六 串 联 质 谱 技 术 在 现 代 中 药 与 天 然 产 物 分 析 中 的 应 用 应 用 实 例 I: 传 统 饮 片 汤 剂 泻 心 汤 成 分 的 剖 析

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1 目 美国应用生物系统公司简介 AB公司亚太技术中心简介 录 封页 封页 美国应用生物系统公司 世界领先的质谱技术 质谱学基础知识 串联四极杆 QQQ 质谱系统... 串联四极杆 / 线性离子阱 Q TRAP 质谱系统 五 串联质谱技术在代谢组学分析中的应用 串联四极杆 / 飞行时间质谱 QqTOF 系统 AB公司质谱仪的技术性能 一 新药研究开发是一个系统工程 二 未来新药创新的发展模式 三 串联质谱技术在组合化学和高通量筛选中的应用 应用实例 I 16种肽活性的快速筛选 应用实例 II 8-in-1组合给药研究中先导化合物的快速鉴定与优化 应用实例 III 快速移植GC-MS筛选方法至LC-MS/MS 四 串联质谱技术在药物代谢研究中的应用 4.1 药物代谢物的结构鉴定 Metabolites Identification 应用实例 I HIV蛋白酶抑制剂代谢物的结构分析 应用实例 II 人工与自动化代谢物数据处理的比较研究 4.2 药物及其代谢物的定量分析 DMPK & ADME 应用实例 I 强安定药氟派啶醇体外代谢物的分析 应用实例II 组合给药的药代动力学研究 应用实例 III 大鼠肝微粒体中雷米克林代谢物快速筛选 应用实例IV 睾丸激素葡糖苷酸结合物的检测 应用实例 I 大鼠摄入长春西汀前后尿液中代谢组学分析 应用实例 II 糖尿病大鼠模型中生物标记物的分析 1

2 六 串 联 质 谱 技 术 在 现 代 中 药 与 天 然 产 物 分 析 中 的 应 用 应 用 实 例 I: 传 统 饮 片 汤 剂 泻 心 汤 成 分 的 剖 析 应 用 实 例 II: 蒲 公 英 中 抗 病 毒 组 分 的 分 析 应 用 实 例 III: 复 方 丹 参 滴 丸 代 谢 物 的 分 析 应 用 实 例 IV: 黄 芪 甲 苷 在 大 鼠 体 内 的 药 代 动 力 学 和 组 织 分 布 研 究 七 串 联 质 谱 技 术 在 治 疗 药 物 监 测 中 的 应 用 应 用 实 例 I: 同 时 检 测 血 液 中 的 多 种 药 物 应 用 实 例 II: 移 植 治 疗 中 免 疫 抑 制 剂 环 胞 霉 素 (CsA CsD) 霉 酚 酸 (MPA) 他 克 莫 司 (TAC) 的 测 定 54 应 用 实 例 III: 激 素 药 物 的 测 定 应 用 实 例 IV: 前 列 腺 激 素 受 体 刺 激 骨 康 复 疗 法 中 受 体 的 测 定 应 用 实 例 V: 脑 中 内 源 性 辣 椒 素 类 物 质 的 检 测 应 用 实 例 VI: 心 脏 血 管 风 险 因 子 半 胱 氨 酸 的 检 测 应 用 实 例 VII: 人 体 体 液 中 18 种 氨 基 酸 的 测 定 应 用 实 例 VIII: 血 红 蛋 白 病 中 血 红 蛋 白 变 种 和 镰 刀 形 红 细 胞 血 红 蛋 白 的 测 定 应 用 实 例 IX :DNA 氧 化 产 物 的 测 定 应 用 实 例 X: 蛋 白 质 生 物 标 记 物 的 测 定 应 用 实 例 XI: 生 物 检 材 中 滥 用 药 物 的 分 析 应 用 实 例 XII: 同 时 分 析 301 种 药 物 / 毒 物 的 实 验 和 谱 库 检 索 方 法 八 串 联 质 谱 技 术 在 药 品 质 量 控 制 和 打 假 中 的 应 用 应 用 实 例 I: 药 品 中 降 解 产 物 及 杂 质 的 分 析 应 用 实 例 II: 柴 胡 皂 苷 生 产 工 艺 的 控 制 应 用 实 例 III: 中 药 溯 源 应 用 实 例 IV: 药 品 打 假 应 用 实 例 V: 中 药 中 农 药 残 留 的 分 析 九 串 联 质 谱 技 术 在 新 生 儿 疾 病 筛 查 中 的 应 用 应 用 实 例 结 束 语

3 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 世 界 领 先 的 质 谱 技 术 1910 年 世 界 上 第 一 台 质 谱 仪 雏 形 在 英 国 卡 文 迪 许 (Caendish) 实 验 室 研 制 1953 年 Wolfgang Paul 提 出 了 四 极 杆 质 谱 仪 的 概 念 1980 年 世 界 上 第 一 台 串 联 质 谱 仪 MS/MS 出 现 1982 年 AB 公 司 高 级 科 学 家 J. Henion,T. Covey 发 明 APCI/MS/MS 1983 年 AB 公 司 ( 原 PerSeptive Biosystems) 推 出 了 第 一 台 热 喷 雾 接 口 MS 系 统 年 J. Fenn 等 发 明 Electrospray 电 喷 雾 技 术 1987 年 AB 公 司 高 级 科 学 家 A.Bruins,T.Covey 等 发 明 了 大 气 压 离 子 化 技 术 IonSpray, 在 常 温 常 压 下 实 现 了 离 子 化 过 程 1987 年 AB 公 司 科 学 家 Chernushevich,I.V. 等 发 明 LC-QQ-TOF 并 申 请 专 利 1989 年 AB 公 司 推 出 了 世 界 上 第 一 台 商 业 化 API Ⅲ LC-MS/MS 串 联 四 极 杆 质 谱 仪 1990 年 AB 公 司 推 出 了 世 界 上 第 一 台 性 能 卓 越 的 MALDI-TOF MS 系 统 1995 年 AB 公 司 推 出 了 世 界 上 第 一 台 台 式 串 联 质 谱 API 300 LC-MS/MS 1995 年 AB 公 司 首 家 发 明 了 DE 专 利 技 术, 极 大 地 提 高 了 MALDI-TOF MS 的 分 辨 率 1997 年 AB 公 司 成 功 地 把 ESI 与 TOF 技 术 完 美 地 结 合 在 一 起, 推 出 了 LC-API/TOF 系 统 1999 年 AB 公 司 的 API 3000 LC-MS/MS 被 LC-MS/MS 行 业 设 定 为 黄 金 标 准 (Gold Standard) 1999 年 AB 公 司 推 出 了 液 相 色 谱 串 联 四 极 杆 - 飞 行 时 间 质 谱 Qstar QQ-TOF 质 谱 仪 2000 年 AB 公 司 首 次 采 用 Q2 离 子 储 存 技 术, 克 服 了 传 统 Q-TOF 检 测 小 分 子 离 子 效 率 低 的 问 题 2000 年 AB 公 司 首 次 成 功 地 把 MALDI 离 子 源 应 用 于 Qstar Pulsar i QQ-TOF 系 统, 并 能 与 API 离 子 源 切 换 2001 年 AB 公 司 推 出 大 气 压 光 化 学 电 离 源 (APPI), 用 于 弱 极 性 化 合 物 的 分 析 2001 年 AB 公 司 成 功 地 推 出 了 世 界 上 唯 一 真 正 的 串 联 飞 行 时 间 质 谱 4700 TOF-TOF 系 统 2001 年 AB 公 司 和 华 盛 顿 大 学 合 作, 独 家 推 出 ICAT 试 剂 和 软 件, 用 于 蛋 白 质 差 异 表 达 的 质 谱 定 性 和 定 量 测 定 2002 年 AB 公 司 在 世 界 上 首 次 实 现 四 极 杆 技 术 与 线 性 离 子 阱 技 术 的 结 合, 成 功 地 推 出 了 新 一 代 串 联 四 极 杆 质 谱 Q TRAP LC-MS/MS 系 统 2003 年 AB 公 司 成 功 推 出 Celera Discovery System 数 据 库 2004 年 AB 公 司 首 次 推 出 组 织 成 像 技 术 (Tissue Imaging), 成 功 地 实 现 组 织 切 片 直 接 质 谱 分 析 药 物 的 分 布 2004 年 AB 公 司 推 出 另 一 种 用 于 差 异 蛋 白 质 定 性 定 量 分 析 的 itraq 试 剂 和 软 件, 实 现 了 蛋 白 质 的 绝 对 定 量 2005 年 AB 公 司 推 出 最 新 设 计 的 API 3200 及 API 3200 Q TRAP 串 联 四 极 杆 质 谱 系 统 2006 年 AB 公 司 首 次 推 出 食 品 安 全 和 环 境 快 速 检 测 平 台 Cliquid 软 件 3

4 质谱学基础知识 质谱工作原理 电喷雾离子源 ESI N2 强电场下溶液带电 在毛细管出口形成带电液滴 溶剂蒸发 液滴 LC液流 雾化气 高电压 表面电场增强 离子逸出表面 蒸发进入空间喷口离子含有正离 子 也含有负离子 喷口电场的极性和溶液的性质决定了何种离子 占优势 离子带电荷的数量取决于被分析物结构和溶剂 加热的喷雾气 由于离子带多电荷 适于用来分析极性分子和生物大分子 涡流 混合 N2 Turbo VTM离子源 新型陶瓷加热技术 双涡流气气化技术 使样品的离子化效率最大化 ESI流速为2~2000 µl/min APCI流速可达~3000 µl/min 新型离子取样界面设计更符合离子运动动力学 保证了更高灵敏度 APCI 离子源自清洁探头设计允许 HPLC 的流速更高 分析通量更高 即插即用型 ESI和APCI接口切换设计使用更方便 NanoSpray 电喷雾离子源 专为低纳升流速提高灵敏度而设计 MicroIonSpray 电喷雾离子源 纳升流速至2 µl/min IonSpray 电喷雾离子源 流速为2~200 µl/min 大气压化学电离离子源 APCI 溶液在气流作用下形成气溶胶 蒸发 电晕放电使溶剂电离 使质子转移或电子捕获 使样 品带电 通常样品带一个电荷 可能有少量碎片 适于分析极性小或中性的分子 气帘气 1. 首先产生溶剂离子 喷雾气 3. 气帘气帮助离子转移到 质量分析器 并去除 簇离子 样品(M) LC液流 补偿气 (~120 ) 电晕放电针 4 2. 反应气离子再与样 品分子反应 形成 离子簇 气帘气

5 串联四极杆 QQQ 质谱系统 PhotoSpray 大气压光离子源 离子源 DuoSpray 离子源 适合于分析低极性化合物 允许用户同时或交替使用 ESI 和 大大提高了灵敏度 APCI离子源 气帘接口 气帘接口是目前世界上性能超群的接口 它采用小流量反向氮 氮气气帘气 气流吹扫的方法 增加溶剂的雾化 大大提高灵敏度 差级真空泵接口 取样板 API离子源 可十分有效地防止接口的污染 反向氮气流有效保护取样孔免 收微粒的污染 真空腔体 分离器 气帘气流 适合于液相色谱非挥发性缓冲剂及各种流动相条件 串联四极杆 QQQ 质谱系统 由 3 级四极杆 Q1 Q2 Q3 空间串联组 成 其中 Q1 和 Q3 具有质量选择器和分析器的功 能 Q2 充当碰撞活化池的作用 引起分子离子 在池中碰撞解离 形成丰富的碎片离子 提供结 构信息 串联四极杆质量分析器 扫描方式 子离子扫描方式 提供样品的结构信息和鉴定碎片 离子 中性丢失扫描 确定丢失中性小分子的离子 相 母离子扫描方式 确定碰撞室中产生的特殊子离子 的 来源 这种扫描方式通常用于 药物代谢物的鉴定 多反应监测扫描方式 MRM 主要用于定量分析 这种扫描方 式可以同时监测多对母-子离子对 是 定量分析最好的方式 当于在Q1-Q3之间的质谱碎片差扫描 5

6 串 联 四 极 杆 / 线 性 离 子 阱 (Q TRAP ) 质 谱 系 统 线 性 离 子 阱 技 术 是 最 新 发 展 的 质 谱 技 术, 把 传 统 串 联 四 极 杆 的 Q3 设 计 成 线 性 离 子 阱, 离 子 通 过 四 极 杆 的 出 口 发 射, 即 离 子 轴 向 发 射 ( 与 四 极 杆 同 方 向 ), 与 串 联 四 极 杆 的 离 子 光 路 和 检 测 器 很 好 匹 配 使 得 离 子 的 利 用 率 非 常 高, 比 传 统 离 子 阱 离 子 的 利 用 率 高 数 倍 甚 至 几 图 1. 串 联 四 极 杆 线 性 离 子 阱 系 统 组 成 十 倍 线 性 离 子 阱 技 术 克 服 了 传 统 离 子 阱 质 谱 仪 诸 如 低 质 量 截 止 点 (1/3 效 应 ) 空 间 电 荷 效 应 碰 撞 效 率 低 定 量 功 能 差 的 遗 憾, 同 时 保 留 了 传 统 离 子 阱 质 谱 仪 全 扫 描 灵 敏 度 高 能 进 行 多 级 质 谱 扫 描 的 特 点 把 串 联 四 级 杆 和 线 性 离 子 阱 技 术 首 次 结 合 在 一 起, 既 保 留 了 串 联 四 极 杆 质 谱 仪 的 优 势, 如 子 离 子 扫 描 母 离 子 扫 描 中 性 丢 失 扫 描 MRM 定 量 功 能, 又 结 合 了 传 统 离 子 阱 质 谱 仪 全 扫 描 灵 敏 度 高 能 进 行 多 级 质 谱 扫 描 的 特 点, 同 时, 还 有 增 强 子 离 子 扫 描 ( 选 择 特 定 化 合 物 鉴 定 碎 片 离 子, 提 供 结 构 鉴 定 信 息 ) 增 强 高 分 辨 率 扫 描 ( 确 定 离 子 电 荷 数, 进 行 MS/MS 分 析 ) 增 强 多 电 荷 扫 描 技 术 ( 剔 除 单 电 荷 离 子 的 干 扰, 有 效 降 低 化 学 噪 声, 分 析 丰 度 低 的 蛋 白 质 ) 时 间 延 迟 碎 裂 功 能 简 化 子 离 子 扫 描 的 图 谱 分 子 量 信 息 ) 等 新 的 扫 描 功 能, 是 一 种 集 优 异 定 性 与 定 量 功 能 于 一 体, 广 泛 用 于 药 物 开 发 药 物 代 谢 等 领 域 的 小 分 子 分 析 和 蛋 白 质 ( 组 ) 研 究 等 生 物 大 分 子 分 析 的 全 能 平 台 MS 3 质 谱 : 提 供 更 丰 富 的 化 合 物 结 构 信 息 时 间 延 迟 碎 裂 功 能 (TDF): 简 化 子 离 子 扫 描 的 图 谱 图 2. MS/MS/MS 质 谱 图 图 3. 线 性 离 子 阱 时 间 延 迟 碎 裂 扫 描 质 谱 图 增 强 多 电 荷 扫 描 技 术 (EMC): 剔 除 单 电 荷 离 子 的 干 扰, 有 效 降 低 化 学 噪 声 10 fm/µl BSA Digest Q3 Trap Single MS Enhanced Muliply Charged Single MS 图 4. 线 性 离 子 阱 增 加 多 电 荷 扫 描 质 谱 图 6

