Microsoft Word - 植物病原實習課程

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1 植 物 病 原 實 習 課 程 一 認 識 真 菌 ( 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) 酵 母 菌 的 菌 落 類 似 細 菌 菌 落 酵 母 菌 之 出 芽 生 殖 (budding) 真 菌 的 菌 落, 呈 棉 絮 狀 1

2 孢 子 發 芽 (Erysiphe cichoracearum) 無 隔 膜 菌 絲 (coenocytic hyphae) 有 隔 膜 菌 絲 (septate hyphae) 2

3 附 著 器 (appressorium)colletotrichum gloeosporioides 吸 器 (haustorium),erysiphe graminis 在 小 麥 表 皮 細 胞 形 成 指 狀 吸 器 孢 子 囊 梗 及 孢 子 囊 (Sporangiophore & Sporangium),Phytophthora parasitica 3

4 向 頂 的 (Acrogetal) 分 生 孢 子 產 生 方 式,Alternaria 向 基 的 (Basipetal) 分 生 孢 子 產 生 方 式,Oidium(Sphaerotheca) 芽 生 式 分 生 孢 子 (blastic conidia),cladosporium, 孢 子 幼 體 先 膨 大 再 分 隔 4

5 二 卵 菌 綱 ( 一, 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) 卵 菌 綱 ; 歸 入 Stramenopila 界 或 Chromista 界 Pythium aphanidermatum 之 孢 子 囊 ( 裂 瓣 狀 ) 卵 菌 綱 Pythium aphanidermatum 之 卵 孢 子 (oospores) Pythium spinosum 之 卵 孢 子 5

6 Phytophthora cryptogea 之 孢 子 囊 馬 鈴 薯 晚 疫 病 之 病 徵 及 病 兆 (symptom & sign) Phytophthora infestans 之 孢 子 囊 梗 及 孢 子 囊 6

7 十 字 花 科 露 菌 病 病 徵 及 病 兆 甘 藍 露 菌 病 葉 背 病 兆 Peronospora parasitica 的 孢 子 囊 梗 及 孢 子 囊 7

8 三 卵 菌 綱 ( 二, 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) 洋 香 瓜 露 菌 病 病 徵 ( 葉 上 表 面 ) 洋 香 瓜 露 菌 病 病 徵 ( 葉 下 表 面 ) Pseudoperonospora cubensis 之 孢 子 囊 梗 及 孢 子 囊 8

9 荔 枝 露 疫 病 病 徵 Peronophthora litchii 之 孢 子 囊 梗 及 孢 子 囊 四 卵 菌 綱 ( 三 ) 及 結 合 菌 綱 ( 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) 芥 藍 白 銹 病 病 徵, 卵 菌 綱 9

10 Albugo candida 之 孢 子 囊, 卵 菌 綱 Mucor 之 孢 子 囊 梗 及 孢 子 囊 孢 子 囊 孢 子, 結 合 菌 綱 Rhizopus stolonifer 之 菌 絲 體, 結 合 菌 綱 10

11 Rhizopus 之 孢 子 囊 梗 孢 子 囊 及 孢 子 囊 孢 子 (sporangiolum), 結 合 菌 綱 洋 桔 梗 溼 腐 病 之 病 徵, 結 合 菌 綱 Choanephora cucurbitarum 之 小 型 孢 子 囊 (sporangiolum), 結 合 菌 綱 11

12 Choanephora cucurbitarum 之 孢 子 囊 孢 子 (sporangiospores), 結 合 菌 綱 五 子 囊 菌 綱 ( 一, 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) 洋 香 瓜 白 粉 病 病 徵 Sphaerotheca fuliginea 之 無 性 世 代, 分 生 孢 子 梗 及 分 生 孢 子 ; 子 囊 菌 綱 12

13 大 車 前 草 白 粉 病 病 徵 Erysiphe plantaginis 的 無 性 世 代 Erysiphe plantaginis 之 閉 子 囊 殼 13

14 E. plantaginis 之 閉 子 囊 殼 E. plantaginis 之 閉 子 囊 殼, 注 意 其 絲 狀 附 屬 絲 (appendages) 及 閉 子 囊 殼 內 多 個 子 囊 E. plantaginis 之 閉 子 囊 殼 內 多 個 子 囊, 每 個 子 囊 內 含 2 個 子 囊 孢 子 14

15 E. plantaginis 之 每 個 子 囊 內 含 2 個 子 囊 孢 子 大 波 斯 菊 白 粉 病 病 徵 Sphaerotheca fuliginea 之 分 生 孢 子 15

16 Sphaerotheca fuliginea 之 閉 子 囊 殼 Sphaerotheca fuliginea 之 每 一 閉 子 囊 殼 內 僅 有 一 子 囊, 每 一 子 囊 內 有 8 個 子 囊 孢 子 百 慕 達 草 葉 瘡 病 病 徵 百 慕 達 草 葉 瘡 病 病 徵 近 照 16

17 Phyllachora cynodontis 子 囊 殼 (perithecium) 縱 切 面 Phyllachora cynodontis 子 囊 (ascus) 及 側 絲 (paraphyses) Phyllachora cynodontis 的 子 囊, 內 含 8 個 子 囊 孢 子 Glomerella cingulata 之 有 性 世 代, 子 囊 (ascus) 17

18 Glomerella cingulata 的 無 性 孢 子 屬 於 Colletotrichum 瓜 類 黑 點 根 腐 病 (Monosporascus cannonballus) 病 根 上 有 小 黑 點 為 子 囊 殼,Sordariales Monosporascus cannonballus 子 囊 殼 內 有 多 個 子 囊, 子 囊 壁 容 易 消 失 18

19 Monosporascus cannonballus 子 囊 內 僅 有 一 子 囊 孢 子 Diaporthe citri 有 性 世 代 於 枯 枝 上 形 成 Diaporthe 的 ascocarp beak( 子 囊 殼 鳥 嘴 部 ) 埋 生 於 枯 枝 木 質 部 的 Diaporthe 子 囊 殼 19

20 Diaporthe 子 囊 殼 的 縱 切 面 Diaporthe 的 子 囊 殼 內 無 側 絲, 且 子 囊 頂 端 有 refractive ring Diaporthe citri 的 無 性 世 代 為 Phomopsis citri, 有 α β 孢 子 萬 壽 菊 菌 核 病 (Sclerotinia sclerotiorum) 20

21 存 在 於 枯 死 花 器 內 的 菌 核 (sclerotium) 地 面 菌 核 於 冬 季 形 成 子 囊 盤 (apothecium) Sclerotinia sclerotiorum 的 菌 核 在 10 / 潮 溼 1~2 個 月 可 誘 致 子 囊 盤 Sclerotinia sclerotiorum 子 囊 盤 縱 切 面 可 見 多 個 子 囊 (ascus) 21

