2 目 录 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 在 不 同 基 质 和 营 养 下 的 固 体 发 酵... 1 试 验 人 员 : 肖 马 云... 1 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 不 同 固 体 发 酵 载 体 的 筛 选.

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1 1 福 建 省 生 物 农 药 工 程 研 究 中 心 福 建 省 农 业 生 物 药 物 工 程 技 术 研 究 中 心 编 号 :FJAT-1106-REP 主 编 : 刘 波 博 士 研 究 员 副 主 编 : 唐 建 阳 研 究 员 朱 育 菁 博 士 蓝 江 林 博 士 林 营 志 博 士 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 农 业 微 生 物 科 技 创 新 团 队 电 话 : , 传 真 : 年 8 月 fjat.yzxz.com

2 2 目 录 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 在 不 同 基 质 和 营 养 下 的 固 体 发 酵... 1 试 验 人 员 : 肖 马 云... 1 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 不 同 固 体 发 酵 载 体 的 筛 选... 5 试 验 人 员 : 肖 马 云... 5 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 动 态 ( 一 ) 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 动 态 ( 二 )...18 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 60 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 及 结 果 分 析...25 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 50 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 及 结 果 分 析...30 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 40 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测...34 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 项 目 : 河 南 土 壤 标 本 中 芽 孢 杆 菌 的 分 离 与 保 存 ( )...38 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 项 目 : 模 式 芽 胞 杆 菌 真 空 冷 冻 干 燥 保 存 (14201~14205)...47 试 验 人 员 : 王 子 旋 刘 国 红 试 验 项 目 : 大 肠 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备...53 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 项 目 : 枯 草 芽 孢 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备...62 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 项 目 : 垫 料 中 所 分 离 的 益 生 菌 对 致 病 菌 的 抑 制 效 果 试 验 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 项 目 : 葡 萄 球 菌 质 粒 标 准 品 的 制 作 和 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备...74 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 项 目 : 荧 光 定 量 PCR 测 定 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 葡 萄 球 菌 的 数 量 变 化 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 项 目 :Co 60 照 射 后 无 致 病 力 的 尖 孢 镰 刀 菌 菌 落 形 态 观 察 及 保 存...88 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 项 目 : 从 三 种 不 同 植 株 上 分 离 到 的 真 菌 的 分 子 鉴 定...97 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 项 目 : 漳 州 香 蕉 枯 萎 病 植 株 根 际 土 壤 中 芽 孢 杆 菌 的 分 离 与 保 存 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 项 目 : 福 建 省 不 同 地 区 发 酵 床 垫 料 的 含 水 量 比 较 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 项 目 : 高 温 条 件 下 发 酵 床 的 微 生 物 生 物 量 的 测 定 ( 四 ) 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 项 目 : 不 同 产 量 和 施 肥 方 式 下 葡 萄 的 CAT 酶 活 性 比 较 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 项 目 : 宁 德 市 九 都 镇 示 范 点 水 质 中 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 ( 六 ) ( 编 号 )

3 3 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 项 目 : 发 酵 床 养 猪 垫 料 的 酸 碱 度 与 电 导 率 的 测 定 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 ( 二 ) 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 ( 三 ) 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 九 ):5 - 氯 灰 黄 霉 素 的 合 成 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 十 ):5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 的 还 原 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 十 一 ): 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 合 成 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 项 目 : 无 致 病 力 尖 孢 镰 刀 菌 FJAT-9290 在 番 茄 上 的 定 殖 特 性 研 究 ( 二 ) 试 验 人 员 : 杨 莹 莹 试 验 项 目 : 无 致 病 力 尖 孢 镰 刀 菌 FJAT-9290 在 香 蕉 上 的 定 殖 特 性 研 究 ( 三 ) 试 验 人 员 : 杨 莹 莹 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 致 死 率 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 效 果 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 效 果 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 致 死 率 摸 索 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 transposase 验 证 (RS982695) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 peptidase U35 phage prohead HK97 验 证 (RS983416) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 bacteriophage protein GP46 验 证 (RS983442) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 Integrase catalytic region 验 证 (RS980089) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA-dependent RNA polymerase 验 证 (RS980192) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 HK97 family phage protein 验 证 (RS980373) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 caudovirus prohead protease 验 证 (RS980384) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 hypothetical protein Bmul_0496 验 证 (RS980442) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 PBCV-1 DNA ligase(rs98orf00203) 验 证 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 项 目 : 两 个 未 知 基 因 的 注 释 及 在 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 搜 索 同 源 基 因...298

4 4 试 验 人 员 : 林 爱 婷 试 验 项 目 : 短 短 芽 孢 杆 菌 JK-2 全 基 因 组 SNP 的 预 测 和 分 析 试 验 人 员 : 林 爱 婷 试 验 项 目 : 苯 酚 硫 酸 法 测 定 胞 外 多 糖 标 准 曲 线 的 测 定 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 金 石 王 1 号 番 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 张 文 州 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 张 文 州 试 验 项 目 : 平 潭 花 生 4 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 项 目 : 莆 田 辣 椒 4 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 项 目 : 土 壤 芽 胞 杆 菌 的 分 离 纯 化 及 保 种 ( ) 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 测 定 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 项 目 : 土 壤 芽 胞 杆 菌 的 分 离 纯 化 及 保 存 ( ) 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 测 定 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 鉴 定 试 验 人 员 : 余 谦 试 验 项 目 : 耐 高 温 芽 孢 杆 菌 的 分 离 试 验 人 员 : 余 谦 试 验 负 责 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 二 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 三 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 四 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 项 目 : 不 同 施 肥 方 式 和 施 肥 量 对 葡 萄 叶 绿 素 的 影 响 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 项 目 : 微 波 诱 变 后 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 弱 化 指 数 的 测 定 试 验 人 员 : 周 游 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 试 验 项 目 : 莆 田 辣 椒 1 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 微 波 诱 变 条 件 摸 索 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 体 的 PCR 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美

5 5 试 验 项 目 : 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 抗 生 素 敏 感 性 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 无 致 病 力 突 变 株 的 形 态 和 分 子 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美

6 1 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ ] 共 4 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 在 不 同 基 质 和 营 养 下 的 固 体 发 酵 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 负 责 : 史 怀 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

7 2 1. 试 验 目 的 香 蕉 枯 萎 病 又 名 香 蕉 巴 拿 马 病 黄 叶 病, 是 由 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum [1] f.sp.cubense) 引 起 的 维 管 束 坏 死 的 一 种 毁 灭 性 真 菌 病 害 和 典 型 的 土 传 病 害, 是 国 际 检 疫 对 象 香 蕉 [2] 枯 萎 病 是 目 前 香 蕉 栽 培 品 种 的 主 要 威 胁, 我 国 香 蕉 枯 萎 病 主 要 由 生 理 小 种 4 号 侵 染 引 起 淡 紫 拟 青 霉 [Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson] 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deu-teromycotina), 丝 孢 纲 (Hyph 本 试 验 室 筛 [3] 选 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 株 对 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 好 的 抑 制 作 用 成 功 的 生 物 防 治 依 赖 于 对 生 防 菌 病 原 物 和 寄 主 植 物 相 互 关 系 的 彻 底 了 解 在 植 物 病 害 生 防 实 践 中, 生 防 菌 被 引 人 土 壤 时, 往 往 会 受 到 土 壤 抑 菌 作 用 及 生 防 菌 与 植 物 根 部 亲 和 能 力 的 影 响, 这 是 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 防 效 不 稳 定 的 重 要 原 因 之 一 因 此, 作 为 生 防 因 子 的 生 防 菌 能 否 在 靶 植 物 根 际 定 殖 生 长 已 成 为 筛 选 评 定 土 传 病 害 生 防 菌 的 一 个 重 要 指 标, 并 最 终 决 定 该 生 防 菌 的 开 发 利 用 潜 [4] 力 成 儒 萍 以 淡 紫 拟 青 霉 孢 子 液 和 固 体 发 酵 物 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 物 较 孢 子 液 浇 灌 的 施 入 方 式 能 使 菌 株 在 土 壤 中 有 相 对 高 的 存 活 量, 而 液 体 流 状 物 的 形 式 容 易 在 土 壤 中 淋 溶 散 失, 不 利 于 长 期 存 活 可 能 由 于 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 物 的 形 式 提 供 给 菌 株 以 介 质 的 固 着, 相 对 稳 定 的 留 存 在 土 壤 基 质 中, 这 样 有 利 于 淡 紫 拟 青 霉 对 土 传 病 害 的 长 效 控 制 本 试 验 研 究 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 基 质 的 发 酵, 研 究 淡 在 拟 青 霉 的 固 体 发 酵 能 力, 为 提 高 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 活 菌 数 提 供 参 考 2. 试 验 方 法 2.1. 供 试 材 料 垫 料 : 由 谷 壳 锯 末 和 猪 粪 等 在 猪 场 沉 积 几 年 制 成 的 垫 料, 玉 米 粉 菇 菌 草 硫 酸 铵 蔗 糖 2.2 试 验 方 法 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 在 GUJS-50 AUTOBIO 型 自 动 机 械 搅 拌 不 锈 钢 发 酵 罐 发 酵 8 天, 发 酵 后 发 酵 液 孢 子 浓 度 为 cfu/ml 试 验 处 理 试 验 设 以 下 处 理 : 1 玉 米 粉 40g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 40g 2 玉 米 粉 40g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 10g 3 玉 米 粉 35g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 15g 4 菇 菌 草 320g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 80g 5 菇 菌 草 100g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 50g 6 垫 料 200g+ 菇 菌 草 200g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 100g 7 垫 料 100g+ 玉 米 粉 100g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 50g 8 垫 料 200g+ 硫 酸 铵 6g+ 蔗 糖 10g + 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 50g 分 离 培 养

8 3 3. 试 验 结 果 各 个 不 同 处 理 放 在 常 温 下 10 天, 用 平 板 计 数 法 分 离 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 并 计 数 7 天 后 各 个 处 理 图 片 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 3 处 理 5 处 理 6 处 理 7 处 理 8 图 1 7 天 后 各 个 处 理 图 片 处 理 后 第 7 天, 处 理 7 处 理 8 和 处 理 6 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 长 情 况 较 好, 但 第 10 天, 处 理 8 有 些 污 染, 其 他 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 长 情 况 不 够 好 10 天 用 平 板 计 数 法 分 离 各 个 处 理, 涂 板 为 10 8 和 10 9 计 数 各 个 处 理 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT 结 果 为, 常 温 下 处 理 2 活 菌 数 为 cfu/g, 处 理 4 为 cfu/g, 其 他 处 理 没 有 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 可 见 加 硫 酸 铵 为 氮 源 和 蔗 糖 为 碳 源 的 垫 料 淡 紫 拟 青 霉 可 以 发 酵 以 下 是 10 天 后 分 离 处 理 2 和 处 理 4 的 照 片

9 4 处 理 2 处 理 4 图 天 后 各 个 处 理 图 片 4. 试 验 讨 论 为 了 筛 选 工 业 上 更 好 的 固 体 发 酵 配 方, 不 同 的 处 理 没 有 灭 菌, 处 理 后 第 7 天, 处 理 7 处 理 8 和 处 理 6 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 长 情 况 较 好, 但 第 10 天, 处 理 8 有 些 污 染, 其 他 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 长 情 况 不 够 好, 试 验 有 待 进 一 步 优 化 15 天 用 平 板 计 数 法 分 离 各 个 处 理, 涂 板 为 10 8 和 10 9 计 数 各 个 处 理 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT 结 果 为, 常 温 下 处 理 2 活 菌 数 为 cfu/g, 处 理 4 为 cfu/g, 其 他 处 理 没 有 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 可 见 加 硫 酸 铵 为 氮 源 和 蔗 糖 为 碳 源 的 垫 料 淡 紫 拟 青 霉 可 以 发 酵, 其 他 处 理 可 能 是 碳 源 和 氮 源 不 够, 进 行 进 一 步 不 同 发 酵 物 的 筛 选 和 营 养 物 质 的 筛 选 5.. 参 考 文 献 [1] 卓 国 豪, 黄 有 宝, 吴 运 新 等. 香 蕉 枯 萎 病 的 综 合 防 治 技 术 [ J]. 植 物 检 疫, 2003, 17( 5) : [2] 王 文 华, 王 葵 娣, 曾 会 才. 香 蕉 枯 萎 病 的 危 害 及 其 防 治 策 略 [J]. 广 西 热 带 农 业, 2007, 3: [3] 李 晓 杰, 徐 树 兰, 汤 历. 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 盆 栽 防 效 的 测 定 [J]. 广 东 农 业 科 学,2005 年 第 5 期 [4] 成 儒 萍, 肖 炎 农. 淡 紫 拟 青 霉 在 作 物 根 围 及 土 壤 中 的 定 殖 研 究, 植 物 病 理 学. [5] 陈 谦, 张 新 雄, 赵 海, 官 家 发. 生 物 有 机 肥 中 几 种 功 能 微 生 物 的 研 究 及 应 用 概 况 [J]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报 2010,16 ( 2 ): 294~300. [6] 张 志 红, 李 华 兴, 韦 翔 华, 刘 序, 彭 桂 香. 生 物 肥 料 对 香 蕉 枯 萎 病 及 土 壤 微 生 物 的 影 响, 生 态 环 境 2008,17(6): [7] 张 志 红, 冯 宏, 肖 相 政, 李 华 兴. 生 物 肥 防 治 香 蕉 枯 萎 病 及 对 土 壤 微 生 物 多 样 性 的 影 响. 果 树 学 报 2010,27(4): 575~579. 试 验 负 责 史 怀 试 验 人 员 肖 马 云

10 5 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ ] 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 不 同 固 体 发 酵 载 体 的 筛 选 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 负 责 : 史 怀 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

11 6 1. 试 验 目 的 香 蕉 枯 萎 病 又 名 香 蕉 巴 拿 马 病 黄 叶 病, 是 由 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum [1] f.sp.cubense) 引 起 的 维 管 束 坏 死 的 一 种 毁 灭 性 真 菌 病 害 和 典 型 的 土 传 病 害, 是 国 际 检 疫 对 象 香 蕉 [2] 枯 萎 病 是 目 前 香 蕉 栽 培 品 种 的 主 要 威 胁, 我 国 香 蕉 枯 萎 病 主 要 由 生 理 小 种 4 号 侵 染 引 起 淡 紫 拟 青 霉 [Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson] 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deu-teromycotina), 丝 孢 纲 (Hyph 本 试 验 室 筛 [3] 选 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 株 对 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 好 的 抑 制 作 用 成 功 的 生 物 防 治 依 赖 于 对 生 防 菌 病 原 物 和 寄 主 植 物 相 互 关 系 的 彻 底 了 解 在 植 物 病 害 生 防 实 践 中, 生 防 菌 被 引 人 土 壤 时, 往 往 会 受 到 土 壤 抑 菌 作 用 及 生 防 菌 与 植 物 根 部 亲 和 能 力 的 影 响, 这 是 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 防 效 不 稳 定 的 重 要 原 因 之 一 因 此, 作 为 生 防 因 子 的 生 防 菌 能 否 在 靶 植 物 根 际 定 殖 生 长 已 成 为 筛 选 评 定 土 传 病 害 生 防 菌 的 一 个 重 要 指 标, 并 最 终 决 定 该 生 防 菌 的 开 发 利 用 潜 [4] 力 成 儒 萍 以 淡 紫 拟 青 霉 孢 子 液 和 固 体 发 酵 物 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 物 较 孢 子 液 浇 灌 的 施 入 方 式 能 使 菌 株 在 土 壤 中 有 相 对 高 的 存 活 量, 而 液 体 流 状 物 的 形 式 容 易 在 土 壤 中 淋 溶 散 失, 不 利 于 长 期 存 活 可 能 由 于 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 物 的 形 式 提 供 给 菌 株 以 介 质 的 固 着, 相 对 稳 定 的 留 存 在 土 壤 基 质 中, 这 样 有 利 于 淡 紫 拟 青 霉 对 土 传 病 害 的 长 效 控 制 本 试 验 研 究 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 固 体 载 体 的 发 酵, 筛 选 出 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 的 最 佳 载 体, 为 提 高 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 活 菌 数 提 供 参 考 2. 试 验 方 法 2.1. 供 试 材 料 垫 料 : 由 谷 壳 锯 末 和 猪 粪 等 在 猪 场 沉 积 几 年 制 成 的 垫 料, 玉 米 粉 花 生 饼 粉 米 糠 地 瓜 干 粉 菜 籽 粉 米 粉 2.2 试 验 方 法 种 子 液 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 摇 床 发 酵 5 天, 转 速 110rpm/min,28, 发 酵 后 发 酵 液 孢 子 浓 度 为 cfu/ml 试 验 处 理 试 验 设 以 下 处 理 : 1. 垫 料 200g+ 米 糠 60g 接 入 种 子 液 40ml 2. 垫 料 200g+ 花 生 饼 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 3. 垫 料 200g+ 玉 米 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 4. 垫 料 200g+ 地 瓜 干 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 5. 垫 料 200g+ 菜 籽 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 6. 垫 料 200g+ 米 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 7. 垫 料 200g+ 麸 皮 30g+ 米 糠 30g 接 入 种 子 液 40ml 8. 垫 料 200g+ 菜 籽 粉 30g+ 大 米 粉 30g 接 入 种 子 液 40ml

12 7 9. 垫 料 200g+ 花 生 饼 粉 30g+ 玉 米 粉 30g 接 入 种 子 液 40ml 10. 垫 料 200g+ 淀 粉 30g+ 玉 米 粉 30g 接 入 种 子 液 40ml 11. 垫 料 200g 接 入 种 子 液 40ml 分 离 培 养 各 个 不 同 处 理 放 在 常 温 下 7 天, 用 平 板 计 数 法 分 离 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 并 计 数 3. 试 验 结 果 7 天 后 平 板 计 数 分 离 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数 表 1 7 天 后 试 验 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数 试 验 处 理 活 菌 数 (cfu/g) 处 理 处 理 处 理 处 理 处 理 处 理 处 理 处 理 处 理 处 理 处 理 由 上 表 可 以 看 出 以 上 处 理 淡 紫 拟 青 霉 活 菌 数 都 有 所 上 升, 处 理 4 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数 最 高 为 cfu/g, 处 理 3 处 理 6 也 有 较 多 的 活 菌 菌 数 分 别 为 和 , 处 理 5 处 理 7 处 理 8 活 菌 数 较 少 为 , 可 见 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 以 上 不 同 的 固 体 载 体 中 均 有 发 酵 能 力, 其 中 在 处 理 4 垫 料 200g+ 地 瓜 干 粉 60g 中 发 酵 能 力 最 强 以 下 是 7 天 后 分 离 平 板 计 数 分 离 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数

13 8 处 理 cfu/g 处 理 cfu/g 处 理 cfu/g 处 理 处 理 cfu/g 处 理 cfu/g 处 理 cfu/g 处 理 cfu/g

14 9 处 理 cfu/g 处 理 cfu/g 处 理 cfu/g 图 2 10 天 后 各 个 处 理 图 片 4. 试 验 讨 论 以 上 结 果 表 明 以 上 处 理 淡 紫 拟 青 霉 活 菌 数 都 有 发 酵 能 力, 处 理 4 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数 最 高 为 cfu/g, 处 理 3 处 理 6 也 有 较 多 的 活 菌 菌 数 分 别 为 和 , 处 理 5 处 理 7 处 理 8 活 菌 数 较 少 为 , 可 见 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 以 上 不 同 的 固 体 载 体 中 均 有 发 酵 能 力, 其 中 在 处 理 4 垫 料 200g+ 地 瓜 干 粉 60g 中 发 酵 能 力 最 强, 地 瓜 干 粉 和 垫 料 是 最 佳 的 固 体 发 酵 载 体, 下 一 步 进 行 进 一 步 营 养 配 比 的 筛 选 5.. 参 考 文 献 [1] 卓 国 豪, 黄 有 宝, 吴 运 新 等. 香 蕉 枯 萎 病 的 综 合 防 治 技 术 [ J]. 植 物 检 疫, 2003, 17( 5) : [2] 王 文 华, 王 葵 娣, 曾 会 才. 香 蕉 枯 萎 病 的 危 害 及 其 防 治 策 略 [J]. 广 西 热 带 农 业, 2007, 3: [3] 李 晓 杰, 徐 树 兰, 汤 历. 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 盆 栽 防 效 的 测 定 [J]. 广 东 农 业 科 学,2005 年 第 5 期 [4] 成 儒 萍, 肖 炎 农. 淡 紫 拟 青 霉 在 作 物 根 围 及 土 壤 中 的 定 殖 研 究, 植 物 病 理 学.

15 10 [5] 陈 谦, 张 新 雄, 赵 海, 官 家 发. 生 物 有 机 肥 中 几 种 功 能 微 生 物 的 研 究 及 应 用 概 况 [J]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报 2010,16 ( 2 ): 294~300. [6] 张 志 红, 李 华 兴, 韦 翔 华, 刘 序, 彭 桂 香. 生 物 肥 料 对 香 蕉 枯 萎 病 及 土 壤 微 生 物 的 影 响, 生 态 环 境 2008,17(6): [7] 张 志 红, 冯 宏, 肖 相 政, 李 华 兴. 生 物 肥 防 治 香 蕉 枯 萎 病 及 对 土 壤 微 生 物 多 样 性 的 影 响. 果 树 学 报 2010,27(4): 575~579. 试 验 负 责 史 怀 试 验 人 员 肖 马 云

16 11 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [201123] 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 动 态 ( 一 ) 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 负 责 : 史 怀 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

17 12 1. 试 验 目 的 香 蕉 枯 萎 病 又 名 香 蕉 巴 拿 马 病 黄 叶 病, 是 由 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 引 起 的 维 管 束 坏 死 的 一 种 毁 灭 性 真 菌 病 害 和 典 型 的 土 传 病 害, 是 国 际 检 疫 对 象 [1] 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 属 于 半 知 菌, 肉 座 目, 镰 刀 菌 属 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 4 个 生 理 小 种, 生 理 小 种 4 号 几 乎 能 侵 染 所 有 香 蕉 品 种, 是 目 前 香 蕉 栽 培 品 种 的 主 要 威 胁, 我 [2] 国 香 蕉 枯 萎 病 主 要 由 生 理 小 种 4 号 侵 染 引 起 淡 紫 拟 青 霉 [Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson] 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deu-teromycotina), 丝 孢 纲 (Hyphomycetes), 丝 孢 目 (Hyphomycetales), 丛 梗 孢 科 (Moniliaceae), 拟 青 霉 属 (Paecilomyees Balnier), 国 内 外 很 多 研 究 人 员 对 这 种 生 防 菌 的 生 物 防 治 应 用 作 了 广 泛 研 究, 史 怀 等 报 道 淡 紫 拟 青 霉 多 糖 对 尖 孢 镰 刀 菌 有 明 显 抑 制 作 用, 他 们 筛 选 到 的 淡 紫 拟 青 霉 菌 株 NH - PL -03, 其 胞 内 外 多 糖 对 尖 孢 镰 刀 菌 的 菌 丝 生 长 及 孢 子 萌 发 均 有 明 显 的 抑 制 作 用, 抑 制 能 力 随 多 糖 浓 度 的 提 高 而 增 强, 显 示 了 良 好 的 生 防 潜 力, 这 为 尖 孢 镰 刀 的 生 物 防 治 提 供 了 新 3 思 路 本 试 验 室 筛 选 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 株 对 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 好 的 抑 制 作 用 [3], 但 缺 乏 对 该 菌 株 在 香 蕉 根 际 和 根 围 定 殖 能 力 和 对 香 蕉 枯 萎 病 防 治 应 用 的 了 解, 类 似 的 研 究 也 少 见 报 道 成 功 的 生 物 防 治 依 赖 于 对 生 防 菌 病 原 物 和 寄 主 植 物 相 互 关 系 的 彻 底 了 解 在 植 物 病 害 生 防 实 践 中, 生 防 菌 被 引 人 土 壤 时, 往 往 会 受 到 土 壤 抑 菌 作 用 及 生 防 菌 与 植 物 根 部 亲 和 能 力 的 影 响, 这 是 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 防 效 不 稳 定 的 重 要 原 因 之 一 因 此, 作 为 生 防 因 子 的 生 防 菌 能 否 在 靶 植 物 根 际 定 殖 生 长 已 成 为 筛 选 评 定 土 传 病 害 生 防 菌 的 一 个 重 要 指 标, 并 最 终 决 定 该 生 防 菌 的 开 发 利 用 潜 力 [4] 本 研 究 通 过 评 价 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 根 基 定 殖 能 力, 为 香 蕉 枯 萎 病 菌 提 供 理 论 依 据 2. 试 验 方 法 2.1. 供 试 材 料 供 试 菌 株 : 生 防 菌 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 香 蕉 枯 萎 病 病 原 菌 FJAT-3076 为 尖 孢 镰 刀 菌, 由 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 微 生 物 中 心 提 供 香 蕉 苗, 生 长 情 况 一 致 的 4-5 叶 期 的 香 蕉 苗 2.2 试 验 方 法 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 在 GUJS-50 AUTOBIO 型 自 动 机 械 搅 拌 不 锈 钢 发 酵 罐 发 酵 8 天, 发 酵 后 发 酵 液 孢 子 浓 度 为 cfu/ml 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 的 制 备 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 9041 发 酵 10 天 的 发 酵 液 与 锯 末 和 谷 壳 混 合 成 的 基 质 混 合, 淡 紫 拟 青 霉 9041 与 基 质 的 比 例 为 1:4, 混 合 均 匀 后 常 温 下 保 存 镰 刀 菌 FJAT-3076 菌 液 的 制 备 活 化 培 养 用 PDA 培 养 基, 菌 液 用 PDA 液 体 培 养 基,30 度 摇 床 180 转 试 验 处 理

18 13 试 验 设 以 下 处 理 处 理 1 只 施 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 2 先 施 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041,7 天 后 接 种 香 蕉 镰 刀 菌 FJAT-3076 处 理 3 同 时 施 用 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 和 接 种 香 蕉 枯 萎 病 菌 FJAT-3076 处 理 6 只 接 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 接 种 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 孢 子 悬 浮 液 浓 度 为 cfu/ml, 生 物 肥 药 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 浓 度 为 cfu/g, 与 施 用 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 后 8 天 开 始 分 离 不 同 处 理 的 根 际 土 壤, 每 7 天 分 离 一 次 每 个 处 理 25 株 香 蕉 苗, 每 株 一 盆 香 蕉 枯 萎 病 菌 FJAT-3076 制 好 的 发 酵 液, 浓 度 为 cfu/ml, 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 9041 浓 度 生 物 肥 药 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 浓 度 为 cfu/g, 镰 刀 菌 用 伤 根 法 接 入, 每 株 苗 接 40-50ml 菌 液, 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 9041 和 土 壤 的 比 例 为 1:10, 混 合 均 匀 后 施 入 每 隔 7 天 后 分 离 淡 紫 拟 青 霉 的 定 殖 动 态 菌 株 定 殖 测 定 方 法 每 次 取 样 采 用 5 点 取 样 法, 随 机 取 5 株, 采 取 5 株 的 根 际 土 壤 混 合 在 一 起, 称 量 10g, 各 处 理 平 板 测 定 设 四 次 重 复 淡 紫 拟 青 霉 在 香 蕉 根 基 土 壤 中 的 定 殖 测 定 挖 取 植 株 根 围 附 近 土 壤 作 为 根 基 土, 称 取 1 份 10g 土 样, 将 土 样 加 10ml 无 菌 水 振 荡 混 匀, 稀 释 适 当 倍 数 后 取 200ul 涂 板 菌 落 形 成 单 位 数 ( 个 /g)= 每 平 皿 菌 落 平 均 数 * 稀 释 倍 数 *5/ 土 壤 重 量 3. 试 验 结 果 表 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 不 同 1 天 7 天 14 天 21 天 28 天 处 理 (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g)

19 14 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 定 殖 量 (cfu/g) 天 7 天 14 天 21 天 28 天 时 间 ( 天 ) 图 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 香 蕉 移 栽 前 分 离 土 壤, 没 有 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 香 蕉 移 栽 后 1 天 在 接 种 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 各 处 理 中 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 分 离 到 的 淡 紫 拟 青 霉 菌 落 初 期 呈 白 色 隆 起, 菌 丝 致 密, 后 菌 落 变 粉 红 色, 经 形 态 鉴 定 为 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 移 栽 1 天 后 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 定 殖 量 分 别 为 cfu/g cfu/g;28 天 后 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 定 殖 量 分 别 为 cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g,14 天 处 理 6 中 淡 紫 拟 青 霉 的 定 殖 量 最 高,14 天 后 处 理 1 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 定 殖 量 开 始 高 于 其 他 处 理 以 下 是 淡 紫 拟 青 霉 在 不 同 处 理 香 蕉 盆 栽 苗 不 同 时 间 的 照 片 处 理 1 1 天 cfu/g cfu/g 处 理 2 1 天 cfu/g cfu/g 处 理 3 1 天 cfu/g

20 15 处 理 6 1 天 cfu/g 处 理 1 7 天 cfu/g 处 理 2 7 天 cfu/g 处 理 3 7 天 cfu/g 处 理 6 7 天 cfu/g cfu/g 处 理 1 14 天 cfu/g 处 理 2 14 天 cfu/g 处 理 3 14 天 cfu/g cfu/g 处 理 6 14 天 cfu/g 处 理 1 21 天 cfu/g 处 理 2 21 天 cfu/g cf 处 理 3 21 天 cfu/g 处 理 6 21 天 cfu/g 处 理 1 28 天 cfu/g 处 理 2 28 天

21 16 处 理 3 28 天 cfu/g 处 理 6 28 天 cfu/g 图 2 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 4. 试 验 讨 论 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 移 栽 1 天 后 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 定 殖 量 分 别 为 cfu/g cfu/g;28 天 后 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 定 殖 量 分 别 为 cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g,14 天 处 理 6 中 淡 紫 拟 青 霉 的 定 殖 量 最 高,14 天 后 处 理 1 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 定 殖 量 开 始 高 于 其 他 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 和 生 物 肥 药 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 较 孢 子 液 浇 灌 的 施 入 方 式 能 使 菌 株 在 围 香 蕉 土 壤 中 有 相 对 高 的 存 活 量, 而 液 体 流 状 物 的 形 式 容 易 在 土 壤 中 淋 溶 散 失, 不 利 于 长 期 存 活 可 能 由 于 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 的 形 式 提 供 给 菌 株 以 介 质 的 固 着, 相 对 稳 定 的 留 存 在 土 壤 基 质 中, 这 样 有 利 于 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 对 土 传 病 害 的 长 效 控 制 5. 参 考 文 献 [1] 卓 国 豪, 黄 有 宝, 吴 运 新 等. 香 蕉 枯 萎 病 的 综 合 防 治 技 术 [ J]. 植 物 检 疫, 2003, 17( 5) : [2] 王 文 华, 王 葵 娣, 曾 会 才. 香 蕉 枯 萎 病 的 危 害 及 其 防 治 策 略 [J]. 广 西 热 带 农 业, 2007, 3: [3] 李 晓 杰, 徐 树 兰, 汤 历. 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 盆 栽 防 效 的 测 定 [J]. 广 东 农 业 科 学,2005 年 第 5 期 [4] 祝 明 亮, 夏 振 远, 张 克 勤, 李 天 飞, 刘 杏 忠. 淡 紫 拟 青 霉 在 烤 烟 根 际 定 殖 能 力 分 析 [J]. [5] 炳 欣, 张 平, 陈 晓 斌. 影 响 引 入 微 生 物 根 部 定 殖 的 因 素 J]. 应 用 生 态 学 报,2000, 11(6):951 一 953. [6] 成 儒 萍, 肖 炎 农. 淡 紫 拟 青 霉 在 作 物 根 围 及 土 壤 中 的 定 殖 研 究, 植 物 病 理 学. [7] 刘 杏 忠, 文 敏, 张 东 升. 定 殖 于 大 豆 胞 囊 线 虫 的 淡 紫 拟 青 霉 生 物 学 特 性 研 究 [J] 中 国 生 物 防 治, 1995,11(2):70 一 74. [8] 孙 漫 红, 刘 杏 忠. 淡 紫 拟 青 霉 在 大 豆 根 际 的 定 殖 对 根 际 微 生 物 的 影 响 [l]. 微 生 物 学 通 报,1995,

22 17 25(3):133 一 136 [9] 罗 明, 单 娜 娜, 文 起 凯 等. 几 种 固 沙 植 物 根 际 土 壤 微 生 物 特 性 研 究 [l]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报, 2002,8(6):618 一 622 [10] 苏 涛, 司 美 茹, 马 宗 琪. 不 同 土 地 利 用 方 式 对 根 际 土 壤 微 生 物 数 量 的 影 响. 农 业 环 境 科 学 学 报, 2006,25( 增 刊 ):136 一 139 [11] 徐 瑞 富, 陆 宁 海, 张 定 法 等. 土 壤 不 同 微 生 物 量 对 木 霉 菌 定 殖 的 影 响 和 木 霉 菌 生 态 学 习 性 研 究 [J]. 中 国 生 态 农 业 学 报,2007,15(1):207 一 2008 试 验 负 责 史 怀 试 验 人 员 肖 马 云

23 18 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ ] 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 动 态 ( 二 ) 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 负 责 : 史 怀 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

24 19 1. 试 验 目 的 香 蕉 枯 萎 病 又 名 香 蕉 巴 拿 马 病 黄 叶 病, 是 由 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 引 起 的 维 管 束 坏 死 的 一 种 毁 灭 性 真 菌 病 害 和 典 型 的 土 传 病 害, 是 国 际 检 疫 对 象 [1] 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 属 于 半 知 菌, 肉 座 目, 镰 刀 菌 属 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 4 个 生 理 小 种, 生 理 小 种 4 号 几 乎 能 侵 染 所 有 香 蕉 品 种, 是 目 前 香 蕉 栽 培 品 种 的 主 要 威 胁, 我 [2] 国 香 蕉 枯 萎 病 主 要 由 生 理 小 种 4 号 侵 染 引 起 淡 紫 拟 青 霉 [Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson] 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deu-teromycotina), 丝 孢 纲 (Hyphomycetes), 丝 孢 目 (Hyphomycetales), 丛 梗 孢 科 (Moniliaceae), 拟 青 霉 属 (Paecilomyees Balnier), 国 内 外 很 多 研 究 人 员 对 这 种 生 防 菌 的 生 物 防 治 应 用 作 了 广 泛 研 究, 史 怀 等 报 道 淡 紫 拟 青 霉 多 糖 对 尖 孢 镰 刀 菌 有 明 显 抑 制 作 用, 他 们 筛 选 到 的 淡 紫 拟 青 霉 菌 株 NH - PL -03, 其 胞 内 外 多 糖 对 尖 孢 镰 刀 菌 的 菌 丝 生 长 及 孢 子 萌 发 均 有 明 显 的 抑 制 作 用, 抑 制 能 力 随 多 糖 浓 度 的 提 高 而 增 强, 显 示 了 良 好 的 生 防 潜 力, 这 为 尖 孢 镰 刀 的 生 物 防 治 提 供 了 新 3 思 路 本 试 验 室 筛 选 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 株 对 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 好 的 抑 制 作 用 [3], 但 缺 乏 对 该 菌 株 在 香 蕉 根 际 和 根 围 定 殖 能 力 和 对 香 蕉 枯 萎 病 防 治 应 用 的 了 解, 类 似 的 研 究 也 少 见 报 道 成 功 的 生 物 防 治 依 赖 于 对 生 防 菌 病 原 物 和 寄 主 植 物 相 互 关 系 的 彻 底 了 解 在 植 物 病 害 生 防 实 践 中, 生 防 菌 被 引 人 土 壤 时, 往 往 会 受 到 土 壤 抑 菌 作 用 及 生 防 菌 与 植 物 根 部 亲 和 能 力 的 影 响, 这 是 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 防 效 不 稳 定 的 重 要 原 因 之 一 因 此, 作 为 生 防 因 子 的 生 防 菌 能 否 在 靶 植 物 根 际 定 殖 生 长 已 成 为 筛 选 评 定 土 传 病 害 生 防 菌 的 一 个 重 要 指 标, 并 最 终 决 定 该 生 防 菌 的 开 发 利 用 潜 力 [4] 本 研 究 通 过 评 价 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 根 基 定 殖 能 力, 为 香 蕉 枯 萎 病 菌 提 供 理 论 依 据 2. 试 验 方 法 2.1. 供 试 材 料 供 试 菌 株 : 生 防 菌 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 香 蕉 枯 萎 病 病 原 菌 FJAT-3076 为 尖 孢 镰 刀 菌, 由 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 微 生 物 中 心 提 供 香 蕉 苗, 生 长 情 况 一 致 的 4-5 叶 期 的 香 蕉 苗 2.2 试 验 方 法 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 在 GUJS-50 AUTOBIO 型 自 动 机 械 搅 拌 不 锈 钢 发 酵 罐 发 酵 8 天, 发 酵 后 发 酵 液 孢 子 浓 度 为 cfu/ml 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 的 制 备 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 9041 发 酵 10 天 的 发 酵 液 与 锯 末 和 谷 壳 混 合 成 的 基 质 混 合, 淡 紫 拟 青 霉 9041 与 基 质 的 比 例 为 1:4, 混 合 均 匀 后 常 温 下 保 存 镰 刀 菌 FJAT-3076 菌 液 的 制 备 活 化 培 养 用 PDA 培 养 基, 菌 液 用 PDA 液 体 培 养 基,30 度 摇 床 180 转 试 验 处 理

25 20 试 验 设 以 下 处 理 处 理 1 只 施 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 2 先 施 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041,7 天 后 接 种 香 蕉 镰 刀 菌 FJAT-3076 处 理 3 同 时 施 用 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 和 接 种 香 蕉 枯 萎 病 菌 FJAT-3076 处 理 6 只 接 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 接 种 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 孢 子 悬 浮 液 浓 度 为 cfu/ml, 生 物 肥 药 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 浓 度 为 cfu/g, 与 施 用 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 后 8 天 开 始 分 离 不 同 处 理 的 根 际 土 壤, 每 7 天 分 离 一 次 每 个 处 理 25 株 香 蕉 苗, 每 株 一 盆 香 蕉 枯 萎 病 菌 FJAT-3076 制 好 的 发 酵 液, 浓 度 为 cfu/ml, 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 9041 浓 度 生 物 肥 药 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 浓 度 为 cfu/g, 镰 刀 菌 用 伤 根 法 接 入, 每 株 苗 接 40-50ml 菌 液, 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 9041 和 土 壤 的 比 例 为 1:10, 混 合 均 匀 后 施 入 每 隔 7 天 后 分 离 淡 紫 拟 青 霉 的 定 殖 动 态 菌 株 定 殖 测 定 方 法 每 次 取 样 采 用 5 点 取 样 法, 随 机 取 5 株, 采 取 5 株 的 根 际 土 壤 混 合 在 一 起, 称 量 10g, 各 处 理 平 板 测 定 设 四 次 重 复 淡 紫 拟 青 霉 在 香 蕉 根 基 土 壤 中 的 定 殖 测 定 挖 取 植 株 根 围 附 近 土 壤 作 为 根 基 土, 称 取 1 份 10g 土 样, 将 土 样 加 10ml 无 菌 水 振 荡 混 匀, 稀 释 适 当 倍 数 后 取 200ul 涂 板 菌 落 形 成 单 位 数 ( 个 /g)= 每 平 皿 菌 落 平 均 数 * 稀 释 倍 数 *5/ 土 壤 重 量 3. 试 验 结 果 表 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 不 同 35 天 42 天 60 天 90 天 处 理 (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) 图 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖

26 21 定 殖 量 (cfu/g) 天 42 天 60 天 90 天 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 时 间 ( 天 ) 图 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 各 处 理 中 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉, 分 离 到 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 落 初 期 呈 白 色 隆 起, 菌 丝 致 密, 后 菌 落 变 粉 红 色, 经 形 态 鉴 定 为 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 移 栽 后 35 天 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 量 为 cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g;90 天 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 量 为 cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g, 期 间 在 42 天 和 60 天 有 些 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 定 殖 量 有 些 下 降,90 天 的 定 殖 量 略 有 上 升 以 下 是 淡 紫 拟 青 霉 在 不 同 处 理 香 蕉 盆 栽 苗 不 同 时 间 的 照 片 处 理 1 35 天 cfu/g 处 理 2 35 天 cfu/g 处 理 3 35 天 cfu/g

27 22 处 理 6 35 天 cfu/g 处 理 1 42 天 cfu/g 处 理 2 42 天 cfu/g 处 理 3 42 天 cfu/g 处 理 6 42 天 cfu/g 处 理 1 60 天 cfu/g 处 理 2 60 天 cfu/g 处 理 3 60 天 cfu/g 处 理 6 60 天 cfu/g 处 理 1 90 天 cfu/g 处 理 2 90 天 cfu/g 处 理 3 90 天 cfu/g 处 理 6 90 天 cfu/g

28 23 图 2 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 4. 试 验 讨 论 各 处 理 中 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉, 分 离 到 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 落 初 期 呈 白 色 隆 起, 菌 丝 致 密, 后 菌 落 变 粉 红 色, 经 形 态 鉴 定 为 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 移 栽 后 35 天 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 量 为 cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g;90 天 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 量 为 cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g, 期 间 在 42 天 和 60 天 有 些 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 定 殖 量 有 些 下 降,90 天 的 定 殖 量 略 有 上 升 以 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 和 生 物 肥 药 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 在 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 能 力 总 趋 势 随 时 间 的 延 长 而 降 低, 以 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 施 入 再 分 离 所 测 定 的 生 物 量 较 孢 子 液 浇 灌 大,90d 后 菌 株 以 生 物 肥 药 拌 土 和 菌 液 浇 灌 在 香 蕉 根 围 土 壤 的 存 活 量 分 别 在 10 6 级 的 数 量 级, 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 拌 土 的 形 式 较 利 于 菌 株 在 土 壤 中 的 长 期 存 活 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 和 生 物 肥 药 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 较 孢 子 液 浇 灌 的 施 入 方 式 能 使 菌 株 在 围 香 蕉 土 壤 中 有 相 对 高 的 存 活 量, 而 液 体 流 状 物 的 形 式 容 易 在 土 壤 中 淋 溶 散 失, 不 利 于 长 期 存 活 可 能 由 于 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 的 形 式 提 供 给 菌 株 以 介 质 的 固 着, 相 对 稳 定 的 留 存 在 土 壤 基 质 中, 这 样 有 利 于 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 对 土 传 病 害 的 长 效 控 制 5. 参 考 文 献 [1] 卓 国 豪, 黄 有 宝, 吴 运 新 等. 香 蕉 枯 萎 病 的 综 合 防 治 技 术 [ J]. 植 物 检 疫, 2003, 17( 5) : [2] 王 文 华, 王 葵 娣, 曾 会 才. 香 蕉 枯 萎 病 的 危 害 及 其 防 治 策 略 [J]. 广 西 热 带 农 业, 2007, 3: [3] 李 晓 杰, 徐 树 兰, 汤 历. 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 盆 栽 防 效 的 测 定 [J]. 广 东 农 业 科 学,2005 年 第 5 期 [4] 祝 明 亮, 夏 振 远, 张 克 勤, 李 天 飞, 刘 杏 忠. 淡 紫 拟 青 霉 在 烤 烟 根 际 定 殖 能 力 分 析 [J]. [5] 炳 欣, 张 平, 陈 晓 斌. 影 响 引 入 微 生 物 根 部 定 殖 的 因 素 J]. 应 用 生 态 学 报,2000, 11(6):951 一 953. [6] 成 儒 萍, 肖 炎 农. 淡 紫 拟 青 霉 在 作 物 根 围 及 土 壤 中 的 定 殖 研 究, 植 物 病 理 学. [7] 刘 杏 忠, 文 敏, 张 东 升. 定 殖 于 大 豆 胞 囊 线 虫 的 淡 紫 拟 青 霉 生 物 学 特 性 研 究 [J] 中 国 生 物 防 治, 1995,11(2):70 一 74. [8] 孙 漫 红, 刘 杏 忠. 淡 紫 拟 青 霉 在 大 豆 根 际 的 定 殖 对 根 际 微 生 物 的 影 响 [l]. 微 生 物 学 通 报,1995, 25(3):133 一 136 [9] 罗 明, 单 娜 娜, 文 起 凯 等. 几 种 固 沙 植 物 根 际 土 壤 微 生 物 特 性 研 究 [l]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报, 2002,8(6):618 一 622

29 24 [10] 苏 涛, 司 美 茹, 马 宗 琪. 不 同 土 地 利 用 方 式 对 根 际 土 壤 微 生 物 数 量 的 影 响. 农 业 环 境 科 学 学 报, 2006,25( 增 刊 ):136 一 139 [11] 徐 瑞 富, 陆 宁 海, 张 定 法 等. 土 壤 不 同 微 生 物 量 对 木 霉 菌 定 殖 的 影 响 和 木 霉 菌 生 态 学 习 性 研 究 [J]. 中 国 生 态 农 业 学 报,2007,15(1):207 一 2008 试 验 负 责 史 怀 试 验 人 员 肖 马 云

30 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 60 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 及 结 果 分 析 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1. 20% % % % % 1%. 5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%. 10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%. 15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%. 20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%. 25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%. 30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%. 35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%. 40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%. 45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%. 50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%. 55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%. 60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%. 65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%. 70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%. 75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%. 80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%. 85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%. 90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%. 95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%. 100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

31 26 1 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 微 生 物 细 胞 组 分 中 一 种 稳 定 而 富 有 的 重 要 成 分, 它 和 细 菌 的 遗 传 变 异 毒 力 耐 药 性 等 有 极 为 密 切 的 关 系, 它 的 种 类 和 含 量 是 细 胞 化 分 类 法 的 重 要 依 据 之 一 [1] 气 相 色 谱 分 析 技 术 能 快 速 [2 3] 灵 敏 精 确 地 检 测 出 细 菌 细 胞 内 的 脂 肪 酸, 是 一 种 重 要 的 化 学 分 类 途 径 脂 肪 酸 的 提 取 方 法 是 由 MIDI 公 司 提 供 主 要 步 骤 分 为 获 菌, 皂 化, 甲 基 化, 萃 取, 洗 涤 五 个 部 分, 据 相 关 文 献 简 绍 获 菌 量 是 影 响 脂 肪 酸 种 类 和 含 量 的 主 要 因 素, 因 此, 本 实 验 对 影 响 取 脂 肪 酸 鉴 定 的 获 菌 量 进 行 了 研 究 2 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlock MIDI) 2.2 材 料 标 准 菌 株 编 号 :8754,8755,8756,8757,8758,8759,8760,8761,8762,8763,8764,8765,8766,8767, 8768,8769,8770,8771,8772,8773. 实 验 设 计 : 对 这 21 株 标 准 菌 株 的 获 菌 量 以 MIDI 系 统 提 供 的 40 毫 克 为 基 础, 左 右 各 取 两 个 值 进 行 设 置, 分 别 为 20,30,40,50,60 五 个 梯 度 本 实 验 先 以 获 菌 量 为 40 毫 克 进 行 研 究 2.3 脂 肪 酸 提 取 前 处 理 试 剂 试 剂 一 :NaOH 45g+ 甲 醇 150 ml + 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 二 :6.00N 盐 酸 325 ml + 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 三 : 正 己 烷 200ML+MTBE()200ML, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 四 :NaOH 10.8g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900ML. 2.4 提 取 步 骤 菌 株 的 培 养 将 NA 平 板 上 的 菌 株 接 种 到 TSBA 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24h 提 取 步 骤 : 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 毫 克 芽 孢 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 耐 酸 耐 碱 管 中 加 入 1.0ML 试 剂 1, 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5. 10s, 水 浴 5min, 从 沸 水 浴 中 移 出 耐 酸 耐 碱 管 并 轻 微 冷 却, 震 荡 5. 10s, 在 水 浴 25min, 取 出 室 温 冷 却 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 酯 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 试 剂 2 2ML, 拧 紧 盖 子, 震 荡 5. 10s,80 水 浴 10min, 移 开 且 快 速 用 流 动 的 自 来 水 冷 却 至 室 温 萃 取 ( 甲 基 酯 脂 肪 酸 从 酸 性 水 相 移 出 转 移 到 一 个 有 机 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25ML 的 试 剂 3 萃 取 溶 剂, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 10min, 打 开 盖 子, 用 干 净 的 移 液 管 取 出 下 层

32 27 似 水 部 分, 弃 去 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 ) 加 入 3.0ML 试 剂 4, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 5min, 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 取 2/3 体 积 的 上 层 有 机 相 到 干 净 的 GC 检 测 小 瓶 ( 此 过 程 要 小 心, 宁 可 少 取 有 机 相, 绝 不 可 吸 入 水 相, 否 则 会 损 坏 色 谱 仪 的 色 谱 柱 ) 2.5 上 样 测 定 脂 肪 酸 2.6 数 据 库 比 对 3 试 验 结 果 1) 实 验 结 果 见 错 误! 未 找 到 引 用 源 2) 测 试 所 的 结 果 如 表 1 表 1 菌 株 编 号 SI 值 MIDI 检 测 结 果 Bacillus-subtilis 8755d Bacillus-atrophaeus 8757d Bacillus-badius 8760d 0.88 Bacillus-cereus-GC subgroup A 8761d Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8771d Bacillus-licheniformis (Bacillus subtilis group) 8756d Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8758d Bacillus-subtilis 8774d 0.59 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8754d Bacillus-subtilis 8762d Geobacillus-stearothermophilus-GC subgroup A (55C, Bacillus) 8764d Bacillus-subtilis 8766d Bacillus-sphaericus-GC subgroup D 8768d 0.74 Staphylococcus-cohnii-cohnii 8769d Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8770d Bacillus-cereus-GC subgroup A 8772d Arthrobacter-globiformis-GC subgroup A (some 48h) 8773d Bacillus-alcalophilus (some 48h) 菌 株 编 号 SI 值 MIDI 检 测 结 果 8754e Bacillus-subtilis 8755e Bacillus-atrophaeus 8757e Bacillus-badius 8760e Bacillus-cereus-GC subgroup A 8761e Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus)

33 e Bacillus-licheniformis (Bacillus subtilis group) 8756e Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8758e Bacillus-subtilis 8774e Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8754e Bacillus-subtilis 8762e Geobacillus-stearothermophilus-GC subgroup B (55C, Bacillus) 8764e Bacillus-subtilis 8766e Bacillus-sphaericus-GC subgroup D 8768e Staphylococcus-cohnii-cohnii 8770e Bacillus-cereus-GC subgroup A 8772e Arthrobacter-globiformis-GC subgroup A (some 48h) 4 试 验 讨 论 从 下 图 可 以 看 出 SI 值 小 于 0.5 的 菌 株 有 2 株, 根 据 MIDI 中 提 到 的 当 SI 值 在 0.5~0.3 之 间, 则 表 明 第 一 选 择 与 第 二 选 择 分 开, 鉴 定 可 能 成 功, 但 是 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 为 非 典 型 的 菌 株 当 SI 值 小 于 时, 则 认 为 该 菌 株 不 存 在 于 数 据 库 中, 所 以 菌 株 8762 可 能 数 据 库 中 没 有 该 菌 株, 通 过 检 查 数 据 库 发 现 数 据 库 中 确 实 没 有 标 准 菌 株, 通 过 本 实 验 可 以 说 明 MIDI 鉴 定 系 统 的 准 确 率 较 好 图 1 不 同 菌 量 与 SI 值 比 较 5 参 考 文 献 [1] 张 国 赏, 吴 文 鹃, 潘 仁 瑞. 气 相 色 谱 一 质 谱 法 检 测 细 胞 脂 肪 酸 及 其 在 细 菌 鉴 定 上 的 应 用 [J]. 合 肥 联 合 大 学 学 报.2000,10(4): [2] ROSE D P, CONNOLLY J M. Omega 一 3 fatty acids as cancer chemo. preventive agents [J].