7 串联四极杆 飞行时间质谱 QqTOF 系统 LINAC 高压碰撞室专利技术 一般的串联MS/MS系统当多反应监测中存在相同质荷比的离 子时 由于碎片离子在碰撞室中的滞留 会产生 记忆效 应 俗称 鬼峰 专利LINAC 设计使离子连续加速 快速通过碰撞池 到达Q3 可有效地消除了这种现象 同时进行多组分分析 提高分析速度 减少离子驻留时间 并且没有灵敏度损失 提高定量结果质 量和通量 图5. LINAC 技术提高分析速 度 减少驻留时间 更利于方法开发 提高工作效率 超强的稳定性和耐用性技术 超宽的动态线性范围 7 50 pg r2 = y = 0.929x Intensity 6 MRM; 5µL 进样 200 µl/min Log Area Log pg 2 time min NH 3 4.2e4 N (1) 图6. 空白土壤样品加标样 (50 ng/ml) 超过 N O NH 0 H+ O O O N R OH (2) N O N R S N Intensity 2 O CH N N (3) r2 = y = 0.893x Log Height Blanks m/z 1 2 logamount ng 3 图7. 优异的定量动态线性范围 1200次进样 (3.5天) 串联四极杆 飞行时间质谱 QqTOF 系统 该系统把传统串联四极杆质谱仪的Q3改变为飞行时间质量分析器 具有测定准确质荷比的能力 能 够直接测定和计算离子的元素组成 具有全扫描 子离子扫描 母离子扫描 中性丢失功能 多电荷扫 描功能 混合扫描功能 MS和MS/MS自动切换扫描功能 同时也具有极高的速度和准确度 以及高灵敏 度和宽动态范围等特点 IonCooler 导入 新设计的屏蔽片 Qsatr Elite MS MS2 ޚ 䋼䞣 ᅮ 73 Razor 检测器 70 C6H10N3O ppm C5H8N3O C11H14N2Cl ppm 8.6 ppm PPM = ppm PPM = m/z, Da C13H16N3O2 600 PPM = 新设计的反射器 C13H18N2Cl PPM = 高效耐用的真空系统 0.6 ppm Max counts. PPM = PPM = LINAC II 碰撞室 C7H12N3O 45 C15H20N3O PPM = 0.6 C9H14N3O -0.6 ppm PPM = TOF Product (470.2): Exp 2, min from Sample 2 (t=60) of IDA DBS low.wiff a= e-004, t0= e+001 (Turbo Spray) 1300 Max counts. +TOF Product (470.2): Exp 2, min from Sample 2 (t=60) of IDA DBS low.wiff a= e-004, t0= e+001 (Turbo Spray) C25H33N5O2Cl C6H10N3O C7H12N3O PPM = -2.1 PPM = PPM = 图8. 串联四极杆飞行时间质谱组成 m/z, Da

8 AB公司质谱仪的技术性能 API 2000 LC-MS/MS API 3000 LC-MS/MS 用于常规分析的台式质谱系统 用于高灵敏度分析的台式质谱系统 API 2000 LC-MS/MS质谱仪控制一体 化 体积小巧 使用简便 适合实验室的 常规分析 本系统以AB公司专利的API离子 源和接口技术为特色 离子源切换方便 即插即用 提供了广泛应用的最大灵活 性 其他特点 包括 API 3000 LC-MS/MS质谱仪以性能优 异 经久耐用而享誉世界 一直是众多用 户的首选分析工具 最佳设计的离子光学及真空系统确 包了化合物检测的最低检测限LOD和最低定 量浓度LOQ 专利的气帘 离子源接口 Curtain Gas 的新设计 保证了超常的耐用性与 可靠性 经久耐用的离子源与接口技术提供 了优异的定性 定量稳定性保证 脉冲计数检测器 CEM 直接得到 离子记数 动态范围高达1~4E6 能分析复 杂基质中的微量成分 同时分析不同浓度 范围的多组分并减少了样品的浓缩与稀释 要求 专利线性加速LINAC 技术极大地提 高扫描速度 有效地消除传统串联四极杆 质谱的记忆效应 具有所有的MS/MS扫描功能 如子 离子扫描 母离子扫描 中性丢失扫描 多反应监测扫描(MRM) 增强了分析的特异 性和灵敏度 世界 黄金工业标准 Analyst 软件自动进行方法优化 使 用极其简便 Skimmer IQ1 Q0 ST Q1 LINAC IQ2 Collision Cell ST3 Q3 CEM DF Orifice Plate 8

9 AB公司质谱仪的技术性能 API 3200 LC-MS/MS API 4000 LC-MS/MS 建立在一流技术基础上的台式质谱系统 高性能定量和鉴定的工业标准系统 一体化控制的API 3200 LC-MS/MS采用了 最新的质谱技术形成优异的性能 以满足日益 严格的环境领域的分析要求 它是专为从事小 分子化合物定量的高通量实验室设计的 对环 境 食品安全 临床研究和药物开发领域的所 有样品类型和不同浓度的样品提供了一流的可 靠性和重现性 与我们的行业领先的 API 5000 系统和 API 4000 系统类似 API 3200 系 统提供了一系列令人难忘的高性能特征 包 括 工业标准API 4000 LC-MS/MS系统为医药 工业 从药物开发到临床试验各个阶段提供了 高性能的定量和鉴定能力 本系统的超高灵敏 度检测也确保食品安全和环境样品 法医毒物 样品 临床研究样品中肽或药物残留的微量分 析 与功能强大的Analyst 软件配合 本系统在 药物开发中为DMPK提供更快的信息通道 API 4000 系统的优异性能包括 最新设计的Turbo V 离子源在更广泛的 流速范围内提供了更高的电离效率 更高的定 量灵敏度 最新设计的 Turbo V 离子源 ESI 和 APCI探针即插即用 在更广泛的流速范围内提 供了更高的电离效率 更高的定量灵敏度 专利线性加速LINAC 技术极大地提高扫 描速度 专利线性加速LINAC 技术极大地提高扫 描速度 专利的气帘接口 Curtain Gas 的新 设计 减少了维护 保证最大的生产力 专利的气帘接口 Curtain Gas 的新 设计 减少了维护 保证最大的生产力 增强高流速性能 有效消除离子抑制效 应 自清洁探针设计和可靠的接口设计 保证 了高通量分析的生产力 高效率的应用软件 包括自动化方法开 发等 简化了质谱操作的复杂性 可选的 DuoSpray 离子源加速方法开 发 增加分析通量 先进的数据采集和数据处理的Analyst 软 件进行自动化设置和分析 提高了分析效率 可选的PhotoSpray 离子源大大扩展了 分析化合物的范围 可选的 DuoSpray 离子源加速方法开 发 增加分析通量 可选的 NanoSpray 离子源提高了极低 流速条件下分析的灵敏度 可选的PhotoSpray 离子源大大扩展了 分析化合物的范围 基于Windows操作系统的工业标准 Analyst 软件及其相关的软件工具符合 GLP 和 CFR 11标准 可选的NanoSpray 离子源提高了极低 流速条件下分析的灵敏度 9

10 API 5000 LC-MS/MS 分 析 复 杂 生 化 样 品 的 最 灵 敏 的 串 联 四 极 杆 系 统 API 5000 LC-MS/MS 系 统 为 复 杂 基 质 中 微 量 化 合 物 的 常 规 定 量 分 析 提 供 了 更 宽 的 动 态 线 性 范 围 和 超 高 的 灵 敏 度, 信 噪 比 比 工 业 标 准 API 4000 LC-MS/MS 系 统 更 高 它 也 为 小 分 子 化 合 物 的 定 量 分 析 提 供 了 无 可 比 拟 的 准 确 度 和 精 密 度 为 了 给 DMPK 和 ADME 研 究 提 供 最 迫 切 要 求 的 最 低 检 测 限,API 5000 LC-MS/MS 系 统 最 新 设 计 的 QJet 离 子 导 入 技 术 与 完 善 的 Turbo V 离 子 源, 以 及 功 能 更 强 大 的 新 一 代 Analyst 软 件 相 结 合, 形 成 了 适 合 于 药 物 开 发 的 各 个 阶 段 的 经 久 耐 用 高 通 量 的 平 台 和 更 高 水 平 的 定 量 性 能 本 系 统 性 能 可 靠 使 用 方 便, 其 特 征 包 括 : 创 新 设 计 的 QJet 离 子 导 入 技 术 通 过 更 有 效 地 捕 获 和 聚 焦 更 多 的 离 子 极 大 地 提 高 了 灵 敏 度 专 利 线 性 加 速 LINAC 技 术 确 保 MS/MS 模 式 中 离 子 的 最 大 传 输 率, 并 有 效 消 除 记 忆 效 应, 同 时 进 行 更 多 的 多 化 合 物 分 析 监 测 和 多 反 应 监 测 (MRM) 专 利 的 气 帘 接 口 (Curtain Gas ) 的 新 设 计, 减 少 了 维 护, 保 证 最 大 的 生 产 力 Turbo V 离 子 源 增 强 高 流 速 性 能, 有 效 消 除 离 子 抑 制 效 应, 自 清 洁 探 针 设 计 和 可 靠 的 接 口 设 计, 保 证 了 高 通 量 分 析 的 效 率 可 选 的 DuoSpray 离 子 源 加 速 方 法 开 发, 增 加 了 分 析 通 量 可 选 的 PhotoSpray 离 子 源 大 大 扩 展 了 分 析 化 合 物 的 范 围 Q TRAP LC-MS/MS 定 性 和 定 量 同 时 分 析 的 新 型 串 联 四 极 杆 系 统 Q TRAP LC-MS/MS 四 级 杆 - 线 性 离 子 阱 质 谱 系 统 把 串 联 四 级 杆 和 线 性 离 子 阱 技 术 首 次 结 合 在 一 起, 既 保 留 了 串 联 四 极 杆 质 谱 仪 的 优 势, 如 子 离 子 扫 描 母 离 子 扫 描 中 性 丢 失 扫 描 MRM 定 量 功 能, 又 克 服 了 传 统 离 子 阱 质 谱 仪 诸 如 低 质 量 截 止 点 (1/3 效 应 ) 空 间 电 荷 效 应 碰 撞 效 率 低 定 量 功 能 差 的 遗 憾, 是 一 台 集 优 异 定 性 与 定 量 功 能 于 一 体, 广 泛 用 于 药 物 开 发 药 物 代 谢 残 留 分 析 检 验 检 疫 等 领 域 的 小 分 子 分 析 和 蛋 白 质 ( 组 ) 研 究 等 生 物 大 分 子 分 析 的 平 台 Q TRAP LC-MS/MS 的 特 征 包 括 : 具 有 四 级 杆 - 线 性 离 子 阱 质 谱 系 统 的 增 强 全 扫 描 (EMS); 增 强 子 离 子 扫 描 (EPI); 增 强 分 辨 率 扫 描 (ER), 准 确 确 定 离 子 的 电 荷 状 态 ; 增 强 多 电 荷 扫 描 (EMC), 有 效 降 低 噪 音 水 平, 提 高 信 噪 比 ; 时 间 延 迟 碎 裂 扫 描 (TDF), 简 化 图 谱, 有 利 于 图 谱 解 析 ; 多 极 串 联 质 谱 功 能 (MS 3 ) 具 有 串 联 四 级 杆 的 子 离 子 扫 描 母 离 子 扫 描 中 性 丢 失 扫 描 多 反 应 监 测 扫 描 (MRM) 等 所 有 功 能 专 利 的 气 帘 离 子 源 接 口 (Curtain Gas ) 的 新 设 计, 保 证 了 优 异 的 耐 用 性 与 可 靠 性 专 利 线 性 加 速 LINAC 技 术 可 消 除 记 忆 效 应, 并 提 高 灵 敏 度 10

11 AB公司质谱仪的技术性能 3200 Q TRAP LC-MS/MS 4000 Q TRAP LC-MS/MS 串联四极杆和线性离子阱技术组合在同一平 结合串联四极杆和线性离子阱技术的新型串联 台的新型串联四极杆系统 四极杆系统 3200 Q TRAP LC-MS/MS系统采用专利 技术建立一个高性能的串联四极杆-线性离子 4000 Q TRAP LC-MS/MS系统在同一台仪 器上提供了超高灵敏度的定性和定量性能 串 联四极杆的扫描模式与线性离子阱的扫描模 式相结合 使其成为药物发现 ADME/ 毒理研 究 代谢组学 法医学 临床研究 环境和食 品微量分析诸多领域的超低含量组分的快速 自动化定量和定性的理想工具 本系统功能强 大 提供了 阱的系统 通过串联四极杆技术的特异性和 耐用性与线性离子阱的 MS/MS 全扫描的高灵 敏度特性相结合 使您能够在一个系统上进 行广泛范围的小分子和药物代谢物的识别和 定量 具有串联四极杆的定性和定量性能 高灵敏度的全扫描 MS CID-MS/MS MS 功能以及真正串联四极杆的 MRM 母离子 扫描 中性丢失扫描的高选择性 如真正的母离子扫描 中性丢失扫描 MRM 3 以及宽阔的线性动态范围 线性离子阱性能 如MS2 MS3 增强 线性离子阱与串联四极杆的碰撞池减少 了循环时间且没有低质量截止点 产生能够进 行谱库检索的MS/MS质谱 分辨率 高灵敏度全扫描等 使您更好地进 行结构鉴定或确证 Analyst 软件提供了最新的定性分析工 MS3 数据进行结构解析 具 包括质谱库和碎片解析等 Analyst 软件提供了最新的定性分析工 具 包括质谱库和碎片解析等 提供基于 MRM 方式下的 MS/MS Q TRAP 谱库建立和检索功能 分析数据 进行谱库检索 在定量分 析的基础上 进行定性分析 这为色 谱峰的确认提供了更为可靠的数据 这是任何其它串联四极杆质谱系统所 不能具有的能力 11 多种检索类型 MS, MS/MS, MS3,UV 带有化学结构式 1200种化合物 用户可自建谱库