22 Sclerotinia sclerotiorum 子 囊 內 有 8 個 子 囊 孢 子 六 子 囊 菌 綱 ( 二, 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) Guignardia psidii 的 子 囊 座 (ascostroma)( 林 正 忠 博 士 ), 室 子 囊 菌 亞 綱 瓜 類 蔓 枯 病 葉 部 病 徵 (Didymella bryoniae) 瓜 類 蔓 枯 病 葉 部 病 徵 近 照, 小 黑 點 為 子 囊 果 或 柄 子 殼 22

23 瓜 類 蔓 枯 病 之 莖 部 病 徵 瓜 類 蔓 枯 病 之 莖 部 病 徵 瓜 類 蔓 枯 病 之 近 照, 小 黑 點 為 子 囊 果 或 柄 子 殼 Didymella bryoniae(r. T. Hanlin) 23

24 Didymella bryoniae 子 囊 果 縱 切 面 Didymella bryoniae 子 囊 果 及 子 囊 Didymella bryoniae 的 無 性 世 代 Phoma cucurbitacearum 柄 孢 子, 如 擠 牙 膏 狀 自 柄 子 殼 溢 出 24

25 Phoma cucurbitacearum 柄 孢 子 蔥 黑 腐 病 (Pleospora herbarum) Pleospora herbarum 之 子 囊 座 (ascostroma) 及 子 囊 Pleospora herbarum 之 一 個 子 囊 內 8 個 子 囊 孢 子, 子 囊 雙 疊 套 (bitunicate) 25

26 Pleospora herbarum 的 無 性 世 代 Stemphylium botryosum 分 生 孢 子 梗 及 分 生 孢 子 落 花 生 葉 燒 病 病 徵 (Leptosphaerulina crassiasca) 落 花 生 葉 燒 病 病 徵 近 照 落 花 生 葉 燒 病 病 徵 近 照, 小 黑 點 為 子 囊 座 (ascostroma) 26

27 Leptosphaerulina crassiasca 子 囊 座 及 子 囊 Leptosphaerulina crassiasca 單 一 子 囊 內 有 8 個 子 囊 孢 子 Venturia inaequalis 的 子 囊 座 ( 子 囊 果 ) 縱 切 面 (G. L. Schumann) 27

28 7. 擔 子 菌 綱 ( 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) 美 人 蕉 銹 病 之 夏 孢 子 堆 及 冬 孢 子 堆 ( 黑 色 ), 擔 子 菌 綱 Puccinia cannae 之 夏 孢 子 (uredospores) P. cannae 之 冬 孢 子 (teliospores) 韭 菜 銹 病 (Puccinia allii) 之 夏 孢 子 堆 (uredium) 28

29 落 花 生 銹 病 (Puccinia arachidis) 之 夏 孢 子 玉 米 銹 病 (Puccinia sorghi) 之 夏 孢 堆 及 冬 孢 子 堆 Puccinia sorghi 之 冬 孢 子 梨 赤 星 病 之 精 子 器 ( 上 表 面 ) 及 春 孢 子 腔 (aecium, 下 表 面 ) Gymnosporangium haraearum 之 精 子 器 (spermagonium) 接 受 菌 絲 (receptive hyphae) 29

30 G. haraearum 之 春 孢 子 腔 縱 切 面, 春 孢 子 (aeciospore) 在 龍 柏 形 成 之 G. haraearum 冬 孢 子 堆 玉 米 黑 穗 病 病 徵 (Ustilago maydis) 冬 孢 子 ( 厚 膜 孢 子 ) 發 芽 產 生 原 菌 絲, 上 面 著 生 擔 孢 子 (basidiospores) 擔 孢 子 子 稱 sporidium 狗 牙 根 黑 穗 病 (Ustilago cynodontis) 30

31 U. cynodontis 之 冬 孢 子 茭 白 筍 ( 菰 黑 穗 病 ) 由 Ustilago esculenta 寄 生 茭 白 筍 內 部 之 冬 孢 子 冬 孢 子 發 芽 之 後 擔 孢 子 行 出 芽 生 殖 呈 酵 母 菌 菌 落 芽 生 孢 子 呈 披 針 形 (sporidium budding) 31

32 Ganoderma 之 子 實 體 ( 擔 子 果 basidiocarp) 4 個 擔 孢 子 著 生 於 擔 子 (basidium) 之 小 梗 (sterigmata) Phellinus noxius 引 起 樟 樹 褐 根 腐 病 ( 安 寶 貞 博 士 ) 32

33 人 工 培 養 產 生 子 實 體 ( 安 寶 貞 博 士 ) P. noxius 菌 落 ( 安 寶 貞 博 士 ) P. noxius 人 工 培 養 時 形 成 節 孢 子 (arthrospores) 草 菇 (Volvariella volvacea) 擔 子 果 之 發 育 33

34 菌 褶 上 的 子 實 層 (hymenium) 及 擔 孢 子 (basidiospores) 茶 網 餅 病 病 徵 Exobasidium reticulatum 之 子 實 層 (hymenium) 及 擔 孢 子 8. 不 完 全 菌 綱 ( 一, 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) 柄 子 殼 (pycnidium) 以 Macrophoma 為 例,Sphaeropsidales 球 殼 孢 目 34

35 Ascochyta pisi( 豌 豆 真 菌 性 斑 點 病 菌 ) PDA 上 柄 子 殼 孔 口 溢 出 孢 子 角 (sporehorn),zythia fragariae Ampelomyces cesatii( 長 豇 豆 白 粉 寄 生 菌 ) 柄 子 殼, 以 Phomopsis 為 例 35

36 Phomopsis 之 柄 孢 子,α,β 孢 子 洋 香 瓜 炭 腐 病 (Botryodiplodia theobromae) 洋 香 瓜 莖 上 小 黑 點 為 Botryodiplodia theobromae 柄 子 殼 Botryodiplodia theobromae 柄 子 殼 及 柄 孢 子 36

37 Botryodiplodia theobromae 柄 孢 子 成 熟 時 呈 深 褐 色, 有 1 個 隔 膜 甜 瓜 炭 疽 病 病 徵 (Colletotrichum lagenarium) 病 斑 表 面 之 Colletotrichum lagenarium 分 生 孢 子 盤 上 有 剛 毛 (setae),melanconiales 黑 盤 孢 目 Colletotrichum lagenarium 之 分 生 孢 子 37

38 Colletotrichum gloeosporioides 之 分 生 孢 子 盤 (acervulus) C. gloeosporioides 在 PDA 上 形 成 黏 性 孢 子 堆 ( 分 生 孢 子 盤 ) Pestalotiopsis psidii 之 分 生 孢 子 盤 Pestalotiopsis funerea 之 分 生 孢 子 盤 38

39 Pestalotiopsis 之 分 生 孢 子 Helminthosporium,Moniliales 叢 梗 孢 目, lignicolous( 木 生 ) 併 入 Bipolaris, 禾 本 科 生 (graminicolous) 併 入 Drechslera Bipolaris 木 生 (lignicolous) Drechslera 禾 本 科 生 (graminicolous) 39