34 29 Pharmacol Therap.1999,83: [3] 黄 伟 坤. 食 品 检 验 与 分 析 [M]. 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社.2000:23. 试 验 负 责 : 林 营 志 试 验 人 员 : 王 子 旋

35 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 50 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 及 结 果 分 析 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1. 20% % % % % 1%. 5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%. 10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%. 15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%. 20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%. 25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%. 30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%. 35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%. 40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%. 45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%. 50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%. 55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%. 60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%. 65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%. 70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%. 75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%. 80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%. 85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%. 90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%. 95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%. 100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

36 31 1 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 微 生 物 细 胞 组 分 中 一 种 稳 定 而 富 有 的 重 要 成 分, 它 和 细 菌 的 遗 传 变 异 毒 力 耐 药 性 等 有 极 为 密 切 的 关 系, 它 的 种 类 和 含 量 是 细 胞 化 分 类 法 的 重 要 依 据 之 一 [1] 气 相 色 谱 分 析 技 术 能 快 速 [2 3] 灵 敏 精 确 地 检 测 出 细 菌 细 胞 内 的 脂 肪 酸, 是 一 种 重 要 的 化 学 分 类 途 径 脂 肪 酸 的 提 取 方 法 是 由 MIDI 公 司 提 供 主 要 步 骤 分 为 获 菌, 皂 化, 甲 基 化, 萃 取, 洗 涤 五 个 部 分, 据 相 关 文 献 简 绍 获 菌 量 是 影 响 脂 肪 酸 种 类 和 含 量 的 主 要 因 素, 因 此, 本 实 验 对 影 响 取 脂 肪 酸 鉴 定 的 获 菌 量 进 行 了 研 究 2 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlock MIDI) 2.2 材 料 标 准 菌 株 编 号 :8754,8755,8756,8757,8758,8759,8760,8761,8762,8763,8764,8765,8766,8767, 8768,8769,8770,8771,8772,8773. 实 验 设 计 : 对 这 21 株 标 准 菌 株 的 获 菌 量 以 MIDI 系 统 提 供 的 40 毫 克 为 基 础, 左 右 各 取 两 个 值 进 行 设 置, 分 别 为 20,30,40,50,60 五 个 梯 度 本 实 验 先 以 获 菌 量 为 40 毫 克 进 行 研 究 2.3 脂 肪 酸 提 取 前 处 理 试 剂 试 剂 一 :NaOH 45g+ 甲 醇 150 ml + 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 二 :6.00N 盐 酸 325 ml + 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 三 : 正 己 烷 200ML+MTBE()200ML, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 四 :NaOH 10.8g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900ML. 2.4 提 取 步 骤 菌 株 的 培 养 将 NA 平 板 上 的 菌 株 接 种 到 TSBA 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24h 提 取 步 骤 : (1) 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 毫 克 芽 孢 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 (2) 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 耐 酸 耐 碱 管 中 加 入 1.0ML 试 剂 1, 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5. 10s, 水 浴 5min, 从 沸 水 浴 中 移 出 耐 酸 耐 碱 管 并 轻 微 冷 却, 震 荡 5. 10s, 在 水 浴 25min, 取 出 室 温 冷 却 (3) 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 酯 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 试 剂 2 2ML, 拧 紧 盖 子, 震 荡 5. 10s,80 水 浴 10min, 移 开 且 快 速 用 流 动 的 自 来 水 冷 却 至 室 温 (4) 萃 取 ( 甲 基 酯 脂 肪 酸 从 酸 性 水 相 移 出 转 移 到 一 个 有 机 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25ML 的 试 剂 3 萃 取 溶 剂, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 10min, 打 开 盖 子, 用 干 净 的 移 液 管 取 出 下 层

37 32 似 水 部 分, 弃 去 (5) 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 ) 加 入 3.0ML 试 剂 4, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 5min, 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 取 2/3 体 积 的 上 层 有 机 相 到 干 净 的 GC 检 测 小 瓶 ( 此 过 程 要 小 心, 宁 可 少 取 有 机 相, 绝 不 可 吸 入 水 相, 否 则 会 损 坏 色 谱 仪 的 色 谱 柱 ) 2.5 上 样 测 定 脂 肪 酸 2.6 数 据 库 比 对 3 试 验 结 果 3) 实 验 结 果 见 错 误! 未 找 到 引 用 源 4) 测 试 所 的 结 果 如 表 1 表 2 菌 株 编 号 SI 值 MIDI 检 测 结 果 Bacillus-subtilis 8755d Bacillus-atrophaeus 8757d Bacillus-badius 8760d 0.88 Bacillus-cereus-GC subgroup A 8761d Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8771d Bacillus-licheniformis (Bacillus subtilis group) 8756d Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8758d Bacillus-subtilis 8774d 0.59 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8754d Bacillus-subtilis 8762d Geobacillus-stearothermophilus-GC subgroup A (55C, Bacillus) 8764d Bacillus-subtilis 8766d Bacillus-sphaericus-GC subgroup D 8768d 0.74 Staphylococcus-cohnii-cohnii 8769d Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8770d Bacillus-cereus-GC subgroup A 8772d Arthrobacter-globiformis-GC subgroup A (some 48h) 8773d Bacillus-alcalophilus (some 48h) 4 试 验 讨 论 从 下 图 可 以 看 出 SI 值 小 于 0.5 的 菌 株 有 3 株, 根 据 MIDI 中 提 到 的 当 SI 值 在 0.5~0.3 之 间, 则 表 明 第 一 选 择 与 第 二 选 择 分 开, 鉴 定 可 能 成 功, 但 是 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 为 非 典 型 的 菌 株 当 SI 值 小 于 时, 则 认 为 该 菌 株 不 存 在 于 数 据 库 中, 所 以 菌 株 8762,8773 可 能 数 据 库 中 没 有 该 菌 株, 通 过 检 查 数 据 库 发 现 数 据 库 中 确 实 没 有 标 准 菌 株 8773(Bacillus massilienis), 通 过 本 实 验 可 以 说 明 MIDI

38 33 鉴 定 系 统 的 准 确 率 较 好 图 2 不 同 菌 量 与 SI 值 比 较 5 参 考 文 献 张 国 赏, 吴 文 鹃, 潘 仁 瑞 气 相 色 谱 一 质 谱 法 检 测 细 胞 脂 肪 酸 及 其 在 细 菌 鉴 定 上 的 应 用 [J] 合 肥 联 合 大 学 学 报 2000,10(4): ROSE D P,CONNOLLY J M.Omega 一 3 fatty acids as cancer chemo. preventive agents [J].Pharmacol Therap.1999,83: 黄 伟 坤 食 品 检 验 与 分 析 [M] 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社.2000:23 试 验 负 责 : 林 营 志 试 验 人 员 : 王 子 旋

39 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 40 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1. 20% % % % % 1%. 5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%. 10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%. 15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%. 20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%. 25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%. 30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%. 35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%. 40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%. 45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%. 50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%. 55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%. 60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%. 65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%. 70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%. 75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%. 80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%. 85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%. 90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%. 95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%. 100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

40 35 1 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 微 生 物 细 胞 组 分 中 一 种 稳 定 而 富 有 的 重 要 成 分, 它 和 细 菌 的 遗 传 变 异 毒 力 耐 药 性 等 有 极 为 密 切 的 关 系, 它 的 种 类 和 含 量 是 细 胞 化 分 类 法 的 重 要 依 据 之 一 [1] 气 相 色 谱 分 析 技 术 能 快 速 [2 3] 灵 敏 精 确 地 检 测 出 细 菌 细 胞 内 的 脂 肪 酸, 是 一 种 重 要 的 化 学 分 类 途 径 脂 肪 酸 的 提 取 方 法 是 由 MIDI 公 司 提 供 主 要 步 骤 分 为 获 菌, 皂 化, 甲 基 化, 萃 取, 洗 涤 五 个 部 分, 据 相 关 文 献 简 绍 获 菌 量 是 影 响 脂 肪 酸 种 类 和 含 量 的 主 要 因 素, 因 此, 本 实 验 对 影 响 取 脂 肪 酸 鉴 定 的 获 菌 量 进 行 了 研 究 2 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlock MIDI) 2.2 材 料 标 准 菌 株 编 号 :8754,8755,8756,8757,8758,8759,8760,8761,8762,8763,8764,8765,8766,8767, 8768,8769,8770,8771,8772,8773. 实 验 设 计 : 对 这 21 株 标 准 菌 株 的 获 菌 量 以 MIDI 系 统 提 供 的 40 毫 克 为 基 础, 左 右 各 取 两 个 值 进 行 设 置, 分 别 为 20,30,40,50,60 五 个 梯 度 本 实 验 先 以 获 菌 量 为 40 毫 克 进 行 研 究 2.3 脂 肪 酸 提 取 前 处 理 试 剂 试 剂 一 :NaOH 45g+ 甲 醇 150 ml + 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 二 :6.00N 盐 酸 325 ml + 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 三 : 正 己 烷 200ML+MTBE()200ML, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 四 :NaOH 10.8g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900ML. 2.4 提 取 步 骤 菌 株 的 培 养 将 NA 平 板 上 的 菌 株 接 种 到 TSBA 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24h 提 取 步 骤 : 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 毫 克 芽 孢 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 耐 酸 耐 碱 管 中 加 入 1.0ML 试 剂 1, 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5. 10s, 水 浴 5min, 从 沸 水 浴 中 移 出 耐 酸 耐 碱 管 并 轻 微 冷 却, 震 荡 5. 10s, 在 水 浴 25min, 取 出 室 温 冷 却 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 酯 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 试 剂 2 2ML, 拧 紧 盖 子, 震 荡 5. 10s,80 水 浴 10min, 移 开 且 快 速 用 流 动 的 自 来 水 冷 却 至 室 温 萃 取 ( 甲 基 酯 脂 肪 酸 从 酸 性 水 相 移 出 转 移 到 一 个 有 机 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25ML 的 试 剂 3 萃 取 溶 剂, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 10min, 打 开 盖 子, 用 干 净 的 移 液 管 取 出 下 层

41 36 似 水 部 分, 弃 去 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 ) 加 入 3.0ML 试 剂 4, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 5min, 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 取 2/3 体 积 的 上 层 有 机 相 到 干 净 的 GC 检 测 小 瓶 ( 此 过 程 要 小 心, 宁 可 少 取 有 机 相, 绝 不 可 吸 入 水 相, 否 则 会 损 坏 色 谱 仪 的 色 谱 柱 ) 2.5 上 样 测 定 脂 肪 酸 2.6 数 据 库 比 对 3 试 验 结 果 5) 实 验 结 果 见 错 误! 未 找 到 引 用 源 6) 测 试 所 的 结 果 如 表 1 表 3 菌 株 编 号 SI 值 MIDI 检 测 结 果 8755c Bacillus. atrophaeus 8757c Bacillus. badius 8760c Bacillus. cereus. GC subgroup A 8761c Virgibacillus. pantothenticus (Bacillus) 8771c Bacillus. licheniformis (Bacillus subtilis group) 8756c 0.53 Brevibacillus. parabrevis. GC subgroup B 8758c 0.67 Bacillus. subtilis 8774c Virgibacillus. pantothenticus (Bacillus) 8754c Bacillus. subtilis 8762c Hyphomonas. hirschiana 8764c Bacillus. subtilis 8768c Staphylococcus. cohnii. cohnii 8769c Brevibacillus. parabrevis. GC subgroup B 8770c Bacillus. cereus. GC subgroup A 8772c Arthrobacter. globiformis. GC subgroup A (some 48h) 8773c Bacillus. sphaericus. GC subgroup D 4 试 验 讨 论 从 下 图 可 以 看 出 SI 值 小 于 0.5 的 菌 株 有 2 株, 根 据 MIDI 中 提 到 的 当 SI 值 在 0.5~0.3 之 间, 则 表 明 第 一 选 择 与 第 二 选 择 分 开, 鉴 定 可 能 成 功, 但 是 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 为 非 典 型 的 菌 株 当 SI 值 小 于 时, 则 认 为 该 菌 株 不 存 在 于 数 据 库 中, 所 以 菌 株 8773 可 能 数 据 库 中 没 有 该 菌 株, 通 过 检 查 数 据 库 发 现 数 据 库 中 确 实 没 有 标 准 菌 株 8773(Bacillus massilienis), 通 过 本 实 验 可 以 说 明 MIDI 鉴 定 系 统 的 准 确 率 较 好

42 37 图 3 不 同 菌 量 与 SI 值 比 较 5 参 考 文 献 张 国 赏, 吴 文 鹃, 潘 仁 瑞 气 相 色 谱 一 质 谱 法 检 测 细 胞 脂 肪 酸 及 其 在 细 菌 鉴 定 上 的 应 用 [J] 合 肥 联 合 大 学 学 报 2000,10(4): ROSE D P,CONNOLLY J M.Omega 一 3 fatty acids as cancer chemo. preventive agents [J].Pharmacol Therap.1999,83: 黄 伟 坤 食 品 检 验 与 分 析 [M] 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社.2000:23 试 验 负 责 : 林 营 志 试 验 人 员 : 王 子 旋

43 38 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 河 南 土 壤 标 本 中 芽 孢 杆 菌 的 分 离 与 保 存 ( ) 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2010 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

44 39 1 试 验 目 的 土 壤 是 微 生 物 的 丰 富 来 源, 是 寻 找 和 发 现 有 重 要 应 用 潜 力 的 微 生 物 的 主 要 菌 源 不 同 土 壤 中 含 的 微 生 物 的 种 类 和 数 量 不 同 [1], 本 实 验 对 个 新 疆 土 样 进 行 了 分 离, 为 了 分 离 芽 孢 杆 菌 本 实 验 选 用 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 本 实 验 采 用 稀 释 平 板 法 从 土 壤 中 分 离 细 菌 并 进 行 分 离 纯 化, 采 用 平 板 计 数 法 统 计 不 同 土 壤 中 各 种 微 生 物 的 含 量 2 试 验 内 容 2.1 材 料 河 南 土 壤 2.2 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 ( 简 称 NA): 牛 肉 浸 膏 3g 蛋 白 胨 5g NaCl 10.0 g 琼 脂 15-20g 水 1000ml ph 仪 器 试 管 锥 形 瓶 150 ml, 移 液 枪, 涂 布 棒, 记 号 笔, 培 养 皿, 振 荡 器, 培 养 箱 2.4 试 验 方 法 土 样 处 理 称 取 10 g 土 壤 至 装 有 90 ml 无 菌 水 的 三 角 瓶, 摇 床 振 荡 15 min 使 之 充 分 溶 解, 在 放 置 到 80 的 水 浴 锅 中 煮 10min, 杀 死 其 他 细 菌 土 壤 原 液 的 配 置 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 ; 平 板 涂 布 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 10~20 s 后, 吸 取 100 μl 至 平 板 上, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 入 平 板 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 细 菌 涂 布 梯 度 : ; 培 养 将 涂 好 的 平 板 用 塑 料 袋 装 好 倒 置 于 恒 温 箱 中 30 培 养 1~2 d; 计 数 统 计 培 养 平 板 上 菌 落 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数, 按 公 式 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数 纯 化 菌 株 采 取 平 板 划 线 分 离 法, 用 接 种 环 在 无 菌 操 作 条 件 下 挑 取 NA 平 板 上 的 单 菌 落 在 新 的 平 板 培 养 基 上 划 线, 划 线 完 毕 后, 盖 上 培 养 皿 盖, 倒 置 于 温 室 培 养 培 养 一 定 时 间 后, 重 复 一 次, 一 直 到 分 离 的 微 生 物 认 为 纯 化 为 止 菌 种 保 藏 对 纯 化 菌 种 编 号 后 拍 照, 提 交 保 种

45 40 3 试 验 结 果 从 河 南 土 壤 中 共 分 离 的 到 26 种 芽 孢 杆 菌, 形 态 描 述 及 数 量 见 错 误! 未 找 到 引 用 源, 分 离 照 片 见 图 1, 纯 化 后 的 照 片 见 图 4 错 误! 未 找 到 引 用 源 细 菌 的 形 态 特 征 土 样 编 号 4 7 菌 株 编 菌 落 描 述 细 菌 含 号 大 小 表 面 颜 色 干 湿 形 状 透 明 度 光 泽 高 低 量 中 褶 皱 中 白 中 干 圆 形 不 透 明 无 凸 起 中 光 滑 灰 白 湿 圆 形 不 透 明 有 隆 起 中 光 滑 灰 白 湿 圆 形 不 透 明 有 隆 起 中 光 滑 白 湿 圆 形 不 透 明 无 隆 起 中 褶 皱 灰 白 干 不 规 则 不 透 明 无 凸 起 中 光 滑 灰 白 湿 圆 形 不 透 明 有 凸 起 中 光 滑 灰 黄 湿 圆 形 不 透 明 有 隆 起 大 光 滑 白 干 不 规 则 不 透 明 无 扁 平 大 光 滑 灰 白 干 不 规 则 不 透 明 无 扁 平 大 光 滑 白 干 圆 形 不 透 明 无 扁 平 大 光 滑 白 干 圆 形 不 透 明 无 扁 平 中 绒 毛 灰 湿 不 规 则 不 透 明 无 扁 平 大 光 滑 灰 湿 不 规 则 不 透 明 有 扁 平 中 光 滑 灰 湿 圆 形 不 透 明 无 隆 起 中 光 滑 灰 黄 湿 圆 形 不 透 明 有 隆 起 中 光 滑 灰 黄 湿 圆 形 不 透 明 有 扁 平 小 光 滑 灰 湿 圆 形 半 透 明 有 扁 平 大 不 光 滑 灰 白 湿 圆 形 不 透 明 无 扁 平 中 光 滑 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 无 扁 平 中 光 滑 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 无 扁 平 大 光 滑 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 有 扁 平 大 绒 毛 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 无 扁 平 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 透 明 有 隆 起 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 透 明 有 扁 平 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 有 中 凹 中 光 滑 灰 黄 湿 近 圆 形 不 透 明 有 扁 平

46 41 FJAT-4-1-( 反 面 ) FJAT-4-1-( 正 面 ) FJAT-7-4-( 反 面 ) FJAT-7-4-( 正 面 ) FJAT-7-4-( 反 面 ) FJAT-7-4-( 正 面 ) FJAT-7-4-( 反 面 ) FJAT-7-4-( 正 面 ) FJAT-7-3-( 反 面 ) FJAT-7-3-( 正 面 ) FJAT-4-1-( 反 面 ) FJAT-4-1-( 正 面 ) FJAT-4-2-( 反 面 ) FJAT-4-2-( 正 面 ) FJAT-4-3-( 反 面 )

47 42 FJAT-4-3-( 正 面 ) FJAT-7-3-( 反 面 ) FJAT-7-3-( 正 面 ) 图 4 土 壤 中 芽 孢 杆 菌 分 离 照 片 FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 )

48 43 FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 )

49 44 FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 )

50 45 FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 )

51 46 FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) 图 2 纯 化 照 片 4 试 验 讨 论 1) 两 个 河 南 土 壤 标 本 分 离 的 到 的 芽 孢 杆 菌 均 较 多, 从 形 态 上 观 察 都 是 一 些 常 见 的 菌 株 2) 从 分 离 纯 化 的 菌 落 照 片 的 形 态 特 征 可 以 看 出 每 种 土 壤 标 本 中 都 含 有 几 种 相 同 的 样 芽 孢 杆 菌, 具 体 是 不 是 一 种 芽 孢 杆 菌 还 需 要 通 过 测 定 脂 肪 酸 来 确 定 5 参 考 文 献 沈 萍, 范 秀 容, 李 广 武. 微 生 物 学 实 验. 高 等 教 育 出 版 社 年. 试 验 负 责 : 林 营 志 试 验 人 员 : 王 子 旋

52 47 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 菌 种 冻 干 保 存 的 实 验 试 验 项 目 : 模 式 芽 胞 杆 菌 真 空 冷 冻 干 燥 保 存 (14201~14205) 试 验 人 员 : 王 子 旋 刘 国 红 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 微 生 物 农 药 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 :

53 48 1 试 验 目 的 本 研 究 的 目 为 收 集 保 藏 现 今 发 现 的 所 有 芽 胞 杆 菌 模 式 菌 株 并 建 立 芽 胞 杆 菌 菌 种 资 源 库, 对 其 进 行 真 空 冷 冻 干 燥 保 存, 供 后 续 研 究 2 试 验 方 法 2.1 材 料 进 品 脱 脂 菌 种 培 养 专 业 奶 粉, 海 藻 糖, 安 瓿 管, 毛 细 滴 管 模 式 菌 株 : 菌 种 名 FJAT 编 号 DMZS 编 号 Bacillus odysseyi Bacillus niacini Paenibacillus lautus Paenibacillus macerans Aneurinibacillus migulanus Ba illus odysseyi 实 验 前 的 准 备 斜 面 培 养 基 准 备 : 准 备 10 ml 试 管, 带 透 气 孔 橡 胶 塞, 洗 净 烘 干 ; 培 养 基 配 置 完 毕 后, 加 热 让 琼 脂 溶 解 混 匀 后 分 装 到 每 个 试 管 中, 每 管 约 3 ml, 灭 菌 后 试 管 一 端 垫 起 移 液 管 一 支, 保 持 倾 斜 即 可 待 试 管 中 的 培 养 基 凝 固 后 用 报 纸 包 好 后 置 常 温 中 备 用 每 次 应 尽 可 能 多 配 置 斜 面 划 线 培 养 : 挑 取 平 板 上 培 养 的 单 菌 落 在 斜 面 培 养 基 上 划 线 后, 放 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 48 小 时 牛 奶 保 护 液 : 重 新 配 置 冻 干 用 牛 奶,25 ml 水 g 奶 粉 (Difco 进 口 脱 脂 菌 种 培 养 专 业 奶 粉 ) g D- 海 藻 糖 (Sigma t5221),115 8 min 灭 菌 后 置 37 培 养 3 days, 检 查 是 否 灭 菌 彻 底 ( 如 染 菌 生 长, 牛 奶 会 变 干 结 块 ), 检 验 无 菌 后 置 4 冰 箱 备 用 灭 菌 后 通 常 为 白 色 略 带 黄 色, 奶 粉 和 海 藻 糖 应 4 低 温 保 存 使 用 的 三 角 瓶 和 纱 布 应 先 行 灭 菌, 应 按 批 次 分 装 小 瓶 安 瓿 管 : 安 瓿 管 内 径 6 mm, 壁 厚 1 mm, 外 径 8mm, 半 球 形 底 部, 不 含 半 球 形 长 度 10.5 mm 使 用 前 用 2% 盐 酸 浸 泡 2 hrs, 一 级 蒸 馏 水 冲 洗 浸 泡 至 中 性,60 鼓 风 烘 箱 烘 干 塞 入 内 标 签, 内 标 签 使 用 普 通 打 印 纸 激 光 打 印, 小 六 号 字, 标 记 菌 种 保 存 号 和 制 作 日 期, 切 成 0.8cm 1cm 的 长 方 形 ; 安 瓿 管 口 塞 上 棉 花 5 支 或 10 支 一 组 ( 每 组 对 应 一 个 菌 种 ) 包 扎 湿 热 灭 菌 (121,20 分 钟 );60 鼓 风 烘 干 毛 细 滴 管 : 毛 细 滴 管 粗 端 关 口 塞 上 棉 花, 放 入 大 试 管 中 灭 菌 处 理, 大 试 管 底 部 塞 好 棉 花 ( 避 免 折 断 ), 包 扎 湿

54 49 热 灭 菌 (121,20 分 钟 );60 鼓 风 烘 干 2.3 方 法 斜 面 培 养 菌 落 分 装 步 骤 : 1. 将 所 有 器 具 置 超 净 台 中 灭 菌 30 min 2. 取 斜 面 试 管 一 支, 取 掉 塞 子 3. 吸 取 0.2 ml 保 护 剂, 加 入 斜 面 培 养 试 管 中 4. 用 毛 细 滴 管 轻 轻 刮 取 表 面 菌 苔, 反 复 吹 吸 10 次 混 匀, 制 备 成 均 匀 的 细 胞 悬 液 6. 分 装 : 一 人 轻 轻 吸 取 0.2 ml 菌 液 至 安 瓿 管 中, 另 一 人 用 镊 子 夹 取 棉 花 塞 住 安 瓿 管 的 管 口 7. 将 安 瓿 管 放 置 到 组 培 瓶 中, 组 培 瓶 底 部 预 先 点 上 揉 成 团 的 报 纸, 每 瓶 5 个 菌 株,25 支 安 瓿 管 8. 做 完 实 验 立 刻 将 安 瓿 管 放 入 超 低 温 冰 箱 预 冻 2.4 预 冻 将 插 好 安 瓿 管 的 组 培 瓶 放 入 放 入 -70 冰 箱 预 冻 预 冻 速 度 控 制 在 每 分 钟 下 降 1, 使 样 品 冻 结 到 -35 ~-40, 预 冻 4-5 h 2.5 真 空 干 燥 1. 检 查 冻 干 机 密 封 油 脂 涂 抹 情 况 2. 组 装 冻 干 机, 检 查 所 有 出 气 阀 门, 关 闭 出 排 水 阀 3. 开 启 冻 干 机 4. 开 启 低 温, 降 至 -80, 等 待 5 分 钟 5. 从 超 低 温 冰 箱 将 预 冻 后 的 样 品 迅 速 置 于 已 充 分 预 冷 地 冷 冻 干 燥 机 样 品 舱 内 6. 放 上 顶 盖, 开 启 真 空 泵, 开 始 冷 冻 干 燥, 持 续 8-24 小 时 7. 确 认 冷 冻 干 燥 完 毕 后, 缓 慢 打 开 放 气 阀, 待 压 力 平 衡 后 关 闭 真 空 泵 8. 取 出 样 品 安 瓿 管 置 于 干 燥 器 内, 备 用 9. 关 闭 冷 凝 器 2.6 判 断 冷 冻 干 燥 已 完 成 的 指 标 : 抽 干 的 样 品 体 积 会 缩 小 至 原 来 的 1/3, 呈 现 白 色, 未 干 的 样 品 仍 然 偏 黄 色 冻 干 样 品 的 汗 水 率 应 低 于 10% 安 瓿 管 内 冻 干 物 呈 酥 松 块 状 或 松 散 片 状 可 取 一 支 用 牙 签 捅, 呈 现 干 粉 状 真 空 度 接 近 空 载 时 的 最 高 值 冷 冻 干 燥 机 显 示 的 样 品 温 度 与 舱 内 温 度 接 近 蒸 馏 水 对 照 管 中 的 水 分 已 完 全 挥 发 掉 或 1%~2% 氯 化 钴 的 对 照 管 已 呈 深 蓝 色 2.7 封 口 在 火 焰 上 封 口 2.8 存 放 安 瓿 管 贴 外 标 签, 装 入 菌 种 保 藏 管 ( 保 存 管 底 部 塞 上 棉 花, 安 瓿 管 封 口 处 朝 内 放 置 ), 放 入 保 存 盒, 低 温 避 光 保 藏 同 一 种 菌 的 保 存 管 扎 在 一 起

55 50 3 试 验 结 果 本 次 试 验 做 的 5 株 标 准 菌 株 是 从 DSMZ 购 买 的 标 准 菌 株, 经 涂 板 培 养 后, 确 认 无 污 染 之 后 做 的 真 空 冷 冻 干 燥 保 藏 下 图 为 标 准 菌 株 涂 板 照 片 FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 )

56 51 FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 )

57 52 FJAT ( 反 面 ) FJAT ( 正 面 ) 4 试 验 结 论 实 验 负 责 人 林 营 志 实 验 人 员 王 子 旋 刘 国 红

58 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 大 肠 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

59 54 1. 试 验 目 的 鉴 于 之 前 提 取 的 芽 孢 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 的 质 粒 都 有 RNA 的 污 染, 本 试 验 采 用 天 根 生 物 的 质 粒 提 取 试 剂 盒 来 提 取 重 组 质 粒, 以 求 获 得 纯 度 很 高 的 质 粒, 为 下 一 步 质 粒 标 准 品 的 获 取 奠 定 基 础 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 材 料 插 入 了 大 肠 杆 菌 特 异 性 片 段 的 pmd-18t 质 粒 标 准 品 试 剂 和 仪 器 Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), 大 肠 杆 菌 TaqMan 荧 光 探 针 ( 5 -(FAM)CACTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGC(TAMARA)-3 ), 上 游 引 物 (5 -AATGGCGCATACAAAGAGAAGC-3 ), 下 游 引 物 (5 -GTTGCAGACTCCAATCCGGA-3 ), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 将 大 肠 杆 菌 质 粒 标 准 品 稀 释 到 250.9ng/µl, 经 计 算 拷 贝 数 是 /µl 将 此 样 品 10 倍 倍 比 稀 释, 取 浓 度 , , , , 四 个 梯 度 的 质 粒 标 准 品 进 行 反 应, 绘 制 标 准 曲 线, 每 个 浓 度 设 置 三 个 重 复 反 应 体 系 : 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) x PCR Forward Premier(10 µm) µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) µm*1 荧 光 探 针 溶 液 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)* x DNA 模 板 *3 dh2o( 灭 菌 蒸 馏 水 ) Total *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s

60 55 图 1 反 应 程 序 3. 试 验 结 果 蓝 白 斑 筛 选 结 果 如 下 : 图 2 大 肠 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线

61 56 图 3 大 肠 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 扩 增 曲 线 所 得 到 的 标 准 曲 线 的 方 程 是 y = -3.39x R 2 = E= 试 验 结 论 一 般 认 为 相 关 系 数 (R 2 ) 大 于 0.98, 越 接 近 1, 结 果 可 信 度 越 高, 扩 增 效 率 (E) 在 之 间, 越 接 近 1, 结 果 越 理 想 从 试 验 结 果 中 看 出, 所 得 到 的 标 准 曲 线 方 程 R 2 达 到 了 0.99, 说 明 结 果 具 有 很 高 的 可 信 度, 而 扩 增 效 率 达 到 了 0.98, 也 比 较 理 想 因 此 可 以 进 行 下 一 步 样 品 中 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 测 定 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

62 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 荧 光 定 量 PCR 测 定 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 葡 萄 球 菌 的 数 量 变 化 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

63 58 1. 试 验 目 的 利 用 荧 光 定 量 PCR 的 方 法 对 垫 料 中 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 和 葡 萄 球 菌 进 行 定 量 分 析, 本 实 验 基 于 之 前 提 取 的 五 批 新 店 部 队 猪 场 的 垫 料 总 DNA, 测 定 这 些 垫 料 之 中 上 述 菌 的 数 量, 以 期 获 得 它 们 的 数 量 变 化 规 律, 以 此 说 明 益 生 菌 和 致 病 菌 在 垫 料 之 中 的 定 殖 情 况 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 材 料 见 下 表 表 1 垫 料 样 品 信 息 样 品 采 集 时 间 ( 年. 月. 日 ) 采 集 栏 位 总 DNA 浓 度 (ng/g) 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 7775

64 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 试 剂 和 仪 器 Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 反 应 体 系 见 下 表 : 表 2 反 应 体 系 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) x PCR Forward Premier(10 µm) µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) µm*1 荧 光 探 针 溶 液 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)* x DNA 模 板 *3 dh2o( 灭 菌 蒸 馏 水 ) Total *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s 图 1 反 应 程 序

65 60 3 试 验 结 果 见 下 表 所 示 表 2 所 测 样 本 中 枯 草 芽 孢 杆 菌 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 对 数 值 样 品 采 集 时 间 ( 年. 月. 日 ) 采 集 栏 位 枯 草 芽 孢 杆 菌 拷 贝 数 葡 萄 球 菌 拷 贝 数 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 对 数 值 的 对 数 值 的 对 数 值 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏

66 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 试 验 结 论 从 试 验 结 果 中 看 出, 通 过 蓝 白 斑 筛 选, 所 有 插 入 的 片 段 都 获 得 很 好 的 筛 选 结 果, 准 备 下 一 步 提 取 质 粒 DNA, 来 验 证 是 否 插 入 进 去 了 特 异 性 片 段 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

67 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 枯 草 芽 孢 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

68 63 1. 试 验 目 的 鉴 于 之 前 提 取 的 芽 孢 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 的 质 粒 都 有 RNA 的 污 染, 本 试 验 采 用 天 根 生 物 的 质 粒 提 取 试 剂 盒 来 提 取 重 组 质 粒, 以 求 获 得 纯 度 很 高 的 质 粒, 为 下 一 步 质 粒 标 准 品 的 获 取 奠 定 基 础 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 材 料 插 入 了 枯 草 芽 孢 杆 菌 特 异 性 片 段 的 pmd-18t 质 粒 标 准 品 试 剂 和 仪 器 Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), 枯 草 芽 孢 杆 菌 TaqMan 荧 光 探 针 ( 5 -(HEX)CGGTTTGTCACCGGCAGTCACCT(BHQ1)-3 ), 上 游 引 物 (5 -ACGTCATCCCCACCTTCCT-3 ), 下 游 引 物 (5 -ACGTCATCCCCACCTTCCT-3 ), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 将 枯 草 芽 孢 杆 菌 质 粒 标 准 品 稀 释 到 246.8ng/µl, 经 计 算 拷 贝 数 是 /µl 将 此 样 品 10 倍 倍 比 稀 释, 取 浓 度 , , , , 四 个 梯 度 的 质 粒 标 准 品 进 行 反 应, 绘 制 标 准 曲 线, 每 个 浓 度 设 置 四 个 重 复 反 应 体 系 : 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) x PCR Forward Premier(10 µm) µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) µm*1 荧 光 探 针 溶 液 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)* x DNA 模 板 *3 dh2o( 灭 菌 蒸 馏 水 ) Total *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s

69 64 图 1 反 应 程 序 3 试 验 结 果 蓝 白 斑 筛 选 结 果 如 下 : 图 2 枯 草 芽 孢 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线

70 65 图 3 枯 草 芽 孢 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 扩 增 曲 线 所 得 到 的 标 准 曲 线 的 方 程 是 y = -3.33x R 2 = E= 试 验 结 论 一 般 认 为 相 关 系 数 (R 2 ) 大 于 0.98, 越 接 近 1, 结 果 可 信 度 越 高, 扩 增 效 率 (E) 在 之 间, 越 接 近 1, 结 果 越 理 想 从 试 验 结 果 中 看 出, 所 得 到 的 标 准 曲 线 方 程 R 2 达 到 了 0.99, 说 明 结 果 具 有 很 高 的 可 信 度, 而 扩 增 效 率 达 到 了 0.99, 也 十 分 理 想 因 此 可 以 进 行 下 一 步 样 品 中 枯 草 芽 孢 杆 菌 拷 贝 数 的 测 定 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

71 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 垫 料 中 所 分 离 的 益 生 菌 对 致 病 菌 的 抑 制 效 果 试 验 2 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

72 67 1. 试 验 目 的 芽 孢 杆 菌 如 枯 草 芽 孢 杆 菌, 地 衣 芽 孢 杆 菌, 短 短 芽 孢 杆 菌, 蜡 样 芽 胞 杆 菌 和 多 粘 芽 孢 杆 菌 等 在 生 长 过 程 中 能 产 生 枯 草 菌 素 多 粘 菌 素 制 霉 菌 素 短 杆 菌 素 等 活 性 物 质, 这 些 活 性 物 质 对 致 病 菌 或 内 源 性 感 染 的 条 件 致 病 菌 有 明 显 的 抑 制 作 用, 这 些 益 生 菌 在 动 物 体 内 能 迅 速 消 耗 环 境 中 的 游 离 氧, 造 成 肠 道 低 氧, 促 进 有 益 厌 氧 菌 的 生 长, 并 产 生 乳 酸 等 有 机 酸 类, 降 低 肠 道 PH 值, 间 接 抑 制 其 他 致 病 菌 的 生 长 本 实 验 基 于 这 些 理 论, 来 探 讨 从 垫 料 分 离 得 到 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 和 多 粘 芽 孢 杆 菌, 对 垫 料 中 分 离 的 致 病 菌 的 抑 制 效 果. 鉴 于 之 前 采 用 的 采 用 的 是 单 层 培 养 基 打 孔 法, 本 次 试 验 采 用 滤 纸 片 法 来 检 测 四 种 芽 孢 杆 菌 对 致 病 菌 的 抑 菌 效 果 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 材 料 供 试 菌 株 : 见 表 1 培 养 基 :NA 培 养 基 表 1 试 验 菌 株 菌 株 编 号 Species 中 文 种 名 来 源 采 集 地 点 FJAT-8505 Klebsiella pneumoniae 肺 炎 克 雷 伯 斯 氏 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT-8506 Acinetobacter towneri 不 动 杆 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT-8588 Acinetobacter junii 琼 氏 不 动 杆 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT-8589 Comamonas testosteroni 睾 丸 酮 丛 毛 单 胞 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT-8440 Acinetobacter calcoaceticus 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT Burkholderiales bacterium 伯 克 霍 尔 德 氏 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT Acinetobacter sp. 不 动 杆 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT Staphylococcus epidermidis 表 皮 葡 萄 球 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT Staphylococcus gallinarum 鸡 葡 萄 球 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT Bacillus amyloliquefaciens 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT Bacillus subtilis 枯 草 芽 孢 杆 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT-8349 Brevibacillus brevis 短 短 芽 孢 杆 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT-8464 Salmonella 沙 门 氏 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 FJAT Escherichia coli 大 肠 杆 菌 垫 料 新 店 部 队 主 场 2.2 方 法 四 种 益 生 芽 孢 杆 菌 发 酵 液 的 制 备 将 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 和 多 年 芽 孢 杆 菌 进 行 平 板 划 线 进 行 活 化, 之 后 挑 取 单 菌 落 于 50ml 液 体 NA 培 养 基 中,30,170rpm 培 养 16 小 时 将 发 酵 液 用 20mm 的 无 菌 滤 膜 进 行 过 滤, 从 而 制 备 这 四 种 菌 的 无 菌 发 酵 液 致 病 菌 的 NA 平 板 制 备 挑 取 睾 丸 酮 丛 毛 单 胞 菌 肺 炎 克 雷 伯 斯 氏 菌 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 表 皮 葡 萄 球 菌 鸡 葡 萄 球 菌

73 68 嗜 麦 芽 寡 养 单 胞 菌 中 间 型 苍 白 杆 菌 沙 门 氏 菌 大 肠 杆 菌 的 单 菌 落 于 NA 液 体 培 养 基 中 摇 床 培 养 16 小 时, 将 预 先 制 备 好 的 1.7% 琼 脂 的 NA 固 体 培 养 基 加 热 熔 化, 待 其 冷 却 至 50 左 右 时, 分 别 加 入 上 述 菌 的 培 养 液 ( 每 2ml 加 入 到 100mlNA 培 养 基 中 ), 充 分 摇 匀 后 平 均 倒 入 4 块 培 养 皿 中, 制 备 成 培 养 基 平 板 抑 制 菌 滤 纸 片 的 制 备 将 制 备 好 的 滤 纸 片 放 置 在 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 和 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 的 摇 床 培 养 液 中, 浸 泡 5 分 钟, 用 镊 子 挑 取 单 个 滤 纸 片, 轻 轻 贴 放 到 被 抑 菌 平 板 上 3 试 验 结 果 图 1 对 8505 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 2 对 8505 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 3 对 8506 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 4 对 8506 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 )

74 69 图 5 对 8588 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 6 对 8588 的 抑 制 效 果 ( 反 面 ) 图 7 对 8589 的 抑 制 效 果 ( 白 的 ) 图 8 对 8589 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 9 对 8595 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 10 对 8595 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 )

75 70 图 11 对 8440 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 12 对 8440 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 13 对 8842 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 14 对 8842 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 15 对 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 16 对 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 )

76 71 图 17 对 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 18 对 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 19 对 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 20 对 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 21 对 8464 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 22 对 8464 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 )

77 72 图 23 对 的 抑 制 效 果 表 2 益 生 菌 对 致 病 菌 的 抑 制 效 果 致 病 菌 及 条 件 致 病 菌 对 对 其 抑 制 作 用 的 益 生 菌 肺 炎 克 雷 伯 斯 氏 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 琼 氏 不 动 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 红 球 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 表 皮 葡 萄 球 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 Acinetobacter towneri Acinetobacter sp. 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 沙 门 氏 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 伯 克 霍 尔 徳 氏 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 粘 质 沙 雷 氏 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 睾 丸 酮 从 毛 单 胞 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌

78 73 4 试 验 结 论 从 结 果 发 现, 除 蜡 样 芽 孢 杆 菌 之 外 的 四 种 芽 孢 杆 菌 对 12 种 病 原 菌 都 有 抑 制 效 果 其 中 枯 草 芽 孢 杆 菌 能 够 抑 制 所 有 的 病 原 菌, 短 短 芽 孢 杆 菌 和 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 能 够 抑 制 除 肺 炎 克 雷 伯 斯 氏 菌 之 外 的 所 有 病 原 菌, 地 衣 芽 孢 杆 菌 只 对 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 和 伯 克 霍 尔 徳 氏 菌 有 抑 制 效 果 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

79 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 葡 萄 球 菌 质 粒 标 准 品 的 制 作 和 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

80 75 1. 试 验 目 的 鉴 于 之 前 提 取 的 芽 孢 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 的 质 粒 都 有 RNA 的 污 染, 本 试 验 采 用 天 根 生 物 的 质 粒 提 取 试 剂 盒 来 提 取 重 组 质 粒, 以 求 获 得 纯 度 很 高 的 质 粒, 为 下 一 步 质 粒 标 准 品 的 获 取 奠 定 基 础 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 材 料 大 肠 杆 菌 DH5α,pMD 18-T Vector 试 剂 盒 插 入 了 大 肠 杆 菌 特 异 性 片 段 的 pmd-18t 质 粒 标 准 品 试 剂 和 仪 器 CaCl2(0.1M),75% 甘 油,AMP 母 液 (100mg/ml),IPTG(200mg/ml),X-gal(20mg/ml, 用 二 甲 基 甲 酰 胺 溶 解 ),LB 液 体 培 养 基 (50ml),50ml 离 心 管,5ml 枪 头 氨 苄 抗 性 平 板 (50ug/ml AMP,40ul X-gal,7ul IPTG) 葡 萄 球 菌 插 入 片 段 扩 增 所 需 引 物 : premier1-5 -GGAGGCAGCAGTAGGGAATC ; premier2-5 -CAGTTTCCAATGACCCTCCA Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), 葡 萄 球 菌 TaqMan 荧 光 探 针 ( 5 -(FAM) AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC(TAMARA)-3 ), 上 游 引 物 (5 - GCACATCTTGACGGTACCTAATCA-3 ), 下 游 引 物 (5 - AACGCTTGCCACCTACGTATTAC -3 ), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 葡 萄 球 菌 特 异 性 片 段 的 获 得 体 系 :10 buffer 2.5µl,dNTPs 0.5µl,Taq 酶 0.3µl,ddH 2O 18.7µl, 引 物 (10µM)1µl, 模 板 1µl 程 序 :95 3min,95 30s,57 30s,72 1min,35 个 循 环,72 5min,12 停 止 质 粒 提 取 步 骤 1. 柱 平 衡 步 骤 : 向 吸 附 柱 CP3 中 ( 吸 附 柱 放 入 收 集 管 中 ) 加 入 500µl 的 平 衡 液 BL,12,000 rpm (~13,400 g ) 离 心 1 分 钟, 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液, 将 吸 附 柱 重 新 放 回 收 集 管 中 ( 请 使 用 当 天 处 理 过 的 柱 子 ) 2. 取 1-5 ml 过 夜 培 养 的 菌 液, 加 入 离 心 管 中, 使 用 常 规 台 式 离 心 机,12,000 rpm (~13,400 g ) 离 心 1 分 钟, 尽 量 吸 除 上 清 ( 菌 液 较 多 时 可 以 通 过 多 次 离 心 将 菌 体 沉 淀 收 集 到 一 个 离 心 管 中 ) 3. 向 留 有 菌 体 沉 淀 的 离 心 管 中 加 入 250 µl 溶 液 P1( 请 先 检 查 是 否 已 加 入 RNaseA), 使 用 移 液 器 或 涡 旋 振 荡 器 彻 底 悬 浮 细 菌 沉 淀 注 意 : 如 果 有 未 彻 底 混 匀 的 菌 块, 会 影 响 裂 解, 导 致 提 取 量 和 纯 度 偏 低 4. 向 离 心 管 中 加 入 250 µl 溶 液 P2, 温 和 地 上 下 翻 转 6-8 次 使 菌 体 充 分 裂 解 注 意 : 温 和 地 混 合, 不 要 剧 烈 震 荡, 以 免 打 断 基 因 组 DNA, 造 成 提 取 的 质 粒 中 混 有 基 因 组 DNA 片 断 此 时 菌 液 应 变 得 清 亮 粘 稠, 所 用 时 间 不 应 超 过 5 分 钟, 以 免 质 粒 受 到 破 坏 如 果 未 变 得 清 亮, 可 能 由 于 菌 体 过 多, 裂 解 不 彻 底, 应 减 少 菌 体 量 5. 向 离 心 管 中 加 入 350 µl 溶 液 P3, 立 即 温 和 地 上 下 翻 转 6-8 次, 充 分 混 匀, 此 时 将 出 现 白 色 絮 状 沉 淀 12,000 rpm (~13,400 g ) 离 心 10 分 钟, 此 时 在 离 心 管 底 部 形 成 沉 淀 注 意 :P3 加 入 后 应 立 即 混 合, 避 免 产 生 局 部 沉 淀 如 果 上 清 中 还 有 微 小 白 色 沉 淀, 可 再 次 离 心 后 取 上 清 6. 将 上 一 步 收 集 的 上 清 液 用 移 液 器 转 移 到 吸 附 柱 CP3 中 ( 吸 附 柱 放 入 收 集 管 中 ), 注 意 尽 量 不 要

81 76 吸 出 沉 淀 12,000 rpm (~13,400 g) 离 心 秒, 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液, 将 吸 附 柱 CP3 放 入 收 集 管 中 7. 可 选 步 骤 : 向 吸 附 柱 CP3 中 加 入 500 µl 去 蛋 白 液 PD,12,000 rpm (~13,400 g ) 离 心 秒, 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液, 将 吸 附 柱 CP3 重 新 放 回 收 集 管 中 如 果 宿 主 菌 是 end A + 宿 主 菌 (TG1,BL21, HB101,JM 系 列, ET12567 等 ), 这 些 宿 主 菌 含 有 大 量 的 核 酸 酶, 易 降 解 质 粒 DNA, 推 荐 采 用 此 步 如 果 宿 主 菌 是 enda - 宿 主 菌 (DH5α,TOP10 等 ), 这 步 可 省 略 8. 向 吸 附 柱 CP3 中 加 入 600 ul 漂 洗 液 PW( 请 先 检 查 是 否 已 加 入 无 水 乙 醇 ),12,000 rpm 离 心 30~60 秒, 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液, 将 吸 附 柱 CP3 放 入 收 集 管 中 9. 重 复 操 作 步 骤 将 吸 附 柱 CP3 放 入 收 集 管 中,12,000 rpm 离 心 2 分 钟, 目 的 是 将 吸 附 柱 中 残 余 的 漂 洗 液 去 除 11. 将 吸 附 柱 CP3 置 于 一 个 干 净 的 离 心 管 中, 向 吸 附 膜 的 中 间 部 位 滴 加 ul 洗 脱 缓 冲 液 EB, 室 温 放 置 2 分 钟,12,000 rpm 离 心 2 分 钟 将 质 粒 溶 液 收 集 到 离 心 管 中 荧 光 定 量 标 准 曲 线 绘 制 方 法 将 葡 萄 球 菌 质 粒 标 准 品 稀 释 到 207.8ng/µl, 经 计 算 拷 贝 数 是 /µl 将 此 样 品 10 倍 倍 比 稀 释, 取 浓 度 , , , , 四 个 梯 度 的 质 粒 标 准 品 进 行 反 应, 绘 制 标 准 曲 线, 每 个 浓 度 设 置 四 个 重 复 反 应 体 系 : 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) x PCR Forward Premier(10 µm) µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) µm*1 荧 光 探 针 溶 液 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)* x DNA 模 板 *3 dh2o( 灭 菌 蒸 馏 水 ) Total *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s

82 77 图 1 反 应 程 序 3 试 验 结 果 插 入 了 葡 萄 球 菌 特 异 序 列 的 pmd-18t 重 组 质 粒 的 测 序 结 果 ( 红 色 部 分 表 示 插 入 序 列 ): TGATGAAGATTCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCT TCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGAC GGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC AAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAA GCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTT AATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGA TCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCT TACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCC GCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCT GCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGT TTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGG TTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCG GAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACATAACCCT GATAAATGCTTCAATAATATTGAGAAAAGGAAGAGTATGAGGATTCCACATTTCCGTGTCCGC CCTTATTTCCTCTTTTTTTCGCGCATTGCCTCCCCGGTTGTTGGTCCCCCCCCCATA 表 1 所 测 得 序 列 的 比 对 结 果 Accession Description Total score Query coverage Max ident FR Uncultured Staphylococcus sp. partial 16S rrna gene, clone % 100% FR Uncultured Staphylococcus sp % 100%

83 78 FR FR partial 16S rrna gene, clone 7.2 Uncultured Staphylococcus sp. partial 16S rrna gene, clone 3.9 Staphylococcus aureus subsp. aureus LGA251 complete genome sequence % 100% % 100% 荧 光 定 量 标 准 曲 线 如 下 : 图 2 葡 萄 球 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线

84 79 图 3 葡 萄 球 菌 荧 光 定 量 PCR 扩 增 曲 线 所 得 到 的 标 准 曲 线 的 方 程 是 y = -3.17x R 2 = E= 试 验 结 论 从 测 序 的 比 对 结 果 中 可 以 看 出, 所 插 入 片 段 为 葡 萄 球 菌 属 的 特 异 性 片 段, 说 明 质 粒 标 准 品 构 建 成 功 一 般 认 为 相 关 系 数 (R 2 ) 大 于 0.98, 越 接 近 1, 结 果 可 信 度 越 高, 扩 增 效 率 (E) 在 之 间, 越 接 近 1, 结 果 越 理 想 从 试 验 结 果 中 看 出, 所 得 到 的 标 准 曲 线 方 程 R 2 达 到 了 0.99, 说 明 结 果 具 有 很 高 的 可 信 度, 而 扩 增 效 率 达 到 了 0.98, 也 比 较 理 想 因 此 可 以 进 行 下 一 步 样 品 中 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 测 定 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