12 QSTAR Elite Hybrid LC-MS/MS 用 于 快 速 代 谢 物 发 现 鉴 定 和 结 构 解 析 的 增 强 型 QqTOF 串 联 质 谱 系 统 QSTAR Elite 系 统, 提 供 了 更 高 的 灵 敏 度 更 高 的 质 量 分 辨 率 更 好 的 质 量 准 确 度 更 快 的 MS/MS 速 度 更 宽 的 线 性 动 态 范 围, 使 QqTOF 的 性 能 达 到 一 个 新 高 度 通 过 改 善 的 工 作 流 程 和 更 智 能 化 的 数 据 采 集, 增 强 的 这 些 性 能 确 保 您 能 从 每 个 实 验 中 获 得 更 多 更 有 意 义 的 信 息 数 据 多 种 离 子 源 的 选 择 极 大 地 扩 展 了 广 泛 应 用 的 灵 活 性 全 扫 描 的 线 性 动 态 范 围 增 加 至 4 个 数 量 级, 没 有 信 号 损 失, 使 定 量 最 优 化 最 新 型 Razor 检 测 器 提 高 分 辨 率 和 质 量 准 确 度 功 能 强 大 应 用 型 的 软 件 工 具 使 您 能 有 效 地 进 行 系 统 控 制 数 据 采 集 和 分 析 认 证 环 境 中 的 Analyst 软 件 根 据 GLP 和 21 CFR 11 标 准 要 求 设 计 整 套 Analyst 软 件 提 供 了 在 一 台 计 算 机 上 控 制 多 台 仪 器 项 目 (Project) 间 的 安 全 性 设 置 提 供 了 可 配 置 的 审 计 图 功 能, 以 防 止 多 余 的 或 不 必 要 的 事 件 发 生 提 高 了 网 络 数 据 采 集 性 能, 使 得 数 据 储 存 和 数 据 备 份 更 好 以 角 色 为 基 础 的 结 构 允 许 实 验 室 使 Analyst 软 件 用 户 化, 更 好 地 符 合 实 验 室 的 要 求 增 强 的 确 认 包 对 软 件 升 级 提 供 了 一 整 套 的 确 认 材 料 远 程 仪 器 监 测 A B 公 司 的 智 能 监 测 服 务 ( S m a r t Monitoring) 使 得 仪 器 的 正 常 运 行 时 间 最 大 化 通 过 智 能 监 测, 我 们 可 以 通 过 互 联 网 远 程 和 积 极 跟 踪 主 要 的 系 统 参 数, 在 仪 器 存 在 潜 在 的 问 题 影 响 您 的 实 验 室 的 效 率 前 识 别 出 它 们 使 用 远 程 优 先 监 测 和 远 程 诊 断 相 结 合, 我 们 的 绝 大 多 数 用 户 显 著 地 增 加 了 仪 器 的 正 常 运 行 时 间 12

13 新药研究开发是一个系统工程 一 新药研究开发是一个系统工程 新药研究与开发 是指新药从实验室发现到上市应用的整个过程 是一项综合利用各种科学和高 新技术的系统工程 是一个复杂的过程 需要反复评估 反复比较并分阶段实施的过程 以保证新药研 究与开发的科学性 可行性 经济性 新药研发具有以下特点 药品研制 生产 通过批准的时间周期 长 平均10年 7 14年 研发成本高 一种新药的平均成本8.0亿美元( 亿美元) 工作量大 平均 个化合物筛选出 1 个 获取利润时间短 平均为 10 年 因为核心化合物的专利保护期只有 20 年 因此 如何减少新药上市时间 增加开发成功率是各大医药厂家共同关注的问题 例如 若研发时 间缩短1/3即可节省1.7亿美元 全球有 1000 家大医药厂家 年销售收入超过 5000 亿美元 我国有大小近 7000 家医药厂家 但是 总的年销售收入还达不到数个大的医药厂家的水平 近年来 我国密切注视国际上新药研究开发的新进 展 积极吸取先进的新技术 新方法 已研究建立了一批细胞水平 分子水平乃至基因水平的筛选模 型 使新药筛选逐步从经验式 机遇式的普筛向以新理论为指导的定向设计过渡 并积极掌握自动化实 验技术 进行了高通量筛选的尝试 以体内的活性成分为模板设计新药 选择中药的活性成分进行结构 修饰 获得具有特色的新结构化合物 等等 这些进展都标志着我国新药研究的开发水平有所提高 但是 我国的新药研究开发创新能力依然比较薄弱 主要体现在创新药物很少 全新结构的化合物 很少 既是全新化合物又有专利保护的更少 在研新药成熟程度差 进展速度慢 不少新药在立项时就 已进行过多年甚至十多年的研究 但由于研究内容与方法均不规范 因此即使已获得专利保护的 I 类新 药 等开发成功 很可能专利已经或即将过期 重复研制的现象有增无减 制剂研究长期滞后 药物给 药系统的研究项目极少 未受到足够重视 制约我国新药研究开发的主要因素药物筛选工作滞后和新药研究与产业化条件差 因此 首先要加 强与药物筛选相关的生物医学基础研究 建立一批微量 快速 准确的筛选模型 提高筛选成功率 第 二是研究药物筛选技术 加快筛选速度 实现高通量药物筛选 第三 广开天然与人为资源 获取大量 供筛样品 建立大规模的药用样品资源库 第四 迅速发展药物制剂研究 加快研制和推广口服缓控释 制剂 开发新剂型如靶向制剂 透皮吸收制剂等 新药开发的主要流程图 13

14 二 未 来 新 药 创 新 的 发 展 模 式 近 年 来, 由 于 基 因 组 学 蛋 白 质 组 学 生 物 信 息 学 合 理 药 物 设 计 及 计 算 机 技 术 组 合 化 学 等 现 代 合 成 技 术 高 通 量 和 大 量 筛 选 技 术 的 应 用 以 及 药 物 化 学 与 分 子 生 物 学 遗 传 学 免 疫 学 酶 学 等 学 科 的 发 展 与 相 互 渗 透, 为 新 药 开 发 的 快 速 发 展 奠 定 了 基 础 未 来 新 药 研 究 与 创 新 将 向 以 下 几 个 方 向 发 展 : (1) 创 制 新 颖 的 分 子 结 构 类 型 NCE 突 破 性 新 药 研 究 开 发 在 现 代 医 学 理 论 和 科 学 设 想 指 导 下, 通 过 反 复 的 设 计 合 成 和 药 理 生 理 或 生 物 筛 选, 创 制 出 新 型 结 构 并 具 有 生 物 活 性 的 药 物 或 即 时 找 出 新 化 学 结 构 类 型 的 NCE, 成 功 的 话, 经 济 效 益 非 常 好, 故 有 实 力 的 制 药 公 司 无 不 以 此 为 主 攻 方 向 但 是 这 种 新 药 研 究, 开 发 难 度 很 大, 风 险 也 很 大 (2) 创 制 me-too 新 药 模 仿 性 新 药 研 制 开 发 即 在 不 侵 犯 别 人 专 利 权 的 情 况 下, 对 新 出 现 的 很 成 功 的 突 破 性 新 药 进 行 较 大 的 分 子 结 构 改 造 或 修 饰, 寻 找 作 用 机 制 相 同 或 相 似 并 在 治 疗 应 用 上 具 有 某 些 优 点 的 NCE, 这 种 新 药 研 究 工 作 创 造 会 较 好 的 经 济 效 益 例 如 国 际 药 品 市 场 非 常 令 人 瞩 目 的 盐 酸 雷 尼 替 丁 和 萘 普 生, 全 球 销 售 额 都 远 远 超 过 其 原 型 的 西 咪 替 丁 和 布 洛 芬 (3) 已 知 药 物 的 进 一 步 研 究 开 发 延 伸 性 新 药 研 究 开 发 对 已 知 药 物 ( 包 括 药 用 植 物 的 有 效 成 分 ) 进 行 分 子 修 饰 或 改 造, 创 制 专 属 性 更 强 疗 效 更 高 或 安 全 性 更 好 的 新 药 也 是 很 普 遍 采 用 的 一 种 途 径 对 本 公 司 现 有 药 ( 或 其 它 公 司 专 利 已 过 期 的 药 物 ) 继 续 研 究, 制 成 更 为 理 想 ( 如 理 化 性 质 更 佳 生 物 利 用 度 更 高 或 具 有 靶 向 性 等 ) 的 衍 生 物 或 前 体 也 普 遍 受 到 重 视 (4) 应 用 现 代 生 物 技 术, 开 发 新 的 生 化 药 物 应 用 基 因 重 组 技 术 细 胞 融 合 技 术 和 复 杂 的 分 离 提 纯 新 技 术, 批 量 生 产 原 来 有 生 物 体 内 仅 仅 微 量 存 在, 但 具 有 高 度 活 性 的 天 然 生 化 物 质 作 为 治 疗 药 物 是 一 项 经 济 效 益 高 社 会 效 益 好 的 高 新 技 术, 正 愈 来 愈 受 到 制 药 界 的 重 视, 并 已 陆 续 开 发 成 功 人 胰 岛 素 干 扰 素 单 克 隆 抗 体 人 生 长 激 素 表 皮 生 长 激 素 TPA TNF 白 介 素 等 一 系 列 产 品 (5) 现 有 药 物 的 药 剂 学 研 究 开 发 发 展 制 剂 新 产 品 在 疗 效 肯 定 的 基 础 上 进 行 药 剂 学 研 究 与 开 发, 如 应 用 新 型 药 用 辅 料 或 制 剂 新 技 术 研 究 开 发 旨 在 提 高 治 疗 质 量, 特 别 是 提 高 生 物 利 用 度 的 新 制 剂 产 品, 或 设 计 开 发 新 剂 型 及 复 方 制 剂 等, 即 能 比 较 容 易 批 准, 有 的 还 有 利 于 延 长 原 有 产 品 的 专 利 保 护 期, 是 一 种 投 资 少 风 险 小, 而 经 济 效 益 可 能 极 佳 的 新 产 品 研 究 开 发 工 作, 近 年 来 一 直 受 到 所 有 制 药 公 司 的 重 视, 有 的 已 取 得 极 大 的 成 功 (6) 应 用 现 代 新 技 术 对 老 产 品 的 生 产 工 艺 进 行 重 大 的 技 术 革 新 和 技 术 改 造 现 代 分 析 技 术 的 进 步 成 为 新 药 开 发 的 加 速 器, 串 联 质 谱 技 术 已 经 成 为 新 药 开 发 研 究 中 的 最 佳 技 术 平 台 它 能 够 进 行 定 性 分 析 是 什 么? 研 究 创 新 药 物 仿 制 药 物 中 药 复 方 肽 类 药 物 等 ; 定 量 分 析 有 多 少? 解 决 生 物 利 用 度 药 物 代 谢 血 尿 药 物 浓 度 测 定 药 物 的 质 量 控 制 中 药 中 残 留 农 药 测 定 等 问 题 14

15 串 联 质 谱 技 术 在 组 合 化 学 和 高 通 量 筛 选 中 的 应 用 三 串 联 质 谱 技 术 在 组 合 化 学 和 高 通 量 筛 选 中 的 应 用 组 合 化 学 发 展 于 20 世 纪 80 年 代, 它 着 重 于 解 决 药 物 研 制 过 程 中 的 合 成 问 题 由 于 对 所 谓 的 构 效 关 系 的 了 解 往 往 非 常 粗 浅, 所 以 在 设 计 药 物 分 子 时 由 于 存 在 着 许 多 尚 不 确 定 的 因 素, 不 得 不 同 时 把 类 似 物 和 衍 生 物 一 并 考 虑 在 内, 然 后 进 行 逐 一 的 筛 选 为 了 提 供 足 够 的 供 筛 选 的 对 象, 往 往 要 合 成 多 达 上 千 个 基 本 相 似 但 组 成 不 同 的 化 合 物, 尽 管 其 中 包 含 着 大 量 的 无 效 劳 动 组 合 化 学 使 短 时 间 内 大 量 合 成 不 同 化 合 物 成 为 可 能 也 只 有 通 过 组 合 化 学 和 基 因 组 学 相 结 合, 才 能 针 对 基 因 组 学 发 现 的 近 万 个 靶 点, 短 期 内 合 成 大 量 药 物 前 体 组 合 化 学 一 般 包 括 以 下 过 程 :1 设 计 化 学 库 设 定 拟 合 成 库 的 大 小, 预 计 所 需 的 原 料 : 一 般 地, 一 个 化 学 库 含 250~ 化 合 物 ; 确 定 主 要 结 构 每 个 分 子 位 置 类 型 支 链 长 度 的 变 化 2 提 供 相 应 的 支 持 如 所 需 信 息 存 量 控 制 预 期 的 结 构 预 期 的 分 子 质 量 等 3 进 行 合 成 通 常 设 定 96 孔 模 式, 每 孔 合 成 1 个 化 合 物 ; 预 设 原 料 和 条 件 反 应 时 间 控 制 在 1~2h, 以 提 高 通 量 4 进 行 简 单 提 纯 常 用 固 相 萃 取 方 法 (SPE) 等 快 速 有 效 和 高 通 量 的 分 离 方 法 除 去 过 量 的 原 料 5 鉴 定 和 纯 度 分 析, 即 样 品 板 孔 中 预 期 的 分 子 是 否 存 在 及 含 量 如 何 通 常 采 用 LC-MS(/MS) 法 进 行 高 通 量 的 确 证 和 定 量 6 验 证 结 果 要 求 纯 度 >60%, 必 要 时 用 SPE 或 HPLC 法 重 新 纯 化 低 纯 度 样 品 7 精 选 热 门 化 合 物 转 移 出 已 鉴 定 和 进 行 纯 度 测 定 的 化 合 物 8 进 行 生 物 活 性 检 测 用 高 通 量 筛 选 分 析 分 离 方 法 进 行 先 导 化 合 物 鉴 定 和 优 化 高 通 量 和 大 量 筛 选 (HTS & mass screening): 随 着 基 因 组 学 蛋 白 质 组 学 和 组 合 化 学 的 发 展, 传 统 的 药 物 筛 选 模 式 已 无 法 适 应 短 时 间 大 批 量 的 药 物 筛 选 新 药 发 现 的 新 模 式 高 通 量 筛 选 是 大 规 模 自 动 化 的 加 样 和 检 测 系 统, 可 以 筛 选 大 量 化 合 物 的 生 物 活 性 其 采 用 分 子 细 胞 水 平 的 药 物 筛 选 模 型, 可 从 大 量 的 样 品 中 鉴 别 出 对 确 定 的 分 子 靶 点 有 相 互 作 用 的 微 量 活 性 化 合 物 计 算 机 控 制, 自 动 化 操 作, 可 实 现 一 药 多 选, 具 有 快 速 微 量 灵 敏 的 特 点 高 通 量 和 大 量 筛 选 包 括 以 下 过 程 :1 选 择 分 子 靶 选 择 的 依 据 是 来 源 于 国 际 上 医 学 生 物 学 的 新 成 果 目 前 国 际 常 用 的 分 子 靶 有 :A 细 胞 膜 受 体 ;B 离 子 通 道 蛋 白 ;C 酶 蛋 白 ;D 细 胞 核 受 体 ;E 转 运 蛋 白 2 建 立 稳 定 表 达 分 子 靶 的 生 物 体 系 蛋 白 靶 : 克 隆 相 对 应 的 蛋 白, 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 和 提 纯 ; 细 胞 受 体 靶 : 克 隆 出 的 基 因 转 化 到 载 体 细 胞 中, 建 立 稳 定 的 细 胞 株 3 建 立 简 便 快 速 的 大 规 模 的 生 物 检 测 方 法 根 据 靶 的 不 同 分 为 两 类 : 以 蛋 白 为 基 础 和 以 细 胞 为 基 础 酶 蛋 白 测 定 酶 活 性 的 变 化 ; 细 胞 膜 受 体 测 定 配 体 - 受 体 的 结 合 ; 细 胞 核 受 体 : 测 定 蛋 白 的 表 达 在 建 立 大 规 模 生 物 检 测 方 法 的 同 时, 要 用 组 合 化 合 物 的 方 法 合 成 大 量 不 同 结 构 的 化 合 物 库 相 配 套 高 通 量 和 大 量 筛 选 的 主 要 方 法 有 : 免 疫 法 受 体 结 合 分 析 法 激 酶 分 析 法 报 告 基 因 分 析 法 生 物 芯 片 法 和 GPCR 药 物 筛 选 技 术 等 质 谱 技 术 起 初 用 于 分 析 化 合 物 的 相 对 分 子 质 量, 随 着 研 究 的 深 入, 已 应 用 于 药 物 的 筛 选 和 设 计 领 域, 为 新 药 研 发 提 供 了 可 靠 的 药 物 靶 点, 能 够 在 短 时 间 内 得 到 先 导 化 合 物, 加 快 了 药 物 发 现 的 速 度 比 如 葛 兰 素 - 史 密 斯 (GSK) 公 司 位 于 Tres Cantos 的 化 学 库 有 130 万 种 化 合 物, 筛 选 1536 孔 / 板,30 万 次 / 天, 成 本 降 低 了 22%/ 孔, 现 在 从 筛 选 出 侯 选 药 物 到 开 展 I 期 临 床 试 验 需 要 3 年 时 间, 而 制 药 行 业 平 均 耗 时 为 5 年 3.1 最 适 高 通 量 筛 选 平 台 API 2000 API 3000 API 3200 系 列 LC-MS 或 FIA-MS 技 术 加 快 组 合 化 学 和 活 性 筛 选 进 程 : 在 活 性 筛 选 前 后 进 行 MS 快 速 识 别 :1 样 品 通 过 LC-MS 或 FIA-MS 直 接 分 析 ;2 更 高 质 量 的 信 息 输 出 加 快 合 成 速 度 ;3 自 动 进 行 样 品 的 数 据 采 集 和 处 理 ;4 快 速 提 供 化 合 物 的 分 子 质 量 信 息 ;5 用 户 定 制 格 15