40 Alternaria 的 分 生 孢 子 鏈 生 Alternaria 的 分 生 孢 子 Stemphylium 的 分 生 孢 子 單 生 Stemphylium 的 分 生 孢 子 梗 及 分 生 孢 子 40

41 Ulocladium 為 孔 出 孢 子, 分 生 孢 子 梗 共 柄 產 (sympodial) 孢 子 Corynespora 的 分 生 孢 子 單 生 Cercospora mikaniacola 的 分 生 孢 子 梗 及 分 生 孢 子 Cladosporium 芽 生 孢 子,1-2 細 胞 的 分 生 孢 子 41

42 Curvularia 的 分 生 孢 子 9. 不 完 全 菌 綱 ( 二, 植 物 真 菌 性 病 害 之 病 原 菌 簡 介 ) 柑 桔 綠 黴 病 Penicillium digitatum 分 生 孢 子 梗 分 生 孢 子 落 花 生 冠 腐 病, 分 生 孢 子 梗 Aspergillus niger 42

43 Aspergillus niger 杜 鵑 灰 徵 病 Botrytis cinerea B. cinerea, 分 生 孢 子 梗 分 生 孢 子 Pyricularia oryzae 43

44 慈 菇 葉 斑 病 (Cylindrocarpon chiayiense) 慈 菇 葉 斑 病 近 照 葉 柄 上 產 孢 (Cylindrocarpon chiayiense) 分 生 孢 子 聚 集 於 分 生 孢 子 梗 頂 端 呈 一 小 束 (Cylindrocarpon chiayiense) Cylindrocarpon chiayiense 分 生 孢 子 44

45 Cylindrocarpon Fusarium oxysporum, 大 小 孢 子 (macro-, micro-conidium), 分 生 孢 子 叢 (sporodochium) Fusarium moniliforme Fusarium oxysporum 之 厚 膜 孢 子 (chlamydospores) 大 鸚 歌 鳳 梨 葉 斑 病 (Myrothecium roridum) 45

46 病 斑 表 面 Myrothecium roridum 的 分 生 孢 子 叢 (sporodochium) 近 照 Myrothecium roridum 的 分 生 孢 子 叢 M. roridum 在 PDA 形 成 分 生 孢 子 叢 分 生 孢 子 著 生 於 孢 子 梗 頂 端 之 瓶 梗 細 胞 (phialides) Myrothecium roridum 分 生 孢 子 46

47 水 稻 白 絹 病 (Sclerotium rolfsii) 無 孢 目 Agonomycetales Rhizoctonia solani 在 培 養 基 上 形 成 褐 色 菌 核 Rhizoctonia solani 的 AG1~AG6( 菌 絲 融 合 群 )( 杜 金 池 博 士 ) 菌 絲 融 合 群 測 定, 同 菌 絲 融 合 群 的 菌 絲 相 遇 後 會 形 成 heterokaryon cells, 但 二 者 後 方 5-6 細 胞 會 顆 粒 狀 而 死 亡, 謂 之 killing reaction( 杜 金 池 博 士 ) 47

48 植 物 病 原 菌 的 分 離 培 養 一 Preparing for isolation: ( 一 ).Sterilization of glassware, such as petri-dishes, test tubes, pipettes, etc., by dry heat( 150 to 160 for 1 hour or more ) or autocalving. ( 二 ).Preparation of solutions for treating the surface of infected or infested tissue as to eliminate or markedly reduce surface contaminants that could interfere with the isolation of the pathogen. The most commonly used surface sterilants include 0.575% sodium hypochlorite (1 Clorox : 9 water ) solution, used both for wiping infected tissue or dipping sections of such tissues in it; 95% ethyl alcohol, which is mild and used for leaf dips for 3 seconds or more. ( 三 ).Preparation of culture media on which the isolated fungal or bacterial pathogen will grown. The most commonly used media are Potato Dextrose Agar(PDA), which is good for most but not all fungi, water agar or glucose agar(1-3% glucose in water agar) for separating some fungi(pythium & Fusarium) from bacterial; and nutrient agar, which contains beef extract and peptone and is good for isolating bacterial plant pathogen. 二 Isolating the pathogen: ( 一 ) 可 以 純 粹 培 養 的 植 物 病 原 菌 1. 所 有 的 植 物 病 原 性 細 菌 2. 大 部 分 的 植 物 病 原 性 真 菌, 除 了 絕 對 寄 生 菌 以 外 3. 一 些 螺 旋 菌 質 4.some xylem-limited Rickettsia like bacteria (Xylella) ( 二 ) 不 能 純 粹 培 養 的 植 物 病 原 Obligate parasites: 1.Erysiphales, the causes of the powdery mildew diseases 2.Peronosporales, which cause the downy mildews 3.Uredinales, which cause the rust disease of plants (It has become possible to grow in culture some stages of some rust fungi by the addition of certain components to the media) 4.Mycoplasma like organism 5.Rickettsia like bacteria 6.virus 7.nematoeds ( 某 些 可 以 真 菌 菌 絲 培 養 ) 8.Protozoa ( 三 ). 植 物 病 原 菌 的 分 離 培 養 1. 從 葉 片 (1). 發 病 中 的 真 菌 性 病 斑 直 接 將 胞 子 震 落 或 挑 取 胞 子 於 培 養 基, 待 長 出 菌 落 再 繼 代 培 養 (subculture) (2). 真 菌 性 或 細 菌 性 病 斑, 切 取 5-10 mm 2 的 病 斑 周 緣 ( 病 - 健 ) 組 織 數 塊, 置 於 消 毒 液 (0.575% sodium hypochlorite) 中 進 行 表 面 消 毒 秒 後, 每 隔 秒 各 取 出 一 塊 組 織 塊, 再 經 無 菌 水 漂 洗 三 次, 以 無 菌 濾 紙 吸 乾 水 分 ( 或 直 接 以 無 菌 濾 紙 吸 乾 消 毒 液 ), 移 入 培 養 基 (3). 若 有 子 實 體 ( 如 pycnidia, perithecia), 直 接 挑 取 置 於 消 毒 液 中, 表 面 消 毒 數 秒 後, 移 入 培 養 基 亦 可 在 解 波 顯 微 鏡 下, 壓 破 子 實 體, 滴 入 數 滴 無 菌 水, 然 後 梯 度 稀 釋 (serial dilution), 滴 入 培 養 基, 以 得 到 單 孢 長 出 之 菌 落 (4). 植 物 病 原 性 細 菌 一 般 採 用 梯 度 系 列 稀 釋 法 (serial dilution), 以 自 其 他 種 類 細 菌 中 分 離 出 來 2. 從 莖 果 及 其 他 部 位 (1). 同 從 葉 片 分 離 法 (2). 削 去 表 皮 或 自 健 康 部 分 (healthy side) 剝 開 後, 自 病 莖 或 病 果 內 部 病 徵 周 緣 挑 取 病 組 織 塊, 移 入 培 養 基 3. 從 根 部 塊 莖 及 接 觸 土 壤 的 果 實 (1). 病 原 殺 死 植 物 後, 常 會 長 出 一 些 腐 生 菌, 因 此 反 覆 以 水 洗 去 土 壤 腐 爛 的 病 組 織, 以 洗 48

