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雨罗
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1 2011 年第 69 卷化学学报 Vol. 69, 2011 第 2 期, 209~214 ACTA CHIMICA SINICA No. 2, 209~214 研究论文微波辅助快速制备核 - 壳型尿苷印迹聚合物及其在线富集应用研究文强 a,b 张明磊 b 张朝晖 *,a,b,c 曾云 ( a 林产化工工程湖南省重点实验室吉首 ) ( b 吉首大学化学化工学院吉首 ) ( c 湖南大学化学生物传感与计量国家重点实验室长沙 ) b 聂丽华 c 摘要采用微波辅助加热, 以尿苷为模板分子, 丙烯酰胺 (AA) 为功能单体, 乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EGDMA) 为交联剂, 快速制备尿苷印迹聚合物, 聚合时间大大缩短, 仅为传统加热的 1/8. 采用红外光谱和扫描电镜对印迹聚合物进行表征, 结果表明二氧化硅表面成功包覆尿苷印迹壳层 ; 该印迹聚合物颗粒分散均匀, 印迹壳层厚度约为 100 nm. 将该印迹聚合物填充萃取柱用于核苷类组分在线富集, 结合高效液相色谱仪技术, 实现了板蓝根提取液中尿苷鸟苷和腺苷在线富集和检测. 关键词微波辅助 ; 尿苷 ; 印迹聚合物 ; 在线富集 Microwave-assisted Heating for Rapid Preparation and On-line Enrichment Application of Core-shell Uridine Imprinted Polymer Wen, Qiang a,b Zhang, Minglei b Zhang, Zhaohui*,a,b,c Zeng, Yun b Nie, Lihua c ( a Hunan Province Key Laboratory of Forest Product and Chemical Engineering, Jishou ) ( b College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou ) ( c State Key Laboratory of Chemo/Biosensing & Chemometrics, Hunan University, Changsha ) Abstract Under microwave assisted heating, uridine imprinted polymer was prepared rapidly using uridine as template, acrylamide (AA) as monomer and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as cross-linker. The results indicated that the polymerization time was shorten significantly, only one eight of the conventional heating. Infrared spectroscopy and scanning electron microscopy were used to characterize the structure and morphology of the imprinted polymer, and the results showed that the imprinted polymer was coated on the surface of silica microspheres successfully. Well-dispersed particles are observed and the thickness of the imprinted shell is about 100 nm. Combined with high liquid chromatography technique, on-line imprinted enrichment and determination of nucleotide ingredients from the extracting solution of isatidis root were performed successfully. Keywords microwave assisted; uridine; imprinted polymer; on-line enrichment 分子印迹聚合物 (molecularly imprinted polymer, MIP) 因其对目标分子具有特异识别和专一吸附性等优点, 已经在许多领域得到应用 [1~3]. 作为固相萃取材料, 用于物质分离富集和痕量检测等方面受到研究人员的高度关注 [4,5]. 目前, 制备分子印迹聚合物的方法主要有本体聚合悬浮聚合和表面聚合等. 本体聚合印迹聚合物后续的打碎研磨筛选工序比较繁琐, 易造成聚合物的浪费 [6,7] ; 悬浮聚合制备技术容易使模板分子深埋, * zhaohuizhang77@hotmail.com Received May 25, 2010; revised August 9, 2010; accepted September 11, 国家自然科学基金 (No ) 湖南省教育厅重点项目 (No. 10A099) 湖南大学化学传感与计量国家重点实验室开放基金 (No ) 湖南省林产化工重点实验室开放基金 (No. JDZ ) 和湖南省吉首大学校级课题基金资助项目.