85 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 荧 光 定 量 PCR 测 定 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 葡 萄 球 菌 的 数 量 变 化 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

86 81 1. 试 验 目 的 利 用 荧 光 定 量 PCR 的 方 法 对 垫 料 中 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 和 葡 萄 球 菌 进 行 定 量 分 析, 本 实 验 基 于 之 前 提 取 的 五 批 新 店 部 队 猪 场 的 垫 料 总 DNA, 测 定 这 些 垫 料 之 中 上 述 菌 的 数 量, 以 期 获 得 它 们 的 数 量 变 化 规 律, 以 此 说 明 益 生 菌 和 致 病 菌 在 垫 料 之 中 的 定 殖 情 况 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 材 料 见 下 表 表 1 垫 料 样 品 信 息 样 品 采 集 时 间 ( 年. 月. 日 ) 采 集 栏 位 总 DNA 浓 度 (ng/g) 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 5015

87 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 试 剂 和 仪 器 Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 反 应 体 系 见 下 表 : 表 2 反 应 体 系 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) x PCR Forward Premier(10 µm) µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) µm*1 荧 光 探 针 溶 液 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)* x DNA 模 板 *3 dh 2O( 灭 菌 蒸 馏 水 ) Total *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s 图 1 反 应 程 序

88 83 3 试 验 结 果 见 下 表 所 示 表 3 所 测 样 本 中 枯 草 芽 孢 杆 菌 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 对 数 值 样 品 采 集 时 间 ( 年. 月. 日 ) 采 集 栏 位 枯 草 芽 孢 杆 菌 拷 贝 数 葡 萄 球 菌 拷 贝 数 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 对 数 值 的 对 数 值 的 对 数 值 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏 第 十 五 栏 第 十 六 栏 第 一 栏 第 二 栏 第 五 栏 第 八 栏 第 十 二 栏 第 十 四 栏

89 第 十 五 栏 第 十 六 栏 图 1 第 1 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 图 2 第 2 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图

90 85 图 3 第 5 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 图 4 第 8 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图

91 86 图 5 第 12 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 图 6 第 14 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图

92 87 图 7 第 15 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 图 8 第 16 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 4 试 验 结 论 从 试 验 结 果 中 看 出, 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 数 量 要 比 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 高 出 1~2 个 数 量 级, 通 过 两 个 月 的 数 据 变 化 可 以 看 出, 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 数 量 基 本 上 没 有 很 大 变 化, 维 持 在 10 5 到 10 7 的 数 量 级 ; 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 有 比 较 小 的 变 化 幅 度, 但 基 本 上 维 持 在 10 3 到 10 5 的 数 量 级 说 明 在 取 样 的 这 个 阶 段, 这 三 种 菌 基 本 形 成 了 比 较 稳 定 的 群 落 结 构 而 枯 草 芽 孢 杆 菌 作 为 益 生 菌 能 够 在 垫 料 中 稳 定 的 存 在, 不 仅 如 此, 而 且 可 能 很 好 的 抑 制 了 大 肠 杆 菌 和 葡 萄 球 菌 的 繁 殖 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

93 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 :Co 60 照 射 后 无 致 病 力 的 尖 孢 镰 刀 菌 菌 落 形 态 观 察 及 保 存 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

94 89 1. 试 验 目 的 Co 60 γ 射 线 是 一 种 高 能 电 磁 波, 其 诱 发 的 突 变 率 和 射 线 剂 量 直 接 有 关 它 能 产 生 电 离 作 用, 直 接 或 间 接 地 改 变 DNA 结 构 直 接 的 效 应 是 导 致 碱 基 的 化 学 键 脱 氧 核 糖 的 化 学 键 糖 - 磷 酸 相 连 接 的 化 学 键 的 断 裂 ; 间 接 的 效 应 是 电 离 辐 射 使 水 和 有 机 分 子 产 生 自 由 基, 自 由 基 作 用 于 DNA 分 子, 特 别 是 对 嘧 啶 的 作 用 较 强, 可 引 起 缺 失 和 损 伤, 造 成 基 因 突 变, 还 可 引 起 染 色 体 断 裂, 引 起 倒 位 缺 失 [1] 和 易 位 等 畸 变, 从 而 改 变 微 生 物 遗 传 性 状 尖 孢 镰 刀 菌 可 以 引 起 农 作 物 枯 萎 病, 是 世 界 范 围 内 毁 灭 性 的 土 传 病 害, 造 成 损 失 平 均 高 达 20%~80%, 镰 刀 菌 所 有 的 菌 株 都 能 在 土 壤 有 机 质 以 及 多 种 植 物 组 织 中 生 长 并 存 活 多 年, 极 难 彻 底 根 除 经 过 对 镰 刀 菌 多 种 微 生 物 防 治 作 用 的 比 较 研 究 发 现, 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 是 防 效 最 好 最 稳 定 [2] 的 生 防 因 子 之 一 非 致 病 力 镰 刀 菌 应 用 了 弱 株 系 交 互 保 护 作 用, 特 别 是 与 病 原 菌 同 型 的 非 致 病 力 菌 株, 在 根 际 与 致 病 菌 进 行 营 养 和 侵 染 位 点 的 竞 争, 诱 导 植 株 产 生 抗 性, 阻 止 或 延 迟 致 病 菌 的 进 入 和 [3] 繁 殖, 从 而 达 到 防 病 的 效 果 利 用 Co 60 γ 射 线 诱 变 处 理 无 致 病 力 的 尖 孢 镰 刀 菌 ( FJAT-9290), 筛 选 菌 落 形 态 差 异 大 的 菌 株 保 存, 为 进 一 步 的 诱 变 实 验 做 准 备 2. 试 验 方 法 2.1 实 验 材 料 供 试 菌 株 FJAT-9290 即 无 致 病 力 的 尖 孢 镰 刀 菌, 来 自 实 验 室 保 存 的 菌 种 实 验 仪 器 (1) 试 剂 : PDA 液 体 培 养 基 : 每 升 含 马 铃 薯 200g, 半 葡 萄 糖 20g PDA 培 养 基 : 每 升 含 马 铃 薯 200g, 半 葡 萄 糖 20g, 琼 脂 18g, 每 200 毫 升 培 养 基 中 加 入 1mL 40mg/mL 的 硫 酸 链 霉 素 9mL 的 无 菌 水 (2) 仪 器 : 超 净 工 作 台 恒 温 培 养 箱 2.2 试 验 方 法 菌 悬 液 的 制 备 用 接 种 环 刮 取 纯 化 的 菌 丝 放 入 100 ml 的 PDA 液 体 培 养 基 中,150rpm,28 培 养 2d Co 60 照 射 诱 变 方 法 将 菌 悬 液 分 装 在 mm 的 已 灭 菌 的 试 管 中, 用 橡 胶 赛 封 住 依 次 照 射, 剂 量 分 别 为 400Gy 600Gy 800Gy 1100Gy 1400Gy, 一 管 作 为 对 照, 不 接 受 辐 射 平 板 涂 布 (1) 经 过 Co 60 γ 射 线 处 理 后 的 菌 悬 液 分 别 依 次 稀 释 成 对 照 稀 释 成 (2) 分 别 取 100μL 涂 布 于 固 体 基 本 培 养 基 上, 每 个 梯 度 重 复 三 次, 于 28 培 养 箱 中 倒 置 培 养 4d 菌 落 计 数 统 计 培 养 平 板 上 菌 落 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数, 按 公 式 : 每 毫 升 菌 液 中 孢 子 的 数 量 =

95 90 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 菌 株 纯 化 用 灭 菌 的 牙 签 刮 取 菌 落 形 态 变 化 较 大 的 接 于 PDA 平 板 上, 在 28 的 恒 温 培 养 箱 中 培 养 4d 菌 种 保 存 对 纯 化 的 菌 种 编 号 拍 照, 提 交 保 存 3. 试 验 结 果 3.1 菌 落 计 数 对 稀 释 涂 布 的 平 板 进 行 计 数, 计 算 其 死 亡 率, 结 果 见 表 1 稀 释 涂 布 平 板 的 部 分 照 片 见 图 1-4(A: 反 面,B: 正 面 ) 表 1 Co 60 γ 射 线 处 理 后 菌 株 的 致 死 率 Co 60 辐 射 剂 量 (Gy) 菌 落 计 数 死 亡 率 % % % % % 图 1 Co 60 照 射 剂 量 为 1100Gy( 重 复 一 )

96 91 图 2 Co 60 照 射 剂 量 为 1100Gy( 重 复 二 ) 3.2 菌 落 形 态 观 察 挑 出 部 分 纯 化 后 菌 落 形 态 变 化 较 大 的 菌 落 和 对 照 进 行 形 态 描 述 记 录, 结 果 见 表 2 表 3, 菌 落 照 片 见 图 3-11(A: 反 面,B: 正 面 ) 表 2 菌 落 反 面 形 态 菌 株 编 号 菌 落 反 面 形 态 FJAT-9290 整 体 紫 色, 圆 环 比 较 密 集, 圆 环 的 宽 度 窄, 颜 色 逐 渐 变 浅 FJAT-9907 整 体 深 紫, 圆 环 比 较 稀 疏, 宽 度 较 大, 圆 环 紫 黑 FJAT-9946 整 体 紫 黑, 圆 环 稀 疏, 宽 度 较 大, 颜 色 逐 渐 加 深, 边 缘 颜 色 较 浅 FJAT-9976 整 体 紫 色, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 深 紫 FJAT-9997 整 体 浅 紫, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 逐 渐 加 深 FJAT 整 体 紫 色, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 深 紫 FJAT 整 体 紫 色, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 逐 渐 加 深 FJAT 整 体 紫 黑, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 逐 渐 加 深 FJAT 整 体 紫 色, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 增 大, 颜 色 逐 渐 加 深 表 3 菌 落 正 面 形 态 菌 株 编 号 菌 落 正 面 形 态 FJAT-9290 中 心 浅 紫, 四 周 浅 紫 ( 很 小 面 积 ), 菌 丝 稀 疏, 网 状 : 边 缘 很 稀 疏, 菌 丝 呈 絮 状 FJAT-9907 中 心 深 紫, 四 周 浅 紫 ( 大 面 积 ), 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 稀 疏 絮 状, FJAT-9946 中 心 紫 黑, 四 周 紫 红, 菌 丝 很 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 稍 稀 疏, 絮 状 FJAT-9976 中 心 紫 黑, 四 周 紫 色, 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 稀 疏, 絮 状 FJAT-9997 中 心 紫 色, 四 周 淡 紫, 菌 丝 较 浓 密, 网 状 ; 白 色 面 积 大, 边 缘 稀 疏, 由 网 状 变 为 絮 状 FJAT 中 心 紫 黑, 四 周 紫 色, 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 稀 疏, 絮 状 FJAT 中 心 紫 黑, 四 周 紫 色 ( 小 面 积 ), 网 状 ; 白 色 菌 丝 很 稀 疏, 絮 状 FJAT 中 心 紫 黑, 四 周 浅 紫 ( 小 面 积 ), 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 很 稀 疏, 稀 疏 FJAT 中 心 紫 黑, 四 周 紫 色, 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 由 网 状 到 絮 状

97 92 图 3 FJAT-9290 菌 落 图 片 图 4 FJAT-9907 菌 落 图 片

98 93 图 5 FJAT-9946 菌 落 图 片 图 6 FJAT-9997 菌 落 图 片

99 94 图 7 FJAT 菌 落 图 片 图 8 FJAT 菌 落 图 片

100 95 图 9 FJAT 菌 落 图 片 图 10 FJAT-9976 菌 落 图 片 图 11 FJAT 菌 落 图 片 4. 试 验 讨 论 1, 由 表 1 可 知, 菌 悬 液 经 不 同 剂 量 的 Co 60 γ 射 线 诱 变 处 理 后, 死 亡 率 随 着 诱 变 剂 量 的 增 加 逐 渐 增 大, 在 1100Gy 时 死 亡 率 达 到 最 高, 为 98.95% 2, 不 同 剂 量 的 诱 变 处 理, 观 察 纯 化 后 的 菌 落 形 态, Gy 对 比 未 诱 变 的 菌 株, 菌 落 形 态 几 乎 没 有 差 异, 故 挑 选 诱 变 剂 量 1100Gy 和 1400Gy 的 纯 化 菌 株 保 存 观 察 菌 落 的 形 态, 与 对 照 比 较, 整 体 上 诱 变 后 的 菌 落 颜 色 变 深, 菌 丝 变 得 浓 密 3, 单 因 素 的 诱 变 处 理 获 得 诱 变 菌 株 的 可 能 性 很 小, 因 此 通 过 Co 60 γ 射 线 处 理 后 挑 选 出 的 菌 株 需 要 进 一 步 采 用 多 种 理 化 因 素 循 环 处 理, 例 如 高 温, 紫 外 等 诱 变 方 式

101 参 考 文 献 [1] 曹 友 声, 刘 仲 敏. 现 代 工 业 微 生 物 学 [M]. 长 沙 : 湖 南 科 学 技 术 出 版 社,1998. [2]Fuchs L.G.,Moenne Loccoz Y.,Delagu G. Nonpathogenic Fusarium oxysporum strain Fo47 induces resistance to Fusarium wilt in tomoto[j].plant Disease,1997,81: [3] 蓝 江 林, 朱 育 菁, 肖 荣 凤 等. 培 养 基 对 尖 孢 镰 刀 菌 非 致 病 力 菌 株 281 产 孢 量 的 影 响 [J]. 中 国 农 学 通 报,2007,23(9). 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 詹 洪

102 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 从 三 种 不 同 植 株 上 分 离 到 的 真 菌 的 分 子 鉴 定 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

103 98 1. 试 验 目 的 鉴 定 真 菌 的 方 法 很 多, 传 统 的 真 菌 分 类 方 法 是 以 真 菌 菌 株 的 形 态 学 特 征 生 长 特 征 以 及 生 理 生 化 指 标 为 基 础 对 某 一 未 知 真 菌 的 鉴 定, 以 上 指 标 所 耗 费 的 长, 工 作 繁 琐 而 且 某 些 真 菌 属 种 之 间 的 形 态 学 生 理 生 化 特 征 差 异 不 显 著, 形 态 学 和 生 长 特 征 经 常 受 到 环 境 因 素 的 影 响, 要 采 用 传 统 的 方 法 对 这 些 真 菌 进 行 鉴 定 分 类 有 一 定 的 难 度 随 着 分 子 生 物 学 和 生 物 信 息 学 等 相 关 学 科 的 迅 速 发 展, 一 系 列 分 子 生 物 学 方 法 逐 渐 被 应 用 到 真 菌 的 分 类 鉴 定 中 大 分 子 rrna 及 其 基 因 rdna 已 被 作 为 一 个 分 子 指 标, 广 泛 的 应 用 到 真 菌 的 分 类 的 鉴 定 中 利 用 ITS 进 行 菌 种 鉴 定 是 目 前 较 多 采 用 的 方 法 ITS 是 内 源 转 录 间 隔 区 (Internal Transcribed Spacer) 的 英 文 缩 写, 位 于 rrna 编 码 基 因 18S,5.8S 和 28S 之 间 的 小 基 因 片 段 其 优 点 有 : 具 有 高 拷 贝 数, 整 个 序 列 的 长 度 在 600~800bp, 利 用 rdna 通 用 引 物 能 够 很 容 易 被 扩 增 出 来 ; 同 时 包 含 保 守 与 变 异 序 列, 能 根 据 保 守 序 列 中 的 变 异 位 点 设 计 特 殊 引 物 进 行 特 异 性 扩 增 比 较,rRNA 基 因 (rdna) 在 微 [1] 生 物 的 鉴 定 应 用 中, 具 有 检 测 微 生 物 种 水 平 的 多 态 性 特 征 本 实 验 用 ITS4 和 ITS5 作 为 引 物, 对 从 三 种 不 同 植 株 中 获 取 的 7 株 真 菌 进 行 鉴 定 2. 试 验 方 法 2.1 实 验 材 料 供 试 菌 株 ( 菌 株 来 源 见 表 1) 表 1 供 试 菌 株 的 来 源 序 号 菌 株 编 号 来 源 采 样 地 1 FJAT-9851 发 病 空 心 菜 福 建 漳 州 2 FJAT-9852 发 病 空 心 菜 福 建 漳 州 3 FJAT-9853 发 病 空 心 菜 福 建 漳 州 4 FJAT-9862 发 病 莲 雾 叶 福 建 漳 州 5 FJAT-9863 发 病 莲 雾 叶 福 建 漳 州 6 FJAT-9865 发 病 莲 雾 叶 福 建 漳 州 7 FJAT-9866 健 康 番 茄 福 建 福 州 实 验 仪 器 (1) 试 剂 :PDA 培 养 基 : 每 升 含 马 铃 薯 200g, 半 葡 萄 糖 20g, 琼 脂 18g, 每 200 毫 升 培 养 基 中 加 入 1mL 40mg/mL 的 硫 酸 链 霉 素 无 菌 水 dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 引 物 1500 bpmaker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 : 超 净 工 作 台 离 心 机 Biometra 梯 度 PCR 仪 BIO-RAD 电 泳 仪 UVP 凝 胶 成 像 仪 2.2 实 验 方 法 菌 株 的 活 化 于 -80 冰 箱 中 取 出 保 存 的 菌 株, 在 PDA 平 板 上 划 线 培 养 3d 后, 用 灭 菌 的 牙 签 挑 取 菌 丝 插 入 PDA 平 板 上 培 养 3d

104 DNA 的 提 取 ( 采 用 尿 素 提 取 法 ) (1) 称 取 150mg 研 磨 的 菌 丝 样 品 与 1.5mL 灭 菌 的 离 心 管 中, 加 入 800μL 尿 素 提 缓 冲 液 (7 mol/l Urea,50mmol/L Tris-HCl PH8.0,62.5mmol/L NaCl),160μL 20%SDS, 用 力 震 荡 摇 匀 后,12000r/min 离 心 5min (2) 将 上 清 液 移 入 到 另 一 个 新 的 离 心 管 中, 12000r/min 再 次 离 心 5min, 再 次 吸 取 上 清 液 到 新 的 离 心 管 中, 加 入 等 提 及 的 苯 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 溶 液 ( 体 积 比 为 25:24:1, 吸 下 层 ), 用 力 震 荡 上 下 颠 倒 混 匀,12000r/min 离 心 5min (3) 取 上 清 液 到 新 的 离 心 管 中 加 入 等 体 积 的 异 丙 醇 和 1/10 体 积 的 3mol/L 的 NaAC 溶 液 (PH5.2), -20 放 置 20min (4)12000r/min 离 心 5min, 弃 上 清 夜, 放 置 使 管 壁 液 体 流 尽 (5) 加 70% 无 水 乙 醇 漂 洗 两 次 使 DNA 沉 淀,12000r/min 离 心 1min, 弃 上 清 液 室 温 风 干 挥 发 乙 醇, 加 入 50μL 灭 菌 水 溶 解, 放 置 4 冰 箱 过 夜 溶 解 (6)-20 保 存 PCR 扩 增 (1) 扩 增 体 系 ddw:37.5μl ; Buffer:5μL; dntp:1μl ITS4:2μL; ITS5:2μL L; Taq:0.5μL DNA:2μL (2) 扩 增 程 序 94, 预 变 性 5min; 94 变 性 1min, 55 退 火 30 s, 72 延 伸 1min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 5min 3. 试 验 结 果 3.1 ITS 区 扩 增 结 果 供 试 菌 株 的 核 糖 体 DNA ITS 区 扩 增 结 果 如 图 1 所 示, 泳 道 编 号 1~7 为 所 扩 增 的 结 果 1 号 和 4 号 菌 株 无 条 带, 和 7 号 菌 株 均 扩 增 出 单 一 条 带, 大 小 在 500~600bp 之 间

105 100 图 1 供 试 菌 株 的 PCR 扩 增 图 谱 泳 道 编 号 1~7 为 表 1 中 所 列 菌 株 ;M:1500bp DNA ladder; +: 阳 性 对 照 ;-: 阴 性 对 照 3.2 ITS 区 序 列 测 定 结 果 测 序 结 果 显 示, 序 列 长 度 580~603bp 不 等, 菌 株 碱 基 编 码 序 列 如 下 所 示 2 号 :FJAT ttcctcccgg cttttgatat gcttaagttc agcgggtatt cctacctgat ccgaggtcaa 61 cattcagaag ttgggggttt aacggcttgg ccgcgccgcg ttccagttgc gagggtttta 121 ctactacgca atggaggctg cagcgagacc gccactagat ttcggggccg gcttgccgca 181 agggctcgcc gatccccaac accaaacccg agggcttgag ggttgaaatg acgctcgaac 241 aggcatgccc gccagaatac tggcgggcgc aatgtgcgtt caaagattcg atgattcact 301 gaattctgca attcacatta cttatcgcat tttgctgcgt tcttcatcga tgccagaacc 361 aagagatccg ttgttgaaag ttttgattta tttatggttt tactcagaag ttacatatag 421 aaacagagtt taggggtcct ctggcgggcc gtcccgtttt accgggagcg ggctgatccg 481 ccgaggcaac aagtggtatg ttcacagggg tttgggagtt gtaaactcgg taatgatccc 541 tccgctggtt caccaacgga gaccttgtta cgatttttta ct 3 号 :FJAT ttcctccgct tattgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac 61 cttagtaaaa ttgggggttt tacggctaga gtccctccga atcccaatgc gagacgaaat 121 gttactacgc aaaggaggct ccgagagggt ccgccactac ctttaagggc ctacgtcaac 181 cgtagagccc caacaccaag cagagcttga gggttgaaat gacgctcgaa caggcatgcc 241 cgccagaatg ctggcgggcg caatgtgcgt tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc 301 aattcacatt acttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg atgccagaac caagagatcc 361 gttgttaaaa gttttgatta tttgcttgtg tcactcagaa gaaacgtcgt taaatcagag 421 tttggttatc ctccggcggg cgccccaccc gcggacggga gagggccggg agacgtcctt 481 tttaggggac gcctacccgc cgaagcaaca gttaaggtat gttcacaaag ggttgatgag 541 cggtaactca gtaatgatcc ctccgctggt tcaccaacgg agaccttgtt acgacttttt 601 act

106 101 5 号 :FJAT atatgcttaa gttcagcggg tattcctacc tgatccgagg tcaacctttg gaaaattggg 61 gggttttacg gcaagagtcc ctccggatcc cagtgcgaga cgtaaagtta ctacgcaaag 121 gaggctccgg gagggtccgc cactaccttt gagggcctac atcagctgta gggccccaac 181 accaagcaga gcttgagggt tgaaatgacg ctcgaacagg catgcccgcc agaatgctgg 241 cgggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg attcactgaa ttctgcaatt cacattactt 301 atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc cagaaccaag agatccgttg ttaaaagttt 361 tgattatttg cttgtaccac tcagaagaaa cgtcgttaaa tcagagtttg gttatcctcc 421 ggcgggcgcc gacccgcccg gaggcgggag gccgggaggg tcgcggagac cctacccgcc 481 gaagcaacag ttataggtat gttcacaaag ggttatagag cgtaaactca gtaatgatcc 541 ctccgctggt tcaccaacgg agaccttgtt acgatttttt act 6 号 :FJAT ttcctccggc ttttgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac 61 ctttggaaaa ttggggggtt ttacggcaag agtccctccg gatcccagtg cgagacgtaa 121 agttactacg caaaggaggc tccgggaggg tccgccacta cctttgaggg cctacatcag 181 ctgtagggcc ccaacaccaa gcagagcttg agggttgaaa tgacgctcga acaggcatgc 241 ccgccagaat gctggcgggc gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg 301 caattcacat tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgccagaa ccaagagatc 361 cgttgttaaa agttttgatt atttgcttgt accactcaga agaaacgtcg ttaaatcaga 421 gtttggttat cctccggcgg gcgccgaccc gcccggaggc gggaggccgg gagggtcgcg 481 gagaccctac ccgccgaagc aacagttata ggtatgttca caaagggtta tagagcgtaa 541 actcagtaat gatccctccg ctggttcacc aacggagacc ttgttacgat ttttact 7 号 :FJAT ttcctccggc ttttgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac 61 attcagaagt tgggggttta acggcttggc cgcgccgcgt tccagttgcg agggttttac 121 tactacgcaa tggaggctgc agcgagaccg ccactagatt tcggggccgg cttgccgcaa 181 gggctcgccg atccccaaca ccaaacccga gggcttgagg gttgaaatga cgctcgaaca 241 ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc aaagattcga tgattcactg 301 aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt ttgctgcgtt cttcatcgat gccagaacca 361 agagatccgt tgttgaaagt tttgatttat ttatggtttt actcagaagt tacatataga 421 aacagagttt aggggtcctc tggcgggccg tcccgtttta ccgggagcgg gctgatccgc 481 cgaggcaaca agtggtatgt tcacaggggt ttgggagttg taaactcggt aatgatccct 541 ccgctggttc accaacggag accttgttac gatttttact 3.3 测 序 结 果 与 GenBank 核 酸 序 列 数 据 库 进 行 同 源 性 比 较 将 所 得 序 列 在 GenBank 核 酸 序 列 数 据 库 中 进 行 同 源 序 列 搜 索 根 据 真 菌 的 分 子 分 类 原 则, 认 为 通 过 ITS 区 域 比 对, 序 列 相 似 性 99%, 即 鉴 别 为 相 同 种 ; 序 列 相 似 性 大 于 95% 且 小 于 99%, 鉴 别 为 相 同 属 ; 序 列 相 似 性 95%, 鉴 别 为 相 同 科 比 较 结 果 见 表 2

107 102 表 2 与 GenBank 核 酸 序 列 数 据 库 进 行 同 源 性 比 对 的 结 果 序 号 菌 株 编 号 结 果 2 FJAT-9852 Gibberella moniliformis( 串 珠 赤 霉 菌 ) 3 FJAT-9853 Colletotrichum truncatum( 大 豆 炭 疽 病 菌 ) 5 FJAT-9863 Glomerella cingulata( 炭 疽 病 菌 ) 6 FJAT-9865 Glomerella cingulata( 炭 疽 病 菌 ) 7 FJAT-9866 Gibberella moniliformis( 串 珠 赤 霉 菌 ) 4. 试 验 讨 论 (1) 图 1 可 知,1 号 和 4 号 菌 株 在 泳 道 中 无 条 带 显 示, 这 可 能 是 扩 增 的 产 物 浓 度 过 低 造 成 的, 具 体 的 原 因 有 待 检 测 (2)3 号 菌 株 即 FJAT-9853 分 离 自 空 心 菜,5 号 和 6 号 菌 株 即 FJAT-9863 和 FJAT-9865 均 分 离 自 莲 雾 病 叶 这 三 株 菌 均 为 炭 疽 病 菌 炭 疽 菌 属 真 菌 是 一 类 全 球 性 分 布 的 植 物 病 原 菌, 特 别 是 在 热 带 亚 热 带 引 起 谷 类 水 果 蔬 菜 等 多 种 作 物 在 采 收 前 后 发 生 炭 疽 病, 导 致 很 大 的 经 济 损 失 故 此 推 测 炭 疽 病 菌 可 能 是 导 致 空 心 菜 和 莲 雾 发 病 的 原 因 之 一 (3)2 号 和 7 号 菌 株 即 FJAT-9852 和 FJAT-9866 分 别 分 离 自 发 病 的 空 心 菜 和 健 康 的 番 茄, 两 株 菌 均 为 串 珠 赤 霉 菌 串 珠 赤 霉 菌 是 串 珠 镰 刀 菌 的 有 性 态, 串 珠 镰 刀 菌 易 造 成 植 株 的 根 腐 和 茎 基 腐, 还 能 引 起 顶 腐 穗 腐 等 症 状 5.. 参 考 文 献 [1] 朱 研 研, 王 耀 耀, 付 美 红 等. 真 菌 分 类 鉴 定 研 究 进 展 [J]. 河 北 化 工,2010,33(4). 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 詹 洪

108 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 漳 州 香 蕉 枯 萎 病 植 株 根 际 土 壤 中 芽 孢 杆 菌 的 分 离 与 保 存 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

109 试 验 目 的 土 壤 是 一 种 极 其 复 杂, 具 有 自 身 来 源 和 自 身 发 展 历 史 的 有 机 自 然 物, 是 微 生 物 的 天 然 培 养 基 土 壤 中 不 仅 有 微 生 物 的 存 在, 而 且 形 形 色 色, 种 类 繁 多 主 要 包 括 细 菌 真 菌 放 线 菌 藻 类 和 原 [1] 生 动 物 其 中, 细 菌 占 最 大 量, 其 次 是 真 菌, 它 们 的 作 用 也 最 盛 芽 孢 杆 菌 具 有 代 谢 快 繁 殖 快, 生 命 力 强 体 积 大 等 特 征 芽 孢 杆 菌 4 小 时 增 殖 10 万 倍, 而 标 准 菌 4 小 时 仅 可 繁 殖 6 倍 ; 无 湿 状 态 可 耐 低 温 -60 耐 高 温 +280, 耐 强 酸 耐 强 碱 抗 菌 消 毒 耐 高 氧 耐 低 氧 ; 体 积 比 一 般 病 源 菌 分 子 大 4 倍 数, 占 据 空 间 优 势, 抑 制 有 害 菌 的 生 长 繁 殖 本 实 验 中 的 土 壤 样 本 是 分 别 从 健 康 和 患 香 蕉 枯 病 的 植 株 根 际 采 集 的, 且 植 株 的 发 病 程 度 逐 渐 加 深 香 蕉 枯 萎 病 (Banana vasicular wilt) 也 称 巴 拿 马 病, 是 一 种 国 内 检 疫 性 毁 灭 性 病 害,1904 年 [2] 在 美 国 夏 威 夷 首 次 发 现, 现 分 布 于 亚 洲 非 洲 澳 大 利 亚 南 太 平 洋 及 热 带 美 洲 的 香 蕉 产 区, 我 国 广 东 广 西 台 湾 福 建 有 分 布, 福 建 省 漳 州 南 靖 泉 州 莆 田 等 地 发 生 严 重, 引 起 粉 蕉 整 株 枯 萎, [3] 林 时 迟 (2000) 鉴 定 该 病 病 原 为 古 巴 尖 镰 孢 分 离 香 蕉 枯 萎 病 植 株 根 际 土 壤 中 的 芽 孢 杆 菌, 保 存 菌 种, 以 供 深 入 研 究 其 和 香 蕉 枯 萎 病 之 间 的 关 系 2. 试 验 方 法 2.1 实 验 材 料 供 试 土 样 本 实 验 的 6 种 土 样 均 于 2011 年 9 月 采 自 福 建 漳 州 南 靖, 分 别 从 健 康 植 株 和 发 病 植 株 根 际 采 集, 根 据 褐 变 程 度,5 株 患 病 植 株 的 发 病 等 级 依 次 为 级, 具 体 见 表 1 表 1 土 样 来 源 土 样 编 号 来 源 采 样 地 点 时 间 1 健 康 香 蕉 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 2 1 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 3 2 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 4 3 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 5 4 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 6 5 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 实 验 仪 器 (1) 试 剂 :NA 培 养 基 : 每 升 含 牛 肉 浸 膏 3g, 酵 母 浸 膏 1g, 蛋 白 胨 5g, 葡 萄 糖 10g, 琼 脂 18g,pH mL 无 菌 水 (2) 仪 器 : 超 净 工 作 台, 恒 温 培 养 箱 2.2 实 验 方 法 样 品 处 理 分 别 称 取 1g 的 土 样 加 入 9mL 的 无 菌 水 中, 剧 烈 震 荡 混 匀 用 移 液 枪 吸 1mL 原 液 加 入 9mL 的 无 菌 水 中 稀 释 成 10-2 将 稀 释 成 10-2 的 土 壤 样 品 放 置 到 80 的 水 浴 中 加 热 10min, 杀 死 其 他 细 菌 稀 释 涂 布 用 移 液 枪 吸 100 μl 水 浴 后 的 土 壤 样 品 在 NA 平 板 上 涂 布, 每 个 样 本 两 个 重 复 恒 温 培 养

110 105 将 涂 布 好 的 平 板 放 在 30 的 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1~2d 菌 落 计 数 统 计 培 养 平 板 上 菌 落 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数, 按 公 式 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数 菌 株 纯 化 用 划 线 法 挑 取 平 板 上 的 单 菌 落 在 NA 培 养 基 上 划 线, 倒 置 于 30 的 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1~2d 菌 种 保 存 对 菌 种 进 行 编 号 拍 照, 然 后 提 交 保 存 3. 试 验 结 果 3.1 菌 落 形 态 特 征 从 6 个 根 际 土 壤 样 本 中 共 分 离 到 9 种 芽 孢 杆 菌, 菌 株 编 号 及 菌 落 形 态 特 征 见 表 2, 菌 落 照 片 见 图 1-9(A: 反 面,B: 正 面 ) 表 2 菌 落 形 态 特 征 序 号 菌 株 编 号 菌 落 特 征 1 FJAT 中, 淡 粉 色, 圆 形, 湿 润, 表 面 光 滑 稍 凸 2 FJAT 中, 淡 黄 色, 圆 形, 较 湿 润, 表 面 光 滑 稍 凸 3 FJAT 小, 乳 白 色, 圆 形, 较 湿 润, 表 面 平 滑 4 FJAT 中, 乳 白 色, 不 规 则, 四 周 湿 润, 表 面 凸 出 褶 皱 干 燥, 5 FJAT 淡 白 色, 圆 形 或 椭 圆 形, 湿 润, 表 面 凸 出 光 滑, 边 缘 模 糊 6 FJAT 大, 白 色, 性 状 不 规 则, 极 干 燥, 表 面 平 滑 7 FJAT 乳 黄 色, 圆 形, 极 湿 润, 表 面 凸 出 光 滑, 具 流 动 性 8 FJAT 黄 色, 不 规 则, 较 干 燥, 表 面 凸 出 褶 皱 9 FJAT 大, 乳 白 色, 树 枝 状, 较 湿 润, 表 面 平 滑 图 1 FJAT 菌 落 图 片

111 106 图 2 FJAT 菌 落 图 片 图 3 FJAT 菌 落 图 片

112 107 图 4 FJAT 菌 落 图 片 图 5 FJAT 菌 落 图 片

113 108 图 6 FJAT 菌 落 图 片 图 7 FJAT 菌 落 图 片

114 109 图 8 FJAT 菌 落 图 片 图 9 FJAT 菌 落 图 片 3.2 数 量 统 计 每 种 土 样 在 平 板 上 的 菌 落 总 数 从 6 种 根 际 土 壤 中 共 分 离 到 的 9 种 芽 孢 杆 菌 :FJAT FJAT FJAT FJAT FJAT FJAT FJAT FJAT FJAT 它 们 的 序 号 依 次 为 : 每 种 土 样 平 板 上 的 菌 落 总 数 ( 见 图 10) 菌 落 总 数 万 个 菌 株 序 号 图 10 每 种 土 样 在 平 板 上 菌 落 总 数

115 每 种 土 样 中 含 各 种 菌 的 具 体 数 目 ( 见 图 11-16) 菌 落 总 数 万 个 菌 株 序 号 图 11 1 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 菌 落 总 数 万 个 菌 株 序 号 图 12 2 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数

116 菌 落 总 数 万 个 菌 株 序 号 图 13 3 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 菌 落 总 数 万 个 菌 株 序 号 图 14 4 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 菌 落 总 数 万 个 菌 株 序 号

117 112 图 15 5 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 菌 落 总 数 万 个 菌 株 序 号 图 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 9 种 菌 每 种 的 数 量 总 和 见 图 17 6 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 菌 落 总 数 万 个 菌 株 序 号 图 17 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 4. 试 验 讨 论 (1) 土 壤 中 含 有 丰 富 的 微 生 物, 从 图 10 可 以 看 出 健 康 植 株 根 际 土 壤 含 有 的 芽 孢 杆 菌 数 量 少, 发 病 最 严 重 的 植 株 根 际 土 壤 中 含 有 的 芽 孢 杆 菌 数 量 最 多, 这 可 能 与 芽 孢 杆 菌 的 抑 菌 作 用 有 关 (2) 结 合 图 11- 图 16 可 知, 在 香 蕉 枯 萎 病 植 株 根 际 土 壤 中, 均 含 有 2 号 和 3 号 菌 株 即 FJAT 和 FJAT-14462, 且 含 量 最 多, 这 两 种 菌 在 土 壤 中 的 作 用 需 要 用 分 子 鉴 定 后, 以 确 定 其 分 类 地 位, 再 做 深 入 的 研 究 ; 在 健 康 的 植 株 根 际 土 壤 中 存 在 9 号 菌 株 即 FJAT-14475, 而 其 他 发 病 植 株 中 没 有 这 种 菌, 这 种 菌 可 能 对 抑 制 植 株 发 病 起 一 定 作 用 ; 发 病 植 株 根 际 土 壤 中 都 存 在 7 号 菌 株 即 FJAT-14472, 这 或 许 是 致 病 菌, 是 造 成 植 株 患 病 的 原 因 之 一

118 113 (3) 由 图 17 知,2 号 和 3 号 菌 株 即 FJAT 和 FJAT 在 土 壤 中 的 含 量 最 多, 其 次 是 只 在 发 病 植 株 根 际 土 壤 中 存 在 的 7 号 菌 株 即 FJAT-14472, 含 量 最 少 的 是 只 在 健 康 植 株 根 际 土 壤 中 存 在 的 9 号 菌 株 即 FJAT (4) 因 为 芽 孢 杆 菌 耐 高 温, 用 80 的 水 浴 中 加 热 10min 杀 死 其 他 细 菌, 稀 释 涂 布, 理 论 上 分 离 到 的 应 该 都 是 芽 孢 杆 菌, 但 是 仍 需 要 用 16S 引 物 鉴 定 5.. 参 考 文 献 [1] 王 祖 农. 土 壤 和 土 攘 微 生 物 [J]. 山 东 大 学 生 物 系. [2] 高 乔 婉. 香 蕉 枯 萎 病 [A]. 中 国 农 业 百 科 全 书. 植 物 病 理 学 卷 [C]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社, ,483. [3] 林 时 迟, 张 绍 升, 周 乐 峰. 福 建 省 香 蕉 枯 萎 病 鉴 定 [J]. 福 建 农 业 大 学 学 报,2000,29(4):465~469. 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 詹 洪

119 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 福 建 省 不 同 地 区 发 酵 床 垫 料 的 含 水 量 比 较 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

120 试 验 目 的 零 污 染 养 猪 技 术 就 是 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 的 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 [1] 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 垫 料 的 主 要 作 用 是 保 温 隔 热 吸 收 粪 尿 和 水 分, 从 而 维 持 动 物 的 舒 适 性 和 栏 内 的 清 洁 度, 使 动 物 生 活 在 舒 适 的 环 境 中, 它 直 接 与 动 物 体 接 触, 也 影 响 着 猪 舍 内 的 微 环 境, 对 实 验 动 物 的 健 康 和 实 验 结 果 有 极 大 的 影 响 [2] 垫 料 的 含 水 量 测 定 参 照 土 壤 含 水 量 的 测 定 方 法, 土 壤 含 水 量 (water content of soil) 是 土 壤 中 所 含 水 分 的 数 量 一 般 是 指 土 壤 绝 对 含 水 量, 即 100g 烘 干 土 中 含 有 若 干 克 水 分, 也 称 土 壤 含 水 率 本 文 通 过 采 集 不 同 地 区 不 同 使 用 时 间 的 发 酵 床 垫 料, 测 定 垫 料 的 含 水 量, 并 研 究 它 们 与 垫 料 腐 熟 程 度 的 相 关 性, 以 期 建 立 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 腐 熟 程 度 的 判 别 指 标, 从 而 进 一 步 研 究 旧 垫 料 的 资 源 化 利 用, 利 用 旧 垫 料 生 产 有 机 肥 料 和 生 物 肥 药 等 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 养 猪 发 酵 床 垫 料 发 酵 床 垫 料 于 2011 年 3 月 和 2011 年 7 月 期 间 在 福 建 省 内 采 集 的, 具 体 垫 料 来 源 见 表 1 表 1 发 酵 床 垫 料 样 品 信 息 表 样 品 数 量 使 用 时 间 采 集 时 间 福 安 03 溪 柄 垫 料 10 1 年 宁 德 扶 摇 垫 料 9 4 个 月 福 安 07 溪 柄 垫 料 6 1 年 半 福 州 新 店 垫 料 11 1 年 半 垫 料 含 水 量 测 定 方 法 测 定 原 理 垫 料 样 品 在 105±2 烘 至 恒 重 时 的 失 重, 即 为 样 品 所 含 水 分 的 质 量 仪 器 设 备 测 定 步 骤 1) 铝 制 称 样 皿 : 直 径 约 40mm, 高 约 20mm; 2) 分 析 天 平 : 感 量 为 0.01g; 3) 小 型 电 热 恒 温 烘 箱 ; 4) 干 燥 器 : 内 盛 变 色 硅 胶 或 无 水 氯 化 钙 用 洁 净 的 铝 制 称 样 皿 于 105 ±2 的 恒 温 干 燥 箱 中 烘 烤 1 h, 取 出 后 置 于 干 燥 器 中 30min, 准 确 称 重, 再 烘 烤 30min, 冷 却 称 重, 至 两 次 称 重 之 差 小 于 g 为 恒 重 ; 将 已 恒 重 的 称 样 皿 在 分 析 天 平 上 回 零 后, 准 确 的 称 取 垫 料 样 品 ( 平 行 样 )l0g 于 已 恒 重 的 铝 制 称 样 皿 中 ; 称 样 皿 的 盖 打 开, 放 入 105 ±2 的 恒 温 烘 箱 中, 烘 烤 3 h; 取 出 称 样 皿 后, 将 称 样 皿 置 于 干 燥 器 中 30min, 准 确 称 重 ; 再 用 相 同 的 方 法 烘 烤 1 h, 冷 却 称 重, 至 两 次 称 重 之 差 小 于 0.002g 为 恒 重 测 定 结 果 的 计 算

121 116 (1) 计 算 公 式 水 分 ( 分 析 基 ),%= (m1-m2)/(m1-m0) 100 (1) 水 分 ( 干 基 ),%= (m1-m2)/(m2-m0) 100 (2) 式 中 :m0 烘 干 空 铝 制 称 样 皿 质 量,g; m1 烘 干 前 铝 制 称 样 皿 及 土 样 质 量,g; m2 烘 干 后 铝 制 称 样 皿 及 土 样 质 量,g (2) 平 行 测 定 的 结 果 用 算 术 平 均 值 表 示, 保 留 小 数 后 一 位 3. 试 验 结 果 3.1 福 安 溪 柄 3 月 份 养 猪 场 垫 料 含 水 量 测 定 福 安 溪 柄 3 月 份 养 猪 场 垫 料 共 采 集 10 栏, 各 栏 垫 料 的 含 水 量 的 试 验 结 果 见 表 2,10 份 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 37.7%-56.1%, 平 均 为 48.98%, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 6.05%-12.78%, 平 均 为 9.79% 表 2 福 安 溪 柄 3 月 份 养 猪 场 垫 料 的 含 水 量 样 品 名 称 m0(g) m1(g) m2(g) 含 水 量 ( 分 析 基 )/% 含 水 量 ( 干 基 )/% 山 上 1 栏 山 上 2 栏 山 上 3 栏 山 上 4 栏 山 上 5 栏 山 下 左 1 栏 山 下 左 2 栏 山 下 左 3 栏 山 下 右 1 栏 山 下 右 2 栏 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 含 水 量 测 定 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 共 采 集 9 栏, 各 栏 垫 料 的 含 水 量 的 试 验 结 果 见 表 3,9 份 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 43.3%-66.9%, 平 均 为 54.68%, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 7.64%-20.21%, 平 均 为 12.84% 表 3 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 的 含 水 量 样 品 名 称 m0(g) m1(g) m2(g) 含 水 量 ( 分 析 基 )/% 含 水 量 ( 干 基 )/% 1 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏

122 福 安 溪 柄 7 月 份 养 猪 场 垫 料 含 水 量 测 定 福 安 溪 柄 7 月 份 养 猪 场 垫 料 共 采 集 6 栏, 各 栏 垫 料 的 含 水 量 的 试 验 结 果 见 表 4,6 份 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 43.2%-49.6%, 平 均 为 46.83%, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 7.61%-9.84%, 平 均 为 8.84% 表 4 福 安 溪 柄 7 月 份 养 猪 场 垫 料 的 含 水 量 样 品 名 称 m0(g) m1(g) m2(g) 含 水 量 ( 分 析 基 )/% 含 水 量 ( 干 基 )/% 山 下 左 1 栏 山 下 左 2 栏 山 下 左 3 栏 山 下 右 1 栏 山 下 右 2 栏 山 下 右 3 栏 福 州 新 店 零 排 放 养 猪 场 垫 料 含 水 量 测 定 福 州 新 店 零 排 放 养 猪 场 垫 料 共 采 集 11 栏, 各 栏 垫 料 的 含 水 量 的 试 验 结 果 见 表 5,11 份 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 29.97%-66.8%, 平 均 为 51.14%, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 4.28%-20.12%, 平 均 为 11.36% 表 5 福 州 新 店 零 排 放 养 猪 场 垫 料 的 含 水 量 样 品 名 称 m0(g) m1(g) m2(g) 含 水 量 ( 分 析 基 )/% 含 水 量 ( 干 基 )/% 1 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 试 验 讨 论 福 建 省 三 个 地 区 零 排 放 养 猪 场 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 29.97%-66.8% 之 间, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 4.28%-20.21% 其 中 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 的 平 均 水 分 含 量 最 高, 对 照 福 安 3 月 份 7 月 份 采 集 的 垫 料 和 新 店 垫 料 的 含 水 量 较 低, 这 主 要 是 垫 料 使 用 时 间 和 垫 料 原 料 配 方 不 同 的 影 响 其 中 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 相 对 使 用 时 间 最 短

123 参 考 文 献 [1]. 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 5. [2]. 刘 恩 岐. 实 验 动 物 垫 料 质 量 的 评 估 [J]. 中 国 比 较 医 学 杂 志,2004,14(3): 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 宋 泽 琼

124 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 高 温 条 件 下 发 酵 床 的 微 生 物 生 物 量 的 测 定 ( 四 ) 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

125 试 验 目 的 零 污 染 养 猪 技 术 就 是 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 白 的 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 [1] 充 分 的 分 解 和 转 化 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 土 壤 微 生 物 生 物 量 对 土 壤 肥 力 的 影 响 已 被 认 识 多 年, 土 壤 微 生 物 生 物 量 虽 然 只 占 土 壤 总 有 机 碳 的 1%-3%, 但 这 一 部 分 的 有 机 碳 却 影 响 着 所 有 进 入 土 壤 的 有 机 质 的 转 化, 成 为 土 壤 组 成 中 的 精 华 部 分, 是 整 个 森 林 生 态 系 统 中 养 分 和 能 源 循 环 的 动 力 [2] 同 理, 猪 舍 的 垫 料 成 分 中 也 含 有 一 定 量 的 土 壤, 也 可 以 用 类 似 土 壤 微 生 物 生 物 量 的 测 定 来 测 定 猪 垫 料 的 微 生 物 生 物 量 测 定 微 生 物 生 物 量 的 方 法 当 首 推 氯 仿 熏 蒸 一 培 养 法 该 法 是 根 据 被 杀 死 的 微 生 物 细 胞 因 矿 化 作 用 而 释 放 的 CO2 量 的 激 增 来 估 计 微 生 物 生 物 量 的 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 2011 年 7 月 19 日 从 中 国 福 建 省 福 州 市 驻 新 店 部 队 生 猪 养 殖 场 采 集 的 新 鲜 猪 垫 料 样 品 采 集 方 法 : 根 据 实 际 情 况 间 隔 猪 栏 采 集, 共 11 栏 11 个 样 本, 在 采 集 的 每 栏 猪 舍 中 纵 向 中 轴 线 上 平 均 分 三 个 部 位, 每 个 部 位 各 采 集 500g, 三 个 部 位 的 样 品 混 合 均 匀, 采 集 2kg 发 酵 床 垫 料 2.2 实 验 器 材 振 荡 器 11cm 的 滤 纸 0.45μm 的 滤 膜 针 筒 量 筒 紫 外 分 光 光 度 计 擦 镜 纸 比 色 皿 密 闭 箱 组 培 瓶 等 2.3 实 验 方 法 每 个 样 本 在 密 闭 箱 中 用 氯 仿 熏 蒸 24 h 后 取 出, 在 通 气 良 好 的 地 方 放 置 2~3 h, 使 残 留 垫 料 中 的 氯 仿 尽 可 能 挥 发 未 熏 蒸 的 样 品 置 于 冰 箱 中 4 保 存 至 分 析 称 取 新 鲜 垫 料 20 g, 转 入 组 培 瓶 中, 加 50 ml 0.5 mol/l K2 SO4, 振 荡 30 min 后 用 两 层 直 径 为 11cm 的 滤 纸 过 滤, 再 用 0.45μm 的 滤 膜 过 滤 一 遍, 然 后 立 即 在 280 nm 紫 外 光 下 测 定 吸 光 度 熏 蒸 和 未 熏 蒸 作 相 同 处 理 微 生 物 生 物 量 (SMB) 用 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 表 示,α=(abs 熏 /G 熏 ) 一 (abs 未 熏 /G 未 熏 ), 其 中 abs 代 表 UV280 的 吸 光 度,G 代 表 新 鲜 垫 料 的 质 量

126 试 验 结 果 11 个 样 品 在 280 nm 紫 外 光 下 测 定 的 熏 蒸 和 未 熏 蒸 的 吸 光 度 及 微 生 物 生 物 量 见 表 1 表 1 各 样 品 的 吸 光 度 及 微 生 物 生 物 量 样 品 abs 熏 abs 未 熏 一 二 平 均 值 一 二 平 均 值 α( 10-3 /g) 1 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 栏 注 :SMB 用 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 表 示,α=(abs 熏 /G 熏 ) 一 (abs 未 熏 /G 未 熏 ), 其 中 abs 代 表 UV280 的 吸 光 度,G 代 表 新 鲜 垫 料 的 质 量 α( 10-3 /g) 栏 号 图 1 新 鲜 猪 垫 料 的 微 生 物 生 物 量 (SMB) 的 柱 状 图 从 图 1 可 以 看 出 如 下 结 果 : 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 若 为 负 值, 说 明 在 薰 蒸 后 垫 料 中 被 杀 死 的 微 生 物 分 解 所 产 生 的 CO2 量 要 小 于 非 薰 蒸 垫 料 中 死 亡 的 微 生 物 分 解 所 产 生 的 CO2, 即 这 些 样 品 中 的 微 生 物 生 物 量 小 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 若 为 正 值, 说 明 在 薰 蒸 后 垫 料 中 被 杀 死 的 微 生 物 分 解 所 产 生 的 CO2 量 要 大 于 非 薰 蒸 垫 料 中 死 亡 的 微 生 物 分 解 所 产 生 的 CO2 即 这 些 样 品 中 的 微 生 物 生 物 量 大 见 图 1 中 所 有 的 样 品 都 是 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 都 为 正 值, 其 中 4 栏 垫 料 样 品 的 吸 光 度 增 量 最 大,10 栏 垫 料 样 品 的 吸 光 度 增 量 最 小,