49 去 腐 生 菌 若 根 部 細 小, 則 可 同 從 葉 片 分 離 法 操 作 (2). 若 為 肉 質 根 部 表 面 病 斑, 洗 去 土 壤 後, 將 病 組 織 切 取 後, 同 從 葉 片 分 離 法, 置 於 消 毒 液 中 進 行 表 面 消 毒 秒 後, 每 隔 秒 各 取 出 一 塊 組 織 塊, 再 經 無 菌 水 漂 洗 三 次, 以 無 菌 濾 紙 吸 乾 水 分, 移 入 培 養 基 (3). 若 為 已 侵 入 根 部 內 的 病 徵, 則 同 從 莖 果 及 其 他 部 位 之 分 離 法, 削 去 表 皮 或 自 健 康 部 分 (healthy side) 剝 開 後, 自 病 根 或 病 果 內 部 病 徵 周 緣 挑 取 病 組 織 塊, 移 入 培 養 基 三 微 生 物 培 養 的 環 境 條 件 A. 溫 度 : optimum growth temperature 1.three main groups: (1).psychrophiles 嗜 冷 性 0-20 Vibrio psychroerythrus 嗜 冷 弧 形 菌 (2).mesophiles 中 溫 性 (3).thermophiles 嗜 熱 性 > 45 stenothermophiles 絕 對 嗜 熱 菌 2.the ability to grow at high temperature: an increased termal stability of ribosomes, membranes, enzymes, 3.the ability to grow at low temperature: not loss the fluidity within lipid layer of cytoplasmic membranes, 4. 溫 度 影 響 性 狀 的 表 現 : pigment: 黏 質 沙 雷 氏 菌 25 紅 色, 37 無 色, nutrient requirement: 植 物 乳 桿 菌 25 不 需 苯 丙 氨 基 酸, 37 時 需 要 B. 氣 體 狀 況 的 需 求 : 根 據 對 氧 氣 的 需 求, 可 以 區 分 為 四 群 : a.aerobic bacteria 好 氣 菌 (Fig.6-2, p.108) b.anaerobic bacteria 嫌 氣 菌 stringent anaerobes 絕 對 嫌 氣 菌 c.facultative anaerobic bacteria d.microaerophilic bacteria 微 好 氣 菌 1. 氧 氣 毒 性 (1).beneficial: strong oxidizing ability, terminal electron acceptor for respiration, (2).also a toxic substance, (3).aerobic and facultative organisms, have protective mechanisms, (4).oxygen toxicity: a.oxygen inactivation of enzymes, directly oxidize certain reduced group, -SH b.damage due to toxic derivatives 衍 生 毒 性 of oxygen, (a).o2-, superoxide radical 超 氧 基 (b).hydrogen peroxide(h2o2 過 氧 化 氫, a powerful oxidizing agent), hydroxyl radicals(oh 輕 基, reactive free radicals), (c).singlet oxygen 單 氧, c. 好 氣 菌 對 於 氧 氣 毒 性 的 自 我 保 護 機 制 : 解 毒 機 制 (a).superoxide dismutase 超 氧 化 岐 化 脢, eliminating superoxide radicals, (b).catalase 分 解 脢 & peroxidase 過 氧 化 脢, dissipating hydrogen peroxide, (5).cultivation of aerobic bacteria: 49

50 培 養 所 需 氣 體 狀 況 的 設 置 (Fig.6-3, p.110), a.in shallow layer, b.constantly shaking, (6).cultivation of anaerobic bacteria a.prereduced media(fig.6-4, p.111) b.anaerobic chamber(fig.6-5, 6. p.111) anaerobic glove box, anaerobic jar 厭 氧 瓶 C. 酸 鹼 度 ( ph ) 1.optimum ph for growth: , limits 5-9 Thiobacillus thiooxidans 氧 化 硫 硫 桿 菌 : ( ) a unclassified bacteria: ( ) 2.carbon source & ph shift 3.buffer(a mixture of weak acid and its conjugate base) phosphate buffer, peptone, automatic control for large fermentation apparatuses, D. 其 他 物 理 條 件 1.illumination: phototrophic bacteria 2.hydrostatic pressure 四 慎 選 培 養 基 的 種 類 及 其 培 養 的 條 件 針 對 菌 別 慎 選 培 養 基 和 培 養 條 件, consulting the references 50

51 植 物 病 害 的 接 種 方 法 一 根 部 接 種 (Root inoculation) 1. 土 壤 接 種 法 (soil infestation) 2. 水 耕 法 (hydroponic method) 3. 根 部 浸 漬 法 (root-dip method) 4. 切 斷 浸 漬 法 (cut and dip method) 5. 根 部 刺 傷 法 (root-stabbing method) 6. 大 型 木 質 根 部 接 種 (inoculation of large woody roots) 7. 不 擾 亂 根 部 之 根 部 接 種 (root inoculation without disturbing the roots) 8. 培 養 皿 法 (in vitro methods) 9. 傾 斜 板 法 (slant-board technique) 10. 種 子 接 種 (seed inoculation) 二 莖 部 接 種 法 (inoculation of stem) 1. 塞 入 法 (cut and insert method) 2. 莖 部 刺 傷 法 (stem-stabbing technique) 3. 莖 部 注 射 法 (stem injection method) 4. 嫁 接 法 (patch grafting) 三 葉 部 接 種 (inoculation of leaves) 1. 噴 霧 法 (spraying of spore suspension) 2. 撒 佈 法 (dusting of spores) 3. 擦 刷 法 (shaking or brushing of infected leaves over the healthy leaves) 4. 葉 片 浸 漬 法 (to dip the leaf into a spore suspension) 5. 沈 降 器 法 (a stetting tower) 6. 噴 霧 室 法 (a horizontal spray chamber) 四 禾 穎 類 植 物 穎 花 接 種 (inoculation of inflorescence of cereal plants) 五 果 實 接 種 (fruit inoculation) 1. 噴 霧 法 (spraying of spore suspension) 2. 塞 入 法 (cut and insert method) 六 種 子 接 種 (seed inoculation) 參 考 文 獻 :Dhingra, O. D., and Sinclair, J. B Basic Plant Pathology Methods. CRC Press, Florida, pp

