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石悠谷
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1 Online system: 农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2016, 2(1): 90~97 DOI: /j.issn 哲罗鲑精子冷冻保存 1* 田永胜 2 马允解子牛王位莹罗志远李胜忠张俊杰 1 中国水产科学研究院黄海水产研究所 / 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛 ;2 新疆奔腾生物技术有限公司, 乌鲁木齐 80000; 新疆伊犁河流域工程建设开发管理局, 乌鲁木齐 80000; 新疆农业大学动物医学院, 乌鲁木齐 * 通讯作者,tianys@ysfri.ac.cn 摘要哲罗鲑 (Hucho taimen) 是分布于额尔齐斯河和黑龙江等水域的冷水性珍稀鱼类, 对其精子冷冻保存技术进行研究并建立精子冷冻库, 对于哲罗鲑种质保存人工繁殖发育苗种培育及种群恢复都具有重要的意义本研究利用生理盐水葡萄糖胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 等配制了 9 种精子稀释液 (MPRS, RS, Hanks, ELS, EG1, EG2, Stein, SS-2 和 D15), 对哲罗鲑精子在稀释液中活力加入抗冻剂后活力和液氮中冷冻后活力进行检测, 发现精子在以上稀释液中均具较高活力 (7.00±2.65)%~(96.67± 2.08)%, 加入二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO) 后活力下降, 冷冻后仅在 ELS 和 D15 中具有极低活力 (1.21±)% 和 (1.1±)% 进而利用 ELS 对甲醇二甲基亚砜浓度进行筛选, 发现精子在 %~12% 甲醇中平衡 20 min 后活力仍为 (79.00±6.52)%~(88.80±7.89)%, 冷冻后仅在 6% 甲醇中具有相对较高活力 (18.±10.61)%, 但与鲜精活力相比显著下降 (P<0.05) 精子在 %~12% DMSO 中平衡 5 min 后精子活力为 (.75±11.09)%~(81.67±2.89)%, 平衡 20 min 后精子活力极大下降 (.25±0.0)%~(5.00±5.77)%, 冷冻后精子活力极低 (1.00±)%~(2.75±1.50)%(P<0.05) 以 D15 为基础液对葡萄糖浓度进行筛选, 发现当葡萄糖浓度为 0%(D0) 时, 冷冻后精子活力相对较高 (17.80±2.59)%, 但与鲜精相比活力显著下降 (P< 0.05) 另外对精子在 D15 D0 Stein 和 ELs 种稀释液中短期保存的效果进行比较表明,Stein 中精子存活在时间最长 (5 h),d0 次之 (15 h) 综上所述, 分别在 ELS 和 D0 中加入 6% 甲醇冷冻保存哲罗鲑精子具有一定活力, 本研究结果为哲罗鲑精子大量冷冻保存和精子库建立等方面研究奠定了基础关键词哲罗鲑, 精子, 冷冻保存中图分类号 Q92 文献标识码 A TIAN Yong- Sheng 1* MA Yun 2 XIE Zi- Niu WANG Wei- Ying LUO Zhi- Yuan LI Sheng- Zhong ZHANG Jun-Jie 1 Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao , China; 2 Xinjiang Gallop Biotechnology Co., Ltd., Urumchi 80000, China; Authority Development and Construction in River Valley of Yili River of Xinjiang, Urumchi 80000, China; College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumchi 80052, China *Correponding author, tianys@ysfri.ac.cn Abstract Taimen (Hucho taimen) is a rare cold- water fish that mainly