16 式可满足各种实验室的需求 FIA样品板查看软件 CombiView ①在每个质谱中自动搜索期望的分子质量 ②搜索结 果显示为图形方式 直观 易懂 若显示为红色 表示未发现期望的分子质量 若显示为绿色 表示发 现了所期望的分子质量 ③点击某一位置即显示质谱图供详细查看 CombiView 软件为交互式界面 使用简便 一目了然 CombiView 软件自动生成样品板报告 样品报告和总结报告 结果报告 方便使用 图9. CombiView 软件信息界面 图10. CombiView 软件结果报告 快速筛选组合化学库 多个靶标药物和受体在试管中经过一定时间作用后 有的和受体结合 有的则不会结合 然后 通 过凝胶色谱柱 SEC G-25 分离 再通过切换阀把药物-受体结合物切换到另一根色谱住 DVB 色谱柱 上 变换流动相使药物-受体结合物解离 再通过MS或MS/MS进行快速筛选 流程图如图12所示 样品板报告 样品报告 总结报告 M1,M2和 受体-结合物因 流动相变化 渐渐离解 未结合M3,M4 LC DVB色谱柱 先前结合的M1 M2 和游离受体 图11. 组合化学库分析报告 MS或MS/MS LC 切换阀 图12. 快速筛选新药流程 应用实例 I 16种肽活性的快速筛选 4.0e6 16种肽和受体作用前 图13上 及作用后 图13下 的活性筛选MRM色谱图如图13所示 筛选数据显示 在16 3.2e6 种肽中 实际上只有1种肽和受体有活性作用 从而免除了 8.0e5 16 种肽要分别进行 16 次实验和检测的过程 最大限度地提 高了筛选速度 作用前 e6 1.6e e6 3.2e Time, min Time, min 作用后 2.4e6 1.6e6 8.0e5 图13. 快速筛选具有活性的肽 Time, min 30

17 串 联 质 谱 技 术 在 组 合 化 学 和 高 通 量 筛 选 中 的 应 用 应 用 实 例 II :8-in-1 组 合 给 药 研 究 中 先 导 化 合 物 的 快 速 鉴 定 与 优 化 本 研 究 计 划 筛 选 8 个 与 肺 病 治 疗 相 关 的 先 导 化 合 物, 要 求 每 个 给 药 剂 量 重 复 10 个 数 据 点, 通 过 静 脉 和 口 服 给 药 (n=1), 每 组 标 准 曲 线 测 定 8 个 数 据 点 组 合 给 药 (cassette dosing)(8-in-1) 于 2 只 大 鼠 从 给 药 后 0~400min 分 别 取 血 清 样 品 经 乙 腈 沉 淀 蛋 白 质 后 稀 释 进 样 分 析, 以 测 定 分 布 容 积 (Vd) 和 消 除 率 (CL) 8 个 化 合 物 的 MRM 色 谱 图 和 7 个 药 物 的 药 物 浓 度 - 时 间 曲 线 如 图 14 图 15 所 示 血 清 浓 度 ( 80.0 ng/ml) 药 物 1 药 物 2 药 物 3 药 物 4 药 物 5 药 物 6 药 物 Time (min) 图 个 药 物 的 质 量 色 谱 图 图 个 药 物 的 血 清 浓 度 变 化 曲 线 根 据 单 个 药 物 给 药 试 验 和 N-in-1 给 药 试 验 的 有 关 数 据, 可 以 推 算 出 两 种 方 法 所 需 的 动 物 数 量 样 品 数 量 及 相 关 的 测 试 工 作 量 由 表 中 可 知, 组 合 给 药 最 大 限 度 地 提 高 了 快 速 筛 选 的 速 度 试 验 模 式 动 物 数 量 样 品 数 量 LC-MS 测 试 次 数 标 准 个 数 单 个 药 物 试 验 in-1 试 验 应 用 实 例 III : 快 速 移 植 GC-MS 筛 选 方 法 至 LC-MS/MS 目 前 还 有 很 多 应 用 GC-MS 进 行 高 通 量 筛 选 药 物, 但 是,GC-MS 的 样 品 制 备 非 常 耗 费 时 间, 需 要 经 过 SPE 萃 取 衍 生 等 步 骤, 而 且 分 析 时 间 也 较 长, 通 常 一 次 分 析 需 要 几 小 时 甚 至 数 天, 因 此, 筛 选 效 率 较 低 由 于 LC-MS/MS 技 术 的 快 速 发 展, 实 际 上, 可 以 把 GC-MS 需 要 经 过 复 杂 处 理 的 样 品 如 血 液 尿 液 样 品 等 经 过 简 单 的 处 理 如 萃 取 后 直 接 进 入 LC-MS/MS 进 行 快 速 筛 选 比 如,1 ml 血 样 用 3 ml 丙 酮 沉 淀 蛋 白 质 后, 蒸 发 至 干, 重 新 溶 解 于 0.5 ml 甲 醇 溶 液 中, 取 10 µl 进 样 LC:Metasil Basic C8 2 mm 50 mm,200 µl/ min MS:QTRAP 系 列 LC-MS/MS,TurboIonSpray 离 子 源 通 过 以 下 流 程 快 速 筛 选 :1 设 定 筛 查 化 合 物 列 表 ( 比 如 同 时 筛 选 100 种 甚 至 更 多 种 药 物 );2 采 集 MS/MS 数 据 ( 全 扫 描 确 证 );3 进 行 库 检 索, 对 比 结 果 3. 库 检 索 结 果 1. 筛 查 化 合 物 列 表 (100 种?) 2. 采 集 MS/MS 数 据 ( 全 扫 描 确 证 ) 图 16. LC-MS/MS 高 通 量 筛 选 药 物 步 骤 17

18 图17显示了同步筛选25种药物的MRM色谱图 200 µl/min流速 所有药物均在20 min前出峰 图18显示了如果采用1.0 ml/min流速 Turbo V 离子源 分析时间将缩短至3 min内 极大地提高了筛 选速度 XIC of +MRM (124 pairs): Exp 1,219.1/158.0 amu from Sample 4 (Sample002) of Data20minLC.wiff(Turbo Spray) Max cps 25 Drugs - 1mL Blood (20 minute LC run) 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 Intensity. cps 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e e e e Time, min e4 1.5e4 1.0e e4 2.0e e e e4 *EPI scan not found e e5 2.0e e4 1. Oycodone 2. Hydrocodone 3. Lidocaine 4. Benzoylecgonine 5. Cocaine 6. Mirtazepine 7. Zolpidem 8. Cocaethylene 9. Trazodone 10. Midazolam 11. Flurazepam 12. Doxepin 13. Mesoridazine 14. Verapamil 15. Carbemazepine 16. Cyclobenzaprine 17. Methadone 18. Amitriptyline 19. Hydroxyzine 20. Flunitrazepam 21. Desipramine 22. Maprotiline* 23. Triazolam 24. Lorazepam 25. Thioridazine Intensity. cps I.S. 3.5e5 3.4e5 3.2e 图17. 25种药物的MRM总离子流图 流速0.2 ml/min Time, min 图18. 25种药物的MRM总离子流图 流速1 ml/min 闪电定量 FlashQuant 技术平台 首次将三重四极杆质谱和MALDI源结合 可高通量快速定量分析小分子药物 基于API 4000 和4000 Q TRAP 质谱仪 器基础之上 2.4 新FlashLaser MALDI源快速定量小分 子化合物 FlashQuant 软件 5分钟定量分析96个样品 方便快速地实现和ESI Turbo V 切换 18

19 串联质谱技术在药物代谢研究中的应用 四 串联质谱技术在药物代谢研究中的应用 药物代谢是指药物在体内吸收 分布 生物转化 排泄等一系列过程 其中生物转化过程包括药物 分子功能团的增减 变换 分子的缩合 降解等 药物经生物转化后 其相应的理化性质亦发生变化 从而引起其药理及毒理活性的改变 药物代谢的研究 包括药物及其在各种复杂的样品基质 ( 全血 血 浆 尿 胆汁及生物组织)中代谢物的分离 结构鉴定以及痕量分析测定 利用MS/MS和LC-MS/MS等联用 技术 不仅可以避免复杂 繁琐 耗时的分离纯化代谢物样品的工作 而且能分离鉴定以往难于辩识的 痕量药物代谢物 从而迅速 方便地解决问题 因此 在探讨药物代谢特征 确定药物代谢物结构及代 谢途径与药物及代谢物的药理作用及毒副作用间的关系 即结构 代谢 活性 / 毒性三者之间的相关性 等药物代谢研究方面 色谱质谱联用技术已经成为应用非常广泛的分析平台 ESI APCI APPI均属于最 软 的电离方式 都能分析许多样品 但是通常认为ESI有利于分析生 物大分子及其他极性大的化合物 另外 由于 ESI 可以产生大量的多电荷离子 因此特别适合分析蛋白 质 多肽类的生物分子 而APCI更适合于分析极性较小的化合物 APPI则能够大大提高弱极性和中性化 合物的分析灵敏度 MS/MS在混合物分析中有很多优势 在质谱与气相色谱或液相色谱联用时 即使色谱未能将物质完 全分离 也可以进行鉴定 MS/MS可从样品中选择母离子进行分析 而不受其他物质干扰 MS/MS在药物领域有很多应用 子离子扫描可获得药物主要成分 杂质和其他物质的母离子的定性 信息 有助于未知物的鉴别 也可用于肽和蛋白质氨基酸序列的鉴别 在药物代谢动力学研究中 对生物复杂基质中低浓度样品进行定量分析 可用多反应监测模式 MRM 消除干扰 如分析药物中某特定离子 而来自基质中其他化合物的信号可能会掩盖检测信号 用MS1 /MS2 对特定离子的碎片进行选择监测可以消除干扰 MRM也可同时定量分析多个化合物 在药物代 谢研究中 为发现与代谢前物质具有相同结构特征的分子 使用中性碎片丢失扫描能找到所有丢失同种 功能团的离子 如羧酸丢失中性二氧化碳 如果丢失 的碎片是离子形式 则母离子扫描能找到所有丢失 这种碎片的离子 目前 与质谱联用的色谱技术主要有气相色谱 (GC) 液相色谱 (LC) 毛细管电泳 (CE) 芯片 Chip 超临界流体色谱 SFC 等 在医药研究领域中 由于大量药物是极性较大的化合物 仅有约 20%的药物可用GC分析 其中多数还必须经过衍生化步骤 因此 GC或GC-MS/MS局限性很大 LC可以 直接分析不挥发性化合物 极性化合物 热不稳定化合物和大分子化合物(包括蛋白 多肽 多糖 多聚 物等) 分析范围广 而且不需衍生化步骤 因此 LC-MS/MS长期为人们所关注 LC-MS/MS技术具有比 MS/MS和LC-MS更优越的性能 首先通过LC的分离 使MS/MS可以分析具有大量杂质的混合物中的待测物 并提高分析的专一性和灵敏度 而且LC可以分离同分异构体 弥补了MS/MS的不足 另外 LC-MS/MS相 对于LC-MS可以提供待测物更多的结构信息 4.1 药物代谢物的结构鉴定 Metabolites Identification 由于多数药物的代谢物保留了原药分子的骨架结构或一些亚结构 因此 I 相代谢反应产物 ROH RNH2 RCOOH RSH等可能进行与原药相似的裂解 丢失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离 子 用MS/MS分别进行IDA自动信息关联扫描分析 中性丢失扫描 母离子扫描以及子离子扫描 即可迅 速找到可能的代谢物并鉴定出结构 Yost等人总结了利用MS/MS鉴定药物代谢物的方法 主要包括以下几 个步骤 ①测定原药的质谱 ②测定原药的子离子谱 选择质子化分子离子 加合离子和主要的碎片离 19