127 试 验 结 论 (1) 综 上 可 知,11 个 样 品 的 微 生 物 生 物 量 的 含 量 都 较 高, 最 高 的 是 10 栏 的 垫 料 样 品, 最 低 的 是 4 栏 垫 料 样 品 (2) 氯 仿 薰 蒸 后 导 致 垫 料 中 一 些 有 机 体 更 易 分 解 ; 用 氯 仿 熏 蒸 后 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 值 有 的 为 正 值, 有 的 为 负 值, 有 的 不 变, 说 明 氯 仿 薰 蒸 对 杀 除 垫 料 中 的 微 生 物 具 有 选 择 性 ; (3) 氯 仿 熏 蒸 杀 菌 作 用 受 多 种 因 素, 尤 其 是 水 分 的 影 响 所 以 用 此 法 所 测 得 的 微 生 物 生 物 量 之 所 以 随 季 节 而 异, 实 际 上 是 由 于 在 不 同 季 节 里 物 质 含 水 量 不 同 所 致, 即 微 生 物 生 物 量 与 含 水 量 呈 负 相 关 这 是 因 为 潮 湿 环 境 下 微 生 物 不 容 易 被 熏 蒸 剂 所 杀 死, 即 使 已 被 杀 死 的, 其 矿 化 作 用 也 因 含 水 量 过 大 而 受 阻 碍, 测 得 的 微 生 物 生 物 量 将 必 然 偏 低 5. 参 考 文 献 [1] 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社, 2009, 5. [2] Laurie A T,Mary A A,Ruth D Y,Forest floor microbical biomass across a northern hardwood successional sequence. Soil Biol Biochem,1998,31: 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 宋 泽 琼

128 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 不 同 产 量 和 施 肥 方 式 下 葡 萄 的 CAT 酶 活 性 比 较 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

129 试 验 目 的 过 氧 化 氢 酶 (CAT) 是 一 种 酶 类 清 除 剂, 又 称 为 触 酶, 是 以 铁 卟 啉 为 辅 基 的 结 合 酶 它 可 促 使 H 2 O 2 分 解 为 分 子 氧 和 水, 清 除 体 内 的 过 氧 化 氢, 从 而 使 细 胞 免 于 遭 受 H 2 O 2 的 毒 害, 是 生 物 防 御 体 系 的 关 键 酶 之 一 H 2 O 2 在 240nm 波 长 下 有 强 烈 吸 收, 过 氧 化 氢 酶 能 分 解 过 氧 化 氢, 使 反 应 溶 液 吸 光 度 (A 240 ) 随 反 应 时 间 而 降 低 根 据 测 量 吸 光 率 的 变 化 速 度 即 可 测 出 过 氧 化 氢 酶 的 活 性 CAT 作 用 于 过 氧 化 氢 的 机 理 实 质 上 是 H 2 O 2 的 歧 化, 必 须 有 两 个 H 2 O 2 先 后 与 CAT 相 遇 且 碰 撞 在 活 性 中 心 上, 才 能 发 生 反 应 H 2 O 2 浓 度 越 高, 分 解 速 度 越 快 CAT 是 红 血 素 酶, 不 同 的 来 源 有 不 同 的 结 构 在 不 同 的 组 织 中 其 活 性 水 平 高 低 不 同 过 氧 化 氢 在 肝 脏 中 分 解 速 度 比 在 脑 或 心 脏 等 器 官 快, 就 是 因 为 肝 中 的 CAT 含 量 水 平 高 本 文 对 不 同 产 量 不 同 施 肥 方 式 下 葡 萄 的 叶 片 葡 萄 果 皮 和 果 肉 的 CAT 酶 活 性 进 行 分 析 比 较, 探 讨 葡 萄 产 量 和 播 种 方 式 与 葡 萄 过 氧 化 物 酶 活 性 的 关 系 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 2011 年 7 月 底, 采 集 自 福 安 的 葡 萄 叶 片 和 葡 萄 果 实, 具 体 信 息 见 表 1 葡 萄 叶 片 从 编 号 1 号 到 编 号 16 号, 葡 萄 果 皮 编 号 从 果 皮 1 号 到 果 皮 8 号, 对 应 的 果 肉 编 号 从 果 肉 1 号 到 果 肉 8 号 表 1 葡 萄 叶 片 和 葡 萄 果 肉 果 皮 的 信 息 编 号 产 量 (kg/ 株 ) 施 肥 方 式 叶 片 形 态 1 号 5 沟 施 老 叶 2 号 5 撒 施 老 叶 3 号 5 沟 施 嫩 叶 4 号 5 撒 施 嫩 叶 5 号 3 沟 施 嫩 叶 6 号 对 照 CK 嫩 叶 7 号 3 沟 施 老 叶 8 号 对 照 CK 老 叶 9 号 丰 产 树 老 叶 10 号 4 撒 施 嫩 叶 11 号 4 撒 施 老 叶 12 号 3 撒 施 嫩 叶 13 号 丰 产 树 嫩 叶 14 号 3 撒 施 老 叶 15 号 4 沟 施 嫩 叶 16 号 4 沟 施 老 叶 果 皮 1 号 5 撒 施 果 皮 2 号 丰 产 树 果 皮 3 号 4 沟 施 果 皮 4 号 3 撒 施 果 皮 5 号 5 沟 施 果 皮 6 号 4 撒 施

130 125 果 皮 7 号 3 沟 施 果 皮 8 号 对 照 CK 果 肉 1 号 5 撒 施 果 肉 2 号 丰 产 树 果 肉 3 号 4 沟 施 果 肉 4 号 3 撒 施 果 肉 5 号 5 沟 施 果 肉 6 号 4 撒 施 果 肉 7 号 3 沟 施 果 肉 8 号 对 照 CK 2.2. 仪 器 和 试 剂 研 钵 25ml 容 量 瓶 试 管 离 心 机 岛 津 Shimadzu 紫 外 分 光 光 度 计 UV ml 离 心 管 冰 块 天 平 恒 温 水 浴 0.2mol/L ph7.8 磷 酸 缓 冲 液 ( 内 含 1% 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 ),0.1mol/L H 2 O 2 ( 用 0.1mol/L 高 锰 酸 钾 标 定 ) 2.3 葡 萄 粗 酶 液 提 取 称 取 新 鲜 小 麦 叶 片 或 其 它 植 物 组 织 5g 置 研 钵 中, 加 入 2~3ml 4 下 预 冷 的 ph7.0 磷 酸 缓 冲 液 和 少 量 石 英 砂 研 磨 成 匀 浆 后, 转 入 25ml 容 量 瓶 中, 并 用 缓 冲 液 冲 洗 研 钵 数 次, 合 并 冲 洗 液, 并 定 容 到 刻 度 混 合 均 匀 将 量 瓶 置 5 冰 箱 中 静 置 10min, 取 上 部 澄 清 液 在 4000rpm 下 离 心 15min, 上 清 液 即 为 过 氧 化 氢 酶 粗 提 液 5 下 保 存 备 用 2.4 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 测 定 取 10ml 试 管 3 支, 其 中 1 支 为 对 照 管, 编 号 S0,2 支 为 样 品 测 定 管, 编 号 为 S1 S2, 按 表 2 顺 序 加 入 试 剂 25 预 热 后, 逐 管 加 入 0.5ml 0.1mol/L 的 H 2 O 2, 每 加 完 一 管 立 即 记 时, 并 迅 速 倒 入 石 英 比 色 杯 中,240nm 下 测 定 吸 光 度, 每 隔 1min 读 数 1 次, 共 测 4min, 待 3 支 管 全 部 测 定 完 后, 根 据 公 式 计 算 酶 活 性 表 2 紫 外 吸 收 法 测 定 H 2O 2 样 品 液 配 置 表 管 号 粗 酶 液 (ml) ph7.8 磷 酸 (ml) 蒸 馏 水 (ml) S S S 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 计 算 以 1min 内 A240 减 少 0.1 的 酶 量 为 1 个 酶 活 单 位 (u) A 240Vt 过 氧 化 氢 酶 活 性 ( U/min gfw) = 0.1 V FW t 式 中 A240 = AS0-(AS1+ AS2)/2;AS0 加 入 煮 死 酶 液 的 对 照 管 吸 光 值 ;AS1, AS2 样 品 管 吸 光 值 ;Vt 粗 酶 提 取 液 总 体 积 (ml);v1 测 定 用 粗 酶 液 体 积 (ml);fw 样 品 鲜 重 (g);0.1 1

131 126 A240 每 下 降 0.1 为 1 个 酶 活 单 位 (u);t 加 过 氧 化 氢 到 最 后 一 次 读 数 时 间 (min) 3. 试 验 结 果 3.1 葡 萄 叶 片 的 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 测 定 不 同 产 量 施 肥 方 式 下 的 葡 萄 叶 片 的 CAT 酶 活 见 表 3 和 图 1 16 株 葡 萄 叶 片 的 酶 活 通 过 LSD 单 因 素 试 验 分 析 可 知 p=0.0002, 即 p<0.01, 说 明 这 16 株 葡 萄 叶 片 的 CAT 酶 活 之 间 差 异 极 显 著 酶 活 最 高 的 是 11 号 叶 片, 即 产 量 为 4kg/ 株, 施 肥 为 撒 施 的 老 叶, 达 U/min gfw, 最 低 的 是 5 号 叶 片, 即 产 量 为 3kg/ 株, 施 肥 为 沟 施 的 嫩 叶, 达 8.438U/min gfw 此 外 从 表 2 和 图 1 中 可 知, 相 同 产 量 和 相 同 施 肥 方 式 下, 老 叶 和 嫩 叶 的 CAT 酶 活 也 不 同, 大 部 分 是 嫩 叶 高 于 老 叶, 如 编 号 1 与 3, 2 与 4,9 与 13,12 与 14,16 与 15, 也 有 一 些 是 老 叶 高 于 嫩 叶, 如 编 号 5 与 7,6 与 8, 相 同 产 量 和 相 同 叶 片 形 态 下, 不 同 施 肥 方 式 的 葡 萄 叶 片 CAT 酶 活 也 不 同, 有 的 是 撒 施 的 施 肥 方 式 下 的 酶 活 高 于 沟 施, 如 编 号 1 与 2,5 与 12,11 与 16, 也 有 相 反 的, 即 沟 施 的 酶 活 高 于 撒 施, 如 编 号 3 与 4, 7 与 14,10 与 15 不 同 产 量 的 葡 萄 叶 片 的 酶 活 之 间 没 有 关 系, 即 施 肥 方 式 和 叶 片 形 态 相 同 下, 产 量 为 5 4 3kg/ 株 的 葡 萄 叶 片 的 酶 活 都 有 最 高 的 出 现 表 3 葡 萄 叶 片 的 CAT 酶 活 (AS1+ AS2) 编 号 AS0 AS1 AS2 /2 ΔA 240 CAT 酶 活 (U/min gfw) 1 号 号 号 号 号 号 号 号 号 号 号 号 号 号 号 号

132 127 葡 萄 叶 片 CAT 活 性 号 2 号 3 号 4 号 5 号 6 号 7 号 8 号 9 号 10 号 11 号 12 号 13 号 14 号 15 号 16 号 样 品 编 号 图 1 葡 萄 叶 片 CAT 酶 活 3.2 葡 萄 果 皮 的 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 测 定 不 同 产 量 施 肥 方 式 下 的 葡 萄 果 皮 的 CAT 酶 活 见 表 4 和 图 2,8 株 果 皮 的 酶 活 通 过 LSD 单 因 素 试 验 分 析 可 知 p=0.0001, 即 p<0.01, 说 明 这 8 株 果 皮 的 CAT 酶 活 之 间 差 异 极 显 著,8 株 果 皮 的 酶 活 最 高 的 是 果 皮 4 号, 即 产 量 为 3kg/ 株, 施 肥 为 撒 施 的 葡 萄 果 皮, 为 U/min gfw, 最 低 的 是 果 皮 1 号, 为 U/min gfw 表 4 葡 萄 果 皮 的 CAT 酶 活 (AS1+ AS2) 编 号 AS0 AS1 AS2 /2 ΔA240 CAT 酶 活 (U/min gfw) 果 皮 1 号 果 皮 2 号 果 皮 3 号 果 皮 4 号 果 皮 5 号 果 皮 6 号 果 皮 7 号 果 皮 8 号 葡 萄 果 皮 CAT 酶 活 果 皮 1 号 果 皮 2 号 果 皮 3 号 果 皮 4 号 果 皮 5 号 果 皮 6 号 果 皮 7 号 果 皮 8 号 果 皮 编 号 图 2 葡 萄 果 皮 CAT 酶 活

133 葡 萄 果 肉 的 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 测 定 不 同 产 量 施 肥 方 式 下 的 葡 萄 果 肉 的 CAT 酶 活 见 表 5 和 图 3,8 株 果 肉 的 酶 活 通 过 LSD 单 因 素 试 验 分 析 可 知 p=0.0001, 即 p<0.01, 说 明 这 8 株 果 肉 的 CAT 酶 活 之 间 差 异 极 显 著, 酶 活 最 高 的 是 果 肉 6 号, 即 产 量 为 4kg/ 株, 施 肥 为 撒 施 的 葡 萄 果 肉, 为 U/min gfw 表 5 葡 萄 果 肉 的 CAT 酶 活 (A S1+ A S2) 编 号 A S0 A S1 A S2 /2 ΔA240 CAT 酶 活 (U/min gfw) 果 肉 1 号 果 肉 2 号 果 肉 3 号 果 肉 4 号 果 肉 5 号 果 肉 6 号 果 肉 7 号 果 肉 8 号 葡 萄 果 肉 CAT 酶 活 果 肉 1 号 果 肉 2 号 果 肉 3 号 果 肉 4 号 果 肉 5 号 果 肉 6 号 果 肉 7 号 果 肉 8 号 果 肉 编 号 图 3 葡 萄 果 肉 CAT 酶 活 3.4 葡 萄 果 肉 的 糖 度 测 定 对 8 株 葡 萄 果 肉 的 糖 度 测 定, 结 果 见 表 6,8 株 果 肉 的 糖 度 通 过 LSD 单 因 素 试 验 分 析 ( 表 7) 可 知 p=0.0001, 即 p<0.01, 说 明 这 8 株 果 肉 的 糖 度 之 间 差 异 极 显 著 表 6 葡 萄 果 肉 的 糖 度 编 号 重 复 一 重 复 二 重 复 三 平 均 值 果 肉 1 号 果 肉 2 号 果 肉 3 号 果 肉 4 号

134 129 果 肉 5 号 果 肉 6 号 果 肉 7 号 果 肉 8 号 表 7 葡 萄 果 肉 的 糖 度 的 LSD 单 因 素 方 差 分 析 变 异 来 源 平 方 和 自 由 度 均 方 F 值 p 值 处 理 间 处 理 内 总 变 异 株 葡 萄 果 肉 的 糖 度 间 差 异 见 表 8, 在 5%( 或 1%) 显 著 水 平 下, 有 相 同 字 母 出 现 的 表 示 无 显 著 性 ( 极 显 著 性 ) 差 异 表 4 葡 萄 果 肉 的 糖 度 的 LSD 法 多 重 比 较 处 理 5% 显 著 水 平 1% 显 著 水 平 果 肉 5 号 a A 果 肉 1 号 ab B 果 肉 2 号 ab B 果 肉 3 号 bc C 果 肉 4 号 cd CD 果 肉 6 号 cde CD 果 肉 7 号 de CD 果 肉 8 号 e CD 4. 试 验 结 论 几 乎 所 有 的 生 物 机 体 都 存 在 过 氧 化 氢 酶 其 普 遍 存 在 于 能 呼 吸 的 生 物 体 内, 主 要 存 在 于 植 物 的 叶 绿 体 线 粒 体 内 质 网 动 物 的 肝 和 红 细 胞 中, 其 酶 促 活 性 为 机 体 提 供 了 抗 氧 化 防 御 机 理 本 实 验 研 究 发 现 16 株 不 同 产 量 施 肥 方 式 下 的 葡 萄 叶 片 葡 萄 果 皮 果 肉 的 的 CAT 酶 活 差 异 性 极 显 著, 其 中 在 相 同 产 量 和 施 肥 方 式 下, 大 部 分 是 嫩 叶 的 POD 酶 活 高 于 老 叶, 不 同 产 量 的 葡 萄 叶 片 的 酶 活 之 间 没 有 关 系, 即 施 肥 方 式 和 叶 片 形 态 相 同 下, 产 量 为 5 4 3kg/ 株 的 葡 萄 叶 片 的 酶 活 都 有 最 高 的 出 现 测 定 8 株 果 肉 的 糖 度 发 现 他 们 之 间 差 异 极 显 著 5 参 考 文 献 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 宋 泽 琼

135 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 宁 德 市 九 都 镇 示 范 点 水 质 中 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 ( 六 ) ( 编 号 ) 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

136 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 微 生 物 细 胞 组 分 中 一 种 稳 定 而 富 有 的 重 要 成 分, 它 和 细 菌 的 遗 传 变 异 毒 力 耐 药 性 [1] 等 有 极 为 密 切 的 关 系, 它 的 种 类 和 含 量 是 微 生 物 鉴 定 和 分 类 法 的 重 要 依 据 之 一 气 相 色 谱 分 析 技 术 能 快 速 灵 敏 精 确 地 检 测 出 细 菌 细 胞 内 的 脂 肪 酸, 从 而 确 定 它 是 哪 种 微 生 物 所 以 本 实 验 采 用 气 相 色 谱 分 析 技 术 对 宁 德 市 九 都 镇 示 范 点 水 质 中 的 细 菌 进 行 鉴 定, 从 而 确 定 其 具 体 的 菌 株 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 2010 年 12 月 1 日 于 宁 德 市 九 都 镇 水 质 示 范 点 采 集 的 水 样, 分 别 为 水 龙 头 设 备 进 水 口 ( 简 称 进 水 口 ) 设 备 出 水 口 ( 简 称 出 水 口 ) 的 水 样 2.2 检 测 仪 器 和 实 验 器 材 试 剂 一 :NaOH 45g+ 甲 醇 (HPLC grade)150 ml + 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 二 :6.00N 盐 酸 325 ml + 甲 醇 (HPLC grade)275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 三 : 正 己 烷 200 ml +MTBE(HPLC grade)200 ml, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 四 :NaOH 10.8g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900 ml. 试 剂 五 : 饱 和 氯 化 钠 溶 液 ( 用 来 最 后 消 气 泡 ) 2.3 提 取 步 骤 菌 株 的 培 养 将 NA 平 板 上 的 菌 株 采 用 四 区 划 线 法 在 TSBA 平 板 上 划 线, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24h. ( 可 通 过 四 区 不 同 密 度 的 菌 株 去 确 认 是 否 纯 化, 最 佳 获 菌 区 为 第 三 区, 此 区 必 须 有 菌 落 并 且 量 要 足 够 多 ) 宁 德 市 九 都 镇 示 范 点 水 质 中 的 细 菌 脂 肪 酸 的 提 取 : 获 菌 用 接 种 环 挑 取 3-5 环 湿 重 的 菌 落 置 于 清 洁 干 燥 的 耐 酸 耐 碱 管 底 部 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 耐 酸 耐 碱 管 中 加 入 1.0±0.1ml 试 剂 1, 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5-10s, 水 浴 5min, 从 沸 水 浴 中 移 出 耐 酸 耐 碱 管 并 轻 微 冷 却, 震 荡 5-10s, 再 水 浴 25min, 取 出 室 温 冷 却 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 酯 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 试 剂 2 2.0±0.1ml, 拧 紧 盖 子, 震 荡 5-10s,80 水 浴 10min, 移 开 且 快 速 用 流 动 的 自 来 水 冷 却 至 室 温 萃 取 ( 甲 基 酯 脂 肪 酸 从 酸 性 水 相 移 出 转 移 到 一 个 有 机 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25±0.1ml 的 试 剂 3 萃 取 溶 剂, 拧 紧 盖 子, 温 和 混 合 旋 转 10min, 打 开 盖 子, 用 干 净 的 移 液 管 取 出 下 层 似 水 部 分, 弃 去 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 ) 加 入 3.0±0.1ml 试 剂 4, 拧 紧 盖 子, 温 和 混 合 旋 转 5min, 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 取 2/3 体 积 的 上 层 有 机 相 到 干 净 的 GC 检 测 小 瓶 ( 此 过 程 要 小 心, 宁 可 少 取 有 机 相, 绝 不 可 吸 入 水 相, 否 则 会 损 坏 色 谱 仪 的 色 谱 柱 )

137 上 样 和 脂 肪 酸 的 检 测 PLFAs 的 检 测 采 用 美 国 MIDI 公 司 生 产 的 微 生 物 自 动 鉴 定 系 统 (Sherlock Microbial Identification System), 包 括 Agilent6890N 型 气 相 色 谱 仪, 全 自 动 进 样 装 置 石 英 毛 细 管 柱 及 氢 火 焰 离 子 化 检 测 器 ; 在 下 述 色 谱 条 件 下 平 行 分 析 脂 肪 酸 甲 酯 混 合 物 标 样 和 待 检 样 本 : 二 阶 程 序 升 高 柱 温,l70 起 始,5 /min 升 至 260, 而 后 40 /min 升 温 至 310, 维 持 90s; 汽 化 室 温 度 250 检 测 器 温 度 300 ; 载 气 为 H2(2ml/min) 尾 吹 气 为 N2(30ml/min); 柱 前 压 l0.00 psi(1psi=6.895kpa); 进 样 量 lμl, 进 样 分 流 比 100:1 2.5 数 据 库 比 对 MIDI 操 作 手 册 指 明, 当 鉴 定 结 果 第 一 选 择 的 相 似 指 数 (Similarity Index, SI) 在 以 上, 且 第 一 选 择 和 第 二 选 择 的 SI 差 值 大 于 0.100, 则 可 以 认 为 鉴 定 成 功, 鉴 定 结 果 为 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 名 若 SI 值 在 到 之 间, 且 第 一 选 择 和 第 二 选 择 的 SI 差 值 大 于 0.100, 则 表 明 第 一 选 择 与 第 二 选 择 分 开, 鉴 定 可 能 成 功, 但 是 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 为 非 典 型 的 菌 株 当 SI 值 小 于 时, 则 认 为 该 菌 株 不 存 在 于 数 据 库 中, 但 软 件 会 给 出 一 个 最 相 关 的 菌 株 3. 试 验 结 果 3.1 进 水 口 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 采 用 稀 释 涂 板 法 对 水 质 净 化 设 备 中 进 设 备 前 的 水 ( 即 进 水 口 ) 中 的 细 菌 进 行 了 分 离 纯 化, 共 得 到 3 株 细 菌, 其 菌 株 形 态 特 征 和 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 见 表 1 表 1 进 水 口 的 细 菌 特 征 及 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 细 菌 编 号 菌 落 特 征 Sim Index 菌 种 名 ( 拉 丁 文 ) FJAT FJAT FJAT 大, 乳 黄 色, 圆 形, 湿 润, 扁 平, 半 透 明, 有 光 泽 小, 乳 白 色, 圆 形, 湿 润, 微 隆, 不 透 明, 有 光 泽 小, 乳 白 色, 圆 形, 偏 湿, 扁 平, 透 明, 有 光 泽 Acinetobacter-calcoaceticus Stenotrophomonas-maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) Moraxella-catarrhalis (Branhamella catarrhalis) 菌 种 名 ( 中 文 ) 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 粘 膜 炎 莫 拉 菌 从 表 1 可 知, 两 株 细 菌 的 匹 配 度 均 大 于 0.5, 所 以 FJAT FJAT 两 株 可 以 基 本 上 确 定 为 数 据 库 中 的 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 和 粘 膜 炎 莫 拉 菌 表 1 中 各 菌 株 匹 配 的 菌 种 的 形 态 学 特 征 分 别 如 下 : 1) 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 : 不 动 杆 菌 广 泛 分 布 于 外 界 环 境 中, 主 要 在 水 体 和 土 壤 中, 易 在 潮 湿 环 境 中 生 存, 如 浴 盆 肥 皂 盒 等 处 该 菌 粘 附 力 极 强, 易 在 各 类 医 用 材 料 上 粘 附, 而 可 能 成 为 贮 菌 源 此 外, 本 菌 还 存 在 于 健 康 人 皮 肤 ( 25%) 咽 部 (7%), 也 存 在 于 结 膜 唾 液 胃 肠 道 及 阴 道 分 泌 物 中 感 染 源 可 以 是 病 人 自 身 ( 内 源 性 感 染 ), 亦 可 以 是 不 动 杆 菌 感 染 者 或 带 菌 者, 尤 其 是 双 手 带 菌 的 医 务 人 员 传 播 途 径 有 接 触 传 播 和 空 气 传 播 在 医 院 里, 污 染 的 医 疗 器 械 及 工 作 人 员 的 手 是 重 要 的 传 播 媒 介 易 感 者 为 老 年 患 者 早 产 儿 和 新 生 儿, 手 术 创 伤

138 133 严 重 烧 伤 气 管 切 开 或 插 管 使 用 人 工 呼 吸 机 行 静 脉 导 管 和 腹 膜 透 析 者, 广 谱 抗 菌 药 物 或 免 疫 抑 制 剂 应 用 者 等 在 使 用 呼 吸 机 者 中, 肺 炎 发 生 率 约 为 3%~5% 2) 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌 假 单 胞 菌 ): 又 名 嗜 - 麦 芽 窄 食 单 孢 菌 嗜 麦 芽 寡 养 单 胞 菌, 该 病 近 年 已 成 为 呼 吸 疾 病 的 较 常 见 菌 种, 仅 次 于 大 肠 埃 希 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 克 雷 伯 菌 肺 炎 链 球 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 流 感 嗜 血 杆 菌 等 在 医 院 环 境 如 制 冰 器 械 透 析 装 置 医 务 工 作 者 的 双 手 氧 气 湿 化 罐 淋 浴 蓬 头 藏 垢 水 洼 水 龙 头 血 压 计 中 心 动 / 静 脉 压 监 测 仪 消 毒 溶 液 雾 化 吸 入 及 人 工 呼 吸 装 置 通 气 管 道 等, 可 分 离 到 该 菌 该 菌 在 潮 湿 环 境 易 于 生 长 繁 殖, 而 在 干 燥 物 品 上 则 不 易 生 长 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 是 院 内 具 有 易 感 因 素 患 者 严 重 感 染 的 重 要 致 病 菌 之 一, 因 其 外 膜 渗 透 屏 障 外 排 系 统 各 种 酶 类 及 迅 速 突 变 的 靶 位 等 原 因 对 多 种 广 谱 抗 菌 药 物 包 括 泰 能 等 碳 青 霉 烯 类 先 天 耐 药 目 前 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 的 临 床 分 离 率 有 逐 年 上 升 趋 势, 耐 药 性 日 益 严 重, 抗 菌 药 物 选 择 有 一 定 困 难, 因 而 引 起 临 床 医 师 的 高 度 关 注 3) 粘 膜 炎 莫 拉 菌 : 为 革 兰 阴 性 双 球 菌, 发 现 于 1896 年, 当 时 称 卡 他 微 球 菌, 因 形 态 学 类 似 奈 瑟 球 菌 属, 后 改 称 卡 他 奈 瑟 球 菌. 但 因 该 菌 与 奈 瑟 球 菌 的 DNA 碱 基 组 成 含 量 及 脂 肪 酸 组 成 的 差 异,Catlin 提 出 将 此 菌 归 属 于 布 兰 汉 菌 属, 称 为 卡 他 布 兰 汉 菌, 后 将 布 兰 汉 菌 属 改 成 莫 拉 菌 属 的 亚 属, 而 改 现 名. 近 年 来 的 研 究 表 明 MC 可 引 起 临 床 多 种 感 染, 儿 童 及 免 疫 缺 陷 者 更 具 感 染 性 3.2 出 水 口 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 采 用 稀 释 涂 板 法 对 水 质 净 化 设 备 中 出 设 备 后 的 水 ( 即 出 水 口 ) 中 的 细 菌 进 行 了 分 离 纯 化, 共 鉴 定 2 株 细 菌, 其 菌 株 形 态 特 征 和 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 见 表 2 表 2 出 水 口 的 细 菌 特 征 及 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 细 菌 编 号 菌 落 特 征 Sim Index 菌 种 名 ( 拉 丁 文 ) FJAT FJAT 中, 乳 白 色, 圆 形, 光 滑, 扁 平, 湿 润, 有 光 泽 中, 金 黄 色, 圆 形, 光 滑, 平 整, 湿 润, 有 光 泽, 不 透 明 Stenotrophomonas-maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) Kocuria-kristinae 菌 种 名 ( 中 文 ) 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 克 氏 库 克 菌 从 表 2 可 知, 两 株 细 菌 的 匹 配 度 均 大 于 0.5, 所 以 FJAT FJAT 两 株 可 以 基 本 上 确 定 为 数 据 库 中 的 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 和 克 氏 库 克 菌 表 2 中 不 同 于 进 水 口 的 菌 株 的 形 态 学 特 征 分 别 如 下 : 1) 克 氏 库 克 菌 : 原 名 克 氏 微 球 菌. 考 克 菌 属 是 革 兰 阳 性 球 菌, 广 泛 存 在 于 土 壤 水 及 人 类 皮 肤 或 呼 吸 道, 一 般 不 致 病, 但 当 机 体 抵 抗 力 下 降 时 可 以 引 起 人 类 感 染 甚 至 出 现 败 血 症 3.3 水 龙 头 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 采 用 稀 释 涂 板 法 对 自 来 水 即 水 龙 头 的 细 菌 进 行 了 分 离 纯 化, 共 得 到 4 株 细 菌, 其 菌 株 形 态 特 征 和 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 见 表 3

139 134 表 3 水 龙 头 的 细 菌 特 征 及 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 细 菌 编 号 菌 落 特 征 Sim Index 菌 种 名 ( 拉 丁 文 ) FJAT FJAT FJAT FJAT 大, 乳 黄 色, 圆 形, 平 整, 光 滑, 湿 润, 透 明, 有 光 泽 偏 小, 圆 形, 不 规 则, 乳 白 色, 透 明, 湿 润, 有 光 泽 小, 粉 红 色, 圆 形, 光 滑, 扁 平, 湿 润, 有 光 泽, 中, 乳 白 色, 圆 形, 光 滑, 湿 润, 透 明, 有 光 泽 Acinetobacter-haemolyticus Stenotrophomonas-maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) Corynebacterium-diphtheriae-intermedius Stenotrophomonas-maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) 菌 种 名 ( 中 文 ) 溶 血 不 动 杆 菌 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 从 表 3 可 知, 仅 细 菌 FJAT 的 匹 配 度 均 大 于 0.5, 所 以 FJAT 可 以 基 本 上 确 定 为 数 据 库 中 的 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 表 3 中 不 同 于 进 水 口 的 菌 株 的 形 态 学 特 征 分 别 如 下 : 1) 溶 血 不 动 杆 菌 :G-, 也 有 G+ 细 胞, 较 粗 的 短 杆, 也 有 球 状,0.5~ ~1.2; 氧 化 酶 阴 性, 触 酶 明 胶 水 解 溶 血 性 皆 为 阳 性 ; 葡 萄 糖 产 酸 微 弱 ; 可 利 用 中 长 链 烃 乙 醇 苹 果 酸 等, 不 利 用 甲 酸 盐 乳 酸 盐 和 丙 酸 盐 等 可 产 大 量 乳 化 剂, 用 于 采 油 和 含 油 污 水 治 理 2) 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 : 棒 状 杆 菌 属 ( diphtheriae), 本 属 细 菌 菌 体 一 端 或 两 端 膨 大 呈 棒 状, 革 兰 染 色 阳 性, 有 异 染 颗 粒, 排 列 不 规 则, 常 呈 栅 栏 状 本 属 细 菌 种 类 多, 主 要 有 白 喉 棒 状 杆 菌 和 类 白 喉 棒 状 杆 菌 引 起 人 类 疾 病 的 主 要 是 白 喉 棒 状 杆 菌, 俗 称 白 喉 杆 菌, 为 白 喉 的 病 原 菌, 白 喉 是 一 种 急 性 呼 吸 道 传 染 病, 其 特 征 是 咽 喉 等 处 形 成 灰 白 色 假 膜 本 菌 不 侵 入 血 流, 其 外 毒 素 进 入 血 液 后 可 引 起 全 身 中 毒 症 状 菌 体 细 长 微 弯, 一 端 或 两 端 膨 大 成 棒 状, 排 列 不 规 则, 常 呈 L V Y 形 或 呈 栅 栏 状 革 兰 染 色 阳 性, 用 美 蓝 或 Neisser 染 色 可 见 异 染 颗 粒 ( 见 彩 图 ), 是 本 菌 的 形 态 特 征 之 一 需 氧 或 兼 性 厌 氧, 在 普 通 培 养 基 上 虽 可 生 长, 但 形 态 不 典 型, 在 凝 固 血 清 培 养 基 上 生 长 迅 速, 形 成 灰 白 色, 圆 形 的 菌 落, 异 染 颗 粒 明 显, 形 态 典 型 在 含 有 0.03%~0.04% 亚 碲 酸 钾 血 清 琼 脂 平 板 上 生 长 时, 菌 体 能 吸 收 碲 盐, 将 其 还 原 为 金 属 碲, 使 菌 落 呈 灰 黑 色 或 黑 色

140 试 验 结 论 1) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 设 备 进 水 口 设 备 出 水 口 水 龙 头 处 共 分 离 到 的 细 菌 种 类 有 6 种, 分 别 为 : 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌 假 单 胞 菌 ) 粘 膜 炎 莫 拉 菌 克 氏 库 氏 菌 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 溶 血 不 动 杆 菌 2) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 设 备 进 水 口 分 离 到 3 株 细 菌, 分 别 为 : 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌 假 单 胞 菌 ) 粘 膜 炎 莫 拉 菌. 3) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 设 备 出 水 口 分 离 到 2 株 细 菌, 分 别 为 : 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌, 假 单 胞 菌 ) 克 氏 库 氏 菌 4) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 水 龙 头 分 离 到 4 株 细 菌, 分 别 为 : 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 溶 血 不 动 杆 菌 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌 假 单 胞 菌 ) 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 5) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 设 备 进 水 口 设 备 出 水 口 水 龙 头 处 分 离 到 的 细 菌 脂 肪 酸 结 果 见 附 件 1. 5 参 考 文 献 [1] 张 国 赏, 吴 文 鹃, 潘 仁 瑞. 气 相 色 谱 一 质 谱 法 检 测 细 胞 脂 肪 酸 及 其 在 细 菌 鉴 定 上 的 应 用 [J]. 合 肥 联 合 大 学 学 报.2000,10(4): 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 宋 泽 琼

141 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 发 酵 床 养 猪 垫 料 的 酸 碱 度 与 电 导 率 的 测 定 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

142 试 验 目 的 微 生 物 发 酵 床 养 猪 是 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 的 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 [1] 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 在 有 益 微 生 物 菌 种 作 用 下 的 一 种 无 污 染 零 排 放 良 性 循 环 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 [2-7] 目 前, 许 多 大 规 模 正 规 的 养 猪 基 地 均 采 用 微 生 物 发 酵 床 技 术 该 技 术 与 传 统 养 猪 模 式 相 比, 有 诸 多 的 优 点 [8-13], 如 解 决 了 粪 污 处 理 问 题, 改 善 了 猪 的 生 长 环 境, 提 高 饲 料 的 利 用 率, 增 强 了 机 体 的 免 疫 力 和 抗 病 力, 节 约 资 源, 提 高 了 养 殖 效 益 等 垫 料 的 主 要 作 用 是 保 温 隔 热 吸 收 粪 尿 和 水 分, 从 而 维 持 动 物 的 舒 适 性 和 栏 内 的 清 洁 度, 使 动 物 生 活 在 舒 适 的 环 境 中, 它 直 接 与 动 物 体 接 触, 也 影 响 着 猪 舍 内 的 微 环 境, 对 实 验 动 物 的 健 康 和 实 验 结 果 有 极 大 的 影 响 [14] ph 值 是 影 响 微 生 物 生 长 的 重 要 条 件 之 一, 有 机 物 料 堆 积 发 酵 过 程 中, 堆 内 酸 碱 度 是 变 化 的, 微 生 物 的 降 解 活 动, 需 要 一 个 微 酸 性 或 中 性 的 环 境 条 件,pH 值 过 高 或 过 低 都 不 利 于 微 生 物 的 繁 殖 和 有 机 物 的 降 解 土 壤 营 养 液 和 灌 溉 水 的 盐 度 对 于 园 艺 作 物 和 植 物 生 长 很 重 要, 溶 液 的 电 导 率 受 温 度 影 响, 它 反 映 了 浸 提 液 中 的 离 子 总 浓 度, 即 可 溶 性 盐 的 含 量 ; 土 壤 的 盐 度 则 依 赖 于 土 壤 结 构 和 正 确 的 含 水 量, 且 溶 液 的 电 导 率 和 盐 度 之 间 有 着 密 切 的 相 关 性 本 实 验 中 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 ph 值 电 导 率 的 测 定 参 照 土 壤 的 测 定 方 法, 以 期 了 解 不 同 发 酵 时 间 垫 料 的 物 理 性 状, 为 今 后 快 速 测 定 垫 料 的 理 化 性 质 提 供 可 靠 方 法 和 理 论 依 据, 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 样 品 垫 料 采 集 自 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场, 具 体 信 息 见 表 1 表 1 垫 料 的 具 体 信 息 样 品 样 品 数 量 使 用 时 间 采 集 时 间 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 垫 料 9 4 个 月 年 年 半 设 备 及 试 剂 :HI 便 捷 式 水 质 电 导 率 土 壤 盐 度 测 定 仪 Starter 3C ph 计 振 荡 器 2mm 筛 300 目 过 滤 筛 去 离 子 水 去 CO2 蒸 馏 水 100ml 三 角 瓶 25ml 量 筒 10ml 离 心 管 2.2 试 验 方 法 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 测 定 用 HI 便 捷 式 水 质 电 导 率 土 壤 盐 度 测 定 仪 的 HI76305( 不 锈 钢 探 头 ) 测 定 盐 度, 将 探 头 尖 完 全 和 垫 料 接 触, 如 果 干 燥, 则 加 入 去 离 子 水, 等 到 显 示 的 数 值 稳 定 后 再 读 数 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 电 导 率 测 定

143 138 称 取 过 2mm 筛 的 风 干 垫 料 10g, 放 在 100ml 三 角 瓶 中, 采 用 土 水 比 1..2, 加 无 CO2 蒸 馏 水 20ml, 盖 好 瓶 塞, 在 振 荡 器 上 振 荡 30min, 放 置 30min, 通 过 300 目 过 滤 筛 过 滤 垫 料 溶 液, 滤 液 倒 入 10ml 离 心 管, 测 量 电 导 率 值 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 酸 碱 度 测 定 采 用 电 位 法 测 定 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 酸 碱 度 : 称 取 过 2mm 筛 的 风 干 垫 料 10g, 放 在 100ml 三 角 瓶 中, 采 用 土 水 比 1..10, 加 无 CO2 蒸 馏 水 50ml, 盖 好 瓶 塞, 在 振 荡 器 上 振 荡 30min, 放 置 30min, 通 过 300 目 过 滤 筛 过 滤 垫 料 溶 液, 滤 液 倒 入 10ml 离 心 管, 用 酸 度 计 测 定 数 据 处 理 利 用 Excel DPS 数 据 统 计 分 析 软 件 进 行 数 据 处 理 3. 试 验 结 果 3.1 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 见 表 2 和 图 1, 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 盐 度 介 于 g/l 之 间, 平 均 为 0.59g/l; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 盐 度 介 于 g/l 之 间, 平 均 为 0.56g/l; 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 盐 度 介 于 g/l 之 间, 平 均 为 0.71 g/l 表 2 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 和 电 导 率 样 品 盐 度 (g/l) 电 导 率 (ms/cm) ph 值 扶 摇 1 栏 扶 摇 2 栏 扶 摇 3 栏 扶 摇 4 栏 扶 摇 5 栏 扶 摇 6 栏 扶 摇 7 栏 扶 摇 8 栏 扶 摇 9 栏 福 安 山 上 1 栏 福 安 山 上 2 栏 福 安 山 上 3 栏 福 安 山 上 4 栏 福 安 山 上 5 栏 福 安 山 上 6 栏 福 安 山 下 左 1 栏 福 安 山 下 左 2 栏 福 安 山 下 左 3 栏 福 安 山 下 右 1 栏 福 安 山 下 右 2 栏 福 安 山 下 右 3 栏 新 店 1 栏 新 店 2 栏 新 店 4 栏 新 店 8 栏

144 139 新 店 9 栏 新 店 10 栏 新 店 12 栏 新 店 13 栏 新 店 14 栏 新 店 15 栏 新 店 16 栏 盐 度 (g/l) 扶 摇 1 栏 扶 摇 2 栏 扶 摇 3 栏 扶 摇 4 栏 扶 摇 5 栏 扶 摇 6 栏 扶 摇 7 栏 扶 摇 8 栏 扶 摇 9 栏 样 品 编 号 图 1 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 盐 度 盐 度 (g/l) 山 上 1 栏 山 上 2 栏 山 上 3 栏 山 上 4 栏 山 上 5 栏 山 上 6 栏 山 下 左 1 栏 样 品 编 号 山 下 左 2 栏 山 下 左 3 栏 山 下 右 1 栏 山 下 右 2 栏 山 下 右 3 栏 图 2 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 盐 度 盐 度 (g/l) 新 店 1 栏 新 店 2 栏 新 店 4 栏 新 店 8 栏 新 店 9 栏 新 店 10 栏 新 店 12 栏 新 店 13 栏 新 店 14 栏 新 店 15 栏 新 店 16 栏 样 品 编 号 图 3 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 垫 料 的 盐 度

145 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 电 导 率 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 电 导 率 见 表 1 和 图 4- 图 6, 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 电 导 率 介 于 ms/cm 之 间, 平 均 为 4.39 ms/cm; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 介 于 ms/cm 之 间, 平 均 为 9.16 ms/cm; 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 电 导 率 介 于 ms/cm 之 间, 平 均 为 5.64 ms/cm [15] 聂 永 丰 认 为, 当 堆 肥 电 导 率 (EC) 值 小 于 9.0 ms/cm, 对 种 子 发 芽 没 有 抑 制 作 用, 说 明 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 和 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 样 品 自 然 发 酵 后 若 作 为 堆 肥, 对 种 子 发 芽 没 有 抑 制 作 用 电 导 率 (ms/cm) 扶 摇 1 栏 扶 摇 2 栏 扶 摇 3 栏 扶 摇 4 栏 扶 摇 5 栏 扶 摇 6 栏 扶 摇 7 栏 扶 摇 8 栏 扶 摇 9 栏 样 品 编 号 图 4 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 电 导 率 电 导 率 (ms/cm) 山 上 1 栏 山 上 2 栏 山 上 3 栏 山 上 4 栏 山 上 5 栏 山 上 6 栏 山 下 左 1 栏 样 品 编 号 山 下 左 2 栏 山 下 左 3 栏 山 下 右 1 栏 山 下 右 2 栏 山 下 右 3 栏 图 5 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 电 导 率 (ms/cm) 新 店 1 栏 新 店 2 栏 新 店 4 栏 新 店 8 栏 新 店 9 栏 新 店 10 栏 新 店 12 栏 样 品 编 号 新 店 13 栏 新 店 14 栏 新 店 15 栏 新 店 16 栏 图 4 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率

146 养 猪 微 生 物 垫 料 的 酸 碱 度 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 酸 碱 度 见 表 1 和 图 7- 图 9, 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 ph 值 介 于 之 间, 平 均 为 6.52; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 介 于 之 间, 平 均 为 7.06; 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 电 导 率 介 于 之 间, 平 均 为 ph 值 扶 摇 1 栏 扶 摇 2 栏 扶 摇 3 栏 扶 摇 4 栏 扶 摇 5 栏 扶 摇 6 栏 扶 摇 7 栏 扶 摇 8 栏 扶 摇 9 栏 样 品 编 号 图 7 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 ph 值 ph 值 山 上 1 栏 山 上 2 栏 山 上 3 栏 山 上 4 栏 山 上 5 栏 山 上 6 栏 山 下 左 1 栏 样 品 编 号 山 下 左 2 栏 山 下 左 3 栏 山 下 右 1 栏 山 下 右 2 栏 山 下 右 3 栏 图 8 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 ph 值 ph 值 新 店 1 栏 新 店 2 栏 新 店 4 栏 新 店 8 栏 新 店 9 栏 新 店 10 栏 新 店 12 栏 样 品 编 号 新 店 13 栏 新 店 14 栏 新 店 15 栏 新 店 16 栏 图 9 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 垫 料 的 ph 值

147 不 同 使 用 时 间 垫 料 的 酸 碱 度 与 盐 度 电 导 率 的 关 系 比 较 宁 德 扶 摇 村 福 安 溪 柄 猪 场 福 州 新 店 猪 场 垫 料 的 酸 碱 度 与 盐 度 电 导 率 的 平 均 值, 见 图 10, 不 同 使 用 时 间 垫 料 的 盐 度 p=0.1209, 即 p>0.05, 说 明 这 三 个 地 方 垫 料 的 盐 度 间 无 显 著 性 差 异 ; 三 个 地 方 垫 料 的 电 导 率 p=0.0001, 即 p<0.01, 说 明 这 三 个 地 方 垫 料 的 电 导 率 间 有 显 著 性 差 异 ; 三 个 地 方 垫 料 的 ph 值 显 著 性 差 异 比 较 可 知, 新 店 猪 场 垫 料 的 ph 值 与 扶 摇 和 福 安 的 有 显 著 性 差 异 使 用 时 间 越 长, 电 导 率 也 越 大, 即 福 安 市 > 新 店 镇 > 扶 摇 村 的 盐 度 电 导 率 ph 值 扶 摇 村 (4 个 月 ) 福 安 市 (2 年 ) 新 店 镇 (1.5 年 ) 图 10 不 同 使 用 时 间 垫 料 的 酸 碱 度 与 盐 度 电 导 率 的 关 系 4. 试 验 讨 论 盐 度 即 植 物 吸 收 溶 解 在 灌 溉 水 中 的 营 养 元 素, 土 壤 中 离 子 浓 度 的 大 小 与 土 壤 的 类 型 有 关, 根 据 土 壤 的 化 学 组 成 和 其 持 水 量, 土 壤 可 能 富 含 营 养 成 分 或 贫 瘠 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 盐 度 平 均 为 0.59g/l; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 盐 度 平 均 为 0.56g/l; 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 盐 度 平 均 为 0.71 g/l 与 适 宜 种 植 的 土 壤 盐 度 值 范 围 比 较, 这 些 样 品 的 盐 度 较 小, 可 以 作 为 植 物 和 果 树 的 肥 料 电 导 率 是 灌 溉 水 和 营 养 液 最 重 要 的 参 数, 灌 溉 需 要 定 期 检 查, 特 别 是 无 土 栽 培, 如 果 电 导 率 值 很 高, 对 植 物 的 影 响 会 非 常 严 重 ; 营 养 液 的 持 效 性 对 植 物 的 生 长 和 产 量 非 常 重 要, 根 据 不 同 的 植 物 状 态, 施 用 正 确 的 营 养 液, 可 以 得 到 较 好 的 效 果, 因 此 需 要 定 期 检 测 电 导 率 值, 确 保 和 植 物 状 态 相 适 合, 且 植 物 有 季 节 性, 如 在 夏 季 需 要 较 低 电 导 率 的 溶 液 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 4.39 ms/cm; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 9.16 ms/cm; 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 5.64 ms/cm 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 ph 值 平 均 为 6.52; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 7.06; 中 国 人 民 解 放 军 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 8.36 这 三 个 地 方 垫 料 的 盐 度 间 无 显 著 性 差 异, 电 导 率 间 有 显 著 性 差 异 ; 三 个 地 方 垫 料 的 ph 值 显 著 性 差 异 比 较 可 知, 新 店 猪 场 垫 料 的 ph 值 与 扶 摇 和 福 安 的 有 显 著 性 差 异 使 用 时 间 越 长, 电 导 率 也 越 大, 即 福 安 市 > 新 店 镇 > 扶 摇 村 的 5. 参 考 文 献 [3]. 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版

148 143 社,2009, 5. [4]. 张 庆 宁, 胡 明, 朱 荣 生. 生 态 养 猪 模 式 中 发 酵 床 优 势 细 菌 的 微 生 物 学 性 质 及 其 应 用 研 究 [J]. 山 东 农 业 科 学,2009,4: [5]. 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 5. [6]. S.M.Tiquia,N.F.Y.Tam,I.J.Hodgkiss.Effects of turning frequency on composting of spent pig-manure sawdust litter[j]. Bioresource Technology, 1997 (62): [7]. Tam,N. F. Y.&Vrijmoed,L.L.P. Effects of Commercial Bacterial Product on Microbial Decomposition of Pig Manure Under Pig-on-litter System[J]. Research Report of the City Polytechnic of Hong Kong, 1993,BCH [8]. Tiquia,S.M. Further Composting of Pig-manure Disposed from the Pig-on-litter (POL) System in Hong Kong[J]. Ph.D. thesis. The University of Hong Kong. Pokfulam Road, Hong Kong [9]. 李 兆 华, 张 志 彬, 王 巍 等. 解 析 发 酵 床 养 猪 技 术 [J]. 吉 林 畜 牧 兽 医,2010,31(1):5-7. [10]. TapkI,Sahin A. Comparison of the thermoregulatory behaviours of low and high producing day cows in a hot environment[j].applied Animal Behaviour Scienc-e,2006,99(8):l-11. [11]. Hemsworth,P.H,Barnett,J.L.The importance of animal comfort for animal prod-uction in intensive grassland systems.in:proceedings of the 19th International Grassland Congress[J].Sao Paulo, Brazil,pp. 2001: [12]. Rebecca S.Morrison,Lee J.The behaviour, welfare, growth performance and meat quality of pigs housed in a deep-litter, large group housing system compar-ed to a conventional confinement system[j].2007: [13]. 樊 志 刚, 李 胜 刚 等. 生 物 发 酵 舍 养 猪 技 术 原 理 及 优 点 [J]. 畜 禽 饲 养,2008, 11: [14]. 白 福 翥, 发 酵 床 养 猪 关 键 技 术 [J]. 现 代 农 业 科 技,2010(12): [15]. 陈 绿 素, 彭 乃 木, 郑 秀 兰. 生 物 发 酵 舍 零 排 放 环 保 养 殖 技 术 的 基 本 原 理 及 关 键 技 术 [J]. 畜 禽 业 生 产 指 导,2010,7(255): [16]. 刘 恩 岐. 实 验 动 物 垫 料 质 量 的 评 估 [J]. 中 国 比 较 医 学 杂 志,2004,14(3): [17] 聂 永 丰. 三 废 处 理 工 程 技 术 手 册. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 宋 泽 琼