distributes in the Irtysh River and Heilongjiang River. Studies on the cryopreservation of H. taimen sperm and establishment of cryobank are of great values in many aspects, such as the preservation of resources, artificial reproduction and breeding of fish, rearing of the larval, and also the recovery of the population. In the present study, 9 types of sperm diluents (MPRS, RS, Hanks, ELS, EG1, EG2, Stein, SS-2 and D15) that consisted of the basic liquid medium 基金项目 : 国家科技支撑计划 (No. 2012BAD26B01) 和国家自然科学基金 (No ) 收稿日期 : 接受日期 :

2 哲罗鲑精子冷冻保存 91 plus inorganic salt, glucose, and fetal bovine serum (FBS) were prepared and used for the cryopreservation of H. taimen spermatozoa. The motility of spermatozoa, in these diluents with or without the cryoprotectant ((dimethyl sulfoxide, DMSO) or MeOH), and also after the freezing treatment with liquid nitrogen, was detected. The results showed that the sperm motility was relatively high (7.00 ± 2.65)% ~(96.67 ± 2.08)% in each diluents mentioned above, however declined after the addition of the DMSO, and only possessed a quite low activity (1.21±)% or (1.1±)% with ELS or D15 after the freezing treatment. Furtherly, a suitable concentration of MeOH or DMSO was screened out with ELS and the results were as follows. It was found that the sperm motility remained at (79.00±6.52)%~(88.80±7.89)% after a 20 min pre-freezing treatment with MeOH at the concentrations of %~12%. The sperm motility was significantly (P<0.05) decreased after the freezing treatment compared with the fresh semen, and a relatively high ratio had been to (18. ± 10.61)% with 6% of MeOH. On the other hand, the motility of the perm had ranged of (.75 ± 11.09)% ~(81.67 ± 2.89)% after the pre-freezing treatment with DMSO (%~12%) for 5 min, and was tremendously declined (.25±0.0)%~(5.00±5.77)% after the treatment for 20 min, but still kept a rather low activity (1.00±)%~ (2.75 ± 1.50)% (P<0.05) after the freezing treatments. D15 