20 子 进 行 裂 解 ;3 选 择 原 药 的 主 要 中 性 丢 失 测 定 生 物 样 品 的 中 性 丢 失 谱 图 谱 中 的 离 子 即 为 原 药 和 可 能 的 代 谢 物 的 分 子 离 子 ;4 选 择 主 要 的 子 离 子 测 定 生 物 样 品 的 母 离 子 谱, 所 得 母 离 子 即 为 各 个 代 谢 物 5 测 定 生 物 样 品 中 所 有 可 能 代 谢 物 的 子 离 子 谱, 解 谱 得 到 代 谢 物 的 结 构 6 测 定 代 谢 物 的 子 离 子 谱, 选 择 任 一 新 出 现 的 中 性 丢 失 和 子 离 子 重 复 进 行 步 骤 3 和 步 骤 4 另 外, 利 用 MS/MS 还 可 成 功 地 鉴 定 药 物 II 相 结 合 型 代 谢 物 如 通 过 记 录 母 离 子 分 析 葡 糖 苷 酸 硫 酸 谷 胱 甘 肽 结 合 物, 这 些 母 离 子 裂 解 产 生 特 征 碎 片 离 子 或 丢 失 特 征 中 性 碎 片 中 性 丢 失 扫 描 : 葡 糖 苷 酸 结 合 物 检 测 176u (C 6 H 8 O 6 )(+/-); 硫 酸 结 合 物 检 测 80u (SO 3 )(+) 或 98u(H 2 SO 4 ) 64u(SO 2 )(-); 谷 胱 甘 肽 结 合 型 代 谢 物 检 测 305u(+); 芳 基 -GSH 检 测 275u(C 10 H 17 N 3 O 6 )(+); 脂 肪 族 -GSH 检 测 129u (C 5 H 7 NO 3 )(+); N- 乙 酰 半 胱 氨 酸 结 合 物 检 测 129u (C 5 H 7 NO 3 )(-) 母 离 子 扫 描 (-): 葡 糖 苷 酸 结 合 物 检 测 m/z 175( 去 质 子 化 葡 糖 苷 酸 部 分 ) 和 m/z 113 ( 葡 糖 苷 酸 部 分 碎 片 ); 硫 酸 结 合 物 检 测 m/z 81(HSO - 3 ) 和 m/z 97 (HSO - 4 ); 磷 酸 结 合 物 检 测 m/z 63 (PO - 2 ), 和 m/z 79(PO - 3 ); 牛 磺 酸 盐 结 合 物 检 测 m/z 126 (Tau+H + ); 肉 碱 丁 基 酯 检 测 m/z 103(C 4 H 7 O 3 )(+); 辅 酶 A 硫 酯 检 测 m/z 428(ADP + ) 和 m/z 339 m/z 最 适 代 谢 物 鉴 定 平 台 API 3000 API 3200 API 4000 API 5000 系 列 或 3200 Q TRAP 4000 Q TRAP 系 列 以 及 QSTAR Elite QqTOF LC-MS/MS 任 一 台 或 多 台 质 谱 仪 线 性 离 子 阱 技 术 : 克 服 了 传 统 离 子 阱 质 谱 仪 诸 如 低 质 量 截 止 点 (1/3 效 应 ) 空 间 电 荷 效 应 碰 撞 效 率 低 定 量 功 能 差 的 遗 憾, 同 时 保 留 了 传 统 离 子 阱 质 谱 仪 全 扫 描 灵 敏 度 高 能 进 行 多 级 质 谱 扫 描 的 特 点 串 联 四 极 杆 / 线 性 离 子 阱 串 联 质 谱 技 术 Q TRAP 系 列 平 台 : 把 串 联 四 级 杆 和 线 性 离 子 阱 技 术 首 次 结 合 在 一 起, 既 保 留 了 串 联 四 极 杆 质 谱 仪 的 优 势, 如 子 离 子 扫 描 母 离 子 扫 描 中 性 丢 失 扫 描 MRM 定 量 功 能, 又 结 合 了 传 统 离 子 阱 质 谱 仪 全 扫 描 灵 敏 度 高 能 进 行 多 级 质 谱 扫 描 的 特 点, 是 一 台 集 优 异 定 性 与 定 量 功 能 于 一 体, 广 泛 用 于 药 物 开 发 药 物 代 谢 等 领 域 的 小 分 子 分 析 和 蛋 白 质 ( 组 ) 研 究 等 生 物 大 分 子 分 析 的 全 能 平 台 MS 3 质 谱 : 提 供 更 丰 富 的 化 合 物 结 构 信 息 比 如 :m/z 1387>m/z 702>, 还 能 继 续 产 生 下 列 碎 片 离 子 图 19. 串 联 四 极 杆 线 性 离 子 阱 质 谱 示 意 图 图 20. 母 离 子 m/z 1387 的 碎 片 离 子 m/z 702 的 子 离 子 扫 描 质 谱 图 定 性 和 定 量 MRM 增 强 型 的 子 离 子 扫 描 (EPI) 实 验 优 势 :1 在 确 证 自 动 化 实 验 中 用 MRM 做 检 测 扫 描, 可 以 触 发 自 动 采 集 MS/MS 数 据 ;2 充 分 利 用 了 MRM 扫 描 模 式 的 高 度 专 一 性 和 高 灵 敏 度 的 特 性 ;3LINAC 碰 撞 室 允 许 同 步 监 测 上 百 对 MRM 离 子 对 ;4MRM 数 据 还 可 同 时 用 于 定 量 实 验 20

21 串 联 质 谱 技 术 在 药 物 代 谢 研 究 中 的 应 用 IDA 工 作 流 程 多 组 份 的 MRM's MRM 触 发 IDA 采 集 自 动 收 集 MS/MS 数 据 MRM 作 为 监 测 扫 描 ( 用 于 定 量 ) IDA 阈 值 1 添 加 到 排 除 列 表 EPI 图 21. EPI 定 性 分 析 流 程 图 22. MRM-IDA-EPI 扫 描 数 据 共 流 出 物 混 合 的 MS/MS 谱 图, 通 过 动 态 本 底 扣 除 得 干 净 的 质 谱 图 做 谱 库 检 索 MRM 作 为 监 测 扫 描 还 可 以 用 MS 3 定 量... - 提 高 选 择 性 MS/MS MS/MS MS/MS 图 23. 共 流 出 物 的 动 态 本 底 扣 除 技 术 的 EPI 质 谱 图 图 24. MS 3 的 MRM 的 质 量 色 谱 图 串 联 四 极 杆 / 线 性 离 子 阱 串 联 质 谱 技 术 Q TRAP 系 列 平 台 : 结 合 线 性 离 子 阱 技 术, 具 有 定 性 和 结 构 解 析 功 能 ( 增 强 型 子 离 子 扫 描 母 离 子 扫 描 中 性 丢 失 MS/MS 数 据 库 MS 3 ) 和 优 异 的 定 量 能 力 (MRM 定 量 ), 是 真 正 的 串 联 四 极 杆 LC-MS/MS 系 统 LightSight 代 谢 物 鉴 定 平 台 LightSight 软 件 使 您 有 效 率 地 从 Applied Biosystems/MDS Sciex 串 联 四 极 杆 和 线 性 离 子 阱 融 合 质 谱 仪 上 采 集 的 数 据 中 鉴 定 和 确 证 代 谢 物 与 世 界 上 杰 出 的 一 百 多 位 代 谢 物 研 究 工 作 者 通 力 合 作 设 计 的 LightSight 软 件, 是 代 谢 物 鉴 定 的 终 极 工 具, 它 具 有 直 观 的 界 面 和 强 大 的 功 能, 帮 助 您 快 速 推 断 并 提 高 结 果 可 信 度 主 要 特 点 和 优 势 简 便 清 晰 的 数 据 审 查 LightSight 平 台 利 用 一 个 工 作 界 面 支 持 快 速 有 效 的 决 策, 使 代 谢 物 的 鉴 定 工 作 比 以 往 任 何 时 候 都 更 有 效 率 样 品 和 对 照 的 提 取 离 子 色 谱 图 (XICs) 重 叠 显 示, 色 谱 峰 直 观 的 从 噪 音 中 区 别 出 来 ; 相 邻 显 示 的 母 体 药 物 和 代 谢 物 的 MS/MS 质 谱 使 图 谱 的 相 似 性 和 差 异 立 即 显 而 易 见 LightSight 平 台 异 常 清 晰 的 数 据 显 示 免 除 了 烦 冗 的 打 印 图 谱 视 觉 比 较 的 需 要 优 异 的 峰 查 找 功 能 PeakPerform 运 算 法 则 通 过 一 个 功 能 强 大 的 样 品 和 对 照 谱 图 比 较 来 寻 找 代 谢 物 运 算 参 数 均 具 有 帮 助 图 标 和 简 单 易 懂 的 语 言 来 解 释, 使 调 整 和 微 调 参 数 进 行 峰 查 找 更 轻 松, 可 变 的 峰 宽 度 设 置 使 检 测 高 压 或 低 压 LC/MS 的 数 据 成 为 可 能 灵 活 的 MS/MS 采 集 方 式 LightSight 软 件 不 管 您 如 何 使 用 MS/MS 采 集 数 据, 它 都 是 最 合 适 的 工 具 ; 不 管 是 利 用 信 息 相 关 扫 描 (IDA) 功 能 与 预 扫 描 同 步 进 行 数 据 采 集, 还 是 在 分 析 预 扫 描 数 据 后 单 独 的 运 行,MS/MS 数 据 很 容 易 被 采 集 对 于 指 定 的 MS/MS 采 集, 采 集 MS/MS 数 据 模 块 会 建 立 一 个 完 善 的 多 时 间 段 (multi-period) 多 实 验 组 (multi-experiment) 的 方 法, 只 需 几 次 点 击 后 即 可 被 提 交 运 行 LightSight 21

22 软件具有最大极限的采集数据效率 通常一次进样即可收集一个化合物的所有代谢物的MS/MS数据 LightSight 平台采用MS/MS数据轻松确证代谢产物 不论是采用IDA 方式或指定的采集方式 MS/MS质谱图会自动地显示在该代谢物色谱图旁边 同时 LightSight 平台具有 功能强大的MS/MS确证工具 从两种方式中组合数据的独特能力 为您获得最高质量MS/MS数据用于确证提供了保障 MS/MS比较工 具自动地显示母体药物和代谢产物的MS/MS质谱的共同碎片离子和中性丢失碎片 能够进行碎裂模式的 快速地视觉比较 并且消除了手工计算这些离子质量数时易产生错误的可能性 ACD/MS结构解析工具 轻松点击 即可从LightSight 界面直接打开ACD/MS处理器处理相应MS/ MS质谱图 您可以从Applied Biosystems公司购买ACD/MS处理器 更好的获得帮助的途径 直接动画显示 图25. 环胞素A 盐酸罗普拉明 微粒孵育液的 一个氘代代谢物示范了在一个工作界面中显示 所有代谢物的相关数据 图26. LightSight 软件中的处理参数采用清晰 易懂 的语言和图形使峰查找过程变得不再神秘 图27. 采集MS/MS模块为分析者指定的选择离 子色谱峰自动产生MS/MS采集方法 图28. MS/MS比较工具找出两个质谱碎片离 子和中性丢失碎片 图29. 用于碎裂解析的ACD/MS处理器界面 图30. 利用LightSight 平台检查同位素化合物 22

23 串 联 质 谱 技 术 在 药 物 代 谢 研 究 中 的 应 用 LightSight 平 台 版 本 1.1 新 功 能 : 支 持 信 息 相 关 扫 描 (IDA) 功 能 现 在, 在 串 联 四 极 杆 或 Q TRAP 质 谱 仪 上 运 行 的 任 何 扫 描 方 式 都 可 以 作 为 预 扫 描 触 发 MS/MS 数 据 采 集 这 项 功 能 无 可 比 拟 的 代 谢 物 检 测 工 具 包 括 了 单 级 MS 全 扫 描 母 离 子 扫 描 中 性 丢 失 扫 描, 以 及 新 版 本 增 加 的 MRM 预 扫 描 功 能 多 反 应 监 测 (MRM) 触 发 IDA 扫 描 功 能 LightSight 平 台 现 在 提 供 给 Q TRAP 系 列 质 谱 仪 的 用 户 最 灵 敏 和 最 具 专 属 性 的 寻 找 目 标 代 谢 物 的 途 径, 采 用 高 专 属 性 和 高 灵 敏 度 的 MRM 方 式 检 测 微 量 水 平 的 目 标 代 谢 物, 同 时 利 用 线 性 离 子 阱 的 高 灵 敏 度 的 全 扫 描 功 能 采 集 所 有 MRM 检 测 出 峰 的 代 谢 物 的 高 质 量 的 MS/ MS 数 据 ; 所 有 这 些 过 程, 只 需 一 次 进 样, 即 可 完 成 应 用 实 例 I :HIV 蛋 白 酶 抑 制 剂 代 谢 物 的 结 构 分 析 提 高 代 谢 物 鉴 定 覆 盖 率 的 策 略 : 自 从 串 联 四 极 杆 - 线 性 离 子 阱 (LIT) 质 谱 仪 诞 生 以 来, 串 联 四 极 杆 和 离 子 阱 的 扫 描 功 能 就 可 以 在 同 一 台 仪 器 上 的 同 一 个 实 验 中 完 成 本 研 究 使 用 4000 Q TRAP 质 谱 仪 在 各 种 监 测 扫 描 模 式 下 ( 如 Q1 Q3 EMS 母 离 子 扫 描 中 性 丢 失 扫 描 和 MRM), 使 用 IDA( 信 息 相 关 扫 描 ) 功 能, 自 动 触 发 收 集 MS/MS 数 据 高 选 择 性 的 扫 描 方 式 与 高 效 率 的 线 性 离 子 阱 MS/MS 实 验 相 结 合, 使 得 其 性 能 比 传 统 的 3D 离 子 阱 和 其 他 的 非 融 合 线 性 离 子 阱 有 显 著 的 提 高 母 离 子 扫 描 和 中 性 丢 失 扫 描 允 许 测 定 复 杂 基 质 中 预 料 的 和 未 预 料 到 的 微 量 水 平 的 代 谢 物 增 强 全 扫 描 (EMS) 提 供 了 预 期 的 和 未 预 料 到 的 含 量 相 对 高 一 些 的 代 谢 物 ; 而 MRM 则 提 供 了 预 期 的 代 谢 物 的 最 高 的 检 测 限, 它 最 适 合 于 快 速 筛 查 把 这 些 扫 描 模 式 组 合 起 来, 为 所 有 的 代 谢 物 研 究 提 供 了 更 为 全 面 广 泛 的 观 察 视 野 本 研 究 主 要 集 中 在 利 用 MRM-IDA 实 验 对 Indinavir ( 茚 地 那 韦,HIV 蛋 白 酶 抑 制 剂 ) 的 体 外 培 养 物 进 行 代 谢 物 研 究 实 验 采 用 了 47 个 理 论 上 推 断 所 得 代 谢 物 的 MRM 离 子 对 进 行 可 能 的 代 谢 物 筛 查, 自 动 触 发 产 生 MS/MS 数 据 LightSight 版 本 1.1 软 件 用 来 采 集 和 分 析 数 据 实 验 条 件 : 体 外 孵 育 10 mmol/l Indinavir ( 茚 地 那 韦,HIV 蛋 白 酶 抑 制 剂 ) 在 人 肝 实 质 细 胞 中 于 标 准 条 件 (37,100 万 个 细 胞 /ml) 中 培 养 1 h 后 向 肝 实 质 细 胞 溶 液 中 加 入 等 体 积 的 乙 腈 淬 灭 反 应 样 品 在 r/min 离 心 5 min, 取 1 份 上 清 液 用 纯 净 水 稀 释 5 倍, 进 行 LC-MS/MS 分 析 样 品 分 析 茚 地 那 韦 孵 育 液 用 Agilent 1200 自 动 进 样 器 和 色 谱 泵 与 4000 Q TRAP 串 联 质 谱 仪 联 用 进 行 分 析, 采 用 YMC ODS AQ 3 mm 100 mm 色 谱 柱 ; 流 速 为 300 µl/min; 流 动 相 A 为 含 0.1% 甲 酸 的 水 溶 液, 流 动 相 B 为 含 0.1% 甲 酸 的 乙 腈 溶 液 ; 梯 度 : 流 动 相 B 在 12 min 内 由 5% 上 升 至 50%, 然 后 在 2 min 内 上 升 至 95%, 最 后 在 95% 保 持 1 min 孵 育 液 采 用 47 个 理 论 代 谢 物 的 多 反 应 监 测 (MRM) 进 行 预 扫 描, 以 触 发 产 生 MS/MS 数 据 由 于 MRM 具 有 极 高 的 灵 敏 度, 因 此 可 筛 查 到 更 多 低 浓 度 代 谢 物, 进 而 触 发 采 集 其 MS/MS 数 据, 以 推 测 代 谢 物 结 构 多 重 MRM-IDA 代 谢 物 方 法 的 建 立 通 过 Analyst 软 件 进 行 用 户 只 需 要 输 入 原 药 的 母 离 子 m/z 614 和 主 要 碎 片 离 子 的 质 荷 比, 选 择 要 监 测 的 MRM 离 子 对 的 最 大 数 目 ( 配 合 合 适 的 驻 留 时 间 ), 指 定 想 要 监 测 的 代 谢 反 应 软 件 LightSight 平 台 版 本 1.1 和 ACD/MS 处 理 器 版 本 用 于 样 品 和 对 照 的 数 据 比 较 以 及 碎 裂 途 径 解 析 MRM-IDA 策 略 : 根 据 已 经 掌 握 的 母 体 药 物 和 其 断 裂 途 径 的 知 识, 可 以 建 立 一 个 方 法, 包 含 理 论 上 可 能 发 生 的 典 型 的 I 相 和 II 相 代 谢 产 物 的 可 能 的 MRM 离 子 对 利 用 Q TRAP 质 谱 技 术 为 这 些 可 能 的 代 谢 物 可 以 监 测 100 多 个 MRM 离 子 对 并 获 得 补 充 的 MS/MS 数 据 根 据 母 药 茚 地 那 韦 的 断 裂 规 律 和 其 主 要 产 物 离 子 的 结 构, 产 生 一 个 可 能 的 代 谢 物 的 MRM 离 子 对 的 列 表, 用 于 筛 查 多 个 离 子 对 的 MRM-IDA 代 谢 物 方 法 的 建 立 是 通 过 Analyst 软 件 进 行 的 用 户 只 需 要 输 入 母 离 子 m/z