2 210 化学学报 Vol. 69, 2011 颗粒不均匀, 而且需要昂贵的分散剂 [8,9]. 表面聚合弥补了这些缺陷, 在近年来得到迅速的发展和应用 [10,11], 但是, 采用传统加热, 表面聚合需要的时间较长, 在溶液 [12] 中聚合物容易自凝成核, 甚至出现絮凝, Duarte 等采用超临界二氧化碳流体作为溶剂, 缩短了聚合时间, 但是所需仪器比较精密和昂贵, 限制了它的应用. 微波辅助加热作为一种新型的加热方法, 因其加热均匀加热速度快节能高效等优点, 已经在食品制药和化学工业等领域得到广泛应用 [13~15]. 但是目前很少将其用于制备印迹聚合物 [16]. 本文采用微波辅助加热, 以尿苷为模板分子, 丙烯酰胺为功能单体, 乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂, 优化聚合温度和聚合时间, 在自制二氧化硅表面成功制备出核 - 壳型印迹聚合材料. 该印迹材料用于板蓝根药材中尿苷鸟苷和腺苷分子的在线富集, 结合高效液相色谱技术, 实现了板蓝根类药品中尿苷鸟苷和腺苷 ( 图 1) 的在线检测. 图 1 尿苷腺苷胸苷和鸟苷的化学结构式 Figure 1 Chemical structures of uridine, adenosine, thymidine and guanosine 1 实验部分 1.1 试剂与设备正硅酸乙酯 (TEOS, Sigma 公司 ); 乙烯基三甲基硅烷 (VTMS, Sigma 公司 ); 乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EGDMA, Sigma 公司 ); 丙烯酰胺 (AA, 分析纯 ); 尿苷胸苷鸟苷和腺苷购自 Sigma 公司 ; 偶氮二异丁腈 (AIBN, 分析纯 ); 除特殊说明外, 其他所用试剂均为分析纯, 所有实验用水为二次蒸馏水. LC-10AD 型高效液相色谱 ( 日本岛津公司 ); WGH-30A 型双光束红外分光光度计 ( 天津港东科技发展有限公司 ); NJL07-3 实验用微波炉 ( 南京杰全微波设备有限公司 ). 1.2 印迹聚合物的制备二氧化硅微球制备按文献报道 [17], 在 100 ml 圆底烧瓶中加入 49.5 ml 无水乙醇, 2.0 ml 浓氨水, 6.3 ml 二次蒸馏水和 2.23 ml TEOS. 在 700 r/min 下搅拌, 反应 12 h, 然后将制备的产品过滤, 用乙醇洗涤 3 次, 80 下真空干燥 12 h, 备用二氧化硅微球修饰称取上述制备的二氧化硅微球 2.0 g, 加入 60 ml 8 mol/l HCl, 回流 12 h. 过滤, 滤饼用蒸馏水洗涤至中性后, 140 下干燥 8 h. 再将该二氧化硅微球重新分散到 30 ml 含 10% (V/V) VTMS 的乙醇溶液中, 超声 10 min, 室温搅拌 12 h, 将 VTMS 修饰的二氧化硅微球用大量的乙醇洗涤, 除去残余的 VTMS. 100 下干燥 3 h, 使 VTMS 与二氧化硅微球表面的羟基充分交联键和微波辅助印迹聚合物 (MH-MIP) 制备将 400 mg 乙烯基修饰的二氧化硅微球分散于 200 ml 乙腈中, 再加入 1.0 mmol 尿苷和 4.0 mmol AA, 以 300 r/min 的速度, 60 下搅拌 1 h. 冷却至室温后, 冰水浴中加入 18.4 mmol EGDMA 和 100 mg AIBN. 该混合物先在冰水浴中通氮气 10 min, 然后微波辅助加热至 60, 搅拌回流 3 h. 得到的聚合物经过离心分离, 用乙醇和蒸馏水洗涤, 140 真空干燥. 该印迹聚合物用甲醇 - 乙酸 - 水 (V/V/V=7 2 1) 混合溶液洗脱模板分子, 干燥, 备用. 非印迹聚合物 (Nonimprinted polymer, NIP) 的合成 : 合成方法与 MH-MIP 完全一致, 只是在合成时不加入模板分子. 常规加热下印迹聚合物 (MIP) 的合成 : 合成方法与 MH-MIP 完全一致, 只是在常规水浴加热下, 恒温 60 反应 24 h. 1.3 溶胀实验取 0.5 g 聚合物 (MH-MIP, MIP 和 NIP), 分别加入到 100 ml 二次蒸馏水中, 室温下浸泡 24 h, 直到聚合物完全溶胀. 溶液充分抽滤, 将充分溶胀的印迹聚合物从微孔滤膜 (0.22 µm) 上敲落到预先准备的蒸发皿, 用滤纸吸去印迹聚合物表面的水分, 称重. 溶胀度通过如下公式求得 [18] : S=(m s -m 0 )/m 0 其中 S 表示溶胀度 ; m s 是溶胀后的印迹聚合物的质量 (mg); m 0 干燥的印迹聚合物的质量 (mg). 1.4 静态平衡吸附准确称取印迹聚合物 (MH-MIP, MIP 和 NIP) 20 mg, 分别置于吸附管中, 各加入 10 ml 浓度为 10~40 µg/ml 的尿苷水溶液, 室温振荡吸附 12 h 后, 以 9000 r/min 速