was used as the basic diluents to screen out the concentrations of glucose. The results showed that the sperm motility was relatively high (17.80±2.59)% after the freezing treatment with glucose at the concentration of 0% (D0), but still was significantly (P<0.05) lower than the fresh semen. In addition, a short- term preservation results conducted with diluents (D15, D0, Stein and ELS) indicated that the sperm had the longest survival time (5 h) with Stein diluents, moderate with D0 (15 h). In conclusion, the H. taimen sperm cryopreserved with ELS and D0 plus with 6% MeOH had a certain degree of motility. Our results will lay the foundations for the cryopreservation of H. taimen sperm on a large scale and furtherly provide the basis for the establishment of the sperm cryobanks. Keywords Hucho taimen, Sperm, Cryopreservation 哲罗鲑 (Hucho taimen) 属鲑形目 (Salmoniformes) 鲑科 (Salmonidae) 哲罗鲑属 (Hucho) 国家二级保护动物, 濒危等级为易危哲罗鲑主要分布在俄罗斯的伏尔加河皮乔拉河贝加尔湖流域额穆尔河水系哈萨克斯坦的鄂毕河水系 ( 徐革锋等, 2010) 在我国主要分布于黑龙江额尔齐斯河乌苏里江图门江和鸭绿江等流域哲罗鲑是以上流域名贵的冷水鱼类, 生长快个体大是淡水中最凶猛的鱼类之一哲罗鲑成年体重可达 50 kg 左右, 长达 2 m 左右, 口腔内上下颌均排列有尖锐的利齿幼鱼以小鱼为食, 大鱼常吞食浮游水面的野鸭 (Mariana mallard) 等野生水禽, 也吃湖中的水獭 (Lutra lutra) 麝鼠 (Ondatra zibethicus) 在新疆高山湖泊喀纳斯湖中有分布, 与传说中的喀纳斯湖精灵有密切的联系 ( 向陔礼, 1986; 袁国映, 刘葆兰, 2005), 因此给哲罗鲑蒙上了神秘的色彩 20 世纪 60 年代我国额尔齐斯河水系哲罗鲑资源较丰富, 在布尔津河每天可捕捞 0~0 尾,1999 年在该流域还可少量捕捞到哲罗鲑 ( 任慕莲等, 2002) 但由于农业用水量加大环境污染过渡捕捞等人为因素影响, 近 20 年来中国境内的哲罗鲑资源量极具下降, 其种群数量已处于濒危状态, 目前在额尔齐斯河已经很难捕捞到此鱼为了恢复这一珍稀品种的种质资源和开发这一名贵鱼类, 近年来国内外对其人工繁殖苗种培育和养殖技术进行了研究 (Jungwirth,1978; 徐伟等, 2007), 人工繁殖苗种已经在我国北方地区部分鱼场进行少量的养殖和放流, 并且进行了远缘人工杂交和后代遗传结构分析 ( 徐革锋等, 2009; 许凌雪等, 2011) 另外在遗传资源方面主要对哲罗鲑线粒体基因进行了克隆和测序 (Wang et al., 2011), 利用线粒体基因对其系统发育进行分析 (Oleinik, Skurikhina, 2008), 利用微卫星标记对其遗传多样性进行了分析 (Liu et al., 2011) 国际上对鲑鳟鱼类精子冷冻保存的研究主要集中在大西洋鲑 (Salmo salar) 和虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 等鱼种上 (Gallant et al., 199; Merino et al., 2012), 对于哲罗鲑精子冷冻保存方面的研究还未见报道精子冷冻保存作为种质保存的一种有效方法, 可以长期地将鱼类遗传物质保存起来, 对于研究哲罗鲑种群分布和进化生态地理演变人工繁殖发育苗种培育及种群恢复都具有重要的意义本研