149 144 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 ( 二 ) 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

150 试 验 目 的 该 系 列 试 验, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 目 前 对 席 夫 碱 的 研 究 发 现, 很 多 席 夫 碱 都 有 很 好 的 抗 菌 活 性, 而 灰 黄 霉 素 的 4 位 置 有 一 个 C=O, 可 以 对 其 进 行 改 造, 生 成 C=N 席 夫 碱 本 次 实 验 是 利 用 甘 氨 酸 与 灰 黄 霉 素 进 行 反 应, 生 成 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 甘 氨 酸 本 身 就 是 极 性 很 大 的 物 质, 水 溶 性 也 非 常 好 通 过 缩 合, 产 物 的 极 性 也 得 到 提 升, 因 此 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 在 上 次 实 验 中, 我 们 已 经 通 过 对 反 应 后 物 质 进 行 质 谱 检 测 发 现 有 目 标 产 物 的 存 在 只 不 过 是 副 反 应 的 产 物 过 多, 而 且 与 目 标 产 物 极 性 相 近 且 都 很 大, 给 分 离 纯 化 带 来 很 大 的 困 难 另 外, 反 应 中 用 到 了 DMSO, 它 虽 然 溶 解 性 很 好, 但 是 沸 点 很 高 且 挥 发 性 极 差, 这 样 也 给 后 期 溶 剂 的 处 理 带 来 了 极 大 的 困 难 因 此, 本 次 试 验 在 总 结 上 次 试 验 的 基 础 上, 更 新 了 反 应 方 法, 试 图 能 使 反 应 向 有 利 于 目 标 产 物 生 成 的 方 向 进 行, 同 时 还 不 会 给 产 物 的 分 离 纯 化 造 成 过 多 的 困 难 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 , 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 : 1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开

151 146 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 试 剂 灰 黄 霉 素, 甲 醇, 水, 甘 氨 酸, 氢 氧 化 钠, 二 氯 甲 烷, 乙 酸 乙 酯, 目 硅 胶, 薄 层 层 析 板 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉, BRUKER 核 磁 共 振 仪,Finnigan LCQ 质 谱 仪 2.2 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 MeO MeO Cl O OMe O O Gly,MeOH,H 2 O NaOH,reflux MeO MeO Cl O OMe O N COOH 图 2 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 过 程 简 式 称 取 3.53 g(10 mmol) 灰 黄 霉 素, 加 入 50 ml 甲 醇 和 20 ml H 2O 中 称 取 0.9 g (12 mmol) 甘 氨 酸 和 1.2 g NaOH, 加 入 上 述 溶 液 加 热 到 60-70, 回 流 反 应 72h 停 止 反 应, 向 其 中 加 入 冰 水 二 氯 甲 烷 水 进 行 萃 取, 产 物 溶 于 水 层 浓 缩 得 到 的 粗 产 品 用 硅 胶 柱 分 离 纯 化, 其 淋 洗 剂 为 乙 酸 乙 酯 - 甲 醇 (1:2,v:v) 硅 胶 柱 分 离 时, 试 管 收 集 点 板, 薄 层 层 析 示 意 图 如 图 3-7

152 147 G R 图 3 图 END 图 5 图 6 图 7 图 3 中, G 为 灰 黄 霉 素 原 料 点,R 为 反 应 结 束 后 反 应 液 的 点 从 从 中 可 以 看 出, 产 物 中 至 少 有 三 个 点, 并 且 淋 洗 液 是 甲 醇 和 乙 酸 乙 酯, 极 性 很 大, 要 将 反 应 液 中 的 各 个 点 分 离 出 来, 难 度 可 想 而 知 图 4-7 为 硅 胶 柱 层 析 时, 收 集 的 试 管 薄 层 检 测 图 中 的 7-10,11,29,30,34,41,END 均 为 收 集 的 试 管 编 号 7-10 管 收 集 到 极 性 最 小 的 第 一 点,11-29 管 同 时 洗 脱 下 第 一 和 第 二 个 点,30-34 管 三 个 点 同 时 出 现, 而 41 管 以 后 则 只 剩 下 极 性 最 大 的 原 点 处 点 将 7-10 管 合 并, 减 压 蒸 干, 然 后 水 洗, 过 滤 ; 甲 醇 洗, 过 滤 收 集 滤 液 合 并, 蒸 干 ( 标 记 为 A) 41- 最 后 管 合 并, 减 压 蒸 干, 甲 醇 洗, 过 滤, 收 集 滤 液 蒸 干 ( 标 记 为 B) 管 合 并, 蒸 干, 水 洗 过 滤, 收 集 滤 渣 ( 标 记 为 C) 将 A B C 进 行 质 谱 初 步 检 测 3. 试 验 结 果

153 148 图 8 组 分 A 的 ESI-MS 谱 图 图 9 组 分 B 的 ESI-MS 谱 图 图 10 组 分 C 的 ESI-MS 谱 图 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 分 子 量 为 409.1, 或 者 以 钠 盐 的 形 式 存 在, 分 子 量 为 431 可 是 A B C 三 个 组 分 的 质 谱 图 均 没 有 出 现 目 标 峰, 而 是 很 奇 怪 的 都 出 现 了 几 乎 相 同 的 质 谱 图 它 们 的 主 峰 均 是 543.2, 另 一 个 峰 是 557.2, 与 目 标 峰 相 差 甚 远 可 是 具 体 什 么 原 因 还 不 清 楚 后 来 查 阅 资 料 发 现, 席 夫 碱 遇 水 不 稳 定, 极 其 容 易 分 解 这 可 能 的 一 个 解 释 是, 反 应 原 液 中 加 入 水, 本 来 的 最 初 目 的 是 想 让 水 溶 解 甘 氨 酸, 然 后 与 甲 醇 互 溶, 可 是 水 却 起 到 了 遏 制 反 应 进 行 的 反 作 用, 或 者 是 即 便 有 产 物 生 成, 可 是 遇 水 分 解 了 这 样 便 导 致 了 一 系 列 的 副 反 应 的 进 行, 以 至 副 产 物 峰 的 出 现 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 综 合 薄 层 层 析 结 果 以 及 质 谱 图, 并 没 有 发 现 目 的 产 物 的 出 现 还 需 要 优 化 试 验 反 应 以 及 纯 化 的

154 149 条 件, 才 能 得 到 较 为 纯 的 产 物 不 过 本 次 实 验 也 有 很 大 的 收 获, 首 先 是 了 解 到 席 夫 碱 遇 水 溶 解 分 解 ; 其 次 是 反 应 溶 剂 的 选 择, 要 根 据 原 料 以 及 产 物 的 性 质 慎 重 选 择 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: ) 李 国 勤, 孙 仁 寅. 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J]. 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1): ) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波 等. 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J]. 武 夷 科 学,2004,20: 8. 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞 等. 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J]. 河 南 农 业 科 学,2009(9): ) 朱 昌 雄, 宋 渊. 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J]. 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6): ) 石 德 清, 陈 琦, 李 中 华. 含 氨 基 酸 席 夫 碱 的 5- 氟 尿 嘧 啶 衍 生 物 的 合 成 及 其 抗 肿 瘤 活 性 [J]. 有 机 化 学,2005, 25(5): 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

155 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 阿 维 菌 素 的 PEG 化 试 验 人 员 : 于 晓 杰 潘 志 针 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 潘 志 针 于 晓 杰 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

156 151 1 试 验 背 景 聚 乙 二 醇 (polyethylene glycol, PEG) 是 一 种 ph 中 性, 无 毒, 水 溶 性 较 高 的 亲 水 聚 合 物, 其 重 复 单 元 为 氧 乙 烯 基, 端 基 为 两 个 羟 基, 呈 线 性 或 支 化 链 状 结 构 PEG 聚 合 物 是 迄 今 为 止 已 知 聚 合 物 中 蛋 白 和 细 胞 吸 收 水 平 最 低 的 聚 合 物, 由 于 PEG 无 毒 及 良 好 的 生 物 相 容 性,PEG 已 被 FDA 批 准 可 作 为 体 内 注 射 药 用 聚 合 物 药 物 的 PEG 修 饰 是 将 活 化 的 PEG 通 过 化 学 方 法 偶 联 到 药 物 上 的 过 程, 即 PEG 化 (PEGylation) PEG 具 有 高 度 的 亲 水 性, 在 水 溶 液 中 有 较 大 的 水 动 力 学 体 积, 并 且 没 有 免 疫 原 性 当 偶 联 到 药 物 分 子 或 药 物 表 面 时, 可 以 将 其 优 良 性 质 赋 予 修 饰 后 的 药 物 分 子, 改 变 它 们 在 水 溶 液 中 的 生 物 分 配 行 为 和 溶 解 性, 在 其 修 饰 的 药 物 周 围 产 生 空 间 屏 障, 减 少 药 物 的 酶 解, 避 免 在 肾 脏 的 代 谢 中 很 快 消 除, 并 使 药 物 能 被 免 疫 系 统 的 细 胞 识 别 1 PEG 最 早 用 于 药 物 修 饰 要 追 溯 到 1977 年,Abuchowsk 2 等 用 PEG 来 修 饰 牛 血 清 蛋 白, 发 现 可 以 有 效 地 改 变 其 免 疫 性 质 在 此 后 的 二 三 十 年 中,, 聚 乙 二 醇 修 饰 技 术 得 到 了 迅 速 的 发 展, 成 功 地 开 发 出 多 种 PEG 化 的 药 品 在 本 实 验 中 PEG 的 引 入, 既 可 以 增 加 阿 维 菌 素 的 水 溶 性 又 可 以 当 作 中 间 介 质 将 阿 维 与 蛋 白 连 接 起 来, 要 是 可 以 做 成 功, 其 实 是 一 举 两 得 PEG 对 蛋 白 的 修 饰 : 因 为 本 实 验 还 要 涉 及 到 以 后 对 Bt 晶 体 的 PEG 化, 因 此 在 这 里 也 介 绍 下 PEG 对 蛋 白 的 修 饰 采 用 PEG 修 饰 技 术 可 以 改 变 蛋 白 质 的 生 物 化 学 特 性, 增 加 蛋 白 水 溶 性 和 稳 定 性, PEG 化 的 蛋 白 在 保 留 天 然 蛋 白 质 的 内 在 生 物 学 活 性 的 同 时, 能 有 效 克 服 蛋 白 质 类 药 物 在 临 床 应 用 中 的 一 些 缺 点, 如 可 以 提 高 血 浆 半 衰 期, 增 强 生 物 利 用 度 等. 为 了 使 PEG 在 较 温 和 的 反 应 条 件 下 与 蛋 白 质 偶 联, 需 将 PEG 活 化, 活 化 后 的 PEG 再 与 蛋 白 质 分 子 上 的 氨 基 巯 基 或 羧 基 进 行 偶 联 氨 基 的 修 饰 : 蛋 白 质 分 子 表 面 的 氨 基 有 较 高 的 亲 核 反 应 活 性, 因 而 是 蛋 白 质 化 学 修 饰 中 最 常 被 修 饰 的 基 团. 用 于 氨 基 修 饰 的 PEG 的 种 类 较 多, 其 中 氰 脲 酰 氯 法 为 最 经 典 的 PEG 活 化 方 法, 烷 基 化 (alkylating) PEGs 和 酰 基 化 (acylation) PEGs 也 是 两 种 常 用 的 PEG 活 化 方 法 姚 文 兵 等 3 用 三 光 气 和 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 对 mpeg-5000 进 行 活 化, 再 对 人 干 扰 素 α-2b 进 行 了 修 饰. 结 果 表 明, 修 饰 后 其 热 稳 定 性 和 耐 酸 碱 稳 定 性 有 极 大 提 高, 体 内 半 衰 期 明 显 延 长 季 波 等 4 采 用 氰 脲 酰 氯 法 先 对 聚 乙 二 醇 单 甲 醚 6000 (mpeg-6000) 进 行 活 化, 再 以 活 化 后 的 PEG 对 牛 血 Cu, Zn-SOD 冻 干 粉 进 行 化 学 修 饰, 制 得 PEG-SOD 与 天 然 的 SOD 相 比, PEG-SOD 衍 生 物 在 耐 热 耐 酸 碱 以 及 抗 酶 解 方 面 都 有 显 著 提 高, 而 抗 胰 蛋 白 酶 的 能 力 强 于 抗 胃 蛋 白 酶 另 外, 这 个 实 验 中 的 氰 脲 酰 氯 也 为 我 们 提 供 了 一 个 思 路 : 或 者 可 以 将 氰 脲 酰 氯 的 三 个 氯 分 别 以 阿 维 菌 素 Bt 蛋 白 以 及 PEG 所 置 换, 合 成 一 种 新 的 物 质 不 过 难 题 是 三 个 氯 处 于 同 等 的 位 置, 要 被 三 种 不 同 物 质 分 别 替 代, 其 操 作 难 度 会 比 较 大 巯 基 的 修 饰 : 巯 基 在 蛋 白 质 组 成 中 通 常 含 量 不 高, 但 是 位 置 确 定, 因 而 可 针 对 那 些 对 活 性 影 响 不 大 呈 游 离 状 态 的 巯 基 进 行 定 量 定 点 修 饰 目 前 可 用 于 巯 基 修 饰 的 活 化 PEG 有 以 下 几 种 : (1)PEG- 邻 - 吡 啶 - 二 硫 醚 (PEG-orthopyridyl-disulphide);(2)PEG- 马 来 酰 亚 胺 (PEG-maleimide);(3)PEG- 乙 烯 基 砜 (PEG-vinylsulfone); (4)PEG- 碘 乙 酰 胺 (PEG-iodoacetamide) Goodson 等 5 通 过 重 组 技 术 把 Cys 残 基 引 入 白 介 素 (ril-2) 的 非 活 性 单 糖 基 化 位 点, 采 用 马 来 酰 亚 胺 活 化 的 PEG (PEG-maleimide) 对 其 进 行 修 饰, 结 果 表 明, PEG-Cys-rIL-2 与 ril-2 具 有 几 乎 相 同 的 生 物 活 性, 而 前 者 在 体 循 环 中 的 滞 留 时 间 是 后 者 的 4 倍 羧 基 的 修 饰 : 羧 基 也 是 蛋 白 质 分 子 侧 链 上 常 见 的 化 学 反 应 基 团, 一 般 在 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 (DCC) 或 1- 乙 基 -3- 二 甲 氨 基 丙 基 - 碳 二 亚 胺 盐 酸 盐 (EDC) 存 在 下, 羧 基 可 与 氨 基 PEG 结 合 PEG 对 小 分 子 的 修 饰 : 聚 乙 二 醇 对 小 分 子 药 物 的 修 饰, 可 以 把 它 的 许 多 优 良 性 质 也 随 之 转

157 152 移 到 结 合 物 中, 使 该 聚 合 物 具 有 优 异 的 生 物 相 容 性, 在 体 内 能 溶 于 组 织 液 中, 能 被 机 体 迅 速 排 出 体 外 而 不 产 生 任 何 毒 副 作 用, 因 此 它 在 医 学 上 的 应 用 受 到 了 广 泛 的 重 视, 目 前 以 抗 肿 瘤 药 物 为 多. 近 年 来, 采 用 PEG 修 饰 技 术 的 小 分 子 药 物 主 要 有 : 紫 杉 醇, 喜 树 碱, 阿 糖 胞 苷, 灯 盏 乙 素 等 PEG 修 饰 小 分 子 药 物, 仍 然 主 要 与 药 物 的 OH, NH2, COOH 等 基 团 反 应 Greenwald 等 6, 7, 8 报 道 了 PEG 对 喜 树 碱 的 修 饰 路 线, PEG 对 喜 树 碱 2 -OH 进 行 修 饰 后 在 水 中 的 溶 解 度 约 为 2 mg/ml, 是 原 药 喜 树 碱 溶 解 度 ( mg/ml) 的 800 倍 PEG 对 2 - 羟 基 的 修 饰 不 仅 增 加 了 药 物 的 水 溶 性, 还 提 高 了 内 酯 的 稳 定 性, 同 时 赋 予 了 药 物 抗 肿 瘤 的 靶 向 性, 动 物 实 验 发 现 前 药 在 肿 瘤 部 位 的 药 物 浓 度 是 喜 树 碱 的 30 倍, 大 大 提 高 了 其 疗 效, 现 该 药 物 已 进 入 临 床 阶 段 本 实 验 中 是 利 用 4 羟 基 进 行 羧 基 化 改 造 后 的 阿 维 菌 素, 与 PEG 衍 生 物 NH2-PEG-COOH 进 行 反 应 阿 维 菌 素 衍 生 物 的 自 由 羧 基 先 用 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 进 行 活 化 生 成 琥 珀 酰 亚 胺 酯, 然 后 再 与 PEG 的 N 端 氨 基 进 行 酰 胺 化 反 应 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 试 剂 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素,NH2-PEG-COOH,EDC, 四 氢 呋 喃,N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 (NHS), 三 乙 胺 薄 层 层 析 硅 胶 板 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵 2.2 阿 维 菌 素 的 PEG 化 反 应 1: 称 取 mmol( g)5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 mmol( g)edc 和 0.00 mmol( g)nhs 溶 于 2 ml DMF 搅 拌 反 应 40 min, 向 其 中 加 入 0.12 g 常 规 PEG(4000), 搅 拌 反 应 过 夜 反 应 2: 称 取 mmol( g)5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 mmol( g)edc 和 mmol( g)nhs 溶 于 1 ml DMF 搅 拌 1 小 时, 向 其 中 加 入 0.1 g NH2-PEG-COOH 3.5 微 升 三 乙 胺 和 0.5 ml DMF, 搅 拌 反 映 4 h 反 应 3: 称 取 g 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 g EDC 和 g NHS 溶 于 1.5 ml THF 搅 拌 1 小 时, 向 其 中 加 入 0.2 g NH2-PEG-COOH 7 微 升 三 乙 胺, 搅 拌 反 映 4 h 3 试 验 结 果 A N R A N 1 R A N 1 R

158 153 图 1 图 2 图 3 反 应 1 用 的 PEG 为 常 规 的 PEG, 即 两 端 为 羟 基 的 PEG 本 次 试 验 为 预 试 验, 主 要 是 摸 索 PEG 与 阿 维 菌 素 藕 合 的 条 件 图 1 为 反 应 1 结 束 后 薄 层 层 析 示 意 图, A N R 分 别 代 表 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 NHS 和 反 应 液 从 图 中 可 以 看 出 反 应 液 中 多 出 一 个 新 点, 说 明 阿 维 菌 素 有 可 能 与 PEG 发 生 藕 合 反 应 反 应 2 则 是 在 反 应 1 的 基 础 上, 采 用 修 饰 后 的 NH2-PEG-COOH 进 行 反 应, 而 N 端 的 氨 基 是 以 盐 酸 盐 的 形 式 存 在, 因 此 加 入 三 乙 胺 释 放 出 活 性 的 氨 基 以 便 进 行 反 应 图 2 为 反 应 2 薄 层 层 析 示 意 图, A N 1 R 分 别 代 表 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 NHS 未 加 NH2-PEG-COOH 前 的 反 应 液 以 及 最 终 反 应 液 从 图 中 可 以 看 出, 1 处 有 一 个 新 点, 应 该 是 阿 维 菌 素 与 NHS 反 应 生 成 琥 珀 酰 亚 胺 酯 的 点, R 处 又 多 个 一 个 点, 红 色 标 示, 该 点 理 论 上 应 该 为 PEG 化 后 阿 维 菌 素 的 点 由 于 反 应 2 中 采 用 的 DMF 沸 点 高, 挥 发 性 差, 溶 剂 难 以 除 去, 因 此 反 应 3 采 用 THF 做 溶 剂 进 行 反 应 图 3 为 反 应 3 薄 层 层 析 示 意 图, A N 1 R 分 别 代 表 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 NHS 未 加 NH2-PEG-COOH 前 的 反 应 液 以 及 最 终 反 应 液 从 图 中 可 以 看 出, 虽 然 1 多 了 一 个 淡 淡 的 新 点, 可 是 反 应 液 R 貌 似 冰 没 有 出 现 产 物 点 4. 试 验 结 论 一 系 列 的 文 献 资 料 显 示, 无 论 通 过 酰 胺 化 还 是 酯 化 进 行 的 阿 维 菌 素 PEG 化 反 应, 理 论 上 是 可 行 的, 该 试 验 证 明 实 际 上 也 是 可 操 作 的 本 次 实 验 中, 反 应 1 是 利 用 羧 基 与 羟 基 的 酯 化 反 应 进 行 的 PEG 藕 合 修 饰 ; 反 应 2 则 是 利 用 羧 基 与 氨 基 的 酰 胺 化 反 应 进 行 的 PEG 化 修 饰 反 应 2 中 有 新 的 物 质 点 出 现 那 么, 在 接 下 来 的 试 验 中, 则 要 继 续 摸 索 优 化 实 验 条 件 和 分 离 纯 化 条 件, 然 后 进 行 产 物 的 质 谱 核 磁 检 测 5 参 考 文 献 1) Kozlowski A,Harris JM. Improvements in protein PEGylation: pegylated interferons for treatment of hepatits C[J].J Control Release,2001,72 :217. 2) Abuchowski A, Van Es T, Palczuk NC, et al. Alteration of immunological properities of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol[j]. J Biol Chem, 1977,252: ) 姚 文 兵, 林 碧 蓉, 沈 子 龙 等. 聚 乙 二 醇 修 饰 干 扰 素 α-2b 的 分 离 纯 化 和 制 备. 中 国 生 化 药 物 杂 志,2001, 22, ) 季 波, 徐 滢 波, 赵 树 进. 聚 乙 二 醇 修 饰 超 氧 化 物 歧 化 酶 及 其 稳 定 性 研 究. 广 州 医 学 院 学 报, 2002, 30, 16. 5) Goodson, R. J., Katre, N. V. Site-direct PEGylation of interleukin-2 at its glycosylation site. Bio/technology. 1990, 8, ) Greenwald, R. B., Pendri, A., Conover, C. Drug delivery system. 2.Camptothecin 20-O-poly (ethylene glycol) ester transport forms. J. Med. Chem.1996, 39, ) Pendri, A., Conover, C. D., Greenwald, R. B. Antitumor activity of paclitaxel-20-glycinate conjugated to poly (ethylene glycol): a water-soluble prodrug. Anti-Cancer Drug Des. 1998, 13, ) Conover, C. D.; Greenwald, R. B. Camptothecin delivery system: enhanced efficacy and tumor accumulation

159 154 of camptothecin following its conjugation to polyethylene glycol via a glycine linker. Cancer Chemother. Pharmacol. 1998, 42, 407. 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 潘 志 针 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 潘 志 针, 于 晓 杰, 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 潘 志 针

160 155 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 ( 三 ) 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

161 156 1 试 验 目 的 在 上 两 次 次 实 验 中, 我 们 已 经 通 过 对 反 应 后 物 质 进 行 质 谱 检 测 发 现 有 目 标 产 物 的 存 在, 但 是 接 下 来 的 时 候 改 变 了 下 试 验 条 件, 反 而 没 有 产 物 生 成 本 次 试 验 在 总 结 上 几 次 试 验 的 基 础 上, 继 续 改 进 反 应 方 法, 试 图 在 反 应 顺 利 的 同 时, 反 应 产 物 也 更 容 易 分 离 纯 化 该 系 列 试 验, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 目 前 对 席 夫 碱 的 研 究 发 现, 很 多 席 夫 碱 都 有 很 好 的 抗 菌 活 性, 而 灰 黄 霉 素 的 4 位 置 有 一 个 C=O, 可 以 对 其 进 行 改 造, 生 成 C=N 席 夫 碱 本 次 实 验 是 利 用 甘 氨 酸 与 灰 黄 霉 素 进 行 反 应, 生 成 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 甘 氨 酸 本 身 就 是 极 性 很 大 的 物 质, 水 溶 性 也 非 常 好 通 过 缩 合, 产 物 的 极 性 也 得 到 提 升, 因 此 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 , 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 :1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生

162 157 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 试 剂 灰 黄 霉 素, 甲 醇, 甘 氨 酸, 氢 氧 化 钾, 二 氯 甲 烷, 乙 酸 乙 酯, 石 油 醚, 石 油 醚, 薄 层 层 析 板 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉,BRUKER 核 磁 共 振 仪,Finnigan LCQ 质 谱 仪 2.2 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 MeO O OMe MeO O OMe MeO Cl O O Gly,MeOH KOH,reflux MeO Cl O N COOH 图 2 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 过 程 简 式 反 应 1: 称 取 8 mmol 甘 氨 酸 8 mmol KOH 加 入 30 ml 甲 醇 中, 加 热 搅 拌 回 流 反 应 1 小 时, 过 滤 去 掉 少 量 残 渣 将 滤 液 滴 入 含 10 mmol 灰 黄 霉 素 的 甲 醇 溶 液 中 回 流 反 应 72 小 时 停 止 反 应, 待 其 冷 却 后, 放 入 冰 箱 静 置 过 夜 有 沉 淀 析 出, 过 滤 收 集 沉 淀 A 反 应 2: 称 取 3.53 g(10 mmol) 灰 黄 霉 素, 加 入 50 ml 甲 醇 中, 搅 拌 下 加 入 0.9 g (12 mmol) 甘 氨 酸 和 0.48g KOH 加 热 到 70-80, 回 流 反 应 72h 停 止 反 应, 将 反 应 液 冷 却 蒸 去 大 部 分 溶 剂, 将 反 应 液 浓 缩 到 较 小 体 积, 然 后 向 其 中 加 入 少 量 乙 醇 和 大 量 的 石 油 醚 这 时 有 沉 淀 析 出, 过 滤 收 集 沉 淀 B

163 158 G R G R 图 3 图 4 反 应 1 和 反 应 2 反 应 结 束 后, 反 应 液 点 板 结 果 相 近, 如 图 3 和 图 4 所 示 图 3 为 两 个 反 应 液 点 板 后, 用 二 氯 甲 烷 和 乙 酸 乙 酯 (2:1,v:v) 作 淋 洗 液 图 4 为 三 氯 甲 烷 和 甲 醇 (2:1,v:v) 做 淋 洗 液 图 3 中, 由 于 淋 洗 液 极 性 较 小, 产 物 点 并 没 有 跑 上 去, 而 是 聚 集 在 原 点 图 4 中, 加 大 淋 洗 液 极 性, 有 两 个 点 跑 上 去 3. 试 验 结 果 图 5 组 分 A 的 ESI-MS 谱 图

164 159 图 6 组 分 B 的 ESI-MS 谱 图 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 分 子 量 为 409.1, 本 实 验 中 反 应 产 物 要 是 以 钾 盐 形 式 存 在 责 分 子 量 为 图 5 为 组 分 A 的 质 谱 图, 图 6 为 组 分 B 的 质 谱 图 组 分 A 主 峰 分 子 量 496.8, 与 目 标 产 物 的 分 子 量 相 差 甚 远 组 分 B 质 谱 图 中 出 现 了 408.5,433.5,446.6,471.6 这 样 几 个 峰 其 中 峰 与 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 分 子 量 (409.1) 相 近 ;433.5 峰 则 与 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 同 时 加 氢 加 钠 (433.1) 相 近 ;446.6 峰 则 与 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 钾 分 子 量 (447.9) 相 近 ; 而 峰 则 与 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 钾 质 谱 加 钠 分 子 量 (470.9) 相 近 这 一 切 很 好 的 证 明 了, 组 分 B 中 应 该 存 在 着 目 标 产 物 或 者 目 标 产 物 的 钾 盐 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 两 个 反 应 薄 层 层 析 结 果 说 明 有 新 的 产 物 生 成 可 是 结 合 质 谱 图 发 现, 组 分 A 中 没 有 目 标 产 物 生 成 而 组 分 B 中 的 各 个 不 同 的 峰 值, 则 说 明 存 在 着 目 标 产 物 或 者 其 钾 盐 在 接 下 来 的 试 验 中, 则 要 进 一 步 通 过 核 磁 高 分 辨 质 谱 等 方 法 对 目 标 产 物 的 结 构 进 行 解 析 另 外, 还 要 进 一 步 摸 索 优 化 反 应 条 件, 使 产 物 产 率 得 到 提 升

165 160 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: ) 李 国 勤, 孙 仁 寅. 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J]. 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1): ) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波 等. 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J]. 武 夷 科 学,2004, 20:8. 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞 等. 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J]. 河 南 农 业 科 学,2009(9): ) 朱 昌 雄, 宋 渊. 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J]. 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6): ) 石 德 清, 陈 琦, 李 中 华. 含 氨 基 酸 席 夫 碱 的 5- 氟 尿 嘧 啶 衍 生 物 的 合 成 及 其 抗 肿 瘤 活 性 [J]. 有 机 化 学,2005, 25(5): 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

166 161 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 九 ):5 - 氯 灰 黄 霉 素 的 合 成 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

167 162 1 试 验 目 的 该 系 列 试 验 的 主 要 目 的, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 本 次 实 验 是 对 灰 黄 霉 素 的 5 位 置 进 行 改 造, 添 加 一 个 卤 素 原 子 氯, 生 成 5 - 氯 灰 黄 霉 素 通 过 该 次 反 应 的 改 造, 试 图 让 产 物 的 极 性 得 到 提 升, 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 另 外, 新 产 物 的 抑 菌 活 性 也 可 能 改 变 同 时, 还 可 以 探 讨 比 较 对 灰 黄 霉 素 5 位 置 分 别 添 加 卤 素 Br 和 Cl 产 物 性 质 的 异 同 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 , 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 :1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景

168 163 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 试 剂 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素, 氯 仿,N- 氯 代 琥 珀 酰 亚 胺, 水, 二 氯 甲 烷, 甲 醇 钠, 甲 醇, 氢 氧 化 钠 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉,BRUKER 核 磁 共 振 仪,esquire3000 plus 灰 黄 霉 素 的 合 成 MeO OOMe MeO O Cl Mol. Wt.: O NCS RT. MeO OOMe O MeO O Cl Cl Mol. Wt.: 图 氯 灰 黄 霉 素 的 合 成 过 程 简 式 称 取 1.9 g 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 溶 于 15 ml 氯 仿 中 向 上 述 溶 液 中 加 入 0.7 g N- 氯 代 琥 珀 酰 亚 胺 室 温 搅 拌 反 应 1 h 停 止 反 应, 向 其 中 加 入 冰 水,2 mol/l NaOH 溶 液 和 二 氯 甲 烷 进 行 萃 取 收 集 有 机 相, 减 压 真 空 浓 缩 到 很 小 的 体 积 向 浓 缩 液 中 加 入 10 ml 甲 醇 和 1 ml 1 mol/l 的 甲 醇 钠 溶 液, 有 沉 淀 析 出 剧 烈 搅 拌 15 min 真 空 抽 滤 收 集 固 体, 少 量 甲 醇 洗 干 燥 后 得 1.18 g 固 体 产 物 质 谱 检 测

169 164 图 3 循 环 水 真 空 干 燥 图 4 薄 层 层 析 图 5 萃 取 图 6 硅 胶 柱 层 析 3. 试 验 结 果

170 165 图 氯 灰 黄 霉 素 的 ESI-MS 谱 图 ( 一 ) 图 氯 灰 黄 霉 素 的 ESI-MS 谱 图 ( 二 ) 5 - 氯 基 灰 黄 霉 素 的 分 子 量 为 图 1 中 出 现 了 两 个 相 对 较 高 的 峰 值, 分 别 为 和 374.4, 它 们 并 不 是 目 标 产 物 的 峰, 而 有 可 能 是 灰 黄 霉 素 (352.7) 图 2 中 改 变 了 质 谱 的 条 件 以 后, 从 图 中 可 以 看 到 有 两 个 和 的 峰, 其 中 与 相 近, 有 可 能 是 本 次 试 验 的 产 物, 而 则 可 能 是 产 物 加 钠 的 结 果 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 综 合 质 谱 图, 可 以 看 到 应 该 有 目 的 产 物 合 成, 还 有 一 些 不 会 对 实 验 结 果 产 生 本 质 影 响 的 较 少 的 杂 质 在 接 下 来 还 需 要 通 过 核 磁 进 行 进 一 步 的 确 认, 以 及 对 物 质 的 抑 菌 活 性 和 水 溶 性 进 行 探 究 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: ) 李 国 勤, 孙 仁 寅 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J] 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1): ) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波, 等 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J] 武 夷 科 学,2004, 20:8 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞, 等 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J] 河 南 农 业 科 学,2009(9): ) 朱 昌 雄, 宋 渊 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J] 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6):17-19 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

171 166 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 十 ):5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 的 还 原 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

172 167 1 试 验 目 的 该 系 列 试 验 的 主 要 目 的, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 本 次 实 验 是 对 灰 黄 霉 素 的 5 位 置 进 行 改 造, 将 之 前 合 成 的 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 的 醛 基 进 行 还 原 通 过 该 次 反 应 的 改 造, 试 图 让 产 物 的 极 性 得 到 提 升, 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 另 外, 新 产 物 的 抑 菌 活 性 也 可 能 改 变 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 , 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 :1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景

173 168 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 试 剂 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素, 四 氢 呋 喃, 水, 硼 氢 化 钠, 碳 酸 氢 钠, 二 氯 甲 烷, 乙 酸 乙 酯 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉,esquire3000 plus 灰 黄 霉 素 的 合 成 MeO O OMe MeO O OMe MeO Cl O O O NaBH 4 MeO Cl O O CH 2 OH 图 醛 基 灰 黄 霉 素 还 原 过 程 简 式 称 取 1.9 g 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 溶 于 25 ml THF 和 1.5 ml 水 中 冰 浴 条 件 下, 向 上 述 溶 液 中 缓 慢 加 入 g NaBH 保 持 冰 浴 搅 拌 反 应 4 h 加 入 3%NaHCO3 溶 液 终 止 反 应 向 其 中 加 入 50 ml 乙 酸 乙 酯 进 行 萃 取, 然 后 水 洗, 饱 和 NaCl 洗 减 压 蒸 掉 溶 剂, 二 氯 甲 烷 和 乙 酸 乙 酯 (2:1,v:v) 作 为 淋 洗 液 硅 胶 柱 分 离 纯 化 质 谱 检 测

174 169 图 3 循 环 水 真 空 干 燥 图 4 薄 层 层 析 3. 试 验 结 果 图 5 萃 取 图 6 硅 胶 柱 层 析

175 170 a 图 7 硅 胶 柱 纯 化 收 集 试 管 薄 层 层 析 图 图 7 为 硅 胶 柱 纯 化 时, 收 集 的 试 管 薄 层 层 析 示 意 图, 其 实 a 代 表 原 料 点, 8-31 代 表 收 集 试 管 的 管 数 从 图 中 可 以 看 出, 管 洗 脱 下 的 为 原 料, 而 从 第 16 管 开 始 系 脱 下 产 物, 直 到 31 管 收 集 管, 蒸 干 溶 剂, 做 质 谱 检 测 图 8 产 物 ESI-MS 谱 图 本 试 验 目 标 产 物 分 子 量 382.8, 而 质 谱 图 中 主 峰 值 为 404.5, 应 该 为 产 物 在 质 谱 时 加 钠 的 缘 故 从 图 中 可 以 看 出, 主 峰 峰 值 相 对 最 高, 说 明 含 量 很 大, 而 其 它 的 杂 志 峰 都 比 较 少 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 综 合 质 谱 图, 可 以 看 到 应 该 有 目 的 产 物 合 成, 还 有 一 些 不 会 对 实 验 结 果 产 生 本 质 影 响 的 较 少 的 杂 质 在 接 下 来 还 需 要 通 过 核 磁 进 行 进 一 步 的 确 认, 以 及 对 物 质 的 抑 菌 活 性 和 水 溶 性 进 行 探 究 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: ) 李 国 勤, 孙 仁 寅 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J] 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1): ) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波, 等 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J] 武 夷 科 学,2004, 20:8 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞, 等 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J] 河 南 农 业 科 学,2009(9):

176 171 6) 朱 昌 雄, 宋 渊 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J] 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6):17-19 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

177 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 十 一 ): 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 合 成 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页

178 173 1 试 验 目 的 该 系 列 试 验, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 目 前 对 席 夫 碱 的 研 究 发 现, 很 多 席 夫 碱 都 有 很 好 的 抗 菌 活 性, 而 灰 黄 霉 素 的 4 位 置 有 一 个 C=O, 可 以 对 其 进 行 改 造, 生 成 C=N 席 夫 碱 本 次 实 验 与 灰 黄 霉 素 缩 氨 基 硫 脲 的 反 应 相 仿, 是 利 用 苯 基 氨 基 硫 脲 与 灰 黄 霉 素 进 行 反 应, 生 成 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 而 与 此 同 时, 产 物 的 极 性 也 得 到 提 升, 因 此 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 , 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 :1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景

179 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 试 剂 灰 黄 霉 素, 苯 基 氨 基 硫 脲, 冰 醋 酸, 乙 醇, 二 氯 甲 烷, 乙 酸 乙 酯 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉,BRUKER 核 磁 共 振 仪,Finnigan LCQ 质 谱 仪 2.2 灰 黄 霉 素 缩 羟 胺 的 合 成 MeO MeO Cl OOMe O O AcOH, MeOH, reflux MeO MeO 图 2 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 合 成 过 程 简 式 Cl OOMe 取 0.83 g 苯 基 氨 基 硫 脲 和 3.52 g 灰 黄 霉 素 加 入 40 ml 乙 醇 和 5 ml 醋 酸 中 加 热 回 流, 几 分 钟 后 混 合 液 变 澄 清, 薄 层 层 析 检 测, 如 图 5 所 示 继 续 反 应,2 h 后 有 黄 色 沉 淀 析 出 h 后, 停 止 反 应, 冷 却, 过 滤 收 集 沉 淀 质 谱 检 测 O HN N S HN

180 175 图 3 循 环 水 真 空 干 燥 图 4 薄 层 层 析 3. 试 验 结 果 G P R 图 5 薄 层 层 析 检 测 示 意 图 图 5 为 反 应 过 程 薄 层 层 析 检 测 G P R 分 别 代 表 灰 黄 霉 素, 苯 基 氨 基 硫 脲 和 反 应 液 从 图 中 可 以 看 出, 反 应 液 中 很 明 显 有 新 的 物 质 点 出 现 图 6 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 质 谱 图

181 176 图 6 为 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 质 谱 图 从 图 中 看 以 看 出, 主 要 有 两 个 峰, 一 个 峰, 一 个 峰 而 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 分 子 量 为 因 而,501.9 峰 很 可 能 既 是 目 的 产 物, 而 则 为 质 谱 时 物 质 加 钠 的 结 果 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 结 合 最 终 的 质 谱, 证 明 合 成 的 物 质 就 是 目 的 产 物 说 明, 成 功 的 完 成 了 另 一 种 灰 黄 霉 素 席 夫 碱 衍 生 物 的 合 成, 得 到 了 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 在 接 下 来 的 实 验 中 还 会 继 续 合 成 灰 黄 霉 素 的 其 它 衍 生 物, 也 包 括 更 多 的 席 夫 碱 衍 生 物 的 合 成, 并 研 究 探 讨 它 们 的 水 溶 性 抗 真 菌 活 力 以 及 相 应 的 结 构 上 的 位 置 与 活 性 的 关 系 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: ) 李 国 勤, 孙 仁 寅 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J] 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1): ) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波, 等 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J] 武 夷 科 学, 2004,20:8 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞, 等 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J] 河 南 农 业 科 学,2009(9): ) 朱 昌 雄, 宋 渊 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J] 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6):17-19 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

182 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 无 致 病 力 尖 孢 镰 刀 菌 FJAT-9290 在 番 茄 上 的 定 殖 特 性 研 究 ( 二 ) 试 验 人 员 : 杨 莹 莹 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

183 试 验 目 的 据 报 道, 病 原 菌 侵 染 会 引 起 植 物 体 内 源 激 素 含 量 变 化, 进 而 激 活 植 物 防 御 反 应 基 因 的 表 达 在 寄 主 病 原 物 互 作 中, 受 病 原 菌 诱 导, 可 引 起 寄 主 体 内 病 组 织 或 邻 近 组 织 中 生 理 功 能 及 生 物 能 量 的 [1] 改 变 早 在 1964 年,Staples 等 人 就 研 究 了 菜 豆 受 菜 豆 单 孢 锈 菌 侵 染 后 几 种 酶 活 性 的 变 化 在 植 物 体 内, 除 了 酶 之 外, 还 有 其 它 物 质 的 变 化 本 实 验 通 过 对 番 茄 幼 苗 接 种 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282, 定 期 取 样, 对 全 植 株 的 水 提 取 液 进 行 全 波 长 扫 描, 提 供 关 于 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 的 免 疫 抗 病 机 制 一 些 基 础 数 据 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 样 品 番 茄 幼 苗 购 于 厦 门 如 意, 生 长 期 为 20 天 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290, 致 病 菌 株 FJAT 仪 器 Shimadzu 紫 外 - 可 见 光 光 谱 仪 UV 试 验 方 法 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 致 病 菌 株 FJAT-282 摇 瓶 发 酵, 将 发 酵 液 稀 释 为 10 7 ( 以 孢 子 数 计 ) 后 浇 灌 接 种, 清 水 浇 灌 作 为 对 照, 每 隔 5 天 取 样 一 次, 称 取 香 蕉 组 织 5g, 研 磨 后 加 蒸 馏 水 30mL 提 取, 离 心 后 去 除 沉 淀, 上 清 液 用 紫 外 - 可 见 光 分 光 光 度 计 进 行 全 波 长 扫 描, 波 长 范 围 190nm-900nm, 2 个 平 行 3. 试 验 结 果 图 1 第 10 天 全 波 段 扫 描 结 果 (190nm-900nm)

184 179 如 图 1 所 示, 由 于 绝 大 多 数 物 质 的 最 大 吸 收 峰 在 400nm 以 下, 导 致 在 这 个 范 围 内 曲 线 较 为 复 杂, 难 以 分 析 对 比, 所 以 选 取 波 长 范 围 在 400nm-900nm 之 间 进 行 分 析 在 两 条 平 行 曲 线 间 有 细 微 差 别, 原 因 可 能 为 植 株 间 本 身 的 差 异 FJAT-282 FJAT-9290 CK 图 2 第 5 天 全 波 段 扫 描 结 果 FJAT-282 FJAT-9290 CK 图 3 第 10 天 全 波 段 扫 描 结 果

185 180 CK FJAT-282 FJAT-9290 图 4 第 15 天 全 波 段 扫 描 结 果 FJAT-282 FJAT-9290 CK 图 5 第 20 天 全 波 段 扫 描 结 果

186 181 FJAT-282 FJAT-9290 CK 图 6 第 25 天 全 波 段 扫 描 结 果 FJAT-282 CK FJAT-9290 图 7 第 30 天 全 波 段 扫 描 结 果

187 182 FJAT-9290 FJAT-282 CK 图 8 第 35 天 全 波 段 扫 描 结 果 FJAT-9290 CK FJAT-282 图 9 第 40 天 全 波 段 扫 描 结 果 如 图 2 所 示, 在 第 五 天 时, 用 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 处 理 的 植 株 的 水 提 取 液 与 清 水 对 照 一 样, 在 波 长 为 680nm 左 右 有 一 个 较 强 吸 收 峰, 而 致 病 菌 株 FJAT-282 在 该 波 长 处 没 有 峰 出 现 ; 随 着 时 间 的 增 加, 在 680nm 处 的 吸 收 峰 强 度 逐 渐 减 弱, 峰 的 高 度 和 宽 度 均 变 小, 如 图 3- 图 8 所 示 ; 在 第 40 天 时,

188 183 三 种 处 理 方 式 的 全 植 株 水 提 取 液 在 波 长 300nm-900nm 范 围 内 的 曲 线 光 滑, 无 吸 收 峰 出 现, 如 图 9 所 示 4. 试 验 讨 论 本 实 验 通 过 对 番 茄 幼 苗 接 种 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282, 定 期 取 样, 对 全 植 株 的 水 提 取 液 进 行 全 波 长 扫 描, 结 果 发 现 : (1) 在 接 菌 初 期, 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 处 理 的 植 株 的 水 提 取 液 与 清 水 对 照 在 波 长 680nm 处 均 出 现 一 个 较 强 的 吸 收 峰, 而 致 病 菌 株 FJAT-282 没 有 ; (2) 随 着 时 间 的 增 加, 该 吸 收 峰 的 强 度 逐 渐 减 弱 ; 在 第 40 天 时, 在 680nm 处 的 吸 收 峰 消 失 ; 根 据 文 献 可 知, 吸 收 波 长 在 680nm 的 物 质 对 应 的 颜 色 是 蓝 绿 色, 植 物 体 内 一 般 均 含 有 叶 绿 素, 因 此 全 植 株 的 水 提 取 液 在 680nm 处 有 吸 收 峰 而 经 过 致 病 菌 FJAT-282 处 理 的 植 株 维 管 束 发 生 褐 变, 叶 片 变 黄, 叶 绿 素 减 少, 全 植 株 的 水 提 取 液 在 680nm 处 的 吸 收 峰 也 降 低, 甚 至 消 失 ; 用 清 水 处 理 及 无 致 病 力 菌 株 处 理 的 植 株 在 种 植 前 期 生 长 情 况 良 好, 然 而 随 着 植 株 的 生 长, 盆 栽 土 壤 养 分 供 应 不 足, 最 终 也 导 致 植 株 叶 绿 素 减 少 5.. 参 考 文 献 [1]Staples R C, et al. Changs in proteins and several enzymes in susceptible bean leaves after infection by the bean rust fungus. Phytopathology, 1964, 54 : 760~764 [2]Sultana F,Hossain M M,Kubota M,et al. Induction of systemic resistence in Arabidopsis thaliana in response to a culture filtrate from a plant growth-promoting fungus, Phoma sp. GS8-3[J]. Plant Biol, 2009, 11(1): [3] 谢 佳 霖. 苋 菜 色 素 提 取 条 件 的 研 究 [J]. 食 品 工 业 科 技,2005,4(26): [4] 武 汉 大 学. 分 析 化 学 [M]. 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社,1982:456 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 杨 莹 莹

189 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 无 致 病 力 尖 孢 镰 刀 菌 FJAT-9290 在 香 蕉 上 的 定 殖 特 性 研 究 ( 三 ) 试 验 人 员 : 杨 莹 莹 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 4 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

190 试 验 目 的 尖 孢 镰 刀 菌 可 以 引 起 农 作 物 枯 萎 病, 是 世 界 范 围 内 毁 灭 性 的 土 传 病 害, 造 成 损 失 平 均 高 达 20%~80%, 镰 刀 菌 所 有 的 菌 株 都 能 在 土 壤 有 机 质 以 及 多 种 植 物 组 织 中 生 长 并 存 活 多 年, 极 难 彻 底 根 除 目 前 主 要 采 用 以 抗 病 品 种 为 主 的 综 合 防 治 措 施, 但 抗 病 品 种 选 育 的 周 期 较 长, 费 用 较 高, 而 且, 新 的 病 原 菌 小 种 能 够 迅 速 克 服 品 种 的 抗 性 因 而, 近 年 来, 内 生 菌 诱 导 植 物 抗 性 (ISR) 受 到 越 来 越 多 植 物 研 究 者 的 重 视, 内 生 菌 寄 生 于 植 株 体 内, 与 寄 主 互 惠 共 生, 生 长 环 境 稳 定, 更 利 于 发 挥 作 用 经 过 对 镰 刀 菌 多 种 微 生 物 防 治 作 用 的 比 较 研 究 发 现, 镰 刀 菌 非 致 病 力 菌 株 是 防 效 最 好 最 稳 定 的 生 [2] 防 因 子 之 一 非 致 病 力 镰 刀 菌 应 用 了 弱 株 系 交 互 保 护 作 用, 特 别 是 与 病 原 菌 同 型 的 非 致 病 力 菌 株, 在 根 际 与 致 病 菌 进 行 营 养 和 侵 染 位 点 的 竞 争, 诱 导 植 株 产 生 抗 性, 阻 止 或 延 迟 致 病 菌 的 进 入 和 繁 殖, 从 而 达 到 防 病 的 效 果 本 实 验 通 过 对 番 茄 幼 苗 接 种 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282, 定 期 取 样 分 离, 确 定 菌 株 在 植 物 中 的 定 殖, 提 供 关 于 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 的 免 疫 抗 病 机 制 一 些 基 础 数 据 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 样 品 番 茄 幼 苗 购 于 厦 门 如 意 集 团, 生 长 期 为 20 天 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290, 致 病 菌 株 FJAT 培 养 基 PDA 培 养 基 ( 分 离 真 菌 ): 土 豆 200g, 葡 萄 糖 20g, 琼 脂 18g, 蒸 馏 水 1000mL,0.3g 链 霉 素,pH 自 然 试 剂 无 菌 水 75% 酒 精 10% 次 氯 酸 钠 2.2 仪 器 超 净 工 作 台 酒 精 灯 接 种 环 恒 温 培 养 箱 镊 子 2.3 实 验 步 骤 灌 根 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 致 病 菌 株 FJAT-282 摇 瓶 发 酵, 将 发 酵 液 稀 释 为 10 7 ( 以 孢 子 数 计 ) 后 浇 灌 接 种, 清 水 浇 灌 作 为 对 照, 每 隔 5 天 取 样 一 次 植 株 内 生 菌 的 分 离 接 菌 后, 每 隔 5 天 采 用 组 织 贴 片 法 对 内 生 菌 进 行 分 离, 具 体 过 程 如 下 : 自 来 水 冲 洗 干 净 植 株 根 部 泥 土 后, 酒 精 棉 球 擦 拭 干 净, 将 植 株 的 茎 中 部 茎 基 部 和 根 部 用 消 毒 后 的 刀 片 切 成 均 匀 片 状, 厚 度 约 为 2~3mm 将 切 成 片 状 的 植 物 组 织 在 75% 的 酒 精 溶 液 中 浸 泡 2~3s, 然 后 在 10% 的 次 氯 酸 钠 溶 液 中 浸 泡 消 毒 7~8m 后, 用 无 菌 水 漂 洗 三 次, 将 植 物 组 织 片 贴 到 已 经 凝 固 的 PDA 平 板 表 面, 倒 置 培 养 3~4 天, 观 察 内 生 菌 的 生 长 情 况 纯 化