3 No. 2 文强等 : 微波辅助快速制备核 - 壳型尿苷印迹聚合物及其在线富集应用研究 211 度离心分离, 取上清液用高效液相色谱测定平衡时尿苷的浓度. 液相色谱检测条件 : 检测波长 λ=254 nm; 流动相为甲醇 - 醋酸水溶液 (0.1%) (V V=3 4); 流速为 0.6 ml/min; 进样量为 10 µl. 1.5 选择性实验选取腺苷鸟苷胸苷为竞争吸附分子. 取 80 mg 聚合物 (MH-MIP 和 NIP), 加入 10 ml 浓度为 10 µg/ml 的尿苷和干扰物的溶液, 室温振荡吸附 12 h, 以 9000 r/min 速度离心分离, 取上清液用高效液相色谱测定平衡时尿苷和干扰物的浓度. 通过初始浓度和吸附平衡浓度的差与初始浓度的比值, 计算出聚合物对各个物质的吸附量. 1.6 板蓝根药物尿苷鸟苷和腺苷在线富集采用固相萃取与高效液相色谱技术联用装置, 在线富集检测板蓝根提取液中核苷类成分. 首先, 参照文献 [7], 填充空色谱柱 (150 mm 4.6 mm), 按照图 2 连接到高效液相色谱仪装置内. 启动 Pump 3, 以 0.5 ml/min 的流速连续进样 20 min, 核苷类成分在 MIP 萃取柱内得到富集. 关闭 Pump 3, 调节转换器, 使得 1 和 6, 2 和 3, 4 和 5 相连, 打开 Pump 1. 为了冲洗非特异性吸附附在 MIP 表面的组分, 采用甲醇冲洗 MH-MIP 富集柱, 流速为 1.0 ml/min, 冲洗液经过色谱柱后, 采用紫外检测器检测. 为了洗脱印迹特异吸附在 MIP 结合位点的核苷类成分, 流动相组成改为甲醇 - 乙酸 - 水 (V/V/V=7 2 1); 流速为 0.6 ml/min, 经过印迹分离柱的分离, 检测 MIP 分离和富集核苷类成分的效果. 其他色谱检测条件 : VP-ODS C 18 色谱柱 (150 mm 4.6 mm), 柱温 30, 紫外检测波长是 254 nm. 物质的量比例为 , 制备尿苷印迹聚合物, 制备过程如图 3 所示. 采用微波辅助代替传统的加热方法, 当微波功率设置为 400 W 时, 聚合体系的温度可控制在 60, 而且在 3 h 内就可以完成聚合. 微波辅助应用于印迹聚合物聚合过程, 大大缩短了聚合时间, 体现出高效和快速等优点 [16]. 图 3 核 - 壳型印迹聚合物的合成图 Figure 3 Procedure for preparing core-shell imprinted polymer 采用扫描电镜对二氧化硅微球和 MH-MIP 进行形貌分析, 结果如图 4 所示. 二氧化硅微球为粒径均匀的规则微球, 粒径约为 200 nm. 相比于二氧化硅微球, MH-MIP 颗粒尺寸明显增大, 约为 400 nm, 由此可估算出 MIP 壳层厚度约为 100 nm. 图 4 SiO 2 和 MH-MIP 的扫描电镜图 Figure 4 SEM images of SiO 2 and MH-MIP 2.2 红外分析图 2 在线富集检测核苷类组分装置图 Figure 2 System configuration for on-line enrichment and detection of nucleotide ingredients 2 结果与讨论 2.1 MH-MIP 制备如图 1 所示, 核苷类组分含有羰基氨基或是羟基, 在溶剂中和功能单体官能团形成氢键. 选择官能团较多的尿苷为模板分子, AA 为功能单体, EGDMA 为交联剂, 二氧化硅乙烯基修饰的二氧化硅和印迹聚合物的红外光谱图如图 5 所示. 图 5(a) 中 1150 cm -1 附近是 Si O Si 和 Si OH 的收缩振动峰, 图 5(b) 与图 5(a) 相比较, 在 1602 和 1407 cm -1 出现两个新的吸收峰, 分别对应 C=C 和 C H 吸收峰, 这表明在二氧化硅表面成功接枝了乙烯基. 微波辅助下 EGDMA, AA 和二氧化硅接枝的乙烯基完成聚合反应后, 得到的 MIP 在 3650~ 3100 cm -1 处有吸收峰, 对应于 O H 和 N H 的伸缩振动 ; 2960 和 1721 cm -1 处吸收峰是由于 C H 和 C=O 伸