52 真 菌 的 接 種 試 驗 台 灣 杉 葉 枯 組 織 之 真 菌 分 離 採 集 自 林 務 局 苗 圃 之 台 灣 杉 葉 枯 病 徵 標 本, 然 後 將 採 集 之 罹 病 葉 片 逢 機 切 成 公 分 左 右 之 小 段 片, 並 以 1% 次 氯 酸 鈉 消 毒 後, 隨 即 利 用 2% 水 瓊 脂 培 養 基 (Water agar, WA) 及 馬 鈴 薯 葡 萄 糖 瓊 脂 培 養 基 (Potato dextrose agar, PDA) 培 養, 所 獲 得 菌 株 定 期 繼 代 培 養 保 存 之 將 供 試 菌 株 培 養 在 PDA 斜 面 上,12 小 時 間 歇 照 光, 每 2-3 星 期 更 新 培 養 一 次, 每 次 更 新 均 用 單 孢 分 離, 以 維 持 野 生 型 性 狀, 供 作 試 驗 之 需 所 分 離 之 菌 株, 依 其 產 孢 構 造 進 行 鑑 定 病 原 性 測 定 自 林 業 試 驗 所 索 贈 之 台 灣 杉 種 子, 播 種 後 育 成 之 實 生 苗 以 及 一 年 生 之 小 苗 作 為 本 研 究 之 供 試 植 株 接 種 前, 於 每 針 葉 中 央 用 3 號 蟲 針 穿 刺 傷 口 (2) 將 所 分 離 供 試 菌 株 之 孢 子 懸 浮 液 配 成 每 毫 升 含 孢 子 量 濃 度, 以 噴 霧 器 均 勻 噴 於 台 灣 杉 葉 上, 而 後 植 株 套 以 塑 膠 袋, 放 在 25 定 溫 箱 並 保 持 48 小 時 之 高 濕 度, 然 後 移 走 塑 膠 袋, 放 在 塑 膠 布 室, 逐 日 澆 水 管 理,7-9 天 後 調 查 植 株 的 罹 病 情 形 若 有 病 徵 出 現, 則 再 進 行 病 組 織 之 分 離 ( 蔡 竹 固 李 明 仁 1997 台 灣 杉 葉 枯 病 之 相 關 病 原 真 菌 調 查 嘉 義 技 術 學 院 學 報 54:93-98 ) 冬 瓜 萎 凋 病 組 織 之 真 菌 分 離 冬 瓜 萎 凋 病 之 病 徵 由 下 位 葉 開 始 逐 漸 變 黃 萎 凋, 隨 後 葉 柄 下 垂, 葉 片 焦 枯, 整 株 枯 萎 死 亡, 少 數 呈 半 邊 萎 凋 或 裂 蔓 現 象, 後 期 在 病 蔓 表 面 出 現 白 色 黴 狀 物 ; 受 害 的 根 部 在 較 小 的 支 根 上 出 現 褐 化 病 徵 ; 若 剖 開 植 株 縱 橫 切 面, 維 管 束 明 顯 褐 變 本 病 在 苗 期 及 成 長 期 均 會 發 生, 若 幼 苗 罹 病, 可 迅 速 萎 凋 死 亡 至 於 較 大 植 株 罹 病 時, 則 可 延 遲 至 結 果 期 才 發 病 將 罹 病 株 ( 品 種 名 : 細 長 大 冬 瓜 ) 根 及 莖 褐 變 部 位 切 取, 經 1% 次 氯 酸 鈉 溶 液 表 面 消 毒 3 分 鐘 後, 放 於 2% 水 瓊 脂 (water agar, WA) 培 養 基 上, 長 出 菌 絲 後 切 取 菌 絲 尖 端, 移 植 於 馬 鈴 薯 斜 面 培 養 基 內 培 養 在 C,1800 Lux 的 光 照 下, 菌 落 呈 白 色, 菌 絲 上 出 現 許 多 的 孢 子 堆, 挑 置 載 玻 片 上 以 顯 微 鏡 觀 察, 共 有 三 型 的 孢 子 病 原 性 測 定 把 所 得 二 菌 株 (FOB-3 及 FOB-6) 配 成 孢 子 懸 浮 液 (10 5 spores/ml), 將 株 齡 二 星 期 的 冬 瓜 苗 ( 細 長 大 冬 瓜 ) 根 部, 插 浸 液 中 半 小 時, 隨 即 定 植 於 健 土 中, 對 照 組 將 根 部 插 浸 於 無 菌 水 中, 二 菌 株 各 接 種 12 株, 經 12 日 二 菌 株 接 種 組 即 出 現 與 田 間 相 似 的 病 徵, 對 照 組 則 不 發 病, 顯 示 二 菌 株 對 冬 瓜 具 有 病 原 性 ( 蔡 竹 固 陳 瑞 祥 童 伯 開 1998 臺 灣 發 生 之 冬 瓜 萎 凋 病 植 病 會 刊 7: ) 52

53 細 菌 的 分 離 一 目 的 : 細 菌 之 塗 平 板 劃 平 板 二 材 料 : 柑 桔 潰 瘍 病 菌 移 植 針 酒 精 燈 培 養 基 無 菌 水 三 角 形 玻 棒 0.525% NaOCl 三 方 法 : 1. 培 養 基 及 三 角 形 玻 棒 先 經 高 壓 滅 菌 釜 滅 菌 後 備 用 2. 摘 取 罹 患 有 柑 桔 潰 瘍 病 之 病 葉 或 軟 腐 病 之 結 球 白 菜 3. 取 一 培 養 皿 置 10%Clorox 溶 液 ( 含 有 0.525% NaOCl), 再 取 三 個 培 養 皿 全 放 置 無 菌 水 4. 將 切 好 之 葉 片 放 入 0.525% NaOCl, 再 連 續 放 入 三 個 裝 有 無 菌 水 之 培 養 皿 內 漂 洗 5. 將 漂 洗 後 之 葉 片 放 入 置 有 無 菌 水 之 試 管 ( 為 原 液 之 細 菌 懸 浮 液 ) 6. 再 取 三 個 試 管 將 原 液 分 別 以 1:10 1:100 1:1000 的 比 率 稀 釋 配 置 7. 再 將 1:10 1:100 1:1000 之 細 菌 懸 浮 液 分 別 以 micropipette 吸 取 0.1ml, 加 入 三 個 NA(nutrient agar) 培 養 基 平 板 內, 以 三 角 形 玻 棒 塗 抹 開 來 塗 平 板 (Serial-Dilution-Agar-Plating) 8. 將 原 液 劃 平 板 (streak plate) 9. 將 所 得 之 培 養 基 平 板 放 於 30 C 之 定 溫 箱 中 培 養, 觀 察 長 出 之 菌 落 53