191 186 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 记 由 于 本 次 试 验 目 的 是 观 察 菌 株 FJAT-9290 与 菌 株 FJAT-282 在 香 蕉 中 的 定 殖 情 况, 所 以 只 挑 取 形 态 类 似 FJAT-9290 的 菌 落 进 行 纯 化, 用 接 种 环 在 菌 落 边 缘 上 取 一 点 接 种 于 平 板 中 央, 培 养 7 天 后 进 一 步 进 行 分 子 鉴 定 菌 株 的 鉴 定 用 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 的 特 异 性 引 物 进 行 PCR 反 应, 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 分 析 FJAT-9290 在 香 蕉 植 株 体 内 的 定 殖 情 况 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 的 特 异 性 引 物 P12-R1:AATAGAGCCTGCAAAGCATG,P12-F2: GTATCCTCCGGATTTTGAGC 3. 试 验 结 果 部 分 分 离 照 片 如 下 所 示 : 图 1 清 水 对 照 第 25 天 分 离 ( 反 面 ) 图 2 清 水 对 照 第 25 天 分 离 ( 正 面 ) 图 3 FJAT-9290 第 25 天 分 离 ( 反 面 ) 图 4 FJAT-9290 第 25 天 分 离 ( 正 面 )

192 187 图 5 FJAT-9290 第 25 天 分 离 ( 反 面 ) 图 6 FJAT-9290 第 25 天 分 离 ( 正 面 ) 图 7 FJAT-282 第 24 天 分 离 ( 反 面 ) 图 8 FJAT-282 第 25 天 分 离 ( 正 面 ) 图 9 FJAT-282 第 25 天 分 离 ( 反 面 ) 图 10 FJAT-282 第 25 天 分 离 ( 正 面 )

193 188 M 阳 阴 阴 图 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 如 图 11 所 示, 琼 脂 糖 电 泳 发 现, 所 有 菌 株 均 扩 增 出 1000bp 左 右 的 片 段, 与 预 计 的 目 的 片 段 大 小 相 同, 并 且 条 带 明 亮, 无 拖 尾 现 象 因 此 可 以 确 定 从 用 菌 株 FJAT-9290 处 理 的 香 蕉 体 内 分 离 到 的 是 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 通 过 形 态 上 的 鉴 定, 可 以 确 定 从 用 菌 株 FJAT-282 处 理 的 香 蕉 体 内 分 离 到 的 为 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT 试 验 讨 论 本 实 验 通 过 对 香 蕉 幼 苗 接 种 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282, 定 期 取 样 分 离 内 生 菌, 结 果 表 明 : 在 接 菌 后 的 第 5 天 至 第 40 天 内, 菌 株 FJAT-9290 和 菌 株 FJAT-282 在 香 蕉 体 内 稳 定 定 殖, 因 此 同 期 测 定 的 其 它 数 据, 如 酶 活 的 测 定 脂 肪 酸 的 测 定 等, 均 受 到 菌 株 FJAT-9290 和 菌 株 FJAT-282 的 影 响, 与 试 验 目 的 一 致, 达 到 了 预 期 效 果 5.. 参 考 文 献 [1] 沈 萍, 范 秀 荣, 李 广 武. 微 生 物 学 实 验 [M]. 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社,1999 年. [2]Fuchs,L G.,Moenne Loccoz.Y.,Delagu.G.Nonpathogenic Fusarium oxysporum strain Fo47 induces resistance to Fusarium wilt in tomoto [J]. Plant Disease, 1997, 81: 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 杨 莹 莹

194 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 致 死 率 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 1458%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

195 试 验 目 的 番 茄 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 细 菌 ( Ralstonia solanacearum nov. comb) 所 引 起 的 世 界 范 围 发 生 的 重 大 病 害 该 病 害 在 我 国 各 地 区 番 茄 上 都 有 严 重 发 生, 是 番 茄 生 产 上 的 最 重 要 病 害 之 一 目 前 生 产 上 主 要 是 采 用 抗 病 品 种 和 轮 作 套 种 等 农 业 措 施 来 防 治 青 枯 病, 但 由 于 受 到 各 种 条 件 和 原 因 的 限 制, 防 治 效 果 仍 很 不 理 想 迄 今 为 止, 仍 未 有 高 抗 青 枯 病 的 番 茄 品 种 ; 大 量 使 用 化 学 农 药 造 成 环 境 污 染 且 至 今 还 没 有 一 种 化 学 农 药 可 有 效 地 控 制 青 枯 病 的 发 生 因 此 探 索 防 治 青 枯 病 新 方 法 和 新 技 术, 对 防 治 番 茄 青 枯 病 具 有 重 要 的 现 实 意 义 陈 庆 河 等 已 经 探 索 了 无 致 病 力 青 枯 菌 株 防 治 番 茄 青 枯 病 的 生 防 潜 能 以 微 生 物 的 自 然 变 易 作 为 基 础 的 筛 选 菌 种 的 机 率 并 不 很 高 因 为 自 发 突 变 率 小, 一 个 基 因 的 自 发 突 变 率 仅 为 10-6 ~10-10 左 右 为 了 加 大 突 变 频 率, 可 采 用 物 理 或 化 学 的 因 素 进 行 诱 发 突 变 物 理 因 素 中 目 前 使 用 得 最 方 便 且 十 分 有 效 是 UV,UV 诱 变 一 般 采 用 15w 的 紫 外 灭 菌 灯, 其 光 谱 比 较 集 中 在 253.7nm 处, 这 与 DNA 的 吸 收 波 长 一 致, 可 引 起 DNA 分 子 结 构 发 生 变 化, 特 别 是 嘧 啶 间 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体, 从 而 引 起 菌 种 的 遗 传 特 性 发 生 变 易 在 生 产 和 科 研 中 可 利 用 此 法 获 得 突 变 株 本 文 介 绍 采 用 紫 外 诱 变 手 段 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 进 过 处 理, 以 研 究 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 弱 的 影 响 为 紫 外 诱 变 构 建 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 库 奠 定 基 础 2. 试 验 材 料 和 方 法 2.1 试 验 材 料 FJAT-1458 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌, 超 净 工 作 台, 台 灯, 红 布, 平 板, 涂 布 棒 等 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3, 5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 移 接 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 18h) 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 将 紫 外 灯 打 开, 预 热 30min; 取 直 径 6cm 的 无 菌 培 养 皿 ( 含 转 子 ), 加 入 菌 悬 液 5ml, 控 制 细 胞 密 度 为 10 7 ~10 8 个 /ml; 将 待 处 理 的 培 养 皿 置 于 诱 变 箱 内 的 磁 力 搅 拌 仪 上, 静 止 1 分 钟 后 开 启 磁 力 搅 拌 仪 旋 纽 进 行 搅 拌, 然 后 打 开 皿 盖, 分 别 处 理 35s 照 射 完 毕 后 先 盖 上 皿 盖, 再 关 闭 搅 拌 和 紫 外 灯 ; 菌 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 TTC 平 板 进 行 计 数 ( 避 光 培 养 3d) 数 量 统 计 对 平 板 菌 落 进 行 计 数, 并 计 算 死 亡 率 照 射 前 活 菌 数 / ml 照 射 后 活 菌 数 / ml 死 亡 率 = 100% 照 射 前 活 菌 数 / ml

196 191 实 验 流 程 图 出 发 菌 株 斜 面 活 化 37,16~24hr 振 荡 培 养 37,110rpm 过 夜 翻 接 37,110rpm 2~4hr 取 4ml 离 心 收 集 菌 体 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 玻 璃 珠 振 荡 20~30min 单 细 胞 菌 悬 液 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 在 暗 室 中 培 养 3d 平 板 菌 落 计 数 3. 试 验 结 果 3.1 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 后,TTC 平 板 上 出 现 的 菌 落 数 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 82.1% 表 1 不 同 紫 外 照 射 时 间 平 板 菌 落 数 及 其 致 死 率 处 理 时 间 活 菌 含 量 致 死 率 0s % 15s % 30s % 45s % 60s %

197 % 99.80% 90% 80% 82.10% 70% 60% 64.80% 致 死 率 50% 40% FJAT-1458 线 性 (FJAT-1458) 30% 20% 23.20% 10% 0% 0% 0s 15s 30s 45s 60s 紫 外 照 射 时 间 图 1 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 曲 线 图 化 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 经 过 紫 外 线 照 射 60s 后 的 至 弱 效 果 如 图 2 所 示, 起 菌 落 形 态 无 明 显 变 图 2 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 经 过 紫 外 线 后 照 射 至 弱 效 果 4. 试 验 讨 论 本 试 验 研 究 表 明, 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 经 过 不 同 时 间 的 紫 外 诱 变, 其 致 死 率 确 实 有 很 大 不 同, 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 82.1%, 一 般 致 死 率 为 75%-80% 为 最 优 致 死 率, 并 且 根 据 图 1, 我 们 可 以 看 出, 当 照 射 时 间 为 40s 时, 其 致 死 率 就 为 75% 左 右 同 时, 在 不 同 紫 外 照 射 时 间 的 处 理 下, FJAT-1458 的 菌 落 形 态 并 没 有 多 大 的 变 化, 但 是 其 致 病 力 的 强 弱 及 其 定 殖 能 力 并 不 能 够 通 过 菌 落 形 态 来 判 断 需 要 进 一 步 的 致 病 性 试 验 来 验 证 其 致 病 性

198 193 5 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 孙 大 光

199 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 效 果 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 1458%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

200 试 验 目 的 番 茄 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 细 菌 ( Ralstonia solanacearum nov. comb) 所 引 起 的 世 界 范 围 发 生 的 重 大 病 害 该 病 害 在 我 国 各 地 区 番 茄 上 都 有 严 重 发 生, 是 番 茄 生 产 上 的 最 重 要 病 害 之 一 目 前 生 产 上 主 要 是 采 用 抗 病 品 种 和 轮 作 套 种 等 农 业 措 施 来 防 治 青 枯 病, 但 由 于 受 到 各 种 条 件 和 原 因 的 限 制, 防 治 效 果 仍 很 不 理 想 迄 今 为 止, 仍 未 有 高 抗 青 枯 病 的 番 茄 品 种 ; 大 量 使 用 化 学 农 药 造 成 环 境 污 染 且 至 今 还 没 有 一 种 化 学 农 药 可 有 效 地 控 制 青 枯 病 的 发 生 因 此 探 索 防 治 青 枯 病 新 方 法 和 新 技 术, 对 防 治 番 茄 青 枯 病 具 有 重 要 的 现 实 意 义 陈 庆 河 等 已 经 探 索 了 无 致 病 力 青 枯 菌 株 防 治 番 茄 青 枯 病 的 生 防 潜 能 以 微 生 物 的 自 然 变 易 作 为 基 础 的 筛 选 菌 种 的 机 率 并 不 很 高 因 为 自 发 突 变 率 小, 一 个 基 因 的 自 发 突 变 率 仅 为 10-6 ~10-10 左 右 为 了 加 大 突 变 频 率, 可 采 用 物 理 或 化 学 的 因 素 进 行 诱 发 突 变 物 理 因 素 中 目 前 使 用 得 最 方 便 且 十 分 有 效 是 UV,UV 诱 变 一 般 采 用 15w 的 紫 外 灭 菌 灯, 其 光 谱 比 较 集 中 在 253.7nm 处, 这 与 DNA 的 吸 收 波 长 一 致, 可 引 起 DNA 分 子 结 构 发 生 变 化, 特 别 是 嘧 啶 间 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体, 从 而 引 起 菌 种 的 遗 传 特 性 发 生 变 易 在 生 产 和 科 研 中 可 利 用 此 法 获 得 突 变 株 本 文 介 绍 采 用 紫 外 诱 变 手 段 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 进 过 处 理, 以 研 究 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 弱 的 影 响 为 紫 外 诱 变 构 建 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 库 奠 定 基 础 2. 试 验 材 料 和 方 法 2.1 试 验 材 料 FJAT-1458 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌, 超 净 工 作 台, 台 灯, 红 布, 平 板, 涂 布 棒 等 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3, 5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 移 接 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 18h) 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 将 紫 外 灯 打 开, 预 热 30min; 取 直 径 6cm 的 无 菌 培 养 皿 ( 含 转 子 ), 加 入 菌 悬 液 5ml, 控 制 细 胞 密 度 为 10 7 ~10 8 个 /ml; 将 待 处 理 的 培 养 皿 置 于 诱 变 箱 内 的 磁 力 搅 拌 仪 上, 静 止 1 分 钟 后 开 启 磁 力 搅 拌 仪 旋 纽 进 行 搅 拌, 然 后 打 开 皿 盖, 分 别 处 理 35s 照 射 完 毕 后 先 盖 上 皿 盖, 再 关 闭 搅 拌 和 紫 外 灯 ; 菌 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 TTC 平 板 进 行 计 数 ( 避 光 培 养 3d) 数 量 统 计 对 平 板 菌 落 进 行 计 数, 并 计 算 死 亡 率 照 射 前 活 菌 数 / ml 照 射 后 活 菌 数 / ml 死 亡 率 = 100% 照 射 前 活 菌 数 / ml

201 196 实 验 流 程 图 出 发 菌 株 斜 面 活 化 37,16~24hr 振 荡 培 养 37,110rpm 过 夜 翻 接 37,110rpm 2~4hr 取 4ml 离 心 收 集 菌 体 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 玻 璃 珠 振 荡 20~30min 单 细 胞 菌 悬 液 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 40s 在 暗 室 中 培 养 3d 平 板 菌 落 计 数 3. 试 验 结 果 3.1 经 过 40s 紫 外 照 射 后 FJAT-1458 形 态 及 其 筛 选 经 过 紫 外 诱 变,FJAT-1458 其 形 态 并 没 有 发 生 很 大 的 变 化, 并 对 诱 变 后 的 FJAT-1458 进 行 保 种, 命 名 U50-U68

202 197

203 198 图 1 部 分 紫 外 诱 变 后 FJAT-1458 图 片 4. 试 验 讨 论 本 试 验 研 究 表 明, 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 经 过 不 同 时 间 的 紫 外 诱 变, 其 致 死 率 确 实 有 很 大 不 同, 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 82.1%, 一 般 致 死 率 为 75%-80% 为 最 优 致 死 率, 并 且 根 据 图 1, 我 们 可 以 看 出, 当 照 射 时 间 为 40s 时, 其 致 死 率 就 为 75% 左 右 同 时, 在 不 同 紫 外 照 射 时 间 的 处 理 下, FJAT-1458 的 菌 落 形 态 并 没 有 多 大 的 变 化, 但 是 其 致 病 力 的 强 弱 及 其 定 殖 能 力 并 不 能 够 通 过 菌 落 形 态 来 判 断 需 要 进 一 步 的 致 病 性 试 验 来 验 证 其 致 病 性 5 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 孙 大 光

204 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 效 果 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

205 试 验 目 的 番 茄 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 细 菌 ( Ralstonia solanacearum nov. comb) 所 引 起 的 世 界 范 围 发 生 的 重 大 病 害 该 病 害 在 我 国 各 地 区 番 茄 上 都 有 严 重 发 生, 是 番 茄 生 产 上 的 最 重 要 病 害 之 一 目 前 生 产 上 主 要 是 采 用 抗 病 品 种 和 轮 作 套 种 等 农 业 措 施 来 防 治 青 枯 病, 但 由 于 受 到 各 种 条 件 和 原 因 的 限 制, 防 治 效 果 仍 很 不 理 想 迄 今 为 止, 仍 未 有 高 抗 青 枯 病 的 番 茄 品 种 ; 大 量 使 用 化 学 农 药 造 成 环 境 污 染 且 至 今 还 没 有 一 种 化 学 农 药 可 有 效 地 控 制 青 枯 病 的 发 生 因 此 探 索 防 治 青 枯 病 新 方 法 和 新 技 术, 对 防 治 番 茄 青 枯 病 具 有 重 要 的 现 实 意 义 陈 庆 河 等 已 经 探 索 了 无 致 病 力 青 枯 菌 株 防 治 番 茄 青 枯 病 的 生 防 潜 能 以 微 生 物 的 自 然 变 易 作 为 基 础 的 筛 选 菌 种 的 机 率 并 不 很 高 因 为 自 发 突 变 率 小, 一 个 基 因 的 自 发 突 变 率 仅 为 10-6 ~10-10 左 右 为 了 加 大 突 变 频 率, 可 采 用 物 理 或 化 学 的 因 素 进 行 诱 发 突 变 物 理 因 素 中 目 前 使 用 得 最 方 便 且 十 分 有 效 是 UV,UV 诱 变 一 般 采 用 15w 的 紫 外 灭 菌 灯, 其 光 谱 比 较 集 中 在 253.7nm 处, 这 与 DNA 的 吸 收 波 长 一 致, 可 引 起 DNA 分 子 结 构 发 生 变 化, 特 别 是 嘧 啶 间 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体, 从 而 引 起 菌 种 的 遗 传 特 性 发 生 变 易 在 生 产 和 科 研 中 可 利 用 此 法 获 得 突 变 株 本 文 介 绍 采 用 紫 外 诱 变 手 段 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 进 过 处 理, 以 研 究 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 弱 的 影 响 为 紫 外 诱 变 构 建 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 库 奠 定 基 础 2. 试 验 材 料 和 方 法 2.1 试 验 材 料 FJAT-91 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌, 超 净 工 作 台, 台 灯, 红 布, 平 板, 涂 布 棒 等 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 移 接 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 18h) 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 2.2.2UV 诱 变 将 紫 外 灯 打 开, 预 热 30min; 取 直 径 6cm 的 无 菌 培 养 皿 ( 含 转 子 ), 加 入 菌 悬 液 5ml, 控 制 细 胞 密 度 为 10 7 ~10 8 个 /ml; 将 待 处 理 的 培 养 皿 置 于 诱 变 箱 内 的 磁 力 搅 拌 仪 上, 静 止 1 分 钟 后 开 启 磁 力 搅 拌 仪 旋 纽 进 行 搅 拌, 然 后 打 开 皿 盖, 分 别 处 理 35s 照 射 完 毕 后 先 盖 上 皿 盖, 再 关 闭 搅 拌 和 紫 外 灯 ; 菌 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 TTC 平 板 进 行 计 数 ( 避 光 培 养 3d) 数 量 统 计 对 平 板 菌 落 进 行 计 数, 并 计 算 死 亡 率 照 射 前 活 菌 数 / ml 照 射 后 活 菌 数 / ml 死 亡 率 = 100% 照 射 前 活 菌 数 / ml

206 201 实 验 流 程 图 出 发 菌 株 斜 面 活 化 37,16~24hr 振 荡 培 养 37,110rpm 过 夜 翻 接 37,110rpm 2~4hr 取 4ml 离 心 收 集 菌 体 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 玻 璃 珠 振 荡 20~30min 单 细 胞 菌 悬 液 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 40s 在 暗 室 中 培 养 3d 平 板 菌 落 计 数 3. 试 验 结 果 3.1 经 过 40s 紫 外 照 射 后 FJAT-91 形 态 及 其 筛 选 经 过 紫 外 诱 变,FJAT-91 其 形 态 并 没 有 发 生 很 大 的 变 化, 并 对 诱 变 后 的 FJAT-91 进 行 保 种, 命 名 U50-U68

207 202 图 1 部 分 紫 外 诱 变 后 FJAT-91 图 片 4. 试 验 讨 论 本 试 验 研 究 表 明, 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 经 过 不 同 时 间 的 紫 外 诱 变, 其 致 死 率 确 实 有 很 大 不 同, 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 82.1%, 一 般 致 死 率 为 75%-80% 为 最 优 致 死 率, 并 且 根 据 图 1, 我 们 可 以 看 出, 当 照 射 时 间 为 40s 时, 其 致 死 率 就 为 75% 左 右 同 时, 在 不 同 紫 外 照 射 时 间 的 处 理 下,FJAT-91 的 菌 落 形 态 并 没 有 多 大 的 变 化, 但 是 其 致 病 力 的 强 弱 及 其 定 殖 能 力 并 不 能 够 通 过 菌 落 形 态 来 判 断 需 要 进 一 步 的 致 病 性 试 验 来 验 证 其 致 病 性 5 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 孙 大 光

208 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 致 死 率 摸 索 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

209 试 验 目 的 番 茄 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 细 菌 ( Ralstonia solanacearum nov. comb) 所 引 起 的 世 界 范 围 发 生 的 重 大 病 害 该 病 害 在 我 国 各 地 区 番 茄 上 都 有 严 重 发 生, 是 番 茄 生 产 上 的 最 重 要 病 害 之 一 目 前 生 产 上 主 要 是 采 用 抗 病 品 种 和 轮 作 套 种 等 农 业 措 施 来 防 治 青 枯 病, 但 由 于 受 到 各 种 条 件 和 原 因 的 限 制, 防 治 效 果 仍 很 不 理 想 迄 今 为 止, 仍 未 有 高 抗 青 枯 病 的 番 茄 品 种 ; 大 量 使 用 化 学 农 药 造 成 环 境 污 染 且 至 今 还 没 有 一 种 化 学 农 药 可 有 效 地 控 制 青 枯 病 的 发 生 因 此 探 索 防 治 青 枯 病 新 方 法 和 新 技 术, 对 防 治 番 茄 青 枯 病 具 有 重 要 的 现 实 意 义 陈 庆 河 等 已 经 探 索 了 无 致 病 力 青 枯 菌 株 防 治 番 茄 青 枯 病 的 生 防 潜 能 以 微 生 物 的 自 然 变 易 作 为 基 础 的 筛 选 菌 种 的 机 率 并 不 很 高 因 为 自 发 突 变 率 小, 一 个 基 因 的 自 发 突 变 率 仅 为 10-6 ~10-10 左 右 为 了 加 大 突 变 频 率, 可 采 用 物 理 或 化 学 的 因 素 进 行 诱 发 突 变 物 理 因 素 中 目 前 使 用 得 最 方 便 且 十 分 有 效 是 UV,UV 诱 变 一 般 采 用 15w 的 紫 外 灭 菌 灯, 其 光 谱 比 较 集 中 在 253.7nm 处, 这 与 DNA 的 吸 收 波 长 一 致, 可 引 起 DNA 分 子 结 构 发 生 变 化, 特 别 是 嘧 啶 间 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体, 从 而 引 起 菌 种 的 遗 传 特 性 发 生 变 易 在 生 产 和 科 研 中 可 利 用 此 法 获 得 突 变 株 本 文 介 绍 采 用 紫 外 诱 变 手 段 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 进 过 处 理, 以 研 究 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 弱 的 影 响 为 紫 外 诱 变 构 建 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 库 奠 定 基 础 2. 试 验 材 料 和 方 法 2.1 试 验 材 料 FJAT-91 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌, 超 净 工 作 台, 台 灯, 红 布, 平 板, 涂 布 棒 等 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 移 接 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 18h) 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 2.2.2UV 诱 变 将 紫 外 灯 打 开, 预 热 30min; 取 直 径 6cm 的 无 菌 培 养 皿 ( 含 转 子 ), 加 入 菌 悬 液 5ml, 控 制 细 胞 密 度 为 10 7 ~10 8 个 /ml; 将 待 处 理 的 培 养 皿 置 于 诱 变 箱 内 的 磁 力 搅 拌 仪 上, 静 止 1 分 钟 后 开 启 磁 力 搅 拌 仪 旋 纽 进 行 搅 拌, 然 后 打 开 皿 盖, 分 别 处 理 35s 照 射 完 毕 后 先 盖 上 皿 盖, 再 关 闭 搅 拌 和 紫 外 灯 ; 菌 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 TTC 平 板 进 行 计 数 ( 避 光 培 养 3d) 数 量 统 计 对 平 板 菌 落 进 行 计 数, 并 计 算 死 亡 率 照 射 前 活 菌 数 / ml 照 射 后 活 菌 数 / ml 死 亡 率 = 100% 照 射 前 活 菌 数 / ml

210 205 实 验 流 程 图 出 发 菌 株 斜 面 活 化 37,16~24hr 振 荡 培 养 37,110rpm 过 夜 翻 接 37,110rpm 2~4hr 取 4ml 离 心 收 集 菌 体 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 玻 璃 珠 振 荡 20~30min 单 细 胞 菌 悬 液 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 在 暗 室 中 培 养 3d 平 板 菌 落 计 数 3. 试 验 结 果 3.1 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 后,TTC 平 板 上 出 现 的 菌 落 数 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 83.4%

211 206 表 1 不 同 紫 外 照 射 时 间 平 板 菌 落 数 及 其 致 死 率 处 理 时 间 活 菌 含 量 致 死 率 0s % 15s % 30s % 45s % 60s % 100% 99.80% 80% 83.40% 60% 60.60% 致 死 率 40% 20% 0% -20% 8.30% 0% 0s 15s 30s 45s 60s 紫 外 照 射 时 间 图 1 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 曲 线 图 FJAT-91 线 性 (FJAT-91) 3.2 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 紫 外 诱 变 后 的 至 弱 效 果 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 经 过 紫 外 线 照 射 30s 后 的 至 弱 效 果 如 图 2 所 示, 菌 落 由 粉 红 表 面 突 起 湿 润 边 缘 有 白 色 圈, 变 为 深 红 表 面 干 燥 边 缘 无 白 圈 图 2 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 经 过 紫 外 线 后 照 射 至 弱 效 果

212 试 验 讨 论 本 试 验 研 究 表 明, 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 经 过 不 同 时 间 的 紫 外 诱 变, 其 致 死 率 确 实 有 很 大 不 同, 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 83.4%, 一 般 致 死 率 为 75%-80% 为 最 优 致 死 率, 并 且 根 据 图 1, 我 们 可 以 看 出, 当 照 射 时 间 为 40s 时, 其 致 死 率 就 为 75% 左 右 同 时, 当 照 射 时 间 为 30s 的 时 候, 强 制 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 号 菌 株 的 至 弱 现 象 比 较 明 显, 从 菌 落 形 态 上 可 以 初 步 判 断 经 过 紫 外 照 射 后 确 实 有 弱 致 病 力 菌 株 的 形 成 有 待 进 一 步 的 验 证 其 致 病 力 5 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 孙 大 光

213 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 transposase 验 证 (RS982695) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

214 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 transposase( 转 座 酶 ), 其 主 要 功 能 是 催 化 转 座 子 插 入 新 位 点, 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf02695, 该 基 因 全 长 为 1326 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

215 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

216 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

217 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5 -GGT GGA GTT GAT CGA CTG GT-3, 下 游 引 物 RS :5 -CGC TTG TTC ATC AGC AGG TA-3, 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (1) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,62 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (3) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 transposase 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1445 FJAT-1446 FJAT-1447

218 213 FJAT-1448 FJAT-1449 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-427 FJAT-428 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-459 FJAT-461 FJAT-462 FJAT-465 FJAT-468 FJAT-469 FJAT-470 FJAT-472 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-476 FJAT-452 FJAT-456 FJAT-458 FJAT-1112 FJAT-77 和 FJAT-78 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1303 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 FJAT-1463 FJAT-1112 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-476 和 FJAT-469 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS982695PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS982695PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS982695PCR 扩 增 结 果 (3)

219 214 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 transposase 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 transposase 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 transposase 序 列 的 48 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 13 株 菌 株 含 有 transposase 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 20 株 菌 株 含 有 transposase 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 15 株 菌 株 含 有 transposase 序 列 表 2 transposase PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 V - Ⅰ<0.74 FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V + FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 <Ⅱ<0.825 V +

220 215 FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A + FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V - FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V + FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A + FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 V + FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V + FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A + FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A + FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V <Ⅲ FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 A + FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A - FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0073 茄 子 南 平 V -

221 216 FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A + FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A + FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 4 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1445 FJAT-1446 FJAT-1447 FJAT-1448 FJAT-1449 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-427 FJAT-428 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-459 FJAT-461 FJAT-462 FJAT-465 FJAT-468 FJAT-469 FJAT-470 FJAT-472 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-476 FJAT-452 FJAT-456 FJAT-458 FJAT-1112 FJAT-77 和 FJAT-78 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1303 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 FJAT-1463 FJAT-1112 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-476 和 FJAT-469 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 transposase 序 列 的 48 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 13 株 菌 株 含 有 transposase 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 20 株 菌 株 含 有 transposase 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 15 株 菌 株 含 有 transposase 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

222 217 附 录 : RS98orf02695 序 列 : ATGGCGCGAGAATCGGACGGCTGGGCACACAAGGAGTTGGAAGGCGTGAATCTGGGTGACGC GAGACGCAACGAACGCGCGAAGACGCTGCTGACGAGGTTTGCCGAGAAGCCGACGGAGAGC ATCCCGCACGCGTGCCACGGCTGGAGCGAGACGATCGGCGCGTATCGTTTCATGGAGAACCCG GCGTTCGAGTGGGGCGACATCATGGAGCCGCATTGGGAGCGCACGGTGCAACGCATGGGTGAG CACGAAGTCGTGCTGTGCATTGCGGACACAACCGAACTGGACTTCAACGGCCAGGAGGCCAG CGGTCTGGGACCGCTGAACTACGAAGCGCGGCGCGGCATGTATGTGCATCCGACCTATGCGGT GAGCACGGATCGCGTGGGGCTGGGCGTGCTGGATGCCTGGATGTGGGCGCGCGAGCCCAAGG ATGCCGACGGCGAGCGTGGCGGCATCAAGGAGAGCGCGCGCTGGATCGAGGGGTACGAGCGG GTCGCCGAACTCGCCTCGCAGTTGCCGAGCACGCGGCTGGTGTACGTGGCCGATCGGGAAGCG GACATCACGGCGCTGATGCAGCGAGCCGCCGAGCTTGGGACACCGGCGGACTGGCTGATCCGC TCGACGCACAATCGCAGCCTGGACGGTGGCGAGAAGCTCTGGCCGACAGTGCTCAAGACCGA GGCGGTGGGCGAAATCGAGTTCGTCATGGCGGCTCGTGAGGGGCAGAAGGCTCGCACGGTGA AACAGGCGTTGCGTATGAAGCAGGTGACGTTGCGGTGCGGGCTTGCGCTGACGTGCGTGATCG CCAAGGAAATCGCCCCGCCGGCAGGCGTCAAGCCAGTCGAATGGCGCTTGCTCACCAATCGAG TGCCGGCCGGCGCAGACGAGCTGGTGGAGTTGATCGACTGGTACCGGGCCAGATGGGAGATTG AGATGTTCTTCCACGTGCTCAAGAACGGCTGCCGTGTCCAAGCGTTGCAGCTCTCGGCCGTTGA TCGCATCGAACGCGCGCTGGCGCTGTTCATGATCGTGGCATGGCGCATCGCTTATCTGATGCGC CTGGGCAGAACCTGTCCTGACCTGGATGCGGCGCTGTTCTTCGACCCTGATGAGATTCATGGAG CCTACCTGCTGATGAACAAGCGTAGGCCCAAGGGCGCGCCAACCCTGAACGAAGTGCTGCGCC TGGTGGCGCAAGTGGGTGGCTTCCTTGCCCGCAAGGGCGACGGCGAGCCCGGTGCCAAGACC ATCTGGGAGGGCTTGCAGCAGGTCATGACCGCCGCTCGGACACTACGCGCGCTTCGCAGTGAA GCCGCTTGA

223 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 peptidase U35 phage prohead HK97 验 证 (RS983416) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

224 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 peptidase U35 phage prohead HK97, 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf03416, 该 基 因 全 长 为 699 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

225 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

226 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

227 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5'-TCC CTA TCT GGA GGA GCT GA-3', 下 游 引 物 RS :5'-GAC AGT TCG TAG GGT TCC CA-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (4) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,64 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (2) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454

228 223 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-1103 FJAT-73 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983416PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983416PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983416PCR 扩 增 结 果 (3)

229 224 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 的 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 表 2 peptidase U35 phage prohead HK97 PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 V - Ⅰ<0.74 FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V -

230 225 FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V - FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 <Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 <Ⅲ V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A - FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V -

231 226 FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 V + FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V + FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 4. 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-1103 FJAT-73 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 的 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

232 227 附 录 RS98orf03416 序 列 : ATGCCTGTGCTTCAAGAAGCCGCGCCGCGCCGCGAACAGCGCGACATGCCGCTGGCGAGCCGC TCGGCCGCCGTGCGCACGGTCAATACCGACAGCCGGACCGTCGATCTTGTCTGGACGACCGGC GCGCGCGTGCTGCGCTACGACTGGTGGAACGACCGTCCCTATCTGGAGGAGCTGAGCCTGGAT CCTGCGCACGTGCGCATGGGCCGGCTGCAATCCGGCGCGGCGAATCTGCTGAACACCCATTCG AGCTCGGATCTGAGCGACGTGCTCGGCGTGGTCACCGGCGCGCAGCTGGACGGCGGCGCCGG CACGGCGACGGTGCGTTTCAGCCAGCGCCCGGACGTGCAGCCCGTGTTTCAGGACGTGGTCGA CGGGATCGTGCGCAGCGTCTCGGTCGGCTACGCCATCTACAAGGTCGAGCGCATCGCGCCGGC CGTCGACGGCGATCCGTGGATCTACCGCGTCATCGACTGGGAACCCTACGAACTGTCCCTGGTG GCGGTGCCGGCCGACCCGGGGGCAACCACGCGCGCGGACCCGTCCGCCGGGCCGCGCGCCTC CGGCATCCAGCAGCGCACGTTCGCGTGCGAGTTCATCGAGCAGTCCAACCCGCCGGCAGCCGC CGGCACCCGTACGAGAGAGGAAAACACCATGCCTGGTGAAACGACCACCCAGCCGGCGGCGC AGACCCCT

233 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 bacteriophage protein GP46 验 证 (RS983442) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

234 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 bacteriophage protein GP46( 噬 菌 体 蛋 白 GP46), 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf03442, 该 基 因 全 长 为 459 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 ( RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

235 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

236 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

237 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5'-GAT CAT GAC CTG AAA ACC GC-3', 下 游 引 物 RS :5'-AAT CGA ATT TGA ATG CCA CC-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 1. 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,64 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (3) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 bacteriophage protein GP46 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449

238 233 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-428 FJAT-1307 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-73 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983442PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983442PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983442PCR 扩 增 结 果 (3)

239 234 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 bacteriophage protein GP46 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 bacteriophage protein GP46 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列 的 32 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 12 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列 表 2 bacteriophage protein GP46 PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 Ⅰ<0.74 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V +

240 235 FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 <Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V + FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V + FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 V <Ⅲ FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V -

241 236 FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 V + FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 4 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-428 FJAT-1307 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-73 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列 的 32 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 12 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

242 237 附 录 RS98orf03442 序 列 : ATGGATATCGAGCTTTTCTGGAACGCCGACGAGTGCCGTTGCGAATGGCGGCAGCGCCCGGAT GGCCAACTGGCGGTCGATCATGACCTGAAAACCGCAGCGCTGGTTTCGCTGTTCACCTGGCGC CGCGCCGAGGCGGGCGACCGCTTGCCGGACCCGAAGGGGCCGCGGCGCGGCTGGTGGGGTGA CCTGCTGGGCGCCAAGCCGATCGGCTCGCGCTTGTGGTTGCTCTCGCGCGAGAAACAGACCGC CGAGGTGGTGCGGCTGGCCAAGGAATACGCGGAGGAGGCGCTGGCCTGGCTGGTCGAGGACG GCGTCTGCAAGAGCGTCGACGTGATGAGCGAGATCGTGCGACCAGGCATGTTGGGGCTGCGGT GCCGCTTCACTCGGCCGGATGCTTCCCAGGTGGCATTCAAATTCGATTTCGCCTGGCAAAACCT CTCAACGATGACGAGCTGA

243 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 Integrase catalytic region 验 证 (RS980089) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

244 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 Integrase catalytic region( 整 合 酶 催 化 区 域 ), 整 合 酶 (Integrase) 是 帮 助 逆 转 录 病 毒 把 携 带 病 毒 遗 传 信 息 的 DNA 整 合 到 宿 主 的 DNA 的 酶 通 常 由 病 毒 自 身 携 带, 并 且 不 存 在 于 宿 主 细 胞 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00089, 该 基 因 全 长 为 2841 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

245 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

246 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

247 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5'-ATG ATG GTC ATT CGG GAC AT -3', 下 游 引 物 RS :5'-GTG GTC ACT CCT GAG TGG GT-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 1. 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,64 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 2. 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3. 试 验 结 果 3.1 Integrase catalytic region 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449

248 243 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980089PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980089PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980089PCR 扩 增 结 果 (3)

249 244 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 Integrase catalytic region 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 Integrase catalytic region 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 Integrase catalytic region 序 列 的 27 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列 表 2 Integrase catalytic region PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 Ⅰ<0.74 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V +

250 245 FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 <Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V <Ⅲ FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V -

251 246 FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 4. 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (4) 在 含 有 Integrase catalytic region 序 列 的 27 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

252 247 附 录 RS98orf00089 序 列 : ATGAGGCTTGCTTCGACCGAACCCGCCTTCCAGCCGAAGTGGGTCGCCATTGAAGCCGCGTGGTCAGACGGCA ATCCCTTTGGTCGGGACGTGCTCCCCCCGTACTCCGACGCGGAGCTCGAAGGTCTCTTTGATGAATGGGGAACG CCCCCTTCGGGGCGGGCCTTCGTGAGGCGAGCCCGGCGCGATGGGCCGGTACGTGAGGTCGAGTCGCGGAGAG GCAACCTCATCTCGCGCTACACGCCGCGAAAGATGAACGGCCGTCGCCAATCGACCGAGAGCCTCGGGCCGGA GTATGCGGCTGTGATTCGCTATGACCTGGACAACTTCACGCGGGAGTTCTACTGCCAGCCAGGCACAGTCCGCG TCAACATCAAGGTGGAGCGAAAAGCAAAGGAGGGGGAGAAGACGTTTACAACCCAGTCCGTCGAGTGCACGC CGGACATTCTGTGCATTACGCCGCACGGCCTATTTATCGATGAATGGAAAACGGAACATGACCTCCTAAAGTTGC TGGAGAAGTATCCGCATCGATTTCAGAAGTGCGATGGGGACTGGCAGTGTCCAGAACGTGAGGCGTACTTTCGC GATAACTTGGGGATTACGTATCGCTTGCGGTCCTCTGCGGAACACAACCCTCGCTTTGTATCAAACCTGGAGTTT CTGCGGGACTACCTGTGTGGCGTATCGACACCACTGTCTTCCACTGCGTGGAAGGCGATGTCGTCGGTGTTGGA GCCTGTGGGCCGAATTTCACTTCAACGCTTGCTCGAGCATGCCCGGCAGCCGCTGACGCCATGGGATTTTTCGTG CATCGACGAGACGACAGTTGATGGATTTACTGTCGACGACATCTACAAGGCTATCGCCGAGCAAAAGGTCTTTG TCGACTTGTTCCACGACGACCTCACTGAACCCCACGAAACGGTACTCTGCTGCTCGCGCGAACAGCTCGAATGG GTTCGTGCCAGCAGACCAGTTCGACATGCCATATCCGAGGAGGTGGCCTTCAATGTGCATGAGGGAACGTCTTT CGTTCGAGGGCGAGAAGTATGCACGGTCAAGAGCGTGGGCAATGAGAACCTCAGTTTTGTGAGCGAAGGTGGT GAGGAGGCCAGCATGCCGTTGGCGCTCTTCGAAAAGATGCTCGACCGACGCGACGTGCAAATCCTGCGACCGC TTCAGAGCACCGAGGACCGCCTCGCAGAACTTGAGAATCCAGGTGACCAGCGTATTGCGGAGGCTTTGCGGCG TTTTCAGCTCGTGGAGGCATCCAAACATGGCAAGCCAAAGCATCAACACTCGCTTCGTACGCTTCAGCGTTACA AGGAAGCAGTAAAGAGGGCCGGCCCCGCCTACTGGGACCAAGTACATAGCTTGACGCCGAAAAAGCCTGGCGG AGGGAGGGCCCAAATATCGGCATTGGCATTGGAGCTTATCCGAGAGGTTGCACGCCAAACGAATACACCGGAGA ACCCTCTGGATGCCAACGCATATCGGCGCTACGTAAAGCTGAGTCGGGAGAAGGGTGTGCCCACCGTCTCACGC AAGACTTTCTATGTCCACTTTGGTCTCGAGAAGGATGTTCTGAAGAGACAAGGTAGTCGCGCCGCTTACAACGA AGAGCCTGCGGCTTGGTACTTGTCCCGCCAAGACAAGATTCACGGTGGCAGACCATTTCACATCGTTCACATCG ACCATACAAAGCTCGACATCCTCATCAAGATTCAAGGGCATGGCGGACGTTGGCATACCTACCGTCCCTGGCTCA CGGTGGCGATTGATGCGGAGACCCGCTCGGTGGTCGGCTTCTATTTGAGCATCCATACGCCGAGTACCGTCTCCT GCATGATGGTCATTCGGGACATGGTGTCTCGACACAGGCGAATGCCGGAAATCATTCTCGTCGATAACGGAAAG GAGTTTCGTTCCGCTGCATTCGAGATGCTGTGCGCCAAAGCTCGGACAACCCTACGGTTCCGTCCACCGCACAA ATCACGGTTCGGTTCGGTTTGCGAAAGGCTGTTTGGAACCACAAACACACTGCTGATTCACAACCTCATTGGCA ATACCAAGGCGTTACAAAAGGTTCGGACGGTGACGCGTTCGGTGGACCCACTCAGGAGTGACCACCTCACATTC CCCCAACTGCACGGTATCTTGGAATACTTCTTCTTCGACCAGTACAACAATCGCGTTCACCCAGCACACGACCAT ACTCCGAATGAATACATGACTCGGCGTTTCGCCGAGACGGGGCTTCGTTTGGAAAGGCATGTTCCCTTCAATCAA AGGTTTCTGATTGAGACCTGCGTGCCGCCCGTTCGCAACGTACCGCACTCAATTGACCGTCAGATGGGCATCAA GATTGGGCCCGTTCACTATTGGGCGGACGACTTCGCTGACCGCCGGTTCAACCAGAAGAAGGCCGAGGTCCGG ATAGATATGTGGGATGTGTCGACTATCTGGGCCAACATCAGCGGCGTTTGGGTTAAATGCGTGTCGAAGCTGCTC ATGCAATTTCGTCAGCTCACTAGCATCGAGTTGCGCTACGCATTCGACTACATACGGAAGCGCTTGGGCGGCTCA CTCCGCAACCCGACGGAAAAGGAAATTGTCGCGTCGACGAGTGACTACCTCCAGCAATTGCAGCTCGGGAACG TTGGCCAAGCGACAGCCTCAACCGCTGAGACCTATGCCGCGAAGGGCACGGCCGCGACCACAGTGCGCGCCGA ACCGACCAGTCCCTCGCATCCCGTACCAGCGCCTCCGACCCCGTCGGTCGCCCGGAAGGCATCGGATTACCAGT ATGGTTCTCGCGGGACGCTAAAGCAGCTTTGA

253 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA-dependent RNA polymerase 验 证 (RS980192) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

254 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 DNA-dependent RNA polymeraseic region( 依 赖 DNA 的 RNA 聚 合 酶 区 域 ),RNA 聚 合 酶 在 基 因 表 达 中 起 着 转 录 调 节 的 重 要 作 用, 真 核 和 原 核 细 胞 内 都 存 在 有 RNA 聚 合 酶, 大 肠 杆 菌 RNA 聚 合 酶 的 研 究 得 比 较 透 彻 的, 这 是 一 个 分 子 量 达 50 多 万, 全 酶 由 五 咱 亚 基 组 成, 去 掉 δ 亚 基 的 部 分 称 为 核 心 酶, 核 心 酶 本 身 就 能 催 化 苷 酸 间 磷 酸 二 酸 键 形 成 利 福 平 和 利 福 霉 素 能 结 合 在 β 亚 基 上 而 对 此 酶 发 生 强 烈 的 抑 制 作 用 β 亚 基 似 乎 是 酶 和 核 苷 酸 底 物 结 合 的 部 位 细 胞 内 转 录 是 在 DNA 特 定 的 起 始 点 上 开 始 的,δ 亚 基 的 功 能 是 辨 认 转 录 起 始 点 的 β 亚 基 是 酶 与 DNA 模 板 结 合 的 主 要 成 分 α 亚 基 可 能 与 转 录 基 因 的 类 型 和 种 类 有 关 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00192, 该 基 因 全 长 为 2283 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 400 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰

255 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村

256 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 青 枯 病 植 株 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口

257 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5'-AAG AAC CCA GTT AAC GCC CT-3', 下 游 引 物 RS :5'-CCT GAA CAG GAG CGT AGA GG', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (5) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,64 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存

258 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 DNA-dependent RNA polymeraseic region 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1303 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980192PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980192PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980192PCR 扩 增 结 果 (3)

259 254 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 DNA-dependent RNA polymeraseic region 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 DNA-dependent RNA polymeraseic region 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 Integrase catalytic region 序 列 的 25 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 7 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列 表 2 DNA-dependent RNA polymeraseic region PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 V - Ⅰ<0.74 FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V -

260 255 FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V - FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 <Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 <Ⅲ V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A - FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V -

261 256 FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 4 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1303 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 [1]. 在 含 有 Integrase catalytic region 序 列 的 25 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 7 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

262 257 附 录 : RS98orf00192 序 列 : GTGGGCCGCCTTATTCAAGATGGGTACGCCCAGGCCGTGCGTCGGCAGCTTGCGCGAGAGGCG GCAAGTGAACGCAAGATTAGCGAGGCAGATTTGCAGCGTGACGCCATCGAGCGCGGGCTATCT GCGTTCCGTGATGCTTTGGCGACAGCGAGCGAAGTACGCGAGTCGGCGCGTAGTCCCAAGCGG GTACCGGCCAAGATCGTGCACTACGGCCGAGCTAAGAACCCAGTTAACGCCCTGAGTGCCGAG CAACAGGCCGCCGCTTGCTGGACGACTTTGTGTAGCTATCTAGGGAAACTGGCCGAGCCGGAG GGCGTGCCGGTGCAGGCTGTAGCAGGGGGGATCGGGCGGCGCTTGAGGGACGCATGCGGCGG CGCAGAGGCGTACGGGCGTCTCGGCTATGAGCGCGCCGGCCTGGTGCTGCTGGACTGGCTGGG CCATGTCACGGGCTGGGTGGAAGAGCGCACCGGAGACCGCGCCTTCGGGTCCGCACGGCAGG AAACAAACAGCCTGCACATTACGCAGAAGTTCCTAGATGACACGCTAGGCGGCGATGAACCCA TCGAGTTCATGGAGCGCAAGCCGATGCTTGTCCCTCCTGTGCCGTGGACGCCCTCTGCTCGCGA TGGTGGGTTCCTCTACGCTCCTGTTCAGGCGATCCGAGGGGTACGTAAGGGTATCGGGTCGGAG GCGATTGTGGGCGCTCTGAACGCTTTGCAGGGCACGCCTTGGCGAGTCAACGCGCGCTTGCTG GCCGTGGCCCGCTCCTTTGAGCGCAACGCCGAGGACTTCGACGGCGGCTCCGTGGTTATGGGC AAGGTGCTGGAGGTACGGCACGACGTGCCCCACGAGCAGCAGCGTAGCAAAACGATTCGCAG CGCGTTGACGCTGGCCGCCTTTGGGGAACTGGAGCACGAAGACGCGTTCTACTTCCCGTGGAA TCTGGACTGGCGGGGCCGGATGTACCCGGCAACCACGCTGGTAAGTCCACAAGGGTCGGACCT GTGTAAAGGGCTGTTGGAGTTCGCGAACGGAACGCCGCTAGGGAGGGATGGAGGCCGCTGGC TCGCTATCCACCTGTGTAACCTCGCAGGGGCGGACAGGCGCGTGGAGGGTGGAGAGTACGTGA CGCTCACGCCTGACGAGCGCGAAGCCTGGGCGCTAGAGCACTCCGACACGCTGTGCGCAATCG CTGCCGATCCCGCCAGTAATACCCAGTGGCGCGACGCAGGAGCATTCGGACTGTGCAAGCTGA AGGGAAATGGCACGCGGCCGGTAGCTCCTGATAAGCCGTGGCAATTCCTCGCAGCGTGCTTCG AGTGGGCTGACTATCAGGCAGAGGGGCCGGGCTTCCGTAGCCGTCTTGCCGGTGCGTTAGACG GGTCGTGCTCGGGCGTGCAGATGCTCTCGGGGATGACGCGGGATGAGAGCGCAGGTGCGATGG TGAACCTCACGCCGACCGAGCGCGGGGCGGACTACTACCGCACTATGTCGGAGGCTCTGGACC GCCGCCTGTGCCGCCTCGCGGATTCTGCTGGTGTGGATGACATGGTGCACTTGAAGCACTGGG CCGGGCATGCTCTGGACCGGGACCTATTGAAGGCCCCGAGTATGACGAAGGTGTACAGCGCAG GCGTGTTCACGTTTGGGGAGCAAGTGGCGGCCAAGACCGGGGCGAGCGAATCGGAATGCCTTT GGCTGGCCCGGCATATCAATGAATGCTTCCGTGACGTTGCGCCGGGCATGCTGGACGCAATGGA GTATCTGCAAGGCGTGGCTGACGTGCTTACGAATGCTGAGCATGGCATGCACTGGGTGACGCCT GTCGGTCTGGAGGTCGAGCAATGCCGCTATGGGACGGAATCTCACATTCTGGAGACGGTTTCTC CGGGGACAGGCAAAAAGCGTAAGCGGGCGTTCAAGGTCACCAGTGACATCCTGAGCAAGCGC GGGCAGCGTGCCGGTGTCTCCCCGAACTTTGTGCACGGAGTCGATGCGGCGCACATGGTGTTG ACCATCAATGCGCTGTACCGACAGGGCGTGCGTAACTTCTGGATGGTGCATGACTCCTTTGGTG CGCCGTTCGCGCAGTGCGACGACGTGTACGCGACAACGCGCGCCATGTTCGTGGAGCTTATGT CCGCTGACCTGTTGGACGCCTGGACGCAGCAGGTAGCCGCCCCGCTCACACAGGAACAACGC GACAAGCTGCCCCCTTTACCGGCGTACGGCGCGCTTGATCTAGGCGAAGTGCGGGCGAGCACG TTTGCGTGGTTCTGA

263 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 HK97 family phage protein (RS980373) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 验 证 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

264 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 HK97 family phage protein(hk97 家 族 噬 菌 体 蛋 白 ), 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00373, 该 基 因 全 长 为 348bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 400 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

265 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

266 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

267 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5'-CCG TCT TCA AGC AGG AAA TC-3', 下 游 引 物 RS :5'-ACG CTC TAA CGC CTC CAA TA-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 1) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,60 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (3) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 HK97 family phage protein 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-450

268 263 FJAT-1300 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-427 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980373PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980373PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980373PCR 扩 增 结 果 (3)