4 212 化学学报 Vol. 69, 2011 缩振动引起的. 结果表明, 微波辅助成功用于核 - 壳型印迹聚合物的制备. 图 6 MH-MIP 和 NIP 的吸附等温线 Figure 6 Adsorption isotherms of MH-MIP and NIP 图 5 二氧化硅微球 (a) 乙烯基修饰二氧化硅 (b) 和印迹聚合物 (c) 的红外图谱 Figure 5 IR spectra of silica microspheres (a), vinyl modified silica microspheres (b) and MIP (c) 2.3 溶胀实验溶胀度反映印迹聚合物多孔结构装载溶剂的能力 [18], 较高的溶胀度表明印迹聚合物的三维网状结构具有较高的韧性. 因此溶胀度的大小影响溶剂中模板分子及其类似物接近印迹聚合物中有效结合位点的几率, 从而影响印迹聚合物对溶剂中模板分子的吸附性能. 溶胀实验在水相中进行, 根据溶胀公式计算出 MH-MIP, MIP 和 NIP 的溶胀度分别为 93.7%, 89.6% 和 64.1%; MH-MIP 和 MIP 在水相中的溶胀度明显大于 NIP, 这表明印迹聚合物的制备具有预定性, 在模板分子洗脱之后, 留下对模板分子及其类似物具有互补结构的空间构型, 增加了聚合物的空间孔隙, 从而增大了装载溶剂的能力. MH-MIP 装载水溶剂的能力比 MIP 略大, 主要是由于微波辅助加热均匀, 模板分子与功能单体形成的氢键作用稳定, 一定程度上增大了有效结合位点. 2.4 静态平衡吸附和选择性研究采用静态平衡吸附法测定 MH-MIP 和 NIPs 对尿苷的吸附等温线, 吸附量通过如下公式求得 [19] : Q=(C 0 -C)V/m 其中, Q 表示聚合物的吸附量 (mg/g); C 0 和 C 分别为尿苷溶液吸附前的浓度和吸附饱和后尿苷的浓度 (µg/ml); V 表示溶液的体积 (ml); m 表示聚合物质量 (g). 结果如图 6 所示. MH-MIP 对尿苷的吸附性能明显大于 NIP, 主要是由于印迹聚合物壳层内含有三维结构, 对模板分子具有特异吸附的结合位点, 通过官能团与模板分子之间的氢键作用结合, 增大了吸附容量. MH-MIP 对尿苷及其类似物选择性研究结果如图 7 所示, 吸附百分比通过以下公式求得 [20] : Adsorption (%)=[(C 0 -C)/C 0 ] 100% 其中, Adsorption (%) 表示吸附百分比, C 0 和 C 分别表示吸附前溶液中单一核苷组分的浓度和吸附饱和后单一核苷组分的浓度 (µg/ml). 图 7 MH-MIP 对核苷成分的选择性研究 Figure 7 Selective adsorption of MH-MIP towards nucleotide ingredients 在 MH-MIP 对尿苷与其它核苷选择吸附实验中, MH-MIP 对尿苷鸟苷和腺苷都有较大吸附量, 主要是由于胸苷鸟苷和腺苷与尿苷的结构式比较相似. 该实验表明利用该印迹材料对板蓝根药物中尿苷鸟苷和腺苷三种核苷组分富集和分离, 可以实现对三种核苷组分的同时测定. 2.5 在线富集检测采用图 2 所示的在线富集检测装置, 对板蓝根提取液中核苷类成分的分离富集性能进行研究, 结果如图 8 所示. 图 8(a) 是采用高效液相色谱仪直接对板蓝根提取液进行检测的图谱, 可以看出样品液的基质比较复杂,

5 No. 2 文强等 : 微波辅助快速制备核 - 壳型尿苷印迹聚合物及其在线富集应用研究 213 并不能观察到核苷类组分的色谱峰. 板蓝根提取液经过在线富集之后, 采用纯甲醇进行冲洗的结果如图 8(b) 所示, 尿苷尿苷和腺苷显示出微弱的色谱峰, 这表明印迹聚合物通过非特异性吸附的核苷类组分及其他物质能被甲醇溶液洗脱. 印迹富集柱最后经过甲醇 - 乙酸 - 水 (V/V/V=7 2 1) 溶液洗脱之后, 如图 8(c) 所示, 很明显地可以看出板蓝根中核苷类组分的色谱峰. 这表明采用在线印迹萃取柱在线分离富集, 可以实现对样品溶液中核苷类组分的富集检测. 回收率, 相对于常规检测只有微小下降, 相对标准偏差 (RSD) 也小于 5.0; 腺苷在线富集回收率降低明显, RSD 也大于 5.0. 这表明 MH-MIP 作为在线富集柱填充材料, 可以实现板蓝根中尿苷鸟苷和腺苷的检测. 