54 細 菌 的 接 種 及 生 理 特 性 一 細 菌 的 接 種 蕃 茄 青 枯 病 感 病 品 種 農 友 301 號 育 苗 30 天 之 幼 苗, 種 植 於 含 青 枯 病 菌 ( Ralstonia solanacearum)10 5 cfu/g dry soil 之 盆 砵 中 於 溫 室 中 觀 察 一 個 月, 記 錄 其 病 徵 表 現 蕃 茄 或 菸 草 發 病 等 級 (disease rating) 區 分 為 : 0 級 : 無 病 徵 1 級 : 一 片 葉 片 部 分 萎 凋 2 級 : 一 片 或 二 片 葉 片 萎 凋 3 級 : 三 片 或 更 多 葉 片 萎 凋 4 級 : 全 部 葉 片 萎 凋 5 級 : 植 株 萎 凋 死 亡 二 細 菌 的 生 理 特 性 1. 脫 硝 作 用 (denitrification) 2. 硝 酸 還 原 作 用 (nitrate reduction) 3. 螢 光 色 素 (fluorescent pigments) 4. 原 兒 茶 酸 (protocatechuate) 之 分 解 5. 石 蕊 牛 乳 試 驗 (Litmus milk) 6. 甲 基 紅 及 Voges-Proskauer 測 定 7. 蛋 黃 反 應 (egg-yolk reaction) 8. 解 脂 作 用 (lipolytic activity) 9. 精 氨 酸 二 水 解 酵 素 (arginime dihydrolase) 10.Koracs 氧 化 酵 素 (oxidase) 測 定 11. 觸 酵 素 雅 ( 過 氧 化 氫 酵 素,catalase) 測 定 12. 磷 酸 酵 素 (phosphatase) 測 定 13. 硫 酸 酵 素 (sulphatase) 測 定 14.DNAse 測 定 15. 尿 素 酵 素 (urease) 測 定 16. 苯 丙 氨 酸 脫 氫 酵 素 測 定 17. 氨 基 酸 脫 梭 酵 素 測 定 18. 白 明 膠 水 解 (hydrolysis of gelatin) 19. 澱 粉 之 水 解 (hydrolysis of starch) 20. 果 膠 上 形 成 凹 坑 之 測 定 21. 七 葉 樹 甘 (aseculin) 之 水 解 22. 硫 化 氫 (H 2 S) 的 產 生 23. 引 朵 (indole) 的 產 生 24. 果 聚 糖 (levan) 的 產 生 25. 酮 葡 糖 酸 (2-ketogluconate) 之 產 生 26. 由 乳 糖 產 生 酮 乳 糖 (3-Ketolactose) 27. 檸 檬 酸 (citrate) 之 利 用 28.Durham 管 糖 類 發 酵 試 驗 29. 酪 蛋 白 水 解 作 用 30. 脂 肪 水 解 作 用 31.IMViC 測 定 32. 碳 水 化 合 物 氧 化 作 用 之 測 定 (carbohydrate oxidation test) 碳 水 化 合 物 氧 化 作 用 之 測 定 (carbohydrate oxidation test) 54

55 依 照 Hayward 的 方 法, 測 定 細 菌 氧 化 碳 水 化 合 物 的 能 力 所 用 的 培 養 基 含 0.1% NH 4 H 2 PO 4 ; 0.02% KCl;0.02% MgSO4 7H 2 O;0.05% peptone; 0.003% 溴 麝 香 草 酚 藍 bromothymol blue (aq. soln.); 0.15% agar;1% carbohydrate, 調 整 為 ph 7.1 測 定 的 碳 水 化 合 物 為 葡 萄 糖 (glucose), 乳 糖 (lactose), 麥 芽 糖 (maltose), 纖 維 雙 糖 (cellobiose), 甘 露 醣 醇 (mannitol), 山 梨 聚 醣 醇 (sorbitol) 及 甜 已 醇 (dulcitol) 碳 水 化 合 物 除 甜 已 醇 因 溶 解 度 低 係 與 培 養 基 的 其 他 成 份 一 起 以 高 壓 殺 菌 釜 殺 菌 外, 其 餘 者 都 單 獨 滅 菌, 然 後 再 加 入 培 養 基 中 單 獨 滅 菌 的 碳 水 化 合 物 中, 麥 芽 糖 及 纖 維 雙 糖 用 細 菌 過 濾 器 滅 菌, 乳 糖, 甘 露 醣 醇 及 梨 山 聚 醣 醇 則 以 高 壓 殺 菌 釜 滅 菌 細 菌 接 入 培 養 基 經 培 養 後, 觀 察 培 養 基 是 否 由 綠 色 變 黃 色 ( 酸 的 產 生 ), 連 續 觀 察 21 天 bromothymol blue (ph=7.0 中 鹼 性, 藍 綠 色,pH=6.0 酸 性, 黃 色 ) 左 : 接 種 組 ph=6.0 酸 性, 黃 色, 右 : 對 照 組 ph=7.0 中 鹼 性, 藍 綠 色 55

56 病 毒 的 純 化 修 飾 Gonsalves & Ishii(1980) 之 方 法, 以 接 種 15 天 之 油 菜 或 青 江 白 菜 病 葉 為 材 料, 以 純 化 茼 蒿 病 毒 或 TuMV(Turnip Mosaic Potyvirus) 每 100g 病 葉 加 入 300ml 萃 取 緩 衝 液 (0.5M potassium phosphate, 10mM Na-EDTA, 0.25% sulfite, ph7.5) 磨 碎, 經 氯 仿 和 四 氯 化 碳 淨 化 40 分 鐘 並 離 心 (9,000 rpm, 10 min, Hitachi RPR 12-2 rotor) 後, 以 聚 乙 二 醇 (polyethylene glycol, PEG 6000) 濃 縮 病 毒 進 一 步 純 化 以 氯 化 銫 等 密 度 梯 度 離 心 (30000rpm, 16 hr, Hitachi RPS-28-a rotor) 行 之, 病 毒 帶 以 2-3 倍 量 之 0.1M 磷 酸 緩 衝 液 (ph7.5) 稀 釋, 並 以 PEG 6000 濃 縮 後, 沈 澱 物 以 0.1M 磷 酸 緩 衝 液 (ph7.5) 懸 浮, 透 析 後 即 得 純 化 病 毒 Gonsalves, D., and Ishii, M Purification and serology of papaya ringspot virus. Phytopathology 70: 陳 煜 焜 陳 翠 妙 陳 脈 紀 1996 茼 蒿 白 化 嵌 紋 病 之 病 因 診 斷 植 物 病 理 學 會 刊 5:

57 病 毒 的 接 種 病 毒 來 源 與 分 離 由 田 間 採 集 葉 片 具 明 顯 病 徵 之 茼 蒿 病 株, 以 0.1M 磷 酸 緩 衝 液 (ph7.4, 含 1%Na 2 SO 3 ) 磨 碎 葉 片, 摩 擦 接 種 於 撒 有 金 剛 砂 (400 mesh) 之 奎 藜 (Chenopodium quinoa Willd) 葉 片, 7-10 天 後 取 黃 化 單 斑, 同 法 接 種 於 奎 藜, 經 三 次 單 離 之 單 斑, 最 後 回 接 於 健 康 之 茼 蒿 或 油 菜 (Brassica campestris L.), 供 為 本 試 驗 之 接 種 源, 並 以 無 水 氯 化 鈣 乾 燥 保 存 於 4 備 用 蕪 菁 嵌 紋 病 毒 (turnip mosaic virus, TuMV), 則 以 同 法 分 離 自 田 間 青 江 白 菜 B. campestris L. subsp. chinensis (L.) Mak. 病 株 (Green & Deng, 1985) 奎 藜 接 種 病 毒 後 產 生 之 局 部 病 斑 寄 主 範 圍 測 定 茼 蒿 病 毒 依 前 述 方 法 接 種 於 莧 科 (Amaranthaceae) 藜 科 (Chenopodiaceae) 菊 科 (Compositae) 十 字 花 科 (Cruciferae) 葫 蘆 科 (Cucurbitaceae) 豆 科 (Leguminosae) 及 茄 科 (Solanaceae) 等 7 科 32 種 植 物, 於 溫 室 連 續 觀 察 四 至 六 週, 並 採 供 試 植 物 之 接 採 供 試 植 物 之 接 種 葉 回 接 於 奎 藜, 同 時 配 合 電 子 顯 微 鏡 陰 染 鏡 檢, 以 確 定 病 毒 之 感 染 Green, S. K., and Deng, T. C Turnip mosaic strains in cruciferous hosts in Taiwan. Plant Dis. 69: 陳 煜 焜 陳 翠 妙 陳 脈 紀 1996 茼 蒿 白 化 嵌 紋 病 之 病 因 診 斷 植 物 病 理 學 會 刊 5:55-62 嵌 紋 型 病 徵 57