269 264 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 HK97 family phage protein 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 HK97 family phage protein 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 HK97 family phage protein 序 列 的 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列 表 2 HK97 family phage protein PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V + FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 Ⅰ<0.74 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V +

270 265 FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 <Ⅱ<0.825 V + FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 V <Ⅲ FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V -

271 266 FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 4 试 验 讨 论 (1) 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-450 FJAT-1300 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-427 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (6) 在 含 有 HK97 family phage protein 序 列 的 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

272 267 附 录 RS98orf00373 序 列 : TTGCGTCAAGCAATCGCGGCAGCGGCCACCGTCTTCAAGCAGGAAATCGTACTCCGCGCGCCT CGCCGCACGGGTGACTTGTCGCGTGGCGTGACTGTCGCTTACGTCCCTGAGGAATCGCGTACG GGCGCCGTCGCTACCTACATAACGACCTTCATCGGTCGCGCACGAAATCGCGAGAACGGCAAG CCCGGTATGCGCCTCGCGGACGTGGCCCGCTGGCTCGAATACGGCACGTCAAAGATGGCAGCA AGCCCGTTCATTCGCCCTTCCTTCGACGCAAAGAAGGAGCAGGCCCTACAGACCGCAGAGGCG AAGATATTGGAGGCGTTAGAGCGTGGCGGGTAG

273 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 caudovirus prohead protease 验 证 (RS980384) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

274 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 caudovirus prohead protease (caudovirus 前 体 蛋 白 酶 ), 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00384, 该 基 因 全 长 为 348bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

275 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

276 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

277 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5'-GTC CAC TAC GAA AAG GCA GC-3', 下 游 引 物 RS :5'-CGG AAG TGA GAG ACA GGG AG-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (5) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,65 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (3) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3. 试 验 结 果 3.1 caudovirus prohead protease 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449

278 273 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980384PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980384PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980384PCR 扩 增 结 果 (3)

279 274 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 caudovirus prohead protease 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 caudovirus prohead protease 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 caudovirus prohead protease 序 列 的 27 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列 表 2 caudovirus prohead protease PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 V - Ⅰ<0.74 FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V -

280 275 FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 <Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 <Ⅲ V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V -

281 276 FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 4. 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 caudovirus prohead protease 序 列 的 27 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

282 277 附 录 : RS98orf00384 序 列 : GTGAAGGCCCGCACAGACGAAGCGTGGCACTCGGTGAAGAGCGGGATCATCAAGGGCACGTC CATCGGGTTTATTCCCCAGGAATACAACTACAAAGACGACGGCGGCGTCCACTACGAAAAGGC AGCCGTGCACGAGCTGTCCCTCACCGCGATTCCCTGCAATCCCGAGGCCGTGATTACGGCTTTC AAGAGCCTGCAAACACTTCACGATGACGCGCCAGCGTCAGCGGAAGAACCGGGCGAAGACCC CGCGCAGCAACCGGCCACGCCCGCCCCCAGCACGTCGGCAGGCAGCGAAGCAGCCCCGGCAC CTCAACCCGAAGTTAAGGCCGTTCGCGCCCTGCTTCTCCCTGTCTCTCACTTCCGCACATAA

283 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 hypothetical protein Bmul_0496 验 证 (RS980442) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

284 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 hypothetical protein Bmul_0496, 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00442, 该 基 因 全 长 为 348bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

285 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

286 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

287 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5'-GCA CGA GTT CAT GCT CGT AA-3', 下 游 引 物 RS :5'-GTT CCG CGA CAT GGT TAA GT-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 5. 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,65 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (6) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-49 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452

288 283 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980442PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980442PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980442PCR 扩 增 结 果 (3)

289 284 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 的 28 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 表 2 hypothetical protein Bmul_0496 PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 Ⅰ<0.74 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V +

290 285 FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 <Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V + FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 V <Ⅲ FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V -

291 286 FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 2. 试 验 讨 论 (1) 菌 株 编 号 FJAT-49 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 的 28 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

292 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 PBCV-1 DNA ligase(rs98orf00203) 验 证 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

293 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 PBCV-1 DNA ligase(pbcv-1 DNA 连 接 酶 ), 小 球 藻 病 毒 PBCV-1 是 能 够 编 码 一 个 298 氨 基 酸 ATP 依 赖 的 DNA 连 接 酶, 它 是 核 酸 转 移 酶 超 家 族 中 的 最 小 的 一 个 成 员, 主 要 包 括 ATP 依 赖 的 DNA 连 接 酶 以 及 GTP 依 赖 的 RNA 加 帽 酶 在 纯 化 重 组 蛋 白 过 程 中 PBCV-1 DNA 连 接 酶 被 研 究, 在 镁 离 子 与 ATP 存 在 的 情 况 下, 该 酶 可 以 有 效 将 带 切 口 的 DNA 有 效 的 连 接 起 来 (Ho K C., 1997) 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00203, 该 基 因 全 长 为 870 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS 和 RS ), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

294 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 莆 田 东 洋 镇

295 Rs-F V 自 己 分 离 番 茄 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平

296 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS :5'-AAC CCG TTT GTT CAG GAG TG-3', 下 游 引 物 RS :5'-ACC TGG TCC GTC ACA AGT TC-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;3000 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (7) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS :1 μl; RS :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,62 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (4) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果

297 292 3 试 验 结 果 3.1 PBCV-1 DNA ligase 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-49 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 FJAT-458 FJAT-1112 和 FJAT-77 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (3)

298 293 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 PBCV-1 DNA ligase 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 PBCV-1 DNA ligase 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列 的 28 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 7 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列 表 2 PBCV-1 DNA ligase PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 V - Ⅰ<0.74 FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 V <Ⅱ<0.825 FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 V -

299 294 FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V + FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 V + FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 V - FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 <Ⅲ A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 A - FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 V +

300 295 FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0466 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 A + FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 V - 4 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-49 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 FJAT-458 FJAT-1112 和 FJAT-77 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 2) 在 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列 的 28 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 7 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8): [5] Ho K O., Van Etten J L., Shuman S., 1997, Characterization of an ATP-Dependent DNAligase encoded by Chlorella virus PBCV-1[J]. Journal of Virology, 71(3): 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云 附 录

301 296 RS98orf00203 序 列 : ATGCTCACCAAGCCGGAACTCATCAAGTTTCCCGTGTGGGCTTCGCCAAAGATTGACGGCGTG CGTTGCGTGATTTTCGGCGGCGTTGCGTATAGCCGCAGCCTCAAGCCGATTCCGAACCCGTTTG TTCAGGAGTGGGCCGCAGCGAACTGTTGCGAGCTTGAGGGCCTGGACGGTGAGCTTGTGGTA GGCAGCGCCACCGCCTCCGACTGTATGCAGAACACCACTTCGGGCGTGATGAAGAAGACCGGC GAACCTGATTTCTCCTTCCATGCATTCGACTTCGTGGGAACCGACTGGCCGTTTGCGACTCGCT GCGAGCAGCTTGAACGCTGGCGCAAGCGCGGCGACTCCGAAGCGATCCGCGTGCACATCGTCT CGCAGGAACTTGTGACGGACCAGGTAGACCTTGCGATGAAGGAGGCGCAATTCCTTGACGAG GGCTACGAAGGAATGATGATCCGTGCTCACGATGGCCGGTACAAGTTCGGACGCAGCACGGAG CGAGAGGGCGGCCTAGTGAAGGTCAAGCGCTTTGACGACGCCGAGGCCGAGGTAATCGGCTA CGAAGAGGAAATGCACAATGCGAATGAGGCAAAGACGAATGCGCTGGGCCAGACGGAACGCA GCACGGTACAGGCCAACTTGGTCGGTAAGCGCACCCTCGGCGCCCTCGTATGCCGAACCGCGT CAGGCGTGGCGTTTTCTGTCGGCACTGGCTTTTCTTCCGCTGACCGTGCCTCGCTATGGCGCGA GCGTGCTGCACTTGTCGGGCGTGTAGTCAAGTACAAGCACTTCGACCACGGCACGGTAGACGC CCCGCGCCACCCCGTGTTCCTCGGCTTCCGTGCGCCGGAGGACATGGCGTGA

302 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 两 个 未 知 基 因 的 注 释 及 在 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 搜 索 同 源 基 因 试 验 人 员 : 林 爱 婷 试 验 负 责 : 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

303 试 验 目 的 对 两 条 未 知 的 基 因 序 列 进 行 BLAST 比 对, 获 得 基 因 的 同 源 注 释, 并 在 青 枯 雷 尔 氏 菌 GMI1000 强 致 病 力 菌 株 RS91 和 无 致 病 力 菌 株 RS98 中 搜 索 同 源 基 因 2. 试 验 方 法 2.1 同 源 注 释 未 知 基 因 利 用 NCBI 的 BLAST( 工 具 进 行 同 源 比 对, 获 得 两 个 未 知 基 因 的 注 释 信 息 比 对 时 选 择 Megablast 对 核 酸 数 据 库 Nucleotide collection(nr/nt) 进 行 搜 索 2.2 在 RS 基 因 组 中 鉴 定 目 标 基 因 利 用 两 条 未 知 的 基 因 DNA 序 列, 在 3 种 青 枯 雷 尔 氏 菌 基 因 组 GMI1000 RS91 和 RS98 中 搜 索 同 源 基 因, 所 用 程 序 为 BLASTN, 搜 索 相 似 性 identity 大 于 80% 的, 分 值 score 大 于 250, 长 度 length 长 于 100 个 碱 基,E 值 小 于 1E-10 的 匹 配 序 列 需 要 用 到 的 blastall 参 数 : -p 程 序 名, 这 里 是 blastn -d 数 据 库 -i 查 询 序 列 文 件, 两 条 未 知 序 列 -o 结 果 输 出 文 件 -e E 值 限 制,1E 多 序 列 联 配 对 这 2 个 基 因 在 3 个 青 枯 雷 尔 氏 菌 基 因 组 中 搜 索 得 到 的 同 源 序 列, 分 别 进 行 多 序 列 比 对, 使 用 的 程 序 是 ClustalX, 用 BioEdit7( /BioEdit.html) 编 辑 多 序 列 比 对 结 果, 观 察 同 源 基 因 序 列 在 这 3 个 菌 株 的 比 对 情 况

304 试 验 结 果 3.1 基 因 序 列 比 对 及 注 释 结 果 两 条 未 知 的 基 因 序 列 如 下 : >seq1 ACACAATTCATCGATGATGGTTGGCTTGCCAGTCAGGTCATGCTCGACCAGCAGGC GCCGGAACTTCAGCAGCGTGGTCGCGTCCGGCACGTTCTCGACCGCCAGATCAAT GCCGGCGAACGCACGCATCGCCATGCTGTCGTACAACGCATCTTCCAGTCCTTCGT CCGACAGCCCGTACCACTGCTGCAAGAAATAAATGCGCAGCATCCTCTGCAGGTCG ACTCTAGAGGATCCCCGCCAC >seq2 ACACAATTCATCGATGATGGTTGGGCACCGCGTGGCGCGCGGCAATGTCGCGTACC ACCTCGCTCAGCTGCGGGTCGAGCAGTTGGGCATCCGACAGATTCACTGCGGCGT GCAGGTCCGGTTGGCGGGCCGTGCCGGCACGCTCGGCCTCTTCGCGCTGCAGGT CGACTCTAGAGGATCCCCGCCAC Seq1, 长 度 244 碱 基, 在 nt(ncbi 的 核 酸 数 据 库 ) 的 比 对 结 果 如 下 :

305 300 从 结 果 可 看 出, 搜 索 到 的 同 源 序 列 大 多 来 自 Ralstonia solanacearum, 其 中, 有 5 条 同 源 序 列 与 Seq1 达 到 很 高 的 匹 配 度, 一 致 性 100%,E 值 4e-97,score 为 363, 具 体 如 下 :

306 301 从 序 列 的 描 述 得 知,Seq1 匹 配 到 的 基 因 中, 来 自 Ralstonia solanacearum rip 系 列 菌 株 的 同 源 基 因 属 于 Ⅲ 型 分 泌 系 统 效 应 蛋 白 III 型 分 泌 系 统 (typeiii secretion system,t3ss) 广 泛 存 在 于 动 植 物 病 原 细 菌 中, 病 原 细 菌 通 过 III 型 分 泌 系 统 将 效 应 蛋 白 注 入 到 寄 主 细 胞 后 或 引 起 寄 主 感 病 或 激 发 抗 病 反 应 Seq1 在 菌 株 GMI1000 中 匹 配 到 大 质 粒 的 基 因 序 列, 匹 配 的 对 应 位 点 基 因 是 tis1021 型 转 座 蛋 白 在 菌 株 Ralstonia solanacearum hpx22 中 的 同 源 基 因 也 与 转 座 有 关 在 nt 数 据 库 上 匹 配 到 的 其 他 结 果, 一 致 性 和 score 等 指 标 都 没 有 前 5 个 同 源 序 列 好, 从 Description 一 栏 可 知, 这 些 基 因 绝 大 多 数 也 与 转 座 有 关 因 此, 预 测 该 Seq1 序 列 可 能 是 转 座 蛋 白 基 因 序 列 的 一 部 分 Seq2, 长 度 188 碱 基, 比 对 结 果 如 下 : Seq2 的 比 对 结 果 不 如 Seq1 理 想, 可 能 是 因 为 序 列 太 短 从 结 果 可 看 出, 有 一 条 同 源 序 列 达 到 较

307 302 高 的 匹 配, 一 致 性 100%,E 值 9e-68,score 为 265, 是 来 自 GMI1000 大 质 粒 的 序 列 接 下 来 另 一 条 较 相 似 的 同 源 序 列 是 来 自 CMR15 的 质 粒 序 列 两 条 序 列 的 具 体 情 况 如 下 : 从 序 列 的 描 述 得 知, 来 自 GMI1000 质 粒 的 同 源 基 因 是 可 能 的 信 号 转 导 蛋 白, 具 有 EAL-ggdef 结 构 域 同 样, 来 自 CMR15 质 粒 的 同 源 基 因 是 潜 在 的 diguanylate 磷 酸 二 酯 酶 ( 信 号 转 导 蛋 白,EAL 结 构 域 ) 在 nt 数 据 库 上 匹 配 到 的 其 他 结 果, 大 部 分 都 来 自 Ralstonia solanacearum, 同 源 基 因 的 产 物 也 大 部 分 是 信 号 转 导 蛋 白, 因 此, 可 以 预 测 该 Seq2 序 列 可 能 是 信 号 转 导 蛋 白 基 因 序 列 的 一 部 分 3.3 多 序 列 联 配 结 果 在 青 枯 雷 尔 氏 菌 基 因 组 中 鉴 定 搜 索 基 因,Seq1 在 GMI1000 大 质 粒 RS91 和 RS98 各 分 别 搜 索 到 2 条 14 条 和 8 条 同 源 序 列 ( 在 GMI1000 的 环 状 基 因 组 DNA 上 没 有 搜 索 到 ), 长 度 都 为 987 个 碱 基, 将 这 些 序 列 进 行 比 对, 结 果 如 下 :

308 303

309 304

310 305 可 见, 这 24 条 序 列 在 菌 株 间 非 常 保 守, 达 到 非 常 高 的 相 似 性 在 各 菌 株 内 的 同 源 序 列 则 是 完 全 一 致 的, 只 是 在 基 因 组 的 位 置 不 同, 属 于 重 复 的 基 因 序 列 从 比 对 结 果 可 看 出,RS91 与 RS98 的 序 列 有 更 高 的 相 似 度, 只 在 第 138 碱 基 处 有 差 异 (T/C);RS91 RS98 与 GMI1000 则 主 要 在 第 和 951 碱 基 位 点 处 存 在 差 异 Seq2 在 GMI1000 大 质 粒 RS91 和 RS98 都 只 分 别 搜 索 到 1 条 同 源 序 列 ( 在 GMI1000 的 环 状 基 因 组 DNA 上 没 有 搜 索 到 ), 比 对 结 果 如 下 :

311 306 RS91 RS98 中 的 同 源 序 列 都 是 不 完 整 的 基 因 片 段, 特 别 是 RS91 的 基 因 序 列 很 短, 有 待 进 一 步 的 拼 接, 比 对 时, 只 在 碱 基 范 围 676~1010bp 内 与 GMI1000 的 同 源 基 因 有 好 的 匹 配 4. 试 验 讨 论 5.. 参 考 文 献 Brumbley S M, Denny T P. Cloning of wild-type Pseudomonas solanacearum phca, a gene that when mutated alters expression of multiple traits that contribute to virulence. J Bacteriol,1990, 172 (10): Brumbley S M, Carney B F, et al. Phenotype conversion in Pseudomonas solanacearum due to spontaneous inactivation of PhcA, a putative LysR transcriptional regulator. J Bacteriol, 1993, 175 (17):

312 307 Clough S J, Schell M A, et al. Evidence for involvement of a volatile extracellular factor in Pseudomonas solanacearum virulence gene expression. Molecular Plant Microbe Interactions, 1994, 7 (5): Clough S J, Lee K, et al. A two-component system in Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum modulates production of PhcA-regulated virulence factors in response to 3-hydroxypalmitic acid methyl ester. Journal of Bacteriology, 1997, 179 (11): 试 验 负 责 试 验 人 员 林 爱 婷

313 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 短 短 芽 孢 杆 菌 JK-2 全 基 因 组 SNP 的 预 测 和 分 析 试 验 人 员 : 林 爱 婷 试 验 负 责 : 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

314 试 验 目 的 短 短 芽 胞 杆 菌 (Brevibacillus brevis) 是 一 类 革 兰 氏 染 色 阳 性 细 菌, 有 较 强 的 蛋 白 分 泌 能 力 ( 邱 孙 全 等,2009), 同 时 也 具 有 广 谱 抗 菌 活 性, 该 菌 能 以 活 体 形 式 寄 居 到 大 量 的 真 菌 植 物 病 原 体 中, 包 括 灰 葡 萄 孢 (Botrytis cinerea) 苍 耳 单 丝 壳 菌 (Sphaerotheca fuliginea) 及 终 极 腐 霉 (Pythium ultimum), 并 且 可 以 通 过 分 泌 抗 菌 代 谢 物 短 杆 菌 肽 S(gramicidin S) 来 抑 制 真 菌 或 细 菌 的 生 长 ( 侯 仲 轲,2000) 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 是 本 实 验 室 从 西 瓜 根 际 土 壤 中 分 离 得 到 一 株 芽 孢 杆 菌 菌 株 ( 郑 雪 芳 等,2006), 研 究 表 明 它 对 西 瓜 枯 萎 病 菌 大 丽 轮 枝 菌 苦 瓜 炭 疽 病 菌 桃 褐 腐 病 菌 番 茄 青 枯 雷 尔 氏 菌 禽 致 病 性 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 都 具 有 强 的 抑 制 作 用, 是 一 株 具 有 广 谱 抗 菌 活 性 的 生 防 菌 ( 葛 慈 斌 等,2009) 当 前 仅 有 一 株 短 短 芽 孢 杆 菌 Brevibacillus brevis NBRC 已 获 得 全 基 因 组 序 列, 本 文 研 究 的 芽 孢 杆 菌 JK2 已 由 生 物 研 究 所 完 成 测 序, 对 其 进 行 全 基 因 组 SNP 的 预 测 及 分 析, 阐 述 该 菌 种 的 多 态 性, 从 而 指 导 短 短 芽 胞 杆 菌 基 因 组 多 态 性 的 研 究 SNP 是 指 基 因 组 水 平 上 由 单 个 核 苷 酸 的 变 异 所 引 起 的 DNA 序 列 多 态 性, 是 可 遗 传 变 异 中 最 常 见 的 一 种, 在 群 体 中 的 发 生 频 率 不 小 于 1% 包 括 单 个 碱 基 的 转 换 颠 换 插 入 和 缺 失 等, 但 通 常 所 说 的 SNP 主 要 是 指 转 换 和 颠 换 所 谓 转 换 是 指 同 型 碱 基 之 间 的 转 换, 如 嘌 呤 与 嘌 呤 ( G/A) 嘧 啶 与 嘧 啶 ( T/C) 间 的 替 换 ; 所 谓 颠 换 是 指 发 生 在 嘌 呤 与 嘧 啶 (A/T A/C C/G G/T) 之 间 的 替 换 依 据 排 列 组 合 原 理,SNP 一 共 可 以 有 6 种 替 换 情 况, 即 A/G A/T A/C C/G C/T 和 G/T, 颠 换 种 类 偏 多, 但 事 实 上, 转 换 的 发 生 频 率 占 多 数, 而 且 是 C/T 转 换 为 主, 其 原 因 是 CpG 二 核 苷 酸 上 的 的 C 是 甲 基 化 的, 容 易 自 发 脱 氨 基 形 成 胸 腺 嘧 啶 T,CpG 也 因 此 变 为 突 变 热 点 理 论 上 讲,SNP 既 可 能 是 二 等 位 多 态 性, 也 可 能 是 3 个 或 4 个 等 位 多 态 性, 但 实 际 上, 后 两 者 非 常 少 见, 几 乎 可 以 忽 略 因 此, 通 常 所 说 的 SNP 都 是 二 等 位 多 态 性 的 在 基 因 组 DNA 中, 任 何 碱 基 均 有 可 能 发 生 变 异, 因 此 SNP 既 有 可 能 在 基 因 序 列 内, 也 有 可 能 在 基 因 以 外 的 非 编 码 序 列 上 因 为 细 菌 基 因 组 小, 重 复 序 列 少, 大 部 分 区 域 都 属 于 编 码 区, 因 此 位 于 编 码 区 内 的 SNP(coding SNP,cSNP) 比 较 多, 这 一 点 跟 真 核 生 物 的 不 同 从 对 生 物 的 遗 传 性 状 的 影 响 上 来 看, csnp 又 可 分 为 2 种 : 一 种 是 同 义 csnp(synonymous csnp), 即 SNP 所 致 的 编 码 序 列 的 改 变 并 不 影 响 其 所 翻 译 的 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列, 突 变 碱 基 与 未 突 变 碱 基 的 含 义 相 同 ; 另 一 种 是 非 同 义 csnp(non-synonymous csnp), 指 碱 基 序 列 的 改 变 可 使 以 其 为 蓝 本 翻 译 的 蛋 白 质 序 列 发 生 改 变, 从 而 影 响 了 蛋 白 质 的 功 能 这 种 改 变 常 是 导 致 生 物 性 状 改 变 的 直 接 原 因 csnp 中, 同 义 csnp 占 了 大 多 数

315 试 验 方 法 2.1 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 全 基 因 组 的 SNP 预 测 SNP 预 测 之 前, 需 要 进 行 读 段 的 定 位, 定 位 所 需 条 件 : 1 参 考 序 列 : 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 拼 接 好 的 基 因 组 框 架 图 (Scaffold 序 列,wls327.all_scaf.fasta), 其 中 舍 弃 长 度 低 于 500bp 的 较 短 序 列 2 reads reads( 读 段 ): 用 Illumina GA 高 通 量 测 序 仪 对 菌 株 基 因 组 DNA 进 行 测 序 所 获 得 的 reads 序 列, 长 度 100bp, 已 对 低 质 量 碱 基 进 行 质 量 校 正 使 用 Bowtie 软 件 将 读 段 定 位 至 框 架 图 上, 采 用 -v 2 模 式, 即 允 许 2 个 错 配, 保 存 为 SAM 格 式 ( 参 数 -S ), 利 用 SAMTools 处 理 SAM 文 件, 并 利 用 BEDTools 的 genomecoveragebed 程 序 计 算 per-base coverage, 即 单 碱 基 覆 盖 率 ( 参 数 -d ), 计 算 框 架 图 的 总 覆 盖 深 度 利 用 SAMTools 的 mpileup 生 成 pileup 文 件,Pileup 格 式 的 定 位 结 果 文 件 说 明 如 下 : 每 行 由 序 列 名 称 序 列 坐 标 位 点 参 考 碱 基 覆 盖 深 度 读 段 的 碱 基 序 列 和 对 应 碱 基 质 量 组 成 在 读 段 碱 基 序 列 这 一 列 中,. 代 表 正 向 链 上 与 参 考 碱 基 匹 配 的 一 个 碱 基 位 点,, 代 表 反 向 链 上 的 匹 配 位 点 ACGTN 代 表 正 向 链 上 的 mismatch 碱 基, acgtn 代 表 反 向 链 上 的 mismatch 碱 基 符 号 ^ 标 志 着 读 段 的 起 始, 紧 随 ^ 的 字 符 的 ASCII 值 减 33 所 得 结 果 即 是 mapping quality $ 符 号 标 志 着 读 段 结 束 模 式 \ + [0-9] + [ACGTNacgtn] + 表 示 在 对 应 参 考 位 置 有 一 段 插 入 序 列, 长 度 由 [] 中 的 整 数 给 出, 后 跟 插 入 序 列 同 样, 模 式 - [0-9] + [ACGTNacgtn] + 表 示 存 在 一 段 缺 失 序 列 SNP 预 测 的 参 数 设 定 : 1 最 低 覆 盖 深 度 :30(reads) 2 最 高 覆 盖 深 度 :500(reads) 3 检 测 位 点 的 差 异 碱 基 数 ( 绝 对 值 ):5 4 检 测 位 点 的 差 异 碱 基 比 率 :2% 满 足 以 上 条 件 的 mismatch 位 点 ( 错 误 匹 配 的 碱 基 位 点 ) 才 是 一 个 有 效 的 SNP 位 点 编 写 一 个 perl 脚 本 pileup_snpfilter.pl, 包 含 以 上 的 参 数 设 定, 对 定 位 的 结 果 文 件 进 行 SNP 扫 描, 获 得 菌 种 JK2 的 全 基 因 组 SNP:JK2.pileup.snp 2.2 转 换 与 颠 换 SNP 类 型 的 统 计 统 计 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 在 全 基 因 组 检 测 到 的 SNP 数 目, 计 算 平 均 密 度, 并 分 别 计 算 转 换 (C/T

316 311 G/A) 与 颠 换 (C/G A/T C/A G/T) 类 型 的 SNP 数 SNP 密 度 的 计 算 :SNP 数 / 参 考 序 列 长 度 转 换 与 颠 换 SNP 数 的 计 算 : 用 shell 命 令 cal_snp.sh 2.3 每 一 个 基 因 中 SNP 数 的 统 计 SNP 在 基 因 组 的 任 何 碱 基 均 有 可 能 发 生 变 异, 在 细 菌 中 位 于 编 码 区 的 SNP 比 较 多, 在 遗 传 研 究 中 具 有 很 重 要 的 意 义 菌 种 JK2 共 有 5666 条 基 因 序 列, 可 从 文 件 wls327.annotation.txt 获 知 利 用 shell 命 令 snp_in_gene.sh 算 出 每 一 个 基 因 中 分 布 的 SNP, 并 统 计 个 数 3. 试 验 结 果 3.1 转 换 与 颠 换 类 型 的 SNP 数 统 计 获 得 菌 种 JK2 的 全 基 因 组 SNP:JK2.pileup.snp, 一 行 代 表 一 个 突 变 二 等 位 的 SNP 每 行 总 共 七 列, 分 别 为 序 列 名 称 SNP 坐 标 位 点 参 考 碱 基 覆 盖 深 度 突 变 碱 基 突 变 碱 基 个 数 和 比 率, 如 下 所 示 : scaffold T 70 G % scaffold A 53 C % scaffold A 49 G % scaffold T 80 G % 三 等 位 的 SNP 有 10 列, 多 了 3 列, 分 别 是 第 三 位 的 突 变 碱 基 突 变 碱 基 个 数 和 比 率, 如 下 : scaffold T 87 C % G % scaffold T 78 G % N % 以 此 类 推, 四 等 位 的 SNP 有 13 列 : scaffold A 118 C % G % T % 三 等 位 和 四 等 位 的 SNP 很 少, 第 三 位 或 第 四 位 突 变 碱 基 的 频 率 也 很 低, 一 般 突 变 碱 基 数 只 有 一 个, 当 然 也 有 少 数 是 2 的

317 312 各 类 型 SNP 的 统 计 结 果 见 表 1, 表 2 和 图 1: 表 1. 各 等 位 SNP 的 统 计 二 等 位 三 等 位 四 等 位 五 等 位 总 和 num % 77.63% 19.74% 2.50% 0.13% 100% 在 本 文 中, 总 共 检 测 到 3075 个 SNP, 参 考 scaffold 序 列 总 长 达 到 6Mb, 平 均 全 基 因 组 的 SNP 密 度 为 0.511/kb 其 中 二 等 位 SNP 占 了 绝 大 多 数, 达 77.63%; 三 等 位 SNP 也 有 19.74%, 其 他 等 位 的 SNP 很 少, 几 乎 可 以 忽 略 表 2. 转 换 与 颠 换 SNP 的 分 布 个 数 及 平 均 突 变 频 率 转 换 Transitions 颠 换 Transversion C/T G/A C/G A/T C/A T/G 总 和 或 平 均 snp_num 平 均 突 变 频 率 Frequencies 10.98% 9.43% 14.53% 12.08% 6.46% 6.95% 7.56% 表 2 的 统 计 不 考 虑 SNP 的 第 三 位 及 第 四 位 突 变 ( 因 为 其 突 变 碱 基 一 般 只 有 一 个, 有 可 能 是 错 误 测 序 所 致 ) 从 表 中 可 知,SNP 在 全 基 因 组 的 平 均 发 生 频 率 为 7.56% 在 突 变 频 率 上, 转 换 的 C/T 与 G/A 是 相 近 的, 颠 换 的 C/G 与 A/T C/A 与 T/G 也 是 相 近 的, 符 合 DNA 双 链 的 碱 基 对 应 关 系

318 313 图 1 上 的 比 例 是 各 SNP 类 型 所 占 的 百 分 比 图 1. JK2 全 基 因 组 SNP 的 分 布 由 统 计 数 据 可 知, 转 换 类 型 的 C/T G/A 所 占 比 例 不 大, 分 别 为 8.39% 10.86%; 颠 换 的 四 种 类 型 C/G A/T C/A 和 G/T 中,C/A 和 G/T 两 者 总 共 约 占 了 全 部 SNP 的 76% JK2 菌 种 整 体 的 转 换 与 颠 换 比 为 , 颠 换 的 SNP 数 远 远 大 于 转 换, 即 颠 换 的 发 生 频 率 比 较 大 3.2 基 因 中 SNP 数 的 统 计 利 用 shell 命 令 分 析 菌 种 JK2 中 每 个 基 因 分 布 的 SNP, 得 到 结 果 文 件 :JK2.snp.in.gene.txt, 如 下 所 示 :

319 314 用 星 号 线 *** 隔 开 每 一 个 基 因 检 测 到 的 SNP 第 一 行 是 基 因 信 息, 包 括 以 下 几 个 方 面 : 所 在 scaffold 序 列, 基 因 起 始 终 止 位 点 长 度 名 称 和 正 负 链, 最 后 一 列 是 指 在 这 个 基 因 中 检 测 到 的 SNP 数 ; 接 下 来, 直 到 *** 之 前 的 所 有 行, 是 分 布 的 SNP 的 具 体 信 息 菌 种 JK2 检 测 到 的 SNP 数 较 少, 密 度 只 有 0.511/kb, 从 上 面 的 信 息 可 以 看 出, 基 因 中 分 布 的 SNP 也 很 少, 主 要 集 中 在 0~4 个, 有 很 多 基 因 没 有 发 现 SNP 但 也 有 一 些 突 出 的 情 况, 如 图 2 所 示, 在 基 因 wls237_1769 中 的 SNP 有 12 个, 而 wls237_4280 分 布 的 SNP 数 多 达 18 个 菌 种 JK2 全 基 因 组 的 所 有 基 因 分 布 的 SNP 数 情 况 见 图 2:

320 315 图 2. JK2 每 一 个 基 因 中 分 布 的 snp 数 的 变 化 横 坐 标 是 基 因 编 号, 按 基 因 在 scaffold 序 列 的 顺 序 排 列 ; 纵 坐 标 是 SNP 个 数 在 基 因 组 内, 虽 然 在 基 因 中 的 SNP 数 不 多, 但 还 是 有 少 数 基 因 其 编 码 SNP (coding SNP,cSNP) 数 5, 提 取 出 这 些 基 因 的 信 息, 如 下 : 菌 种 JK2 有 39 个 : scaffold wls237_0332 Forward 5 scaffold wls237_1157 Forward 5 scaffold wls237_1201 Forward 5 scaffold wls237_1208 Forward 5 scaffold wls237_1277 Reverse 6 scaffold wls237_1285 Forward 5 scaffold wls237_1328 Forward 5 scaffold wls237_1657 Forward 5 scaffold wls237_1659 Forward 5 scaffold wls237_1669 Forward 9 scaffold wls237_1769 Forward 12 scaffold wls237_2339 Reverse 5

321 316 scaffold wls237_2432 Reverse 7 scaffold wls237_2445 Reverse 5 scaffold wls237_2517 Reverse 7 scaffold wls237_2552 Reverse 5 scaffold wls237_2602 Forward 7 scaffold wls237_2624 Forward 5 scaffold wls237_3135 Reverse 7 scaffold wls237_3157 Forward 5 scaffold wls237_3616 Reverse 6 scaffold wls237_3798 Forward 5 scaffold wls237_4025 Forward 5 scaffold wls237_4028 Forward 5 scaffold wls237_4082 Forward 7 scaffold wls237_4098 Forward 5 scaffold wls237_4104 Forward 5 scaffold wls237_4280 Forward 18 scaffold wls237_4335 Reverse 5 scaffold wls237_4555 Forward 5 scaffold wls237_4579 Reverse 5 scaffold wls237_4961 Reverse 5 scaffold wls237_5202 Forward 5 scaffold wls237_5296 Reverse 8 C wls237_5322 Reverse 5 C wls237_5330 Reverse 5 scaffold wls237_5430 Reverse 5 C wls237_5547 Reverse 5 scaffold wls237_5616 Reverse 5 每 一 行 的 最 后 一 列 数 字 指 的 是 基 因 中 分 布 的 SNP 数, 这 些 SNP 密 度 相 对 较 高 的 基 因 可 能 对 菌 种 有 重 要 影 响, 不 过 还 是 要 进 一 步 确 定 这 些 SNP 是 同 义 csnp 还 是 非 同 义 csnp, 有 待 进 一 步 考 究

322 试 验 讨 论 根 据 对 一 些 常 见 物 种 的 分 析, 发 现 基 因 组 的 SNP 密 度 主 要 在 1.0/kb ~ 2.0/kb 之 间, 如 本 人 硕 士 论 文 分 析 的 物 种 日 本 晴 水 稻, 全 基 因 组 的 平 均 SNP 密 度 为 1.41/kb, 另 一 物 种 拟 南 芥 的 SNP 密 度 为 1.6/kb 又 如, 人 类 基 因 组 中 平 均 每 500~1000 个 碱 基 对 中 就 有 1 个 SNP, 其 密 度 也 介 于 1.0/kb ~ 2.0/kb 当 然, 这 主 要 是 在 真 核 生 物 的 情 况, 有 可 能 分 析 物 种 的 不 同, 密 度 会 有 一 定 的 不 同, 如 之 前 分 析 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 RS91 平 均 全 基 因 组 的 SNP 密 度 为 3.96/kb,RS98 的 SNP 密 度 为 3.34/kb, 都 非 常 高, 而 本 文 分 析 的 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 的 SNP 数 明 显 少 很 多, 密 度 只 有 0.511/kb, 看 来 JK2 是 比 较 保 守 的 一 个 菌 种 一 般 来 说, 转 换 的 发 生 更 容 易, 因 为 它 是 同 型 碱 基 之 间 的 替 换, 大 量 研 究 ( 仪 军 玲 等,2008; 杨 永 强 等,2009) 也 表 明, 转 换 的 发 生 频 率 更 大 Wang 等 在 1998 年 对 人 类 基 因 组 进 行 大 规 模 SNP 检 测 时 得 出, 转 换 与 颠 换 的 比 约 为 2..1, 本 人 硕 士 分 析 的 日 本 晴 水 稻 转 换 与 颠 换 比 值 为 但 是, 在 细 菌 中 情 况 却 有 些 不 同, 如 青 枯 雷 尔 氏 菌 RS91 转 换 与 颠 换 的 比 为 ,RS98 的 转 换 与 颠 换 比 为 , 颠 换 的 SNP 数 远 远 大 于 转 换 在 本 文 中, 菌 种 JK2 的 其 中 两 种 颠 换 C/G 与 A/T 突 变 数 确 实 比 转 换 少, 但 另 外 两 种 颠 换 C/A 与 T/G 远 多 于 转 换, 占 了 SNP 的 绝 大 多 数, 总 的 转 换 与 颠 换 比 为 , 颠 换 的 发 生 频 率 还 是 比 较 大 这 可 能 是 由 于 分 析 对 象 的 不 同, 原 核 与 真 核 生 物 真 的 有 差 别 5.. 参 考 文 献 Wang D G, Fan J B, Siao C J, et al. Large-scale identification, mapping and genotyping of single nucleotide polymorphisms in the human genome [J]. Science, 1998, 280: 杨 永 强, 王 巍 杰, 徐 长 波, 等. 单 核 苷 酸 多 态 性 研 究 进 展 [J]. 化 学 与 生 物 工 程,2009,26(8): 仪 军 玲, 李 彩 霞, 胡 兰, 等. 单 核 苷 酸 多 态 性 及 其 检 测 方 法 [J]. 证 据 科 学,2008,16(6 ): 邱 孙 全, 杨 红, 赵 春 安, 李 海 燕. 一 株 内 生 短 短 芽 胞 杆 菌 的 鉴 定 及 其 抗 菌 活 性 研 究 [J]. 天 然 产 物 研 究 与 开 发,2009,21: 郑 雪 芳, 葛 慈 斌, 林 营 志, 刘 建, 刘 波. 瓜 类 作 物 枯 萎 病 生 防 菌 BS-2000 和 JK-2 的 分 子 鉴 定 [J]. 福 建 农 业 学 报,2006,21(2): 葛 慈 斌, 刘 波, 蓝 江 林, 黄 素 芳, 朱 育 菁. 生 防 菌 JK-2 对 尖 孢 镰 刀 菌 抑 制 特 性 的 研 究. 福 建 农 业 学 报,2009,24(1): 试 验 负 责 试 验 人 员 林 爱 婷

323 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 苯 酚 硫 酸 法 测 定 胞 外 多 糖 标 准 曲 线 的 测 定 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

324 试 验 目 的 青 枯 菌 胞 外 多 糖 是 决 定 青 枯 菌 侵 染 力 的 主 要 因 素 之 一 青 枯 菌 存 在 致 病 力 强 弱 菌 株 的 分 化, 强 弱 致 病 力 菌 株 在 分 泌 胞 外 多 糖 上 是 否 存 在 区 别 本 试 验 通 过 用 乙 醇 沉 淀 方 法, 从 青 枯 菌 强 弱 菌 株 发 酵 液 中 提 取 胞 外 多 糖, 然 后 用 苯 酚 - 硫 酸 比 色 法 测 定 胞 外 多 糖 的 量, 以 分 析 不 同 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 在 分 泌 胞 外 多 糖 的 量 上 是 否 存 在 差 异 [1] 青 枯 雷 尔 氏 菌 (Ralstonia solanacearum), 属 于 革 兰 氏 阴 性 b 蛋 白 类 细 菌 雷 尔 氏 菌 引 起 的 植 物 细 菌 性 青 枯 病 害 (Bacterial wilt), 简 称 青 枯 病, 是 一 种 世 界 范 围 的 细 菌 性 土 传 病 害 该 菌 寄 主 广 泛, 能 够 侵 染 热 带 和 温 带 地 区 多 达 450 种 以 上 的 植 物 种 类, 严 重 影 响 了 很 多 重 要 经 济 作 物, 比 如 番 茄 [2] [3] 烟 草 辣 椒 等 的 产 量 青 枯 病 的 防 治 目 前 还 没 有 有 效 的 化 学 农 药 防 治 且 易 造 成 环 境 污 染 和 残 留 利 用 无 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 对 作 物 青 枯 病 进 行 生 物 防 治, 是 一 个 有 益 的 尝 试, 并 已 有 过 许 多 成 功 的 例 子 本 试 验 通 过 标 准 曲 线 的 制 作 为 下 一 步 研 究 不 同 青 枯 雷 尔 氏 菌 胞 外 多 糖 的 差 异 比 较 提 供 了 条 件 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 浓 硫 酸 : 分 析 纯,95.5%,5% 苯 酚, 分 析 纯 葡 萄 糖,UV2550-SHIMADZU 紫 外 - 可 见 光 谱 仪 2.2 试 验 方 法 (1) 苯 酚 - 硫 酸 法 标 准 曲 线 的 制 定 : a 原 理 : 糖 类 物 质 与 硫 酸 作 用 脱 水, 生 成 糠 醛 或 糠 醛 的 衍 生 物, 此 衍 生 物 遇 芳 香 族 酚 类 或 胺 类 化 合 物, 能 缩 合 生 成 有 色 物 质 b 标 准 曲 线 制 定 的 方 法 : 取 6 支 试 管 (18 180), 分 别 加 入 0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml(100Ug/ml) 标 准 葡 萄 糖 溶 液, 依 次 加 水, 使 最 终 体 积 均 为 1ml 另 取 1ml 水 作 为 空 白 每 一 试 管 再 加 入 1ml 5% 的 苯 酚 水 溶 液, 摇 匀 用 吸 量 管 向 每 个 试 管 中 加 入 5ml 浓 硫 酸, 将 试 管 摇 匀 10min 后, 放 入 25 水 浴 中 20min 显 色 后 的 橙 黄 色 溶 液 可 稳 定 几 小 时, 将 各 溶 液 在 490nm 下 比 色 测 定 每 个 测 得 的 光 密 度 减 去 空 白 的 光 密 度 后, 以 糖 的 微 克 数 为 横 坐 标, 以 光 密 度 为 纵 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线 或 求 出 糖 的 微 克 数 --- 光 密 度 之 间 的 函 数 关 系 式 (2) 胞 外 多 糖 含 量 测 定 : 准 确 吸 取 各 胞 外 多 糖 溶 液 1.0ml, 加 入 到 试 管 中, 各 试 管 再 加 入 1ml 5% 的 苯 酚 水 溶 液 和 5ml 浓 硫 酸, 将 试 管 摇 匀 10min 后, 放 入 25 水 浴 中 20min, 将 各 显 色 后 的 橙 黄 色 溶 液 在 490nm 下 比 色 测 定 根 据 测 得 的 光 密 度 值 从 标 准 曲 线 上 查 得 相 应 含 量 或 从 标 准 关 系 式 中 算 出 相 应 含 量, 计 算 各 青 枯 菌 发 酵 液 的 胞 外 多 糖 含 量

325 试 验 结 果 (1) 苯 酚 - 硫 酸 法 的 标 准 曲 线 : 对 于 不 同 体 积 的 标 准 葡 萄 糖 溶 液, 用 苯 酚 - 硫 酸 法 测 得 的 光 密 度 如 下 表 所 示 : 表 1: 不 同 体 积 标 准 糖 溶 液 的 光 密 度 标 准 糖 溶 液 的 体 积 (ml) 光 密 度 (λ=490nm) 用 标 准 曲 线 回 归 分 析, 其 回 归 方 程 :Y=0.1533X , 相 关 系 数 r= 吸 光 度 y = x R 2 = 系 列 1 线 性 ( 系 列 1) 标 准 糖 溶 液 的 体 积 (ml) 图 1 苯 酚 - 硫 酸 法 的 标 准 曲 线

326 321 图 2 苯 酚 - 硫 酸 法 显 色 后 的 不 同 菌 株 多 糖 溶 液 ( 图 中 最 左 一 只 试 管 内 为 CK) 4. 试 验 讨 论 通 过 对 不 同 体 积 的 标 准 葡 萄 糖 溶 液 生 长 曲 线 的 测 定, 建 立 菌 体 生 物 量 的 直 观 测 定 方 法, 从 而 为 更 加 深 入 地 研 究 青 枯 雷 尔 氏 菌 胞 外 多 糖 提 供 依 据, 同 时 为 进 一 步 研 究 青 枯 雷 尔 氏 菌 胞 外 多 糖 的 差 异 提 供 依 据 5.. 参 考 文 献 [1] 沈 向 红 保 健 食 品 中 粗 多 糖 测 定 方 法 研 究. 实 用 预 防 医 学,8(6): 袁 晓 华 等. 植 物 生 理 生 化 实 验. 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社,9-11 [2] 姚 占 芳 等 香 菇 多 糖 提 取 工 艺 条 件 和 测 定 方 法 的 研 究. 河 南 农 业 大 学 学 报,29(2): [3] 何 学 友. 我 国 林 木 青 枯 病 研 究 概 况 [J]. 森 林 病 虫 通 讯,1997 (1): [4]Opina N L,Valdez R B,Opina O S.Effect of rice-tomato cropping patterns and flooding on the survival of Pseudomonas solanacearum E.F.Smith[J]. Philippine-Phytopathology.1994,30(2):93~99. [5] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [6] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4): [7] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1): [8] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [9] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1): 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州 郑 雪 芳

327 322

328 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 金 石 王 1 号 番 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 张 文 州 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

329 试 验 目 的 随 着 科 技 水 平 日 益 提 高, 种 苗 培 育 以 逐 步 成 为 了 育 苗 的 重 要 手 段 之 一 而 种 苗 运 输 中 出 现 的 烂 苗 和 徒 长 现 象 成 了 限 制 种 苗 发 展 的 一 个 重 要 因 素 因 此, 找 出 一 种 有 效 防 治 运 输 过 程 中 出 现 烂 苗 和 徒 长 的 方 法 是 当 前 种 苗 发 展 急 需 解 决 的 问 题 本 试 验 采 用 农 科 院 生 产 的 苗 立 鲜, 模 拟 运 输 条 件 观 察 苗 立 鲜 对 金 石 王 1 号 番 茄 实 生 苗 保 鲜 及 徒 长 现 象 的 作 用 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 (1) 保 鲜 品 种 : 金 石 王 1 号 番 茄, 由 厦 门 如 意 集 团 有 限 公 司 购 买 (2) 微 生 物 保 鲜 材 料 : 苗 立 鲜, 由 本 研 究 室 自 行 研 制, 稀 释 2000 倍 使 用 2.2 试 验 方 法 2.1 微 生 物 保 鲜 菌 使 用 方 法 喷 施 实 生 苗 为 金 石 王 1 号 番 茄 14 天 苗 ( 苗 外 运 时 间 ), 实 验 组 采 用 稀 释 2000 倍 苗 立 鲜 喷 施, 使 植 株 茎 杆 和 叶 片 充 分 淋 湿, 对 照 组 用 清 水 做 相 同 处 理 处 理 结 束 后, 将 苗 放 至 阴 凉 处 待 苗 晾 干, 装 箱 每 个 处 理 300 株 苗 2.2 检 测 指 标 1) 观 察 植 株 是 否 徒 长 2) 选 取 实 验 和 对 照 组 各 30 株 分 析 : 叶 片 数 株 高 弯 曲 度 差 异 3. 试 验 结 果 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 如 表 1, 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 株 高 为 19.45cm 而 清 水 对 照 植 株 平 均 株 高 为 18.72cm 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 曲 度 为 , 清 水 对 照 平 均 曲 度 为 叶 片 数 分 别 为 4.13 和 4.14, 二 者 相 差 较 小 表 1 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 ck 处 理 株 高 叶 片 数 曲 度 株 高 叶 片 数 曲 度

330 平 均 值

331 326 图 1 处 理 96 h 后 番 茄 苗 处 理 96h 后 试 验 组 图 2 开 箱 后 番 茄 苗 处 理 96h 后 对 照 组

332 327 图 4 处 理 96h 后 试 验 组 对 照 组 的 比 较 图 5 试 验 田

333 328 图 6 苗 立 鲜 产 品 图 片 4. 试 验 结 论 由 表 1 可 知 试 验 组 和 对 照 组 株 高 和 曲 度 差 别 较 大, 叶 片 数 差 别 较 小 综 合 以 上 因 素 可 知 苗 立 鲜 对 抑 制 种 苗 的 徒 长 具 有 显 著 作 用 通 过 图 片 可 明 显 的 发 现 对 照 组 番 茄 苗 弯 曲 度 很 大, 这 对 植 株 田 间 的 生 长 有 一 定 的 影 响, 而 苗 立 鲜 处 理 番 茄 植 株 会 比 较 健 壮 下 一 步, 将 对 试 验 苗 进 行 田 间 观 察, 以 便 进 一 步 比 较 苗 立 鲜 对 番 茄 后 续 生 长 的 影 响 5. 参 考 文 献 1) 孔 凡 真. 国 外 食 品 保 鲜 十 项 新 技 术 [J]. 肉 品 卫 生,2003,(9): ) 李 京 晶, 籍 保 平, 周 峰, 李 博. 丁 香 和 肉 桂 挥 发 油 的 提 取 主 要 成 分 测 定 及 其 抗 菌 活 性 研 究 [J]. 食 品 科 学,2006,27(8): ) 王 海 宏, 周 慧 娟, 乔 勇 进, 张 绍 铃, 陈 召 亮, 王 希 英. 桃 贮 藏 保 鲜 技 术 研 究 现 状 与 发 展 趋 势 [J]. 保 鲜 与 加 工,2009,9(2): ) 王 曙 文, 代 永 刚, 牛 红 红, 南 喜 平. 国 内 外 果 蔬 生 物 保 鲜 技 术 的 研 究 进 展 [J]. 农 产 品 加 工,2008,(12): ) Roller S.The quest for natural antimicrobials as novel means of food preservation; status report on a European research project [J].International Biodeterioration and Biodegradation,1995,36 (3-4): ) Scannell A G,Ross R P,Hill C,et al. An efective lacticin biopreservative in fresh pork sausage [J].J Food Port,2000,63 (3): ) 张 福 星, 蒋 炳 生. 生 物 保 鲜 液 膜 对 草 莓 常 温 保 鲜 效 果 的 研 究 [J]. 安 徽 农 业 科 学,2000, 28(5): ) 周 静 亚, 徐 忠 传, 马 春 朋. 壳 聚 糖 在 鲜 切 果 蔬 保 鲜 中 的 应 用 [J]. 食 品 研 究 与 开 发. 2009, (10): ) 李 雯, 邵 远 志, 符 青 苗, 谢 江 辉. 壳 聚 糖 在 香 蕉 果 实 贮 藏 保 鲜 上 的 应 用 效 果 [J]. 天 然 产 物 研 究 与 开 发,2008,20(6): ) 李 凤 梅, 周 庆 新, 李 文 香, 王 成 荣, 吕 建 华. 丁 香 提 取 液 与 壳 聚 糖 复 合 对 草 莓 保 鲜 效 果 的 影 响 [J]. 青 岛 农 业 大 学 学 报,2008,25(4): ,306 11) 张 举 印, 饶 景 萍, 董 晓 庆, 田 改 妮. 壳 聚 糖 复 合 涂 膜 对 红 富 士 苹 果 保 鲜 研 究 [J]. 西 北 农