3 92 农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 究通过哲罗鲑精子稀释液的筛选抗冻剂种类和浓度的筛选及短期冷藏保存等方面的研究, 为哲罗鲑精子大量冷冻保存和精子库的建立提供了一定的理论和技术依据 1 材料与方法 1.1 实验材料利用新疆伊犁河恰甫其海水库养殖的哲罗鲑 (Hucho taimen) 亲鱼 21 多尾, 培育在 ( 20) m 2 的长方形流水养鱼池中, 进排水量约 (15~20) m /h, 在水温达到 8 时对雄鱼注射促黄体生成素释放激素类似物 (LRH-A 2)2.5 µg/kg 和绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin, HCG)00 IU/kg 催熟, 雄鱼成熟后采用挤压腹部法收集精液, 采精时避免光线直射, 将精液直接收集在 50 ml 玻璃瓶中, 置于事先放入冰块的保温盒中, 带回实验室进行冷冻保存实验 1.2 精子稀释液的配制和筛选利用市售 NaCl KCl CaCl 2 2H 2O MgCl 2 6H 2O Na 2HPO NaHCO NaH 2PO KHCO KOH MgSO KH 2PO 葡萄糖蔗糖柠檬酸 Tris 胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) N- 二 ( 羟乙基 ) 甘氨酸 (bicine) 蛋黄二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO) 配制了 9 种精子稀释液和冷冻保存液 : MPRS(Ji et al., 200) RS Hanks ELS(Zhang et al., 2011) EG1(Babiak et al., 2001) EG2(Cabrita et al., 2001) Stein(Drokin et al., 1998) SS- 2( 田永胜等, 201) D15( 陈松林等, 2007)( 表 1) 分别利用以上精子稀释液以 1 1 的比例稀释精液, 平衡 5 min 后, 利用 OLYMPUS 显微镜观察并统计精子活力 ( 运动精子 / 全部精子数 )( 田永胜等, 2009) 然后分别在以上稀释液中加入 20% 的 DMSO, 再以 1 1 的比例稀释精液, 平衡 5 min 后在显微镜下观察并统计精子活力最后将稀释后的精液分装在 2 ml 冷冻管中, 每管注入稀释精液 1.0 ml, 采用三步法冷冻保存在液表 1 精子稀释液配方 Table 1 Composition of extenders for sperm cryopreservation of Hucho taimen 成分精子稀释液 Composition Sperm dilutions MPRS RS Hanks ELS EG1 EG2 Stein SS-2 D15 NaCl/(g L -1 ) KCl/(g L -1 ) CaCl 2 2H 2O/(g L -1 ) MgCl 2 6H 2O/(g L -1 ) Na 2HPO /(g L -1 ) NaHCO /(g L -1 ) NaH 2PO /(g L -1 ) 0.01 KHCO /(g L -1 ) 2.0 KOH/(g L -1 ) MgSO /(g L -1 ) 0.09 KH 2PO /(g L -1 ) 0.05 葡萄糖 /(g L -1 ) Glucose 蔗糖 /(g L -1 ) Sucrose 柠檬酸 /(g L -1 ) Citric acid Tris/% 胎牛血清 FBS/% N- 二 ( 羟乙基 ) 甘氨酸 /(g L -1 ) Bicine 卵黄 Egg yolk/% DMSO/% mos/(m L -1 ) ph

4 哲罗鲑精子冷冻保存 9 氮中 ( 陈松林等, 2007) 冷冻 ~ h 后, 利用 7 水浴解冻精子, 在显微镜下观察并统计精子活力 1. 抗冻剂 ( 甲醇和二甲基亚砜 ) 浓度的筛选以 ELS 为稀释液, 分别以终浓度为 % 6% 8% 10% 和 12% 加入抗冻剂甲醇 (methanol) 和 DMSO, 稀释精液在加入冰块的保温盒中平衡 20 min 后在显微镜下观察并统计精子活力然后将稀释精液分装在 2 ml 冷冻管中, 每管注入稀释精液 1.0 ml, 采用三步法冷冻保存在液氮中冷冻 ~ h 后, 利用 7 水浴解冻精子, 在显微镜下观察并统计精子活力 1. 