58 16. 線 蟲 的 分 離 及 觀 察 柏 門 式 漏 斗 分 離 法 (Baermann funnel method) 1. 採 集 用 具 : 小 鐵 鏟 塑 膠 袋 2. 植 株 根 群 附 近 土 壤 : 約 200 公 克 3. 舒 潔 衛 生 紙 2 張, 將 土 壤 包 裹 後 置 放 網 篩 上 4. 漏 斗 及 指 形 管 為 橡 膠 管 連 結 好 後 加 水 至 8 分 滿 5. 網 篩 置 放 後 再 加 滿 水 柏 門 氏 漏 斗 法, 為 活 著 的 線 蟲 可 自 水 中 游 泳 穿 過 衛 生 紙 空 隙 而 下 沉 至 漏 斗 下 方 指 形 管 內 6. 經 小 時 後, 鋏 緊 橡 皮 管, 取 出 指 形 管 7. 指 形 管 之 管 內 水 液 注 入 5cm 小 培 養 皿. 於 解 剖 及 光 學 顯 微 鏡 下 檢 查 柏 門 式 漏 斗 分 離 法 環 紋 線 蟲 Criconemoides(=Criconema, ring nematodes), 與 Hemicyciliophora 屬 相 似, 惟 體 形 較 短, 體 環 極 明 顯, 突 出 如 鋸 齒 狀, 故 稱 環 紋 線 蟲 蟲 體 不 帶 前 一 齡 期 之 角 皮 口 針 節 球 微 向 前 鉤 尾 端 呈 圓 錐 形 至 圓 形 營 根 部 外 寄 生 58

59 針 線 蟲 Longidorus(needle nematodes), 蟲 體 甚 長, 達 數 mm, 固 定 後 常 彎 曲 口 針 甚 長, 並 有 延 伸 部 (stylet extension), 後 者 粗 大, 幾 與 口 針 本 身 等 長 口 針 前 端 靠 近 口 唇 處 有 導 環 (guiding ring) 食 道 前 部 狹 長 彎 曲, 後 部 擴 大 呈 圓 柱 狀, 長 於 體 寬 除 一 種 外, 皆 為 雙 卵 巢, 由 陰 門 向 前 後 延 伸, 可 迴 轉 尾 部 甚 短, 肛 門 橫 裂 本 屬 線 蟲 存 在 於 根 圈 土 壤, 營 根 外 寄 生 有 些 種 類 可 媒 介 植 物 毒 素 (virus) 病 根 瘤 線 蟲 根 瘤 線 蟲 雌 雄 容 易 由 形 態 上 分 辨 雄 的 像 線 狀, 長 約 mm, 直 徑 μ m 雌 的 為 梨 狀, 長 約 mm, 寬 mm 每 雌 蟲 將 大 約 500 個 卵 產 於 膠 狀 物 質 中 第 一 齡 幼 蟲 在 每 個 卵 內 發 育 當 在 卵 內 脫 皮 之 後 就 變 成 第 二 齡 的 幼 蟲, 後 來 破 殼 而 出, 進 入 土 壤, 移 動 著 直 到 找 到 一 個 易 受 感 染 的 根 為 止 第 二 齡 的 幼 蟲 為 似 線 狀, 且 是 線 蟲 唯 具 感 染 性 的 時 期 如 一 個 易 受 感 染 的 寄 主 剛 好 在 附 近, 幼 蟲 就 進 入 那 個 根, 在 根 內 定 居 下 來, 並 長 得 很 胖, 以 像 似 香 腸 形 狀 的 方 式 生 長 線 蟲 將 口 針 插 入, 將 唾 液 注 入 頭 部 四 周 寄 主 細 胞 以 取 食 唾 液 刺 激 細 胞 腫 大, 且 使 部 分 細 胞 內 物 質 溶 解, 線 蟲 以 口 針 吸 吮 之 線 蟲 經 過 了 第 二 次 脫 皮 就 邁 入 了 與 第 二 齡 相 似, 但 缺 少 口 針 的 第 三 齡, 且 更 肥 胖 第 三 次 脫 皮 過 後 就 邁 入 可 分 辨 雌 雄 的 第 四 齡 一 隻 雄 的 四 齡 蟲, 又 再 變 成 似 線 狀, 且 被 三 齡 的 外 皮 所 圍 繞 經 過 了 四 齡 後 的 最 後 ( 第 四 次 ) 脫 皮, 從 根 內 游 出 來, 係 一 隻 成 熟 的 雄 蟲 自 由 地 生 活 在 土 壤 中 四 齡 雌 蟲 繼 續 長 胖 或 長 得 長 一 點 經 過 第 四 次 的 脫 皮 成 為 一 隻 成 熟 的 雌 蟲 這 成 熟 的 雌 蟲 繼 續 長 大, 且 不 受 精 或 受 精 而 將 卵 下 於 一 個 膠 狀 保 護 的 外 殼 卵 也 許 置 於 根 部 組 織 的 內 側 或 外 側, 依 母 蟲 位 置 而 定 卵 也 許 立 即 孵 化 或 牠 們 可 越 冬 待 至 春 天 孵 化 整 個 生 活 環 在 溫 度 27 下 25 天 可 完 成, 但 如 在 較 低 或 較 高 的 溫 度 下 須 較 久 的 時 間 當 孵 化 時, 感 染 性 的 二 齡 蟲 可 移 動 擦 傷 根 部 鄰 近 的 部 分, 且 在 同 一 根 內 造 成 新 的 感 染, 或 牠 們 從 根 部 出 來 而 感 染 同 棵 植 物 或 別 株 植 物 的 根 最 多 的 根 瘤 線 蟲 通 常 距 土 壤 表 面 5 公 分 到 25 公 分 下 的 地 帶 處, 但 在 桃 及 其 他 根 部 已 發 現 有 深 及 2 到 2.5 公 尺 的 深 處 根 瘤 線 蟲 以 自 己 的 力 量 移 動 的 能 力 有 限, 但 牠 們 可 以 以 水 或 緊 黏 農 具 的 土 壤 傳 播 或 用 別 的 方 法 而 運 送 到 從 未 感 染 線 蟲 的 地 區 59