24 和 主 要 碎 片 离 子 (m/z 421 m/z 97), 选 择 要 监 测 的 MRM 离 子 对 的 最 大 数 目 ( 配 合 合 适 的 驻 留 时 间 dwell time), 指 定 要 检 测 的 代 谢 反 应 本 研 究 中, 基 于 I 相 代 谢 反 应 列 表, 选 择 了 47 个 MRM 离 子 对 来 鉴 定 测 试 样 品 中 茚 地 那 韦 的 可 能 代 谢 产 物 图 31. 茚 地 那 韦 的 化 学 结 构 图 32. 茚 地 那 韦 的 一 个 代 谢 物 的 XIC 色 谱 图 和 MRM-IDA 每 个 离 子 对 有 40 ms 的 驻 留 时 间, 因 此, 监 测 的 47 个 MRM 离 子 对 总 的 循 环 时 间 为 1.88 s, 在 目 前 的 色 谱 条 件 下 每 个 色 谱 峰 大 约 有 10 个 数 据 点 图 32 显 示 了 其 中 一 个 代 谢 物 的 XIC 色 谱 图 以 及 在 同 一 次 进 样 中 相 应 的 MS/MS 质 谱 图 (IDA) 将 代 谢 产 物 的 MS/MS 质 谱 与 母 体 药 物 的 相 比 较, 使 得 确 证 变 得 很 容 易 每 个 可 能 的 代 谢 产 物 ( 每 个 MRM 离 子 对 的 XIC) 及 其 MS/MS 数 据 可 显 示 在 同 一 界 面 下, 并 与 母 体 药 物 的 MS/MS 数 据 比 较 采 用 目 标 MRM 方 法 的 策 略, 无 论 低 浓 度 还 是 高 浓 度 的 代 谢 产 物 均 可 通 过 相 应 的 MS/MS 数 据 被 确 证 鉴 定 除 了 通 过 Q TRAP 系 统 的 自 动 触 发 MS/MS 数 据 采 集 功 能 进 行 代 谢 产 物 的 确 证 外, 此 平 台 会 自 动 采 集 偶 尔 遗 漏 的 峰 或 者 代 谢 物 研 究 者 想 重 新 采 集 的 那 些 峰 该 平 台 能 自 动 建 立 多 个 时 间 段 的 分 析 方 法, 提 高 MS/MS 的 质 量 和 覆 盖 率, 这 些 结 果 将 被 整 合, 并 自 动 地 行 MS/MS 质 谱 数 据 比 较 及 分 析 采 用 信 息 相 关 扫 描 (IDA) 的 模 式,MS/MS 质 谱 图 可 被 自 动 触 发 采 集, 同 时 与 预 扫 描 的 数 据 相 关 联, 在 同 一 界 面 下 显 示 然 而, 如 果 某 些 峰 遗 漏 或 需 要 额 外 的 MS/MS 信 息, 基 于 时 间 段 (period) 补 充 采 集 的 MS/MS 的 数 据 也 很 容 易 被 收 集 并 被 加 入 到 数 据 包 中 如 图 33 所 示, 在 自 动 实 验 (experiment) 中 没 有 MS/MS 信 息 的 低 含 量 的 可 能 代 谢 物 ; 如 图 34 所 示, 基 于 时 间 段 采 集 的 MS/MS 质 谱 图 与 其 它 信 息 关 联 共 同 显 示 在 同 一 个 视 窗 中, 更 便 于 进 行 确 证 性 评 估 图 33. 茚 地 那 韦 的 MS/MS 质 谱 图 及 无 关 联 信 息 图 34. 茚 地 那 韦 的 MS/MS 及 关 联 代 谢 物 信 息 LightSight 软 件 : 自 动 化 进 行 代 谢 物 的 鉴 定 和 确 证 : 代 谢 物 是 通 过 比 较 母 体 药 物 和 代 谢 物 的 MS/MS 质 谱 图 进 行 确 证 的, 这 个 流 程 是 一 个 典 型 的 单 调 乏 味 和 耗 时 费 力 的 过 程, 常 常 要 花 费 好 几 天 时 间 本 研 究 使 用 LightSight 平 台 和 ACD/MS 处 理 器 鉴 定 和 确 证 了 茚 地 那 韦 的 11 个 代 谢 物, 整 个 流 程 耗 时 不 到 1 天 时 间 24

25 串 联 质 谱 技 术 在 药 物 代 谢 研 究 中 的 应 用 MS/MS 分 析 : 用 MRM-IDA 方 法 鉴 定 和 确 证 的 人 肝 实 质 细 胞 液 中 茚 地 那 韦 的 代 谢 物 如 下 表 所 示, 该 方 法 采 用 了 LightSight 平 台 比 较 代 谢 物 和 茚 地 那 韦 的 MS/MS 质 谱 图 以 推 测 代 谢 物 结 构, 并 通 过 ACD/MS 处 理 器 将 推 测 的 代 谢 物 结 构 与 相 应 的 MS/MS 质 谱 图 进 行 关 联, 进 行 结 构 确 认 表 1. 确 认 的 代 谢 物 代 谢 物 检 测 到 的 代 谢 物 数 目 N- 脱 烷 化 (C 6 H 5 N) 1 N- 脱 烷 化 (C 6 H 5 N) + 氧 化 1 氧 化 3 二 - 氧 化 4 葡 糖 醛 酸 化 2 图 35. 茚 地 那 韦 和 ( 氧 化 代 谢 物 ) 的 MS/ MS 质 谱 中 共 同 的 碎 片 离 子 和 中 性 丢 失 碎 片 LightSight 软 件 利 用 一 个 简 单 有 效 的 工 具 使 得 用 户 能 够 更 快 速 地 比 较 代 谢 物 和 母 体 药 物 的 MS/MS 质 谱,MS/MS 比 较 工 具 自 动 地 显 示 两 个 质 谱 图 中 共 同 的 碎 片 离 子 和 中 性 丢 失 碎 片 因 为 茚 地 那 韦 的 MS/ MS 质 谱 在 进 行 比 较 前 已 经 被 解 析, 茚 地 那 韦 和 代 谢 物 的 共 同 碎 片 离 子 表 明 代 谢 位 点 没 有 发 生 在 这 些 碎 片 上 面, 而 共 同 的 中 性 丢 失 碎 片 则 给 我 们 提 供 了 代 谢 位 点 的 可 能 位 置 图 36. M4( 氧 化 代 谢 物 ) 和 茚 地 那 韦 ( 圆 圈 中 的 离 子 ) 的 共 同 碎 片 离 子 表 明 代 谢 未 发 生 这 些 碎 片 上 m/z 364 和 m/z 465 两 个 离 子 表 明 氧 化 未 发 生 在 分 子 的 特 定 部 位 图 37. M4( 氧 化 代 谢 物 ) 和 茚 地 那 韦 的 共 同 的 中 性 丢 失 碎 片 表 明 代 谢 位 点 可 能 的 发 生 位 置 中 性 丢 失 193u 表 明 氧 化 位 点 发 生 在 分 子 的 特 定 部 位 比 较 代 谢 物 和 母 体 药 物 的 MS/MS 质 谱 图 帮 助 推 测 可 能 的 代 谢 物 结 构, 为 了 进 一 步 的 结 构 确 认, 代 谢 物 的 MS/MS 质 谱 图 可 在 ACD/MS 管 理 器 中 与 推 测 所 得 结 构 相 互 关 联 如 果 代 谢 物 MS/MS 质 谱 图 中 主 要 碎 片 离 子 不 能 够 从 推 测 的 结 构 中 找 到 归 属, 表 明 两 者 的 相 关 性 差, 因 此, 推 测 的 结 构 就 不 可 能 是 代 谢 物 的 结 构 如 果 MS/MS 质 谱 图 中 所 有 的 主 要 碎 片 离 子 都 能 够 从 推 测 的 结 构 中 找 到 归 属, 表 明 两 者 的 相 关 性 好, 因 此, 推 测 的 结 构 很 可 能 就 是 代 谢 物 的 结 构 图 38. 推 测 的 结 构 与 所 采 集 的 代 谢 物 (M4) 的 MS/ MS 质 谱 图 的 相 关 性 不 好 主 要 碎 片 离 子 m/z 465 不 能 从 推 测 的 结 构 中 得 到 解 释, 因 此, 推 测 所 得 的 结 构 有 误 图 39. 推 测 所 得 结 构 与 所 采 集 的 代 谢 物 (M4) 的 MS/MS 质 谱 图 的 相 关 性 好 所 有 的 主 要 碎 片 离 子 从 推 测 的 结 构 中 都 得 到 解 释, 因 此, 推 测 的 结 构 很 可 能 是 代 谢 物 的 结 构 25

26 结 论 : 由 药 物 代 谢 研 究 者 设 计 的 LightSight 软 件 有 效 地 支 持 你 的 从 代 谢 物 鉴 定 到 结 构 解 析 的 代 谢 鉴 定 工 作 流 程 ; 它 比 现 有 的 其 他 同 类 软 件 学 习 更 容 易 使 用 更 简 便 ; 它 使 代 谢 物 鉴 定 中 最 单 调 乏 味 的 和 耗 时 费 力 的 过 程 自 动 化 进 行, 大 大 地 节 省 了 你 的 宝 贵 时 间, 并 且 帮 助 你 产 生 更 高 可 信 度 的 结 果 应 用 实 例 II : 人 工 与 自 动 化 代 谢 物 数 据 处 理 的 比 较 研 究 由 于 LightSight 软 件 具 有 优 异 的 峰 查 找 功 能, 通 过 一 个 功 能 强 大 的 样 品 和 对 照 谱 图 比 较 来 寻 找 代 谢 物, 能 够 自 动 化 进 行 代 谢 物 的 鉴 定 和 确 证, 因 此, 极 大 地 提 高 了 代 谢 物 鉴 定 的 速 度 和 效 率 本 实 验 通 过 测 定 14 种 药 物 对 比 研 究 了 人 工 进 行 代 谢 物 数 据 处 理 与 自 动 化 进 行 代 谢 物 数 据 处 理 流 程 各 自 需 要 的 步 骤 与 时 间 表 种 药 物 的 信 息 及 相 关 实 验 化 合 物 分 子 质 量 /u 实 验 动 物 监 测 扫 描 扫 描 极 性 Terfenadine 叔 哌 丁 醇 大 鼠 EMS + Buspirone 丁 螺 环 酮 大 鼠 Q1 + Loperamide 洛 派 丁 胺 大 鼠 EMS + Verapamil 维 拉 帕 米 大 鼠 EMS + Erythromycin 红 霉 素 大 鼠 EMS NL + Haloperidol 氟 哌 醇 大 鼠 Q1 + Bendroflumethiazide 氟 克 尿 噻 大 鼠 母 离 子 (2) Q3 - Nicardipine 硝 苯 苄 啶 犬 EMS 母 离 子 (2) NL (2) + Brompheniramine 溴 苯 那 敏 大 鼠 Q3 + Bromocriptine 溴 麦 角 隐 亭 大 鼠 犬 兔 EMS + Chlorthalidone 氯 噻 酮 大 鼠 EMS - Benzbromarone 苯 溴 马 隆 大 鼠 EMS 母 离 子 - Ketoconazole 酮 康 唑 大 鼠 Q3 + Diclofenac 双 氯 灭 酸 大 鼠 Q1,EMS - 实 验 :5~50 mmol/l 各 种 药 物 在 人 肝 实 质 细 胞 和 NADPH 体 系 中 于 37 培 养 1 h 样 品 稀 释 5~10 倍 后 进 样 分 析 用 Agilent 1100 系 统 和 Tempo LC 系 统 与 4000 Q TRAP 串 联 质 谱 仪 联 用 进 行 分 析 实 验 所 得 的 数 据 通 过 传 统 的 人 工 方 法 和 LightSight 软 件 自 动 方 法 进 行 处 理 鉴 定 和 确 证 代 谢 产 物 传 统 的 人 工 处 理 方 法 : 所 有 样 品 ( 每 隔 1 h 取 1 个 点 样 品 ) 和 对 照 样 品 (t=0) 通 过 监 测 扫 描 ( 线 性 离 子 阱 EMS Q1 Q3 母 离 子 扫 描 或 中 性 丢 失 扫 描 (NL)) 评 价 其 差 异, 即 根 据 存 在 于 样 品 中 但 在 对 照 样 品 中 不 存 在 的 色 谱 峰 发 现 可 能 的 代 谢 物 通 过 对 样 品 和 对 照 样 品 的 全 质 荷 比 范 围 选 取 25m/z 的 质 荷 比 宽 度 的 色 谱 (XIC) 进 行 人 工 处 理 数 据, 比 如, 叔 哌 丁 醇 的 250~275 m/z 的 XIC 图 如 图 40 所 示, 监 测 扫 描 范 围 为 100~800 m/z 对 每 个 色 谱 图 进 行 检 查, 鉴 定 可 能 的 色 谱 峰, 色 谱 峰 相 应 的 质 谱 图 也 通 过 校 正 的 m/z 和 同 位 素 丰 度 进 行 审 查, 比 如, 确 定 图 40 中 的 峰 D 的 质 谱 图 然 后 选 择 样 品 的 1 个 XIC 图 并 与 对 照 样 品 相 应 的 质 荷 比 范 围 进 行 比 较 比 如, 感 兴 趣 的 m/z 250.2( 峰 D) 的 样 品 与 对 照 样 品 的 XIC 图 如 图 42 所 示 该 峰 经 过 识 别 处 理 后, 收 集 相 应 的 MS/MS 数 据 以 确 证 或 排 除 此 峰 是 否 是 母 药 的 代 谢 物 26