表 1 MH-MIP 对板蓝根中核苷组分回收率与常规检测方法的对比 Table 1 Comparison of recoveries of nucleotide ingredients between conventional detection method and on-line enrichment method 加标浓度 / 常规检测方法在线富集方法 (µg L -1 ) 回收率 /% RSD/% 回收率 /% RSD/% 尿苷鸟苷腺苷结论图 8 核苷成分在线富集检测色谱图 (a) 提取液, (b) 甲醇冲洗液, (c) 甲醇 - 乙酸 - 水 (V/V/V=7 2 1); (1) 尿苷, (2) 鸟苷, (3) 腺苷 Figure 8 Chromatograms of nucleotide ingredients by online enrichment and detection (a) Extraction solution, (b) washed by methanol, (c) eluted by the mixture solution methanol/acetic acid/water (V/V/V = 7 2 1); (1) uridine, (2) guanosine, (3) adenosine 进一步采用加标回收率 (Recovery, %) 试验研究洗涤程序流速对回收率影响, 检验在线富集检测的准确性. 板蓝根提取液中尿苷鸟苷和腺苷的加标浓度都为 5 µg/l, 在线富集过程以 0.5 ml/min 的流速连续进样 10 min, 采用如图 2 所示的在线富集装置, Pump 1 处溶液为纯甲醇, 并以不同的流速 (0.4~0.8 ml/min) 连续冲洗 MH-MIP 柱 5 min. 最后再按照洗涤程序通过紫外检测器测定核苷类组分的富集含量, 计算出各组分的回收率. 研究表明, 随着流速的增加, 尿苷和鸟苷的回收率呈现出先增大后减小的趋势, 流速为 0.6 ml/min 时, 尿苷和鸟苷回收率最大. 当流速很慢或过快时, 尿苷和鸟苷分子都不能从 MH-MIP 柱内得到很好的洗脱, 而腺苷回收率在设定的流速范围内基本上没有变化, 说明腺苷与 MH-MIP 结合的键能略微低于尿苷和鸟苷, 在甲醇 - 乙酸 - 水 (V/V/V=7 2 1) 溶液环境下解吸附较容易. MH-MIP 对板蓝根中核苷组分回收率与常规检测方法的对比如表 1 所示, 板蓝根中尿苷鸟苷在线富集采用微波辅助加热方法成功制备核 - 壳型印迹聚合物, 聚合时间缩短为 3 h. 采用扫描电镜对聚合物进行形貌表征, 估算出该印迹聚合物壳层厚度约为 100 nm. MH-MIP 对核苷组分的选择性实验表明该印迹聚合物对核苷类组分均有吸附作用, 进一步采用在线富集装置对板蓝根中核苷组分进行在线分离富集得到较好的效果. 结合在线富集技术和高效液相色谱检测技术, 成功用于板蓝根提取液中核苷组分加标回收率测定, 为天然药物中核苷组分的分离和测定提供了新方法. References 1 Meng, Z.-H.; Yamazaki, T. H.; Sode, K. Biosens. Bioelectron. 2009, 20, Ohkubo, K.; Sawakuma, K.; Sagawa, T. Polymer 2001, 42, Hwang, C. C.; Lee, W. C. J. Chromatogr. A 2009, 765, Yin, J.-F.; Yang, G.-L.; Chen, Y. J. Chromatogr. A 2005, 1090, Zhai, Y.-H.; Liu, Y.-W.; Chang, X.-J.; Chen, S.-B.; Huang, X.-P. Anal. Chim. Acta 2007, 591, Liu, Y.-W.; Li, W.-Y.; He, X.-W.; Chen, L.-X.; Zhang, Y.-K. Acta Chim. Sinica 2008, 66, 56 (in Chinese). ( 刘秋叶, 李文友, 何锡文, 陈朗星, 张玉奎, 化学学报, 2008, 66, 56.) 7 Chen, D.-H.; Hu, B.; Huang, C.-Z. Talanta 2009, 30, Wang, L.-L.; Yan, Y.-S.; Deng, Y.-H.; Li, C.-X.; Xu, W.-Z. Chin. J. Anal. Chem. 2009, 37, 537 (in Chinese). ( 王玲玲, 闫永胜, 邓月华, 李春香, 徐婉珍, 分析化学, 2009, 37, 537.) 9 Hu, X.-G.; Hu, Y.-L.; Li, G.-K. J. Chromatogr. A 2007, 1147, 1.

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