQ ) 分 別 為 3 倍 標 準 偏 差 (SD) 及 10 倍 標 準 偏 差, 計 算 方 式 參 考 Verdon 等 人 (2005) 之 方 法. 六 樣 品 製 備 樣 品 解 凍 後 細 切 以 均 質 機 均 質, 精 稱 2.0 g 放 置 於 50 ml 塑 膠 離 心 管, 添 加 試 驗 則 加 入 標 準 品, 於 室 溫 靜 置 15 分 鐘 加 入 20 ml 樣 品 萃 取 液 (0.3% 偏 磷 酸 metaphosphoric: 氰 甲 烷, 1:1,v/v) 以 振 盪 器 高 速 振 盪 萃 取 10 分 鐘 後 再 以 6000 rpm 離 心 10 min 將 上 層 液 倒 入 250 ml 濃 縮 瓶 40 減 壓 濃 縮 去 除 氰 甲 烷, 萃 取 液 經 濾 紙 (ADVANTEC 5A) 過 濾, 以 避 免 萃 取 液 進 入 HLB 後 堵 塞 注 入 預 先 以 甲 醇 3 ml 再 以 去 離 子 水 3 ml 潤 洗 之 HLB, 調 整 真 空 固 相 萃 取 裝 置 流 速 至 每 秒 一 滴 ( 每 滴 體 積 約 0.04 ml) 棄 流 出 液, 以 3 ml 水 流 後 4 ml 甲 醇 沖 堤, 沖 提 液 於 40 氮 氣 濃 縮 並 以 10% 氰 甲 烷 ( 含 0.1% 甲 酸 ) 定 容 至 1 ml, 檢 液 以 0.45 μm Nylon 濾 膜 過 濾 後 注 入 HPLC 分 析 七 HPLC 分 析 條 件 逆 相 層 析 管 柱 為 Symmetry C18 (250 mm x 4.5 mm i.d., 5 μm; Waters) 柱 溫 35, 移 動 相 組 成 : 溶 液 A (0.1% formic acid 溶 液, ph 2.5) 溶 液 B ( 氰 甲 烷 ), 流 速 1.0 ml /min, 表 2-1 移 動 相 之 梯 度 設 定 : 平 衡 (post time)10 分 鐘, 注 入 量 50 ml 表 2-2 螢 光 偵 測 器 激 發 λex / 放 射 λem 波 長 設 定 40