27 串 联 质 谱 技 术 在 药 物 代 谢 研 究 中 的 应 用 样 品 D 峰 D 峰 对 照 品 图 40. 样 品 和 对 照 品 的 全 扫 描 总 离 子 流 图 图 41. 在 相 同 保 留 时 间 段 提 取 的 质 谱 图 D 峰 样 品 对 照 品 图 42. 样 品 和 对 照 品 中 质 荷 比 为 m/z 的 相 应 质 量 色 谱 图 表 3 列 出 了 人 工 处 理 叔 哌 丁 醇 代 谢 物 数 据 的 结 果 通 过 人 工 处 理 MS/MS 数 据 即 质 荷 比 范 围 选 择 峰 鉴 定 m/z 归 属 再 选 择 感 兴 趣 的 质 荷 比 和 MS/MS 以 确 证, 叔 哌 丁 醇 的 9 个 代 谢 物 得 到 鉴 定 和 确 证 通 过 这 种 人 工 处 理 流 程, 鉴 定 14 个 药 物 的 所 有 代 谢 物 大 约 需 要 300 h, 相 当 于 1 个 月 仅 仅 筛 查 7~8 个 药 物 的 全 部 代 谢 物 表 3. 叔 哌 丁 醇 的 9 个 代 谢 物 的 相 关 信 息 峰 m/z 保 留 时 间 /min 峰 面 积 峰 高 占 总 面 积 百 分 比 /% D e8 2.27e7 3.6 E e7 5.25e6 0.8 G( 母 药 ) e9 2.04e H e8 1.70e7 2.7 I e9 2.16e K e7 1.19e7 1.9 J e8 4.10e7 6.4 L e8 2.06e7 3.2 N e7 6.48e6 1.0 M e8 9.11e 自 动 化 代 谢 物 数 据 处 理 方 法 : 运 用 LightSight 软 件 和 PeakPerform 运 算 法 则, 每 个 药 物 的 样 品 与 对 照 样 品 比 较 的 处 理 过 程 只 需 大 约 1.5 h 同 样 地, 对 于 14 个 药 物,LightSight 软 件 不 仅 发 现 了 人 工 处 理 鉴 定 和 确 证 的 全 部 代 谢 物, 而 且 发 现 了 3 个 新 的 代 谢 物, 整 个 处 理 过 程 只 花 费 23 h, 数 据 检 查 和 处 理 的 效 率 和 速 度 比 人 工 处 理 方 法 提 高 了 13 倍 下 表 总 结 了 LightSight 软 件 所 鉴 定 和 确 证 的 14 个 药 物 的 所 有 代 谢 物 27

28 表 4. 叔 哌 丁 醇 的 13 个 代 谢 物 的 相 关 信 息 峰 m/z 保 留 时 间 /min 峰 面 积 峰 高 占 总 面 积 百 分 比 /% D e8 2.27e7 3.5 E e7 5.25e6 0.8 G( 母 药 ) e9 2.04e H e8 1.70e7 2.8 I e9 2.16e K e7 1.19e7 1.8 J e8 4.10e7 6.8 L e8 2.06e7 3.0 N e7 6.48e6 0.6 M e8 9.11e Q e7 8.38e6 1.4 R e7 6.03e6 0.9 S e7 5.56e6 0.8 结 论 : LightSight 软 件 的 自 动 化 代 谢 物 处 理 方 法 比 传 统 的 人 工 处 理 方 法 节 省 了 13 倍 的 时 间, 而 且 覆 盖 率 还 有 很 大 程 度 的 提 高 4.2 药 物 及 其 代 谢 物 的 定 量 分 析 (DMPK & ADME) 药 代 动 力 学 近 20 年 迅 速 发 展, 是 研 究 药 物 活 性 成 分 组 分 单 方 和 复 方 体 内 吸 收 分 布 代 谢 和 排 泄 的 动 态 变 化 规 律 及 其 体 内 时 量 - 时 效 关 系 并 用 数 学 函 数 加 以 定 量 描 述 的 一 门 边 缘 学 科 其 研 究 方 法 主 要 有 生 物 效 应 法 和 体 内 药 物 浓 度 法 体 内 药 物 浓 度 法 是 经 典 方 法, 对 西 药 或 有 效 成 分 明 确 的 中 药 及 中 药 复 方 能 得 较 准 确 的 参 数 但 新 药 开 发 阶 段 首 先 用 各 种 体 外 模 型 对 候 选 物 的 代 谢 特 性 进 行 筛 选 以 确 定 药 物 是 否 有 继 续 开 发 的 价 值, 随 后 进 行 动 物 的 体 内 代 谢 研 究 以 及 人 体 的 体 外 代 谢 研 究, 以 推 断 药 物 在 人 体 内 可 能 的 代 谢 途 径 及 是 否 安 全 有 效 药 物 代 谢 的 体 外 研 究 : 1 进 行 药 物 的 体 外 高 通 量 代 谢 筛 选 进 入 20 世 纪 90 年 代 以 来, 基 因 组 计 划 及 组 合 化 学 技 术 越 来 越 广 泛 地 用 于 药 物 的 设 计 过 程, 为 得 到 大 量 化 合 物 提 供 新 的 途 径, 同 时 高 通 量 筛 选 方 法 的 出 现 加 快 了 对 化 合 物 生 物 学 活 性 进 行 评 估 的 速 度 2 确 定 药 物 代 谢 途 径 及 相 关 酶 在 药 物 代 谢 过 程 中, 一 种 酶 可 催 化 药 物 的 多 种 代 谢 反 应 ; 而 多 种 同 工 酶 或 不 同 酶 系 统 可 能 催 化 同 一 代 谢 反 应 药 物 由 体 外 模 型 得 到 的 代 谢 特 征 通 常 可 一 定 程 度 地 反 映 体 内 的 代 谢 特 性, 因 此, 可 在 新 药 开 发 的 早 期 阶 段 用 人 体 体 外 实 验 进 行 药 物 代 谢 的 有 关 研 究 以 确 定 药 物 在 人 体 内 可 能 的 代 谢 特 征 3 确 定 药 物 间 相 互 反 应 生 物 转 化 过 程 是 许 多 药 物 消 除 的 主 要 途 径, 因 此 当 两 种 或 多 种 药 物 经 同 一 代 谢 酶 代 谢 时, 药 物 间 则 可 能 由 于 对 药 酶 的 竞 争 而 发 生 相 互 作 用 由 于 分 子 生 物 学 技 术 的 进 步, 药 物 代 谢 的 体 外 研 究 在 技 术 上 已 取 得 巨 大 进 步, 如 今 可 利 用 体 外 系 统 协 助 进 行 药 物 间 相 互 作 用 的 研 究 动 物 的 体 内 实 验 : 1 体 内 代 谢 产 物 的 收 集 分 离 鉴 定 代 谢 产 物 可 在 一 定 程 度 上 了 解 药 物 的 代 谢 途 径 近 年 来,LC-MS/ 28

29 串 联 质 谱 技 术 在 药 物 代 谢 研 究 中 的 应 用 MS 等 高 速 高 效 高 灵 敏 度 的 分 析 方 法 已 用 于 代 谢 产 物 的 分 析, 可 在 检 测 出 极 微 量 代 谢 产 物 的 同 时 鉴 定 代 谢 产 物 的 结 构 2 体 内 生 化 研 究 近 年 来 在 分 子 水 平 对 药 物 代 谢 酶 已 进 行 了 越 来 越 深 入 的 研 究, 促 使 药 物 的 体 内 代 谢 研 究 不 仅 局 限 于 对 代 谢 产 物 的 分 离 鉴 定, 而 且 参 与 药 物 代 谢 的 酶 学 特 征 及 相 关 基 因 分 子 生 物 学 特 征 由 于 其 药 物 代 谢 酶 水 平 和 组 成 的 差 异 所 致, 在 体 内 药 物 代 谢 研 究 的 过 程 中 可 观 察 到, 同 一 药 物 在 不 同 种 属 个 体 或 性 别 动 物 体 内 其 代 谢 药 效 及 毒 性 可 能 存 在 很 大 的 差 别 预 测 人 体 内 的 代 谢 特 征 : 在 进 入 临 床 实 验 前, 根 据 药 物 代 谢 的 体 外 及 动 物 体 内 特 性 可 初 步 推 断 出 药 物 在 人 体 的 代 谢 途 径 并 可 定 量 ( 或 半 定 量 ) 估 计 药 物 各 代 谢 途 径 的 清 除 率 但 是, 由 于 种 族 及 环 境 等 因 素, 不 同 人 群 中 药 物 代 谢 酶 的 基 因 构 成 可 能 有 很 大 差 异, 即 药 物 代 谢 酶 的 基 因 多 态 性 当 药 物 主 要 由 这 类 酶 代 谢 时, 不 同 患 者 对 同 一 药 物 的 代 谢 速 率 可 能 有 显 著 差 异 临 床 研 究 : 新 药 准 备 进 入 临 床 研 究 前 一 定 要 了 解 药 物 的 代 谢 图 谱, 确 定 药 物 在 人 体 内 不 会 产 生 未 知 物, 避 免 人 体 由 于 暴 露 于 未 知 化 合 物 而 可 能 产 生 的 毒 性 可 是 如 果 进 入 临 床 后 在 人 体 内 发 现 有 大 量 未 知 代 谢 物 的 生 成, 通 常 要 暂 停 开 发, 直 到 合 成 出 该 未 知 代 谢 物 并 通 过 动 物 实 验 确 定 无 毒 后 才 能 继 续 在 临 床 药 理 研 究 的 最 后 阶 段, 关 于 药 物 的 代 谢 途 径 活 性 代 谢 物 的 存 在 代 谢 的 种 属 差 异 以 及 药 物 对 代 谢 酶 的 诱 导 及 抑 制 等 特 征 都 已 清 楚, 这 些 数 据 在 临 床 针 对 不 同 情 况 不 同 特 异 质 及 特 殊 人 群 的 用 药 有 很 重 要 的 理 论 意 义 和 实 用 价 值 药 物 动 力 学 研 究 要 求 对 生 物 利 用 度 药 物 代 谢 程 度 血 尿 药 物 浓 度 等 进 行 定 量, 但 其 样 品 基 质 复 杂, 要 求 测 试 方 法 的 灵 敏 度 高 重 现 性 好 且 具 有 高 通 量 的 能 力 大 量 实 验 表 明,LC-MS/MS 的 联 用 技 术 具 有 比 GC-MS,LC-MS(SIM 或 SRM) 及 MS/MS 更 高 的 专 一 性 和 灵 敏 度 因 为 LC-MS/MS 的 多 反 应 监 测 (MRM) 是 检 测 转 变 中 的 一 对 离 子 而 不 是 单 个 离 子, 因 此 大 大 增 加 了 检 测 的 专 一 性, 同 时 也 改 善 了 信 噪 比 若 样 品 经 过 色 谱 柱 再 进 入 质 谱 仪 可 进 一 步 分 离 杂 质, 减 小 背 景 干 扰, 从 而 改 善 信 噪 比, 提 高 灵 敏 度 因 此, 对 于 生 物 样 品 的 分 析, 使 用 多 反 应 监 测 (MRM) 做 检 测 手 段 比 单 离 子 监 测 更 可 靠 更 现 实 例 如, 一 些 微 量 结 合 型 代 谢 物 如 Δ 9 -THC 及 其 活 性 代 谢 物 维 生 素 D 3 的 主 要 代 谢 物 fmol 级 的 1,25-(OH) 2 D 3 也 能 够 被 鉴 定 和 定 量 AB 公 司 串 联 质 谱 的 主 要 专 利 技 术 LINAC 的 诞 生, 使 得 LC-MS/MS 这 种 快 速 分 析 技 术 特 别 适 合 于 组 合 给 药 的 药 代 动 力 学 研 究, 即 给 动 物 同 时 服 用 几 种 药 物, 按 常 规 取 样 时 间 取 血, 运 用 LC-MS/MS 联 用 技 术 进 行 样 品 处 理 和 分 析 目 前, 有 文 献 记 录 的 数 据 是 可 以 同 时 测 定 421 种 化 合 物 最 适 代 谢 物 鉴 定 平 台 API 3000 API 3200 API 4000 API 5000 系 列 或 2000 Q TRAP 3200 Q TRAP 4000 Q TRAP 系 列 以 及 QSTAR Elite QqTOF LC-MS/MS 任 一 台 或 多 台 质 谱 仪 QTRAP 等 系 列 仪 器 鉴 定 代 谢 物 的 流 程 第 1 步, 分 析 母 药 化 合 物, 确 定 可 能 的 断 裂 途 径 第 2 步, 利 用 EMS-IDA (MS 1 ) 检 测 高 含 量 的 代 谢 物 第 3 步, 低 含 量 代 谢 物 的 检 测 :1 母 离 子 扫 描 -IDA;2 中 性 丢 失 -IDA;3 理 论 上 的 多 重 -MRM- IDA : 是 目 前 检 测 可 预 测 的 代 谢 转 化 产 物 的 最 灵 敏 专 一 性 最 好 的 方 法 第 四 步, 利 用 Metabolite ID 软 件 处 理 数 据 全 自 动 完 成 模 板 定 量, 筛 查 得 到 pk 时 间 点 及 Caco II 29