葡萄糖浓度的筛选以 D15 为基础稀释液, 在其中分别加入 15% 20% 25% 0% 5% 和 0% 的葡萄糖, 再加入终浓度 6% 甲醇, 以 1 1 的比例稀释精液, 在加入冰块的保温盒中平衡 20 min 后在显微镜下观察并统计精子活力然后将稀释精液分装在 2 ml 冷冻管中, 每管注入稀释精液 1 ml, 采用三步法冷冻保存在液氮中冷冻 5 h 后, 利用 7 水浴解冻精子, 在显微镜下观察并统计精子活力 1.5 哲罗鲑精子在不同稀释液中短期冷藏保存分别以 D15 D0 Stein 和 ELS 为稀释液, 以 1 1 的比例稀释哲罗鲑精液, 分别注入 2 ml 冷冻管中, 每管注入 1.5 ml, 同时以未加稀释液的鲜精作对照, 将冷冻管置于保温盒中, 保温盒中事先放入体积 1/ 的冰块, 保存温度 2~ 每隔 5 h 在显微镜下观察统计一次精子活力, 直至精子完全失活 1.6 数据统计分析利用 SPSS19.0 统计软件对获得的数据进行单因素方差分析 (One- Way ANOVA), 采用 Student- Newman-Keuls 进行多重比较和差异显著性分析, 筛选精子活力最高的精子稀释液配方抗冻剂成份和浓度利用 Excel 软件对统计结果做图, 在图中利用 a b c 后 d 等字母表示分析结果之间的显著性差异, 字母相同为无显著性差异 (P>0.05), 字母不同具显著性差异 (P<0.05) 2 结果与分析 2.1 精子稀释液分别利用未加抗冻剂的稀释液 MPRS RS Hanks D15 EG1 EG2 Stein SS-2 和 ELS 以 1 1 稀释哲罗鲑精液, 平衡后精子保持了较高的活力 (7.00 ± 2.65)% ~(96.67 ± 2.08)%, 鲜精的活力为 (96.±1.5)% 加入抗冻剂 DMSO 后,MPRS 精子活力极低,EG1 和 EG2 中精子失去活力, 其他稀释表 2 不同稀释液中哲罗鲑精子活力 Table 2 Sperm motility of different solutions of Hucho taimen 稀释液 Solutions MPRS RS Hanks D15 EG1 EG2 Stein SS-2 ELS 鲜精 Fresh sperm 样本量 Number 6 未加抗冻剂 Not add antifreeze 8.67±.21 b 85.00±8.66 b 96.±1.5 a 96.67±1.5 a 7.00±2.65 c 8.67±.21 b 96.±1.5 a 96.67±2.08 a 87.50±5.2 ab 96.±1.5 a 哲罗鲑精子活力 /% Sperm motility of Hucho taimen 10% 二甲基亚砜 10%DMSO 5.±0.58 d 61.67±10.1 c 66.67±15.28 bc 6.±15.28 c 0 d 0 d 8±5.00 ab 96.00±1.00 a 81.±6.27 ab 96.±1.5 a 冷冻 Frozen 1.10± 1.21± 不同小写字母表示差异显著 (P<0.05), 下同 Different lower cases indicate significant difference (P<0.05), the same below

5 9 农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 液中精子活力保持在 (61.67 ± 10.1)% ~(96.00 ± 1.00)%, 但是经过液氮中冷冻后, 仅 ELS 和 D15 中精子具有极低的活力, 其他稀释液中精子失去活力 ( 表 2) 2.2 甲醇和二甲基亚砜浓度对精子活力影响在 ELS 中加入 %~12% 的甲醇, 平衡 20 min 后精子活力保持在 (79.00±6.52)%~(88.80±7.89)%, 在液氮中冷冻保存后,6% 甲醇冷冻后精子活力较其他浓度高, 达到 (18.±10.61)%, 但与鲜精 (96.± 2.1) 相比具有显著性差异 (P<0.05)( 表 ) 在 ELS 中加入 %~12% 二甲基亚砜, 平衡 5 min 后精子活力保持在 (.75 ± 11.09)% ~(81.67 ± 2.89)%; 平衡 20 min 后, 精子活力为 (.25±0.0)%~ (5.00±5.77)%,12% 以上二甲基亚砜中精子失去活力 ; 液氮中冷冻保存后,%~10% 二甲基亚砜中精表在 ELS+ 不同浓度甲醇中平衡和冷冻后哲罗鲑精子活力 Table Sperm motility in ELS+different methanol and after frozen of Hucho taimen 甲醇 /% 样本量哲罗鲑精子活力 /% Methanol Number Sperm motility of Hucho taimen 平衡 20 min 冷冻后 20 min equilibrated Frozen ±7.89 ab.50±.02 c ±2.89 ab 18.