60 17. 寄 生 性 高 等 植 物 藻 類 的 觀 察 菟 絲 子 (Cuscuta chinensis) 蔓 生, 淡 黃 色 褐 紅 或 紫 色, 葉 呈 鱗 片 狀, 看 來 幾 乎 無 葉, 莖 柔 軟, 纏 繞 寄 主 之 莖 葉 而 生, 夏 秋 時 開 化 花 小 呈 叢 狀, 白 黃 或 淡 紅 色 花 萼 5 裂, 大 約 與 花 冠 等 長, 花 冠 短 鐘 形, 約 2 公 厘 長, 5 裂, 雄 蕊 5 枚, 雌 蕊 內 花 柱 2 枚, 蒴 果 扁 球 形, 內 含 2-3 個 種 子 菟 絲 子 隨 寄 主 種 子 發 芽 生 長 而 纏 繞 寄 主, 與 寄 主 接 觸 部 位 生 出 吸 器 (haustoria) 穿 入 寄 主 皮 層 維 管 束, 分 泌 酵 素 或 生 長 調 節 物 質, 利 用 寄 主 水 分 養 分 供 其 生 長 及 繁 殖 之 用 60

61 柿 寄 生 (dwarf mistletoes) 之 學 名 Viscum angulatum, 此 寄 生 性 高 等 植 物 屬 桑 寄 生 科 (Loranthaceae), 枝 條 綠 色, 寄 生 性 無 葉 灌 木, 40-60cm 高, 枝 條 二 叉 的, 2-5cm 長 葉 退 化 成 鱗 片, 花 不 明 顯, 雌 雄 異 花, 昆 蟲 授 粉 果 實 長 橢 圓 形, 7 x 6mm, 有 粘 性, 可 粘 著 於 其 他 枝 條 上, 藉 以 傳 播 條 件 適 宜 時, 種 子 發 芽 長 出 幼 根 所 有 槲 寄 生 均 含 葉 綠 素, 可 自 行 製 造 營 養, 但 仍 需 自 寄 主 吸 取 水 分 及 礦 物 質, 也 吸 取 一 部 分 養 分, 故 稱 之 為 半 寄 生 (semi-parasite) 芒 果 藻 斑 病 Cephaleuros virescens Kunze 以 原 葉 體 (thallus) 存 在, 盤 狀 ( 淡 綠 紅 色 或 褐 色 ) 絲 狀 體 向 寄 主 角 質 層 入 侵, 在 角 質 層 與 表 皮 細 胞 間 生 長 固 定 及 吸 收 成 熟 之 原 葉 體 上 有 毛 狀 物, 是 其 有 性 及 無 性 器 官 61

62 高 濕 度 時,C. virescens 會 產 生 細 小 毛 狀 物, 在 其 頂 端 著 生 3-9 支 約 略 等 長 的 短 柄, 其 上 著 生 許 多 黃 色 圓 形 的 游 走 孢 子 囊, 當 有 足 量 水 份 時, 就 會 釋 出 游 走 胞 子, 開 始 另 一 次 新 的 感 染 62

63 植 物 病 原 的 保 存 一 微 生 物 的 保 存 目 的 : 1.stock-culture 原 種 collection 2.for laboratory classes and research work 3.as test agents, for chemotherapeutic agent, vitamins, amino acids 4.as reference strains, 5.as agents for production of vaccines, antisera, antitumor agent, enzymes, and organic chemicals 6.properly identified and cataloged strains of bacteria 7.to maintain strains alive and uncontaminated and to prevent any change in their characteristics, 二 微 生 物 的 保 存 方 法 (methods of maintenance and preservation) 1.periodic transfer to fresh media (1).heterotroph, nutrient agar, several weeks or months (2).the development of varients and mutants 2.overlaying cultures with mineral oil(fig.8-7, p.141) (1).the oil is about 1/2 in above the tip of the slanted culture, (2).1 month to 2 years, (3). 較 少 發 生 變 異 及 突 變 體 3.liophilization( freeze-drying 冷 凍 乾 燥, Fig.8-8,p.142) (1).in small vials and frozen at -60 to -78, (2).sublimes 昇 華 under the vacuum, (3).a minimum of damage to cell structure, (4).the vials are sealed off under a vacuum and stored in a refrigerator, (5).remained viable and unchanged for more than 30years, (6).minimal storage space, (7).the small vials can be sent conveniently, (8).How to revive 復 活 the lyophilized culture, 4.storage at low temperatures (1).for long-term preservation, (2).cryoprotective agent 抗 結 晶 劑 : glycerol, dimethyl sulfoxide( DMSO 氧 化 硫 二 甲 脂 ), small ampoules 壺 腹 玻 管 (3).frozen at a controlled rate to -150 (4).stored in a liquid nitrogen refrigerator (5).remain viable for 10 to 30 years, without change in their characteristics, (6).relatively expensive, 三 微 生 物 的 收 集 及 保 存 機 構 (culture collections, central collections) 1.why establish a large central collections,for acquisition 取 得, preservation 保 存, distribution 分 配, 2.The Institut Pasteur in Paris, France 3.The National Collection of Type Cultures in London, England 4.The Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Darmstadt, the Federal Republic of Germany 5.The Institute for Fermentation in Osaka, Japan 6.The American Type Culture Collection( ATCC ) in Rockville, Maryland, U.S.A. 7.The Northern Utilization Research and Development Division, USDA in Peoria, Illinois, U.S.A. 8.The Quartermaster Research and Development Center, U.S. Army, Natick, Massachusetts; for microbial strains that are associated with deterioration 使 變 壞 process 9.The Department of Anaerobic Microbiology, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg; for anaerobic bacteria 10.CCRC-Culture Collection & Research Center, Hsinchu, Taiwan 63

64 四 微 生 物 培 養 的 特 性 (growth on various media, provide useful clues for identification) A. 菌 落 的 特 性 1.size: 量 其 直 徑 以 mm 計 算 2.margin or edge: entire 完 整, erose 不 規 則 齒 狀, undulate 波 狀, lobate 葉 狀, ciliate 細 毛 狀, fimbriate 繖 狀, locerate 破 裂 狀, ramose 樹 枝 狀 3.surface texture: smooth 光 滑, rough 粗 糙, mucoid 黏, wrinkled (1).S R variation, R mutant lack the ability to make capsule or O antigen (2).S, R related to virulence 4.elevation: thin, thick; flat 扁 平, convexity 中 度 隆 起 5.consistency 硬 度 : butyrous, viscous 黏 稠, stringy, rubbery, dry 乾, brittle, powdery 粉 狀 6.optical feature 混 濁 度 : opaque 不 透 明, translucent 半 透 明, opalescent 乳 白 光 7.chromogenesis or pigmentation: water-insoluble pigments, water-soluble pigments, fluorescent B. 肉 湯 ( 液 體 ) 培 養 的 特 性 1.amount of growth: scanty 缺 乏, moderate 中 度, abundant 豐 富 2.distribution and type of growth: turbid 混 濁, pellicle 表 膜, sediment 沈 澱 (granular 粒 狀, viscous 黏 性 ) 64