30 Loop Tune FIA 化 合 物 数 据 库 Batch & MRM 建 立 自 动 定 量 Excel 数 据 输 出 至 PK 软 件 图 43. 全 自 动 分 析 流 程 图 44. IntelliQuan 自 动 定 量 信 息 关 联 扫 描 技 术 (Information Dependent Acquisition,IDA) 监 测 扫 描 自 动 触 发 选 择 母 离 子 进 行 MS/MS 扫 描 ; 监 测 扫 描 形 式 多 样, 可 以 是 MS 1 母 离 子 扫 描 中 性 丢 失 或 MRM; MS 2 可 以 自 动 触 发 获 得 MS 3, 然 而, 由 于 Q TRAP 系 列 平 台 的 MS 2 提 供 的 碎 片 离 子 非 常 丰 富, 因 此, 并 不 经 常 需 要 采 集 MS 3 ; 对 于 MS 1 IDA 需 要 4 个 关 联 MS 2 以 保 证 大 量 信 号 的 覆 盖 率 动 态 本 底 扣 除 (Dynamic Background Subtraction,DBS) 随 着 HPLC 的 运 行, 动 态 选 择 前 一 个 监 测 扫 描 的 3 个 质 谱 和 正 在 进 行 的 监 测 扫 描 的 1 个 质 谱 作 为 本 底, 自 动 扣 除 ; 增 加 了 信 噪 比, 最 大 程 度 地 增 加 了 检 测 低 含 量 的 共 洗 脱 组 分 的 可 能 性 监 测 扫 描 监 测 扫 描 1 监 测 扫 描 本 底 离 子 ( 深 色 ) 316- 要 选 择 的 分 析 物 要 选 择 的 分 析 物 2 监 测 扫 描 2 IDA 条 件 动 态 本 底 扣 除 (DBS) MS 2 1 扣 除 本 底 的 监 测 扫 描 IDA 选 择 要 监 测 的 峰 关 联 扫 描 MS 2 2 MS 2 3 MS 2 4 图 45. 信 息 关 联 扫 描 流 程 图 46. 动 态 本 底 扣 除 前 后 质 谱 图 的 比 较 母 离 子 和 中 性 丢 失 扫 描 方 法 的 设 计 I 相 和 II 相 代 谢 物 的 鉴 定 根 据 母 药 分 子 的 断 裂 结 构 利 用 几 个 母 离 子 和 中 性 丢 失 扫 描, 通 常 能 够 获 得 完 全 的 母 药 分 子 的 覆 盖 率 ; 所 有 这 些 扫 描 都 可 用 在 Q TRAP 平 台 上 作 为 监 测 扫 描 并 自 动 选 择 获 得 MS 2, 图 谱 便 于 解 析 ; 灵 敏 度 能 与 MRM 方 法 相 匹 配 ; 能 够 发 现 未 预 期 的 代 谢 物 理 论 上 的 多 重 MRM 方 法 的 设 计 I 相 和 II 相 代 谢 物 的 鉴 定 例 如, 母 体 药 物 有 2 种 可 能 的 断 裂 途 径 : 30

31 串 联 质 谱 技 术 在 药 物 代 谢 研 究 中 的 应 用 每 个 生 物 转 化 会 自 动 建 立 2 个 MRM 离 子 对 扫 描 ; Q TRAP 系 列 平 台 自 动 关 联 扫 描 获 得 MS 2 ; 母 离 子 扫 描 和 中 性 丢 失 扫 描 具 有 更 好 的 灵 敏 度 ; 每 对 MRM 的 驻 留 时 间 为 10~30 ms; 保 证 用 于 定 量 的 峰 有 10 点 的 数 据 ; 具 有 最 高 的 灵 敏 度 ; 自 动 选 择 获 得 MS 2, 图 谱 便 于 解 析 丁 螺 环 酮 的 每 个 浓 度 点 重 复 8 针 进 样, 线 性 曲 线 表 明 其 优 异 的 动 态 线 性 范 围, 最 小 定 量 浓 度 为 pg/µl 表 格 中 的 数 据 说 明 在 认 证 环 境 条 件 下 其 优 异 的 数 据 一 致 性 和 重 现 性 LightSight 代 谢 物 鉴 定 平 台 图 47. 丁 螺 环 酮 的 定 量 动 态 线 性 曲 线 应 用 实 例 I: 强 安 定 药 氟 派 啶 醇 体 外 代 谢 物 的 分 析 体 内 代 谢 产 物 鉴 定 的 挑 战 通 常 情 况 下, 体 外 孵 育 的 代 谢 物 相 对 容 易 鉴 定 ; 在 药 物 开 发 的 后 期, 人 体 或 动 物 体 内 代 谢 物 对 研 究 PK 和 毒 性 非 常 重 要 ; 体 内 基 质 ( 胆 汁 尿 液 血 浆 和 粪 便 ) 样 品 非 常 脏 和 复 杂 ; 代 谢 物 浓 度 非 常 低, 往 往 远 低 于 10 µmol/l 的 孵 育 液 的 代 谢 物 ; MS 缺 少 灵 敏 度 和 选 择 性, 不 适 合 体 内 代 谢 物 鉴 定 样 品 制 备 10 µmol/l 氟 派 啶 醇 在 新 鲜 的 大 鼠 肝 实 质 细 胞 液 中 孵 育 ; 样 品 稀 释 至 2 µmol/l, 然 后 添 加 至 基 质 中 ; 胆 汁 尿 液 和 血 清 用 1:1 的 甲 醇 萃 取, 干 燥 后 溶 解 于 80 : 20 水 / 乙 腈 溶 液 中 ; 色 谱 柱 :2 mm 200 mm Prodigy Phenonmenex, 流 速 :250 µl/min,1% 甲 酸 ; 用 3200 Q TRAP DBS IDA 等 方 法 采 集 数 据 ; 用 AUTO FRAG CE 功 能 以 获 得 更 丰 富 的 碎 片 离 子 结 果 m/z123.1 的 母 离 子 TIC 代 谢 物 XIC m/z552.3 m/z552.3 的 MS 2 m/z123.1 的 母 离 子 谱 传 统 离 子 阱 会 丢 失 低 质 荷 比 离 图 48. 氟 派 啶 醇 的 结 构 和 子 离 子 扫 描 质 谱 图 图 49. 代 谢 物 m/z 的 XIC 图 和 m/z 的 母 离 子 扫 描 图 31

32 m/z123.1 的 母 离 子 XIC m/z354 中 性 丢 失 176 TIC XIC m/z558.3 m/z123.1 的 母 离 子 谱 m/z354 的 MS 2 m/z558.3 的 MS 2 中 性 丢 失 176 谱 图 50. 母 离 子 扫 描 查 找 脱 水 和 缩 环 代 谢 物 图 51. 中 性 丢 失 扫 描 176u 查 找 氧 化 去 氯 甲 基 化 糖 基 化 代 谢 物 特 别 值 得 注 意 的 是 : 在 葡 糖 醛 酸 化 脱 水 和 环 还 原 化 氧 化 脱 氯 化 氧 化 脱 氟 化 + 甲 基 化 + 糖 基 化 ( 通 过 中 性 丢 失 176u 发 现 ) 的 检 测 谱 图 中, 串 联 四 极 杆 - 线 性 离 子 阱 Q TRAP 系 列 毫 无 例 外 地 产 生 了 低 质 荷 比 的 离 子 而 这 些 离 子 在 传 统 的 离 子 阱 质 谱 仪 中 是 不 能 检 测 到, 其 原 因 是 因 为 传 统 的 离 子 阱 质 谱 仪 存 在 空 间 电 荷 效 应 及 低 质 荷 比 截 止 效 应 ( 俗 称 1/3 效 应 ) 的 缘 故 表 5. 检 测 到 的 I 相 和 II 相 代 谢 物 编 号 RT(min) 离 子 (m/z) 代 谢 物 可 能 归 属 母 药 血 清 尿 液 胆 汁 m/z123 和 m/z 165 暂 未 定 X 失 去 OH + 缩 环 还 原 + 氧 化 X X 失 去 OH + 缩 环 还 原 - Cl + OH + Gluc X X X X 氧 化 脱 氟 + 甲 基 化 + Gluc X 脱 氯 化 + ( 氧 化 甲 氧 基 化 ) 右 环 + Gluc X X X Gluc+ 氧 化 ( 左 环 ) X X X X 氧 化 脱 氟 化 + 甲 基 化 + Gluc X X 失 去 OH + 缩 环 还 原 + Gluc + 氧 化 ( 左 环 ) X X X X 失 去 OH + 缩 环 还 原 + Gluc + 氧 化 ( 右 环 ) X X X X Gluc+ 氧 化 X X X OH 上 Gluc X X X X 失 去 OH + 缩 环 还 原 + 氧 化 + Gluc X 失 去 OH + 缩 环 还 原 + Gluc X X X X Gluc+ 氧 化 X Gluc + 二 氧 化 ( 左 边 ) + 环 还 原 X X X X 失 去 OH + 缩 环 还 原 + Gluc X X 失 去 OH + 缩 环 还 原 - Cl + OH X X m/z123 和 m/z 165 暂 未 定 * X X X X 氧 化 右 环 X X X X 母 药 X X X X m/z123 和 m/z 165 暂 未 定 X X m/z123 和 m/z 165 暂 未 定 X 氧 化 X X X X m/z123 和 m/z 165 暂 未 定 X 失 去 OH + 缩 环 还 原 X X X X m/z123 和 m/z 165 暂 未 定 X X 通 过 QQQ 监 测 的 代 谢 物 占 总 代 谢 物 的 比 例 100% 66% 60% 55% 通 过 MS1 监 测 的 代 谢 物 占 总 代 谢 物 的 比 例 22% 11% 11% 4% 32

33 串 联 质 谱 技 术 在 药 物 代 谢 研 究 中 的 应 用 总 结 : 由 MS 1 和 QQQ 共 检 测 到 26 个 代 谢 物, 其 中 有 9 个 代 谢 物 ( 表 中 斜 体 离 子 ) 可 能 是 新 代 谢 物, 以 前 未 见 报 道 绝 大 部 分 代 谢 物 的 可 能 归 属 得 到 合 理 推 测 自 动 化 进 行 常 规 定 量 MS 1 可 以 检 测 部 分 体 外 孵 育 的 代 谢 物, 检 出 率 为 4%~22% QQQ 的 高 灵 敏 度 特 性 允 许 检 测 体 外 孵 育 体 系 的 低 水 平 代 谢 物, 检 出 率 为 55%~100% QQQ+DBS IDA 方 法 消 除 了 干 扰 的 本 底 使 得 IDA 的 效 率 更 好 能 够 同 步 进 行 定 性 和 定 量 Q TRAP 系 列 串 联 四 极 杆 - 线 性 离 子 阱 平 台 比 传 统 离 子 阱 能 够 产 生 更 好 的 断 裂 离 子 应 用 实 例 II: 组 合 给 药 的 药 代 动 力 学 研 究 体 内 药 代 动 力 学 在 新 药 研 究 中 相 当 重 要, 可 以 通 过 口 服 或 注 射 给 药 后 的 药 代 动 力 学 研 究 获 得 一 些 非 常 重 要 的 药 代 参 数 但 体 内 药 代 动 力 学 的 筛 选 比 较 费 时, 而 且 样 品 和 试 验 动 物 的 消 耗 量 也 很 大, 研 究 经 费 很 高 因 此,Berman 等 提 出 了 一 种 新 的 给 药 方 法, 即 盒 式 给 药 法 (cassette dosing), 又 称 为 组 合 给 药 技 术, 即 给 动 物 同 时 服 用 几 种 药 物, 按 常 规 取 样 时 间 取 血, 运 用 LC-MS/MS 联 用 技 术 进 行 样 品 分 析 组 合 给 药 需 要 考 虑 每 组 实 验 所 包 含 的 药 物 怎 样 组 合, 对 于 该 组 药 物 的 给 药 和 检 测 最 为 合 适 在 给 药 方 面, 要 求 将 相 同 或 者 相 似 理 化 性 质 的 药 物 放 在 一 组, 以 方 便 该 组 药 物 的 溶 解 及 给 药, 降 低 HPLC 条 件 的 摸 索 难 度 同 时 由 于 需 要 对 血 样 进 行 质 谱 分 析, 所 以 分 子 质 量 相 同 并 可 能 产 生 相 同 碎 片 的 化 合 物 不 宜 放 在 一 组, 不 同 电 离 模 式 的 化 合 物 也 不 宜 放 在 一 组 另 外 在 候 选 药 物 组 中 加 入 一 个 已 知 药 代 参 数 的 化 合 物, 利 用 其 来 检 测 组 内 其 它 化 合 物 的 药 动 学 行 为 是 否 正 常 但 是 在 组 合 给 药 时, 不 可 避 免 地 会 发 生 药 物 的 相 互 作 用, 例 如 吸 收 和 清 除 途 径 的 相 互 促 进 或 竞 争 血 浆 蛋 白 的 竞 争 结 合 对 酶 的 激 活 或 者 抑 制 以 及 药 理 活 性 的 增 加 或 者 毒 性 反 应 出 现 等 因 此, 需 要 通 过 降 低 给 药 量, 避 免 可 能 出 现 的 组 内 药 酶 抑 制 或 加 入 参 照 化 合 物, 将 这 种 相 互 作 用 降 至 最 低 组 合 给 药 由 于 相 互 作 用 的 存 在, 只 能 使 药 代 参 数 优 于 单 独 给 药, 所 以 在 药 物 粗 选 中 不 会 漏 选, 进 一 步 的 筛 选 会 剔 除 误 选 化 合 物 下 面 通 过 比 较 经 典 给 药 法 群 体 给 药 法 (Pop) 稳 定 同 位 素 标 记 联 合 给 药 法 (SIL) 和 组 合 给 药 技 术 (N-in-1) 后 通 过 LC-MS/MS 获 得 的 药 物 动 力 学 数 据, 来 显 示 组 合 给 药 技 术 的 优 越 性 本 实 验 研 究 基 质 金 属 蛋 白 酶 (MMP) 受 体 与 羟 肟 酸 类 化 合 物 的 作 用, 血 清 样 品 分 别 取 自 大 鼠 兔 猴 稳 定 同 位 素 标 记 联 合 给 药 法 (SIL) 的 药 物 标 记 药 物 (13C6) 及 内 标 的 MRM 色 谱 图 如 图 52 所 示 100 m/z 317 m/z m/z 323 m/z C 6 50 相 25 对 0 强 度 100 m/z 394 m/z 内 标 ng/ml 33 ng/ml 时 间 /min 图 52. 三 种 物 质 ( 药 物 标 记 药 物 内 标 ) 的 MRM 色 谱 图 浓 度 ( ng/ml) Intravenous -5 mg/kg 未 标 记 给 药 稳 定 标 记 静 脉 注 射 给 药 未 标 记 口 服 给 药 图 53. SIL 给 药 的 变 化 曲 线 快 速 口 服 25 mg/kg 图 54. 快 速 口 服 给 药 的 变 化 曲 线 33