±10.61 b ±6.52 c 6.60±2.19 c ±2.52 ab 7.75±2.6 c 12 8.±5.77 c 1.±0.58 c 鲜精 96.±2.1 a 96.±2.1 a Fresh sperm 子活力仅为 (1.00±)%~(2.75±1.50)%, 与鲜精 (96.±2.1)% 具有显著性差异 (P<0.05)( 表 ) 2. 葡萄糖浓度对冷冻精子活力的影响在 D15 中加入 15%~0% 的葡萄糖, 再加入 6% 甲醇稀释和冷冻哲罗鲑精子, 在室温下平衡 5 min 时精子活力在 (71.67±2.89)%~(88.±2.89)%, 平衡 20 min 后精子活力在 (10. ± 0.58)% ~(8. ± 5.77)%, 葡萄糖浓度 0%(D0) 时精子活力最高, 与鲜精活力 (9 ± )% 具有显著性差异 (P< 0.05) 经过在液氮中冷冻保存后精子活力极大下降, 在葡萄糖浓度为 25%~5% 时精子有一定的活力, 葡萄糖浓度 0% (D0) 时精子活力较高, 为 (17.80±2.59)%, 与鲜精活力具有显著性差异 (P< 0.05)( 表 5) 2. 精子在不同稀释液中短期低温保存效果短期保存开始时各种稀释液中的精子活力为 (81.67±2.89)%~(95.±0.58)%, 与鲜精活力 (98%) 无显著差异 (P>0.05) 冷冻保存 5 h 后,D15 中精子已经全部失活保存 5~10 h 后 ELS 中精子活力显著降低 (1.±2.87)%,15 h 后精子失去活力 D0 和 Stein 中保存精子在 10 h 时与鲜精无显著差异 (P> 0.05),15 h 后精子活力显著降低, 分别为 (15.00± 5.0)% 和 (28.±2.87)%,D0 中保存精子在 20 h 后失去活力 Stein 中保存精子成活时间最长, 一直到 5 h 时还有 (1.±0.57)% 的精子具有活力 ( 图 1) 讨论哲罗鲑是我国重要的珍稀冷水鱼类资源, 在自表在 ELS+ 不同浓度二甲基亚砜中平衡和冷冻后哲罗鲑精子活力 Table Sperm motility in ELS+different dimethyl sulfoxide and after frozen of Hucho taimen 二甲基亚砜 /% 样本量哲罗鲑精子活力 /% DMSO Number Sperm motility of Hucho taimen 平衡 5min 平衡 20min 冷冻后 5 min equilibrated 20 min equilibrated Frozen.75±11.09 c 9.75±0.50 d 2.75±1.50 b ±7.50 b 1.25±0.96 c 1.50±0.58 bc ±0.50 b 5.00±5.77 b 1.50±0.58 bc ±2.89 b.25±0.0 e 1.00± bc ±2.89 b 0 e 0 d 鲜精 96.±2.1 a 96.±2.1 a 96.±2.1 a Fresh sperm

6 哲罗鲑精子冷冻保存 95 然水域的分布已经相当稀少 1998 年出版的中国濒危动物红皮书鱼类和 200 年出版的中国物种红色名录中, 已经将哲罗鲑列为濒危物种 ( 汪松等, 1998) 哲罗鲑除分布在我国额尔齐斯河黑龙江流域外, 同属的川陕哲罗鲑 (Hucho bleekeri) 在北纬 29~ 度秦岭以南长江上游水系也有分布, 属第四纪冰川期由北方南侵的残留鱼类, 是研究我国鱼类区系形成和古地理学的有力证据之一, 在动物地理学鱼类系统和气候变化等多方面具有重要研究价值 ( 唐文家等, 2006) 但是由于矿山开采水环境污染及人们对野生鱼类资源的无序利用, 哲罗鲑生存环境被严重破坏, 致使其种群资源严重衰退精子冷冻保存技术的发展为珍稀经济鱼类种质资源的保存提供了一条有效的途径, 目前精子冷冻保存已经被利用到农业畜牧医疗科研等生物技术相关领域, 国内开始对鱼类精子进行冷冻保存研究始于上世纪 80 年代, 到目前为止已经对 0 多种海淡水鱼类精子进行了冷冻保存研究 ( 陈松林等, 2007), 但国内在淡水水域冷水鱼类精子冷冻保存方面的研究较少, 目前仅对江鳕 (Lota lota)( 田永胜等, 201) 和白斑狗鱼 (Esox lucius)(zhang et al., 2011) 精子冷冻保存技术进行了研究鲑鳟鱼类为国际上冷水鱼类养殖的主要品种, 对于其种质资源的保存研究被广泛受到重视 Merino 等 (2012) 利用 1% BSA+0% 精浆对虹鳟精子首次进行了玻璃化冷冻保存, 获得了 81% 的成活率 Labbe 等 (2001) 研究了冷冻对虹鳟精子核 DNA 稳定性和后代发育的影响, 认为冷冻对精子质量没有造成明显的影响 Cabrita 等 (2001) 认为, 外部抗冻剂可提高虹鳟精子细胞膜的稳定性 Gallant 等 (199) 利用不同的稀释液对大西洋鲑精子进行了冷冻保存, 发现 0.17 mol/l NaCl mol/l KCl mol/l Na 2HPO 7H 2O 7.5 g/l L-α- 卵磷脂和 12% DMSO 可以明显地降低不成活精子比精子活力 /% Sperm motility 图 1 Figure 1 表 5 Table 5 成活时间 /h Time 不同稀释液 (D15 D0 Stein 和 ELS) 中短期低温保存哲罗鲑精子活力 Sperm motility in low temperature freezing of different solutions (D15, D0, Stein and ELS) of Hucho taimen 在 D15+6%Methanol+ 不同浓度葡萄糖中平衡和冷冻保存哲罗鲑精子活力 Sperm motility in D15+ 6%Methanol +different glucose and after frozen of Hucho taimen 葡萄糖 /% Glucose 鲜精 Fresh sperm 样本量 Number 平衡 5 min 5 min equilibrated 88.±2.89 a 88.±2.89 a 86.67±2.89 a 85.00±5.00 a 78.±2.89 b 71.67±2.89 c 9± a 哲罗鲑精子活力 /% Sperm motility of Hucho taimen 平衡 20min 20 min equilibrated 81.67±2.89 b 78.±2.89 b 81.67±2.89 b 8.±5.77 b 1.67±2.89 c 10.±0.58 d 9± a 冷冻 Frozen 0 c 0 c 1.±0.58 c 17.80±2.59 b 1.67±0.58 c 0 c 9± a

7 96 农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 率 Kusuda 等 (2005) 认为, 分别利用 10% 的甘油二甲基亚砜与 90% 的小牛血清 (FBS),10% 甲醇与 90% 00 mmol/l 葡萄糖配制成混合液, 适合于冷冻保存库页岛哲罗鲑 (Hucho perryi) 精子本研究中利用 9 种精子稀释液冷冻保存哲罗鲑精子, 仅在 ELS 和 D15 中发现有成活的精子, 但是成活相当低, 利用 ELS 为稀释液, 对甲醇和二甲亚砜的浓度进行调整和筛选, 发现 6% 的甲醇冷冻精子的活力较高, 而二甲基亚砜冷冻精子成活率极低再利用 D15 为稀释液对其中葡萄糖浓度进行筛选, 当葡萄糖浓度为 0%(D0) 时冷冻精子成活率较高本研究结果认为, 一定浓度甲醇和葡萄糖有利于哲罗鲑精子冷冻保存, 但是冷冻保存后精子活力与鲜精相比下降太多主要原因可能与冷冻保存体积有关, 本研究利用 2 ml 冷冻管作为精子容器, 主要目的是研究哲罗鲑精子大量冷冻的技术方法, 而目前报道的鲑鳟鱼精子冷冻保存大都利用 250 μl 小体种积麦管做为冷冻精子容器, 麦管贮藏体积小, 保存精子量少, 不利于鱼类大量精子冷冻保存与应用 (Drokin et al., 1998; Merino et al., 2012) 冷冻管体积较大, 可以大量的冷冻保存, 在海水鱼类精子冷冻中被广泛应用, 但在冷水鱼中未有应用报导因此对于哲罗鲑精子的大量冷冻保存还有待于对其冷冻方法做进一步的研究在鱼类人工繁殖和实际生产中, 经常遇到养殖场技术人员将采集的大量鱼类精子直接放置在冰箱, 或者将精子容器放置在事先准备好的冰桶中, 这样鱼类精子可以维持数小时到十多小时的活力, 以这样方法来弥补和解决雌雄鱼成熟不同步的问题但是当原精直接暴露在空气中时, 由于受到环境温度水分蒸发氧化蛋白质变性等多种因素的影响, 使精子活力迅速降低, 影响受精的效果由于大部分养殖公司都不具备精子冷冻保存的设备和技术, 所以精子的短期冷冻保存在一定程度上能够暂时解决精子的应用问题龚丽等 (2011) 对二倍体和三倍体虹鳟精子短期冷冻保存进行了研究, 原精液在下可保持活力达 5~12.5 d 连晋和王拴文 (1999) 利用人工精浆稀释虹鳟精液并低温保存可将精子保存到 60 d 本研究利用种不同稀释液 (D15 D0 Stein 和 ELS) 对哲罗鲑精子进行稀释后放置在 2~ 的保温盒中保存, 精子在 Stein 和 D0 中保存时间较长, 说明这两种稀释液的渗透压及溶液成份为精子的短期保存提供了较适宜的外部环境, 研究结果为哲罗鲑精子的短期低温保存和应用提供了一定的技术基础结论本研究发现,ELS 和 D0 两种稀释液分别加入 6% 甲醇冷冻保存哲罗鲑精子具有一定的活力, 0% 的葡萄糖有益于提高精子活力, 二甲基亚砜不适于冷冻保存哲罗鲑精子本研究为我国珍稀冷水鱼类哲罗鲑精子冷冻保存技术及精子冷冻库的建立提供了一定的技术依据, 但大量冷冻保存精子活力较低, 因此哲罗鲑精子的大量冷冻保存技术还有待进一步完善参考文献陈松林, 田永胜, 李军, 等鱼类精子和胚胎冷冻保存理论与技术 [M]. 北京 : 中国农业出版社, pp (Chen S L, Tian Y S, Li J, et al Fish Sperm and Embryo Cryopreservation Theory and Technology. [M] Beijing, Agriculture Press of China, pp ) 龚丽, 刘奕, 杨翟平, 等二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究 [J]. 水产学杂志, 2(1): 0-.(Gong L, Liu Y, Yang ZP, et al Cryopreservation of semen in diploid and triploid Rainbow trout Oncorhynchus mykiss[j].chinese Journal Fisheries, 2(1): 0-.) 连晋, 王拴文虹鳟精子液态低温保存方法 [J]. 淡水渔业, 29(12): (Lian J, Wang S W Sperm cryopreservation of rainbow trout[j]. Freshwater Fisheries, 29(12): ) 任慕莲, 郭炎, 张人铭, 等中国额尔齐斯河鱼类资源及渔业 [M]. 新疆科技卫生出版社, 乌鲁木齐, pp (Ren M L, Gou Y,Zhang R M,et al Fisheries Resources and Fishery of the Ertixhe River in China[M]. Urumqi, Xinjiang Science and Technology Publishing House, pp ) 唐文家, 李柯懋, 申志新珍贵的鲑科鱼类 - 川陕哲罗鲑 [J]. 水产科学,25(5): (Tang W J, Li K M, Shen Z X Hucho bleekeri, a precious fish[j]. Fisheries Science, 25(5): ) 田永胜, 陈松林, 季相山, 等半滑舌鳎精子冷冻保存 [J]. 渔业科学进展 0(6): (Tian Y S, Chen S L, Ji X S, et al Cryopreservation of tongue sole Cynoglossus semilaevis sperm[j]. Progress in Fishery Sciences, 0(6): ) 田永胜, 姜静, 马允, 等额尔齐斯河江鳕精子冷冻保

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西南民族学院学报哲学社会科学版第卷资料来源中国统计年鉴年年新中国五十年统计资料汇编中国人口统计年鉴年数据资料来源中国统计年鉴中国统计出版社年版资料来源

西南民族学院学报哲学社会科学版第卷资料来源中国统计年鉴年年新中国五十年统计资料汇编中国人口统计年鉴年数据资料来源中国统计年鉴中国统计出版社年版资料来源郑长德教育的发展人力资源的开发是决定西部民族地区未来发展的关键因素之一是实施西部大开发战略提高其经济竞争力和综合实力的重要保障本文从西部民族地区教育发展的现状入手指出中华人民共和国成立多年来西部民族地区