334 329 业 学 报,2009,(5): ) 曾 荣, 李 平, 陈 金 印. 天 然 保 鲜 剂 涂 膜 处 理 对 猕 猴 桃 果 实 活 性 氧 代 谢 的 影 响 [J]. 保 鲜 与 加 工,2005,5(5): ) 万 惠 萍, 叶 淑 红, 陈 丽, 曹 方, 于 榕, 穆 野, 钟 耀 广. 壳 聚 糖 膜 在 黄 瓜 保 鲜 中 的 应 用 [J]. 大 连 工 业 大 学 学 报,2008,27(2): ) 邓 冬 梅, 孙 宇 飞, 肖 恒 春. 不 同 放 置 方 式 对 壳 聚 糖 常 温 保 鲜 黄 瓜 的 影 响 [J]. 广 西 工 学 院 学 报,2008,19(1): ) 高 兆 银, 胡 美 姣, 李 敏, 杨 凤 珍. 壳 聚 糖 涂 膜 对 台 农 1 号 丰 亡 果 保 鲜 效 果 研 究 [J]. 中 国 南 方 果 树,2007,36(2):37-39 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州

335 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 张 文 州 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

336 331 1 试 验 目 的 随 着 科 技 水 平 日 益 提 高, 种 苗 培 育 以 逐 步 成 为 了 育 苗 的 重 要 手 段 之 一 而 种 苗 运 输 中 出 现 的 烂 苗 和 徒 长 现 象 成 了 限 制 种 苗 发 展 的 一 个 重 要 因 素 因 此, 找 出 一 种 有 效 防 治 运 输 过 程 中 出 现 烂 苗 和 徒 长 的 方 法 是 当 前 种 苗 发 展 急 需 解 决 的 问 题 本 试 验 采 用 农 科 院 生 产 的 苗 立 鲜, 模 拟 运 输 条 件 观 察 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 实 生 苗 保 鲜 及 徒 长 现 象 的 作 用 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 (1) 保 鲜 品 种 : 农 友 长 茄 实 生 苗, 由 厦 门 如 意 集 团 有 限 公 司 购 买 (2) 微 生 物 保 鲜 材 料 : 苗 立 鲜, 由 本 研 究 室 自 行 研 制, 稀 释 800 倍 使 用 2.2 试 验 方 法 2.1 微 生 物 保 鲜 菌 使 用 方 法 喷 施 实 生 苗 为 农 友 长 茄 14 天 苗 ( 苗 外 运 时 间 ), 实 验 组 采 用 稀 释 800 倍 苗 立 鲜 喷 施, 使 植 株 茎 杆 和 叶 片 充 分 淋 湿, 对 照 组 用 清 水 做 相 同 处 理 处 理 结 束 后, 将 苗 放 至 阴 凉 处 待 苗 晾 干, 装 箱 每 个 处 理 300 株 苗 2.2 检 测 指 标 3) 观 察 植 株 是 否 徒 长 4) 选 取 实 验 和 对 照 组 各 30 株 分 析 : 叶 片 数 株 高 弯 曲 度 第 三 叶 的 长 和 宽 差 异 3. 试 验 结 果 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 如 表 1, 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 株 高 为 15.5cm 而 清 水 对 照 植 株 平 均 株 高 为 17.8cm 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 曲 度 为 , 清 水 对 照 平 均 曲 度 为 90.8 表 1 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 处 理 ck 株 高 叶 片 数 曲 度 第 二 片 第 二 片 第 二 片 第 二 片 株 高 叶 片 数 曲 度 叶 长 叶 宽 叶 长 叶 宽

337 平 均 值

338 333 图 1 处 理 96 h 后 茄 子 苗 处 理 96h 后 试 验 组 图 2 开 箱 后 茄 子 苗 处 理 96h 后 对 照 组

339 334 图 4 处 理 96h 后 试 验 组 对 照 组 的 比 较 图 5 试 验 田

340 335 图 6 苗 立 鲜 产 品 图 片 4. 试 验 结 论 由 表 1 可 知 试 验 组 和 对 照 组 株 高 和 曲 度 差 别 较 大, 叶 片 数 及 叶 长 叶 宽 差 别 较 小 综 合 以 上 因 素 可 知 苗 立 鲜 对 抑 制 种 苗 的 徒 长 具 有 显 著 作 用 下 一 步, 将 对 试 验 苗 进 行 田 间 观 察, 以 便 进 一 步 比 较 苗 立 鲜 对 茄 子 后 续 生 长 的 影 响 5. 参 考 文 献 16) 孔 凡 真. 国 外 食 品 保 鲜 十 项 新 技 术 [J]. 肉 品 卫 生,2003,(9): ) 李 京 晶, 籍 保 平, 周 峰, 李 博. 丁 香 和 肉 桂 挥 发 油 的 提 取 主 要 成 分 测 定 及 其 抗 菌 活 性 研 究 [J]. 食 品 科 学,2006,27(8): ) 王 海 宏, 周 慧 娟, 乔 勇 进, 张 绍 铃, 陈 召 亮, 王 希 英. 桃 贮 藏 保 鲜 技 术 研 究 现 状 与 发 展 趋 势 [J]. 保 鲜 与 加 工,2009,9(2): ) 王 曙 文, 代 永 刚, 牛 红 红, 南 喜 平. 国 内 外 果 蔬 生 物 保 鲜 技 术 的 研 究 进 展 [J]. 农 产 品 加 工,2008,(12): ) Roller S.The quest for natural antimicrobials as novel means of food preservation; status report on a European research project [J].International Biodeterioration and Biodegradation,1995,36 (3-4): ) Scannell A G,Ross R P,Hill C,et al. An efective lacticin biopreservative in fresh pork sausage [J].J Food Port,2000,63 (3): ) 张 福 星, 蒋 炳 生. 生 物 保 鲜 液 膜 对 草 莓 常 温 保 鲜 效 果 的 研 究 [J]. 安 徽 农 业 科 学,2000, 28(5): ) 周 静 亚, 徐 忠 传, 马 春 朋. 壳 聚 糖 在 鲜 切 果 蔬 保 鲜 中 的 应 用 [J]. 食 品 研 究 与 开 发. 2009, (10): ) 李 雯, 邵 远 志, 符 青 苗, 谢 江 辉. 壳 聚 糖 在 香 蕉 果 实 贮 藏 保 鲜 上 的 应 用 效 果 [J]. 天 然 产 物 研 究 与 开 发,2008,20(6): ) 李 凤 梅, 周 庆 新, 李 文 香, 王 成 荣, 吕 建 华. 丁 香 提 取 液 与 壳 聚 糖 复 合 对 草 莓 保 鲜 效 果 的 影 响 [J]. 青 岛 农 业 大 学 学 报,2008,25(4): ,306 26) 张 举 印, 饶 景 萍, 董 晓 庆, 田 改 妮. 壳 聚 糖 复 合 涂 膜 对 红 富 士 苹 果 保 鲜 研 究 [J]. 西 北 农 业 学 报,2009,(5): ) 曾 荣, 李 平, 陈 金 印. 天 然 保 鲜 剂 涂 膜 处 理 对 猕 猴 桃 果 实 活 性 氧 代 谢 的 影 响 [J]. 保 鲜 与 加 工,2005,5(5):29-31

341 336 28) 万 惠 萍, 叶 淑 红, 陈 丽, 曹 方, 于 榕, 穆 野, 钟 耀 广. 壳 聚 糖 膜 在 黄 瓜 保 鲜 中 的 应 用 [J]. 大 连 工 业 大 学 学 报,2008,27(2): ) 邓 冬 梅, 孙 宇 飞, 肖 恒 春. 不 同 放 置 方 式 对 壳 聚 糖 常 温 保 鲜 黄 瓜 的 影 响 [J]. 广 西 工 学 院 学 报,2008,19(1): ) 高 兆 银, 胡 美 姣, 李 敏, 杨 凤 珍. 壳 聚 糖 涂 膜 对 台 农 1 号 丰 亡 果 保 鲜 效 果 研 究 [J]. 中 国 南 方 果 树,2007,36(2):37-39 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州

342 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 平 潭 花 生 4 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

343 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 (Ralstonia solanacearum), 属 于 革 兰 氏 阴 性 b 蛋 白 类 细 菌 [1] 雷 尔 氏 菌 引 起 的 植 物 细 菌 性 青 枯 病 害 (Bacterial wilt), 简 称 青 枯 病, 是 一 种 世 界 范 围 的 细 菌 性 土 传 病 害 该 菌 寄 主 广 泛, 能 够 侵 染 热 带 和 温 带 地 区 多 达 450 种 以 上 的 植 物 种 类, 严 重 影 响 了 很 多 重 要 经 济 作 物, 比 如 番 茄 烟 草 花 生 等 的 产 量 [2] 青 枯 病 的 防 治 目 前 还 没 有 有 效 的 化 学 农 药 防 治 且 易 造 成 环 境 污 染 和 残 留 [3] 利 用 无 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 对 茄 科 作 物 进 行 免 疫 接 种, 使 植 株 产 生 类 似 于 动 物 的 免 疫 系 统 以 抵 制 病 害 本 试 验 通 过 分 离 从 平 潭 病 区 采 集 回 来 的 病 株, 检 测 该 病 区 是 否 由 青 枯 病 引 起, 以 便 我 们 更 有 针 对 性 的 防 治 作 物 病 害 的 发 生 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 植 株 试 验 植 株 为 平 潭 采 集 回 来 的 花 生 病 株 培 养 基 配 制 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 溢 菌 实 验 溢 菌 实 验 : 用 无 菌 刀 切 下 发 病 部 位 纵 切 面 切 片 置 于 载 波 片 上, 盖 上 盖 玻 片 从 盖 玻 片 的 一 边 滴 加 无 菌 水, 置 于 水 平 台 面 上 5min, 观 察 是 否 有 菌 脓 溢 出, 以 便 初 步 判 断 该 病 害 是 否 为 细 菌 性 病 害 植 株 目 标 菌 的 分 离 植 株 预 处 理 : 植 株 先 用 清 水 清 洗, 用 报 纸 将 植 株 水 分 吸 干 称 样 及 样 品 处 理 : 称 取 根 部 果 实 各 1 g, 先 用 75 酒 精 消 毒 30s 再 用 10 的 NACLO 消 毒 5min, 然 后 用 无 菌 水 清 洗 3 遍, 再 用 灭 菌 滤 纸 将 样 品 吸 干, 放 至 装 有 10 ml 无 菌 水 的 研 钵, 充 分 研 磨, 即 配 成 10-1 浓 度 ; 10-3 稀 释 样 品 原 液 : 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 平 板 涂 布 : 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 s, 吸 取 200 μl 至 相 应 标 记 浓 度 的 平 板 上, 溶 液 滴 至 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 透 进 平 板 中 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 培 养 :: 将 涂 好 的 平 板 用 袋 子 装 好 倒 置 于 30 恒 温 箱 中 培 养 60h; 划 线 分 离 纯 化 : 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 上 标 记, 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 取 平 板 上 要 分 离 纯 化 的 菌 落 至 相 应 标 记 的 平 板 上, 划 线 完 后 放 在 30 温 箱 中 培 养.; 结 果 计 算 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 3 个 平 板 上 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴

344 339 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 3. 试 验 结 果 3.1 溢 菌 实 验 由 图 1 可 知 花 生 病 株 无 溢 菌 现 象, 表 明 花 生 病 株 可 能 不 是 由 于 细 菌 性 病 害 引 起 的 需 通 过 进 一 步 分 离 以 验 证 该 病 害 是 否 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 图 1 花 生 根 部 溢 菌 实 验 图 由 图 2 植 株 分 离 图 片, 通 过 菌 落 形 态 可 初 步 判 断 该 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在 对 筛 选 出 的 几 株 菌 株 利 用 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 起 检 测 均 无 目 标 条 带 出 现, 表 明 花 生 植 株 发 病 不 是 由 青 枯 病 引 起 3.2 部 分 试 验 图 片 图 2 平 潭 花 生 4 级 病 株

345 340 图 3 花 生 病 株 株 部 分 分 离 图 片 4. 试 验 讨 论 本 试 验 从 采 集 回 来 的 花 生 病 株, 通 过 溢 菌 试 验 可 初 步 判 断 该 病 害 不 是 细 菌 性 病 害, 即 不 是 青 枯 病 引 起 的 发 病 现 象 通 过 对 植 株 各 部 位 的 分 离, 通 过 形 态 和 分 子 手 段 进 行 验 证 表 明 花 生 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 这 对 我 们 进 一 步 防 治 该 地 区 花 生 病 害 具 有 重 要 的 指 导 意 义 根 据 试 验 结 果 可 以 判 断 平 潭 花 生 病 株 不 是 青 枯 病, 可 能 由 于 枯 萎 病 或 其 他 真 菌 性 病 害 引 起 的, 这 将 更 有 利 于 我 们 有 效 防 病 害 的 发 生

346 参 考 文 献 [1] Hayward, A.C The hosts of Pseudomonas solanacearum. In Bacterial Wilt: the disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. Hayward, A.C., and Hartman, G.L.(eds).Walingford: CAB International, pp [2] M.Gillings, P.Fahy&C.Davies.Pestriction analysis of an amplified polygalacturonase gene fragment differentiates strains of Microbiology.1993,17, the phytopathogenic bacterium Pseudomonas solanacearum.letters in Applied [3] 何 学 友. 我 国 林 木 青 枯 病 研 究 概 况 [J]. 森 林 病 虫 通 讯,1997 (1): [2]Opina N L,Valdez R B,Opina O S.Effect of rice-tomato cropping patterns and flooding on the survival of Pseudomonas solanacearum E.F.Smith[J]. Philippine-Phytopathology.1994,30(2):93~99. [4] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [5] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4): [6] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1): [7] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [8] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1): [9] 杨 宇 红, 刘 俊 平, 等. 植 物 保 护 学 报 [J],2008,38(5): [10] 杨 威, 刘 苏 闵, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26( 增 刊 )90-94 [11] 吕 建 林, 刘 二 明, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26(2) [12] 祝 明 亮, 夏 振 远, 等. 中 国 烟 草 学 报 [J],2004, 10(1)25-27 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美

347 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 莆 田 辣 椒 4 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

348 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 (Ralstonia solanacearum), 属 于 革 兰 氏 阴 性 b 蛋 白 类 细 菌 [1] 雷 尔 氏 菌 引 起 的 植 物 细 菌 性 青 枯 病 害 (Bacterial wilt), 简 称 青 枯 病, 是 一 种 世 界 范 围 的 细 菌 性 土 传 病 害 该 菌 寄 主 广 泛, 能 够 侵 染 热 带 和 温 带 地 区 多 达 450 种 以 上 的 植 物 种 类, 严 重 影 响 了 很 多 重 要 经 济 作 物, 比 如 番 茄 烟 草 辣 椒 等 的 产 量 [2] 青 枯 病 的 防 治 目 前 还 没 有 有 效 的 化 学 农 药 防 治 且 易 造 成 环 境 污 染 和 残 留 [3] 无 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 对 茄 科 作 物 进 行 免 疫 接 种, 使 植 株 产 生 类 似 于 动 物 的 免 疫 系 统 以 抵 制 病 害 本 试 验 通 过 分 离 从 莆 田 病 区 采 集 回 来 的 病 株, 检 测 该 病 区 是 否 由 青 枯 病 引 起, 以 便 我 们 更 有 针 对 性 的 防 治 作 物 病 害 的 发 生 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 植 株 试 验 植 株 为 莆 田 采 集 回 来 的 辣 椒 病 株 培 养 基 配 制 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 溢 菌 实 验 溢 菌 实 验 : 用 无 菌 刀 切 下 发 病 部 位 纵 切 面 切 片 置 于 载 波 片 上, 盖 上 盖 玻 片 从 盖 玻 片 的 一 边 滴 加 无 菌 水, 置 于 水 平 台 面 上 5min, 观 察 是 否 有 菌 脓 溢 出, 以 便 初 步 判 断 该 病 害 是 否 为 细 菌 性 病 害 植 株 目 标 菌 的 分 离 植 株 预 处 理 : 植 株 先 用 清 水 清 洗, 用 报 纸 将 植 株 水 分 吸 干 称 样 及 样 品 处 理 : 称 取 根 茎 基 部 茎 中 部 茎 顶 部 叶 各 1 g, 先 用 75 酒 精 消 毒 30s 再 用 10 的 NACLO 消 毒 5min, 然 后 用 无 菌 水 清 洗 3 遍, 再 用 灭 菌 滤 纸 将 样 品 吸 干, 放 至 装 有 10 ml 无 菌 水 的 研 钵, 充 分 研 磨, 即 配 成 10-1 浓 度 ; 稀 释 样 品 原 液 : 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-3 平 板 涂 布 : 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 s, 吸 取 200 μl 至 相 应 标 记 浓 度 的 平 板 上, 溶 液 滴 至 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 透 进 平 板 中 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 培 养 :: 将 涂 好 的 平 板 用 袋 子 装 好 倒 置 于 30 恒 温 箱 中 培 养 60h; 划 线 分 离 纯 化 : 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 上 标 记, 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 取 平 板 上 要 分 离 纯 化 的 菌 落 至 相 应 标 记 的 平 板 上, 划 线 完 后 放 在 30 温 箱 中 培 养.; 结 果 计 算 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 3 个 平 板 上 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT 利 用

349 344 GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 3. 试 验 结 果 3.1 溢 菌 实 验 由 图 1 可 知 辣 椒 病 株 无 溢 菌 现 象, 表 明 辣 椒 病 株 可 能 不 是 由 于 细 菌 性 病 害 引 起 的 需 通 过 进 一 步 分 离 以 验 证 该 病 害 是 否 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 图 1 辣 椒 根 部 溢 菌 实 验 图 3.2 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 检 测 由 图 2 植 株 分 离 图 片, 通 过 菌 落 形 态 可 初 步 判 断 该 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在 对 筛 选 出 的 几 株 菌 株 利 用 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 起 检 测 均 无 目 标 条 带 出 现, 表 明 辣 椒 植 株 发 病 不 是 由 青 枯 病 引 起 图 2 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 检 测 (6,7 泳 道 为 + 对 照 ) 3.3 部 分 试 验 图 片

350 345 图 3 辣 椒 病 株 株 部 分 分 离 图 片 4. 试 验 讨 论 本 试 验 从 采 集 回 来 的 辣 椒 病 株, 通 过 溢 菌 试 验 可 初 步 判 断 该 病 害 不 是 细 菌 性 病 害, 即 不 是 青 枯 病 引 起 的 发 病 现 象 通 过 对 植 株 各 部 位 的 分 离, 通 过 形 态 和 分 子 手 段 进 行 验 证 表 明 辣 椒 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 这 对 我 们 进 一 步 防 治 该 地 区 辣 椒 病 害 具 有 重 要 的 指 导 意 义 根 据 试 验 结 果 可 以 判 断 平 潭 辣 椒 病 株 不 是 青 枯 病, 可 能 由 于 枯 萎 病 或 其 他 真 菌 性 病 害 引 起 的, 这 将 更 有 利 于 我 们 有 效 防 病 害 的 发 生

351 参 考 文 献 [1] Hayward, A.C The hosts of Pseudomonas solanacearum. In Bacterial Wilt: the disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. Hayward, A.C., and Hartman, G.L.(eds).Walingford: CAB International, pp [2] M.Gillings, P.Fahy&C.Davies.Pestriction analysis of an amplified polygalacturonase gene fragment differentiates strains of Microbiology.1993,17, the phytopathogenic bacterium Pseudomonas solanacearum.letters in Applied [3] 何 学 友. 我 国 林 木 青 枯 病 研 究 概 况 [J]. 森 林 病 虫 通 讯,1997 (1): [2]Opina N L,Valdez R B,Opina O S.Effect of rice-tomato cropping patterns and flooding on the survival of Pseudomonas solanacearum E.F.Smith[J]. Philippine-Phytopathology.1994,30(2):93~99. [4] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [5] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4): [6] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1): [7] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [8] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1): [9] 杨 宇 红, 刘 俊 平, 等. 植 物 保 护 学 报 [J],2008,38(5): [10] 杨 威, 刘 苏 闵, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26( 增 刊 )90-94 [11] 吕 建 林, 刘 二 明, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26(2) [12] 祝 明 亮, 夏 振 远, 等. 中 国 烟 草 学 报 [J],2004, 10(1)25-27 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美

352 347 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 ], 共 7 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 芽 胞 杆 菌 的 分 离 纯 化 及 保 种 ( ) 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

353 试 验 目 的 目 前 在 各 种 农 作 物 及 果 树 等 经 济 作 物 中 发 现 的 植 物 内 生 细 菌 已 超 过 745 种 ( 隶 属 于 9 个 属 ), 这 些 内 生 细 菌 大 多 为 土 壤 微 生 物 种 类 [1] 其 中 芽 胞 杆 菌 (Bacillaceae), 包 括 芽 胞 杆 菌 属 芽 胞 乳 杆 菌 属 梭 菌 属 脱 硫 肠 状 菌 属 和 芽 胞 八 叠 球 菌 属 等, 它 们 繁 殖 快 速, 生 命 力 强, 耐 强 酸 耐 强 碱 抗 菌 消 毒 耐 高 氧 ( 嗜 氧 繁 殖 ) 耐 低 氧 ( 厌 氧 繁 殖 ), 为 土 壤 微 生 物 的 主 要 类 群, 由 于 芽 胞 杆 菌 具 有 重 要 的 生 态 和 生 理 作 用, 研 究 它 就 有 重 要 的 意 义 为 了 分 离 得 到 新 的 芽 胞 杆 菌, 本 实 验 对 辽 宁 和 江 苏 省 某 些 地 区 的 土 壤 标 本 进 行 了 分 离, 采 用 稀 释 平 板 法 从 土 壤 中 分 离 芽 胞 杆 菌 并 进 行 了 纯 化, 统 计 了 几 种 不 同 土 壤 中 各 种 芽 胞 杆 菌 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 表 1 采 集 土 样 的 信 息 编 号 采 集 地 点 生 境 类 型 2983 辽 宁 沈 阳 天 柱 山 草 地 2984 辽 宁 沈 阳 天 柱 山 草 地 2985 辽 宁 沈 阳 天 柱 山 草 地 2971 江 苏 浙 江 草 地 2.2 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 膏 3 g NaCl 5 g 蛋 白 胨 10 g 琼 脂 g 水 1000 ml ph 仪 器 试 管 锥 形 瓶 150 ml, 移 液 枪, 涂 布 棒, 培 养 皿, 振 荡 器, 培 养 箱 2.4 试 验 方 法 土 样 处 理 取 五 种 土 样, 加 入 编 号 的 锥 形 瓶 内 (150 ml), 瓶 内 装 有 90 ml 无 菌 水, 加 土 样 各 10 g 震 荡 20 min( 摇 床 ) 后 水 浴 10 min(80 ) min 均 可, 中 间 震 荡 2-3 次 土 壤 原 液 的 配 置 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-3,10-4 ; 平 板 涂 布 超 净 台 上 无 菌 操 作, 每 个 梯 度 重 复 2 次 ; 涂 布 梯 度 为 培 养 用 袋 子 装 好,30 恒 温 箱 培 养 1-2 d 2.5 计 数 统 计 平 板 上 的 菌 落 数, 描 述 菌 落 形 态 大 小 等, 算 出 每 一 稀 释 度 菌 落 的 平 均 数 菌 落 数 计 算 公 式 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数 2.6 纯 化 菌 株 用 平 板 划 线 法, 用 接 种 环 在 NA 平 板 上 挑 取 单 菌 落 在 新 的 平 板 上 划 线, 划 线 后 盖 上 培 养 皿 盖, 倒 置 温 室 培 养, 培 养 后 重 复 多 次 直 到 认 为 菌 落 完 全 被 纯 化 2.7 菌 种 保 藏

354 349 对 纯 化 菌 种 编 号 后 拍 照, 保 种 3. 试 验 结 果 从 芽 孢 杆 菌 中 分 离 的 菌 株 的 形 态 特 征 描 述 和 数 量 及 照 片 见 表 2 和 纯 化 菌 落 图 表 2 从 土 样 标 本 中 分 离 的 芽 胞 杆 菌 形 态 描 述 编 号 及 数 量 菌 株 编 号 大 小 表 面 颜 色 小 光 滑 小 光 滑 小 光 滑 小 光 滑 淡 黄 色, 四 周 包 色 白 色, 四 周 透 明 中 间 灰 白, 四 周 透 明 淡 黄, 中 间 半 透 明 干 湿 形 状 高 度 边 缘 菌 落 数 ( 10 2 cfu/g 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 90 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 70 湿 圆 形 隆 起 整 齐 300 湿 圆 形 中 凹 整 齐 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 粗 糙 白 色 湿 圆 形 中 凸 不 整 齐 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 光 滑 透 明 湿 不 规 则 裂 叶 状 不 整 齐 小 光 滑 灰 色, 有 透 明 圈 湿 圆 形 扁 平 整 齐 大 粗 糙 白 色 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 大 光 滑 灰 白 湿 圆 形 隆 起 整 齐 小 不 光 滑 灰 色, 有 透 明 圈 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 淡 黄 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 粗 糙 淡 黄 湿 圆 形 褶 皱 不 整 齐 小 粗 糙 透 明 湿 不 规 则 点 状 不 整 齐 大 粗 糙 灰 白 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 大 粗 糙 灰 色 湿 圆 形 褶 皱 整 齐 大 粗 糙 白 色 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 大 粗 糙 灰 白 湿 圆 形 隆 起 整 齐 小 粗 糙 灰 白 湿 圆 形 隆 起 不 整 齐 小 光 滑 透 明 湿 圆 形 隆 起 整 齐 大 粗 糙 白 色 干 丝 状 扁 平 不 整 齐 大 粗 糙 白 色 湿 圆 形 褶 皱 不 整 齐 大 粗 糙 灰 白 湿 圆 形 隆 起 整 齐 小 光 滑 灰 色, 四 周 透 明 湿 圆 形 扁 平 整 齐 大 粗 糙 灰 色 湿 不 规 则 裂 叶 状 不 整 齐 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 170

355 350 图 1 FJAT- 土 样 4322( 正 面 ) 图 2 FJAT- 土 样 4322( 反 面 ) 图 3 FJAT- 土 样 4320( 正 面 ) 图 4 FJAT- 土 样 4320( 反 面 ) 图 5 FJAT- 土 样 4224( 正 面 ) 图 6 FJAT- 土 样 4224( 反 面 ) 图 7 FJAT- 土 样 4224( 正 面 ) 图 8 FJAT- 土 样 4224( 反 面 ) 图 9 FJAT- 土 样 4230( 正 面 ) 图 10 FJAT- 土 样 4230( 反 面 ) 图 11FJAT- 土 样 4243( 正 面 ) 图 12 FJAT- 土 样 4243( 反 面 ) 图 为 土 壤 中 分 离 的 菌 落 形 态

356 351 图 13 菌 株 14365( 正 面 ) 图 14 菌 株 14365( 反 面 ) 图 15 菌 株 14356( 正 面 ) 图 16 菌 株 14356( 反 面 ) 图 17 菌 株 14377( 正 面 ) 图 18 菌 株 14377( 反 面 ) 图 19 菌 株 14362( 正 面 ) 图 20 菌 株 14362( 反 面 ) 图 21 菌 株 14351( 正 面 ) 图 22 菌 株 14351( 反 面 ) 图 23 菌 株 14361( 正 面 ) 图 24 菌 株 14361( 反 面 )

357 352 图 25 菌 株 14374( 正 面 ) 图 26 菌 株 14374( 反 面 ) 图 27 菌 株 14363( 正 面 ) 图 28 菌 株 14363( 反 面 ) 图 29 菌 株 14369( 正 面 ) 图 30 菌 株 14369( 反 面 ) 图 31 菌 株 14366( 正 面 ) 图 32 菌 株 14366( 反 面 ) 图 33 菌 株 14367( 正 面 ) 图 34 菌 株 14367( 反 面 ) 图 35 菌 株 14370( 正 面 ) 图 36 菌 株 14370( 反 面 ) 图 为 纯 化 的 菌 落 形 态

358 试 验 讨 论 1. 土 壤 中 有 些 芽 胞 杆 菌 在 各 土 样 中 普 遍 存 在, 但 在 各 土 样 中 的 种 类 和 含 量 很 有 差 异, 可 能 是 由 于 生 境 不 同 造 成 的 2. 通 过 形 态 可 见 某 些 芽 胞 杆 菌 的 生 长 速 率 和 状 态 等 与 其 他 相 比 差 异 比 较 大 5. 参 考 文 献 [1] 宋 培 勇, 李 凤 华, 马 莉 莉. 珙 桐 内 生 细 菌 的 分 离 鉴 定 及 系 统 发 育 分 析 [J]. 微 生 物 学 通 报, (MicrobiologyChina), 2011, 38(1):8 13. 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 田 潇 娜

359 354 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 ], 共 4 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 测 定 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

360 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 生 物 体 内 一 种 重 要 的 生 物 大 分 子, 它 不 仅 是 生 物 体 的 基 本 结 构 成 分, 还 具 有 重 要 的 生 理 作 用 [1], 藻 类 真 菌 和 细 菌 中 多 不 饱 和 脂 肪 酸 含 量 丰 富, 是 因 为 微 生 物 中 具 有 一 系 列 脱 氢 酶 和 延 长 酶 等 活 性 物 质, 能 够 从 头 合 成 多 不 饱 和 脂 肪 酸, 也 就 是 说 不 同 的 生 物 由 于 自 身 生 理 功 能 等 的 不 同 会 产 生 不 同 的 脂 肪 酸, 因 此 通 过 鉴 定 脂 肪 酸 来 鉴 定 生 物 种 类, 无 疑 成 为 一 种 很 有 效 的 分 类 途 径 尤 其 通 过 脂 肪 酸 鉴 定 芽 胞 杆 菌 更 是 一 种 很 有 效 的 方 法 本 实 验 就 是 通 过 提 取 脂 肪 酸, 通 过 气 相 色 谱 检 测 系 统 来 鉴 定 芽 胞 杆 菌 2. 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlockmidi) 2.2 脂 肪 酸 提 取 前 试 剂 处 理 试 剂 I:NaOH45 g+ 甲 醇 150 ml+ 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 II:6.00 N 盐 酸 325 ml+ 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 III: 正 己 烷 200 ml+mtbe 200 ml, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 IV:NaOH 10.8 g + 去 离 子 蒸 馏 水 900 ml 2.3 提 取 步 骤 菌 株 的 培 养 将 菌 株 接 种 到 TSB 平 板 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24 h 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 mg 芽 胞 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 管 中 加 入 1.0 ml 的 [ 试 剂 I], 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5-10 min; 放 入 的 沸 水 中 水 浴 5 min; 从 沸 水 中 移 开 试 管 并 轻 微 的 冷 却 不 要 打 开 盖 子 ; 震 荡 每 支 试 管 5-10 min; 再 水 浴 25 min; 移 开 和 放 置 试 管 架 室 温 冷 却 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 脂 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 2.0 ml[ 试 剂 II]; 栓 紧 盖 子 震 荡 5-10 min; 水 浴 加 热 试 管 min; 移 开 且 快 速 用 龙 头 水 冷 却 至 室 温 萃 取 ( 甲 基 脂 脂 肪 酸 移 出 从 酸 性 水 相 转 移 到 一 个 有 机 相 液 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25 ml[ 试 剂 III] 萃 取 溶 剂 在 每 个 试 管 中 ; 盖 紧 盖 子, 放 此 批 的 试 管 在 一 个 旋 转 器 温 和 混 合 旋 转 10 min; 打 开 管 盖, 利 用 干 净 的 移 液 管 取 出 每 个 样 本 的 下 层 似 水 部 位, 弃 去 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 酸 ) 加 入 3.0 ml[ 试 剂 IV]; 栓 紧 盖 子 和 温 和 震 荡 试 管 旋 转 约 5 min; 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 出 约 2/3 体 积 的 上 层 有 机 体 到 干 净 的 GC 检 体 小 瓶 2.4 上 样 脂 肪 酸 检 测 2.5 数 据 库 比 对

361 试 验 结 果 共 测 试 34 株 菌 株, 测 试 结 果 如 下 : 菌 株 编 号 SimIndex 菌 种 名 Bacillus simplex Bacillus pumilus GC subgroup B Bacillus megaterium GC subgroup B Brevibacillus choshinensis Bacillus alcalophilus Bacillus cereus GC subgroup B 无 匹 配 Bacillus cereus Bacillus cereus GC subgroup B Bacillus GC group Brevibacillus choshinensis Bacillus megaterium GC subgroup B Bacillus atrophaeus Bacillus GC group Bacillus lentus 无 匹 配 Bacillus halmapalus Bacillus sphaericus GC subgroup E Paenibacillus polymyxa (Bacillus) Bacillus licheniformis (Bacillus subtilis group) Paenibacillus macquariensis Bacillus pumilus GC subgroup A Bacillus atrophaeus Bacillus licheniformis Bacillus GC group Bacillu GC group Cedecea davisae Kurthia gibsonii Sporosarcina ureae Bacillus sphaericus GC subgroup E Cedecea davisae Bacillus clausii

362 Virgibacillus pantothenticus (Bacillus) 4. 试 验 讨 论 1. 通 过 各 项 指 标 可 以 看 出 通 过 这 种 方 法 鉴 定 的 脂 肪 酸 精 确 度 是 很 高 的 2. 检 测 结 果 的 峰 值 显 示 某 些 脂 肪 酸 中 可 能 含 有 杂 质, 应 注 意 确 保 提 取 脂 肪 酸 的 纯 度 5. 参 考 文 献 [1] 刘 梦 坛, 李 超 伦, 孙 松. 脂 肪 酸 对 中 华 哲 水 蚤 摄 食 两 种 海 洋 微 藻 的 指 示 作 用 [J]. 生 态 学 报, 2011, 31(4): 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 田 潇 娜

363 358 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 ], 共 8 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 芽 胞 杆 菌 的 分 离 纯 化 及 保 存 ( ) 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 :

364 359 fjat.yzxz.com 1. 试 验 目 的 芽 胞 杆 菌 是 土 壤 和 植 物 微 生 态 的 优 势 微 生 物 种 群, 是 植 物 病 害 生 防 微 生 物 的 重 要 组 成 部 分, 由 于 其 能 产 生 抗 逆 性 强 的 芽 孢, 对 菌 体 的 生 存 剂 型 加 工 及 其 在 环 境 中 的 存 活 和 定 殖 都 十 分 有 利, 因 [1] 此 它 是 一 种 理 想 的 生 防 微 生 物, 许 多 性 状 优 良 的 拮 抗 菌 株 已 成 功 地 应 用 于 植 物 病 害 生 物 防 治 中, 而 土 壤 又 是 芽 胞 杆 菌 主 要 的 来 源, 因 此, 分 离 筛 选 各 种 不 同 的 芽 胞 杆 菌 为 生 物 农 药 的 开 发 等 提 供 [2] 了 基 础 资 源, 具 有 重 要 意 义 为 了 分 离 得 到 新 的 芽 胞 杆 菌, 本 实 验 对 几 个 不 同 地 区 的 土 壤 标 本 进 行 了 分 离, 采 用 稀 释 平 板 计 数 法 统 计 了 几 种 不 同 土 壤 中 各 种 芽 胞 杆 菌 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 表 1 采 集 土 样 的 信 息 编 号 采 集 地 点 生 境 类 型 采 集 时 间 4160 河 北 野 狐 岭 河 北 张 家 口 草 地 河 北 野 狐 岭 树 林 北 京 颐 和 园 河 北 衡 水 花 地 2.2 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 膏 3 g NaCl 5 g 蛋 白 胨 10 g 琼 脂 g 水 1000 ml ph 仪 器 试 管 锥 形 瓶 150 ml, 移 液 枪, 涂 布 棒, 培 养 皿, 振 荡 器, 培 养 箱 2.4 试 验 方 法 土 样 处 理 取 五 种 土 样, 加 入 编 号 的 锥 形 瓶 内 (150 ml), 瓶 内 装 有 90 ml 无 菌 水, 加 土 样 各 10 g 震 荡 20 min( 摇 床 ) 后 水 浴 10 min(80 ) min 均 可, 中 间 震 荡 2-3 次 土 壤 原 液 的 配 置 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-3,10-4 ; 平 板 涂 布 超 净 台 上 无 菌 操 作, 每 个 梯 度 重 复 2 次 ; 涂 布 梯 度 为 培 养 用 袋 子 装 好,30 恒 温 箱 培 养 1-2 d 2.5 计 数 统 计 平 板 上 的 菌 落 数, 描 述 菌 落 形 态 大 小 等, 算 出 每 一 稀 释 度 菌 落 的 平 均 数 菌 落 数 计 算 公 式 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数 2.6 纯 化 菌 株 用 平 板 划 线 法, 用 接 种 环 在 NA 平 板 上 挑 取 单 菌 落 在 新 的 平 板 上 划 线, 划 线 后 盖 上 培 养 皿 盖,

365 360 倒 置 温 室 培 养, 培 养 后 重 复 多 次 直 到 认 为 菌 落 完 全 被 纯 化 2.7 菌 种 保 藏 对 纯 化 菌 种 编 号 后 拍 照, 保 存 3. 试 验 结 果 从 芽 孢 杆 菌 中 分 离 的 菌 株 的 形 态 特 征 描 述 和 数 量 及 照 片 见 表 2 和 图 表 2 从 土 样 标 本 中 分 离 的 芽 胞 杆 菌 形 态 描 述 编 号 及 数 量 菌 株 编 号 大 小 表 面 颜 色 干 湿 形 状 高 度 边 缘 菌 落 数 ( 10 4 cfu/g) 大 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 褶 皱 不 整 齐 小 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 褶 皱 不 整 齐 小 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 褶 皱, 有 白 色 圈 不 整 齐 小 光 滑 黄 色, 透 明 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 光 滑 中 间 灰 白, 四 周 透 明 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 小 粗 糙 白 色 湿 圆 形 中 间 有 褶 皱 整 齐 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平, 中 间 有 白 圈 整 齐 小 粗 糙 淡 黄 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 灰 白 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 粗 糙 粉 色 湿 不 规 则 褶 皱 不 整 齐 大 粗 糙 灰 色 湿 不 规 则 白 色 褶 皱 不 整 齐 大 粗 糙 灰 白 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 透 明 湿 不 规 则 有 白 色 褶 皱 不 整 齐 小 光 滑 白 色 湿 不 规 则 扁 平 裂 叶 状 小 光 滑 淡 黄 色, 有 透 明 圈 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 光 滑 淡 粉 湿 圆 形 中 凸 整 齐 小 光 滑 透 明 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 光 滑 白 色 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 大 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 大 光 滑 灰 白 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 大 粗 糙 白 色 湿 圆 形 中 凸 不 整 齐 小 粗 糙 白 色 湿 圆 形 隆 起 整 齐 小 光 滑 淡 黄 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 中 间 有 波 纹 状 整 齐 6

366 小 光 滑 中 间 淡 黄, 四 周 透 明 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 淡 黄 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 光 滑 透 明 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 淡 粉 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 光 滑 淡 黄 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 大 光 滑 灰 色 湿 不 规 则 扁 平, 有 白 色 褶 皱 不 整 齐 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 扁 平, 中 间 白 色, 有 圈 状 凸 不 整 齐 3 起 小 光 滑 灰 白, 有 透 明 圈 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 粗 糙 灰 色 湿 圆 形 扁 平, 有 白 色 褶 皱 整 齐 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平, 有 白 色 褶 皱 整 齐 大 粗 糙 灰 色 湿 不 规 则 褶 皱 不 整 齐 小 光 滑 黄 色 湿 圆 形 中 凸 整 齐 小 光 滑 中 间 黄 色, 四 周 透 明 湿 圆 形 中 凸 整 齐 小 光 滑 灰 色, 半 透 明 湿 圆 形 扁 平 整 齐 大 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 小 光 滑 白 色 湿 不 规 则 扁 平 裂 叶 状 小 光 滑 淡 黄 湿 圆 形 褶 皱 不 整 齐 小 光 滑 中 间 透 明, 四 周 白 色 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 1 图 1 FJAT- 土 样 4157( 正 面 ) 图 2 FJAT- 土 样 4157( 反 面 ) 图 3 FJAT- 土 样 4157( 正 面 )

367 362 图 4 FJAT- 土 样 4157( 反 面 ) 图 5 FJAT- 土 样 4161( 正 面 ) 图 6 FJAT- 土 样 4161( 反 面 ) 图 7 FJAT- 土 样 2384( 正 面 ) 图 8 FJAT- 土 样 2384( 反 面 ) 图 9 FJAT- 土 样 4160( 正 面 ) 图 10 FJAT- 土 样 4160( 反 面 ) 图 11 FJAT- 土 样 2982( 正 面 ) 图 12 FJAT- 土 样 2982( 反 面 ) 图 为 土 壤 中 分 离 的 菌 落 形 态 图 13 菌 株 ( 正 面 ) 图 14 菌 株 14408( 反 面 ) 图 15 菌 株 ( 正 面 )

368 363 图 16 菌 株 14409( 反 面 ) 图 17 菌 株 ( 正 面 ) 图 18 菌 株 14411( 反 面 ) 图 19 菌 株 ( 正 面 ) 图 20 菌 株 14379( 反 面 ) 图 21 菌 株 ( 正 面 ) 图 22 菌 株 14404( 反 面 ) 图 23 菌 株 ( 正 面 ) 图 24 菌 株 14400( 反 面 ) 图 25 菌 株 ( 正 面 ) 图 26 菌 株 14394( 反 面 ) 图 27 菌 株 ( 正 面 )

369 364 图 28 菌 株 14410( 反 面 ) 图 29 菌 株 ( 正 面 ) 图 30 菌 株 14388( 反 面 ) 图 31 菌 株 14422( 正 面 ) 图 32 菌 株 14422( 反 面 ) 图 33 菌 株 14385( 正 面 ) 图 34 菌 株 14385( 反 面 ) 图 35 菌 株 14386( 正 面 ) 图 36 菌 株 14386( 反 面 ) 图 为 纯 化 菌 株 形 态 4. 试 验 讨 论 1. 实 验 结 果 表 明 不 同 土 壤 中 含 菌 的 种 类 和 数 量 不 同, 也 就 是 说 不 同 地 区 菌 的 生 长 受 环 境 条 件 各 方 面 的 影 响 2. 不 同 土 壤 中 含 有 一 些 相 同 的 菌, 但 各 土 壤 中 也 有 许 多 不 同 的 芽 胞 杆 菌, 不 同 平 板 上 也 会 因 微 环 境 的 不 同 长 不 同 的 菌 5. 参 考 文 献 [1] 陈 中 义, 张 杰, 黄 大 昉. 植 物 病 害 生 防 芽 孢 杆 菌 抗 菌 机 制 与 遗 传 改 良 研 究 [J]. 植 物 病 理 学 报, 2003, 33(2):

370 365 [2] 任 士 伟, 邢 小 霞, 董 向 丽 生 防 芽 孢 杆 菌 的 分 离 筛 选 与 初 步 鉴 定 [J]. 现 代 农 药, 2011, 10 (1): 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 田 潇 娜

371 366 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 ], 共 5 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 测 定 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

372 试 验 目 的 芽 胞 杆 菌 中 含 有 多 种 不 同 的 脂 肪 酸, 因 脂 肪 酸 是 生 物 体 内 一 种 重 要 的 生 物 大 分 子, 它 不 仅 是 生 物 体 的 基 本 结 构 成 分, 还 具 有 重 要 的 生 理 作 用 [1], 藻 类 真 菌 和 细 菌 中 多 不 饱 和 脂 肪 酸 含 量 丰 富, 是 因 为 微 生 物 中 具 有 一 系 列 脱 氢 酶 和 延 长 酶 等 活 性 物 质, 能 够 从 头 合 成 多 不 饱 和 脂 肪 酸, 也 就 是 说 不 同 的 生 物 由 于 自 身 生 理 功 能 等 的 不 同 会 产 生 不 同 的 脂 肪 酸, 因 此 通 过 鉴 定 脂 肪 酸 来 鉴 定 生 物 种 类, 无 疑 成 为 一 种 很 有 效 的 分 类 途 径 尤 其 通 过 脂 肪 酸 鉴 定 芽 胞 杆 菌 更 是 一 种 很 有 效 的 方 法 本 实 验 就 是 通 过 提 取 脂 肪 酸, 用 气 相 色 谱 检 测 系 统 来 鉴 定 芽 胞 杆 菌 2. 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlockmidi) 2.2 脂 肪 酸 提 取 前 试 剂 处 理 试 剂 I:NaOH45 g+ 甲 醇 150 ml+ 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 II:6.00 N 盐 酸 325 ml+ 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 III: 正 己 烷 200 ml+mtbe 200 ml, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 IV:NaOH 10.8 g + 去 离 子 蒸 馏 水 900 ml 2.3 提 取 步 骤 菌 株 的 培 养 将 菌 株 接 种 到 TSB 平 板 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24 h 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 mg 芽 胞 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 管 中 加 入 1.0 ml 的 [ 试 剂 I], 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5-10 min; 放 入 的 沸 水 中 水 浴 5 min; 从 沸 水 中 移 开 试 管 并 轻 微 的 冷 却 不 要 打 开 盖 子 ; 震 荡 每 支 试 管 5-10 min; 再 水 浴 25 min; 移 开 和 放 置 试 管 架 室 温 冷 却 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 脂 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 2.0 ml[ 试 剂 II]; 栓 紧 盖 子 震 荡 5-10 min; 水 浴 加 热 试 管 min; 移 开 且 快 速 用 龙 头 水 冷 却 至 室 温 萃 取 ( 甲 基 脂 脂 肪 酸 移 出 从 酸 性 水 相 转 移 到 一 个 有 机 相 液 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25 ml[ 试 剂 III] 萃 取 溶 剂 在 每 个 试 管 中 ; 盖 紧 盖 子, 放 此 批 的 试 管 在 一 个 旋 转 器 温 和 混 合 旋 转 10 min; 打 开 管 盖, 利 用 干 净 的 移 液 管 取 出 每 个 样 本 的 下 层 似 水 部 位, 弃 去 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 酸 ) 加 入 3.0 ml[ 试 剂 IV]; 栓 紧 盖 子 和 温 和 震 荡 试 管 旋 转 约 5 min; 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 出 约 2/3 体 积 的 上 层 有 机 体 到 干 净 的 GC 检 体 小 瓶 2.4 上 样 脂 肪 酸 检 测 2.5 数 据 库 比 对

373 试 验 结 果 共 测 试 48 株 菌 株, 测 试 结 果 如 下 : 菌 株 编 号 SimIndex 菌 种 名 Bacillus cereus GC subgroup B Paenibacillus azotofixans (Bacillus azotofixans) Bacillus megaterium GC subgroup A Paenibacillus lentimorbus Bacillus lentus Bacillus GC group Paenibacillus polymyxa (Bacillus) Bacillus oleronius Bacillus sphaericus GC subgroup D Bacillus sphaericus GC subgroup B Bacillus lentus Bacillus cereus GC subgroup B Bacillus subtilis Bacillus pumilus GC subgroup B Virgibacillus pantothenticus (Bacillus) Bacillus cereus GC subgroup B Stenotrophomonas maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) Bacillus circulans GC subgroup A Bacillus viscosus(was Arthrobacter) Bacillus circulans GC subgroup A Bacillus megaterium GC subgroup A Bacillus clausii Bacillus clausii Bacillus alcalophilus Bacillus alcalophilus Bacillus megaterium GC subgroup A Bacillus pumilus GC subgroup B Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus)

374 Paenibacillus lentimorbus Bacillus oleronius Bacillus cereus GC subgroup A Bacillus sphaericus GC subgroup B Bacillus cereus GC subgroup B Paenibacillus-polymyxa (Bacillus) Bacillus pumilus GC subgroup B Bacillus megaterium GC subgroup A Bacillus megaterium GC subgroup A Microbacterium laevaniformans (Corynebacterium laevaniformans Bacillus cereus GC subgroup B Paenibacillus lautus Paenibacillus polymyxa (Bacillus) Bacillus cereus GC subgroup B Paenibacillus poymyxa (Bacillus) Bacillu cereus GC subgroup B Bacillus cereus GC subgroup B 无 匹 配 Bacillus sphaericus GC subgroup D Bacillus pumilus GC subgroup B 4. 试 验 讨 论 1. 检 测 结 果 的 峰 值 显 示 某 些 脂 肪 酸 中 可 能 含 有 杂 质, 应 注 意 确 保 提 取 脂 肪 酸 的 纯 度 2. 通 过 各 项 指 标 可 以 看 出 通 过 这 种 方 法 鉴 定 的 脂 肪 酸 精 确 度 是 很 高 的 5. 参 考 文 献 [1] 刘 梦 坛, 李 超 伦, 孙 松. 脂 肪 酸 对 中 华 哲 水 蚤 摄 食 两 种 海 洋 微 藻 的 指 示 作 用 [J]. 生 态 学 报, 2011, 31(4): 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 田 潇 娜

375 370 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 ], 共 4 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 鉴 定 试 验 人 员 : 余 谦 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

376 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 生 物 体 内 一 种 重 要 的 生 物 大 分 子, 它 不 仅 是 生 物 体 的 基 本 结 构 成 分, 还 具 有 重 要 的 生 理 作 用 [1], 藻 类 真 菌 和 细 菌 中 多 不 饱 和 脂 肪 酸 含 量 丰 富, 是 因 为 微 生 物 中 具 有 一 系 列 脱 氢 酶 和 延 长 酶 等 活 性 物 质, 能 够 从 头 合 成 多 不 饱 和 脂 肪 酸, 也 就 是 说 不 同 的 生 物 由 于 自 身 生 理 功 能 等 的 不 同 会 产 生 不 同 的 脂 肪 酸, 因 此 通 过 鉴 定 脂 肪 酸 来 鉴 定 生 物 种 类, 无 疑 成 为 一 种 很 有 效 的 分 类 途 径 尤 其 通 过 脂 肪 酸 鉴 定 芽 胞 杆 菌 更 是 一 种 很 有 效 的 方 法 本 实 验 就 是 通 过 提 取 脂 肪 酸, 通 过 气 相 色 谱 检 测 系 统 来 鉴 定 芽 胞 杆 菌 的 种 类 2. 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlockmidi) 2.2 脂 肪 酸 提 取 前 试 剂 处 理 试 剂 I:NaOH45 g+ 甲 醇 150 ml+ 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 II:6.00 N 盐 酸 325 ml+ 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 III: 正 己 烷 200 ml+mtbe200 ml, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 IV:NaOH10.8 g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900 ml 2.3 提 取 步 骤 菌 株 的 培 养 将 菌 株 接 种 到 TSB 平 板 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24 h 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 mg 芽 胞 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 管 中 加 入 1.0 ml 的 [ 试 剂 I], 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5-10 min; 放 入 的 沸 水 中 水 浴 5 min; 从 沸 水 中 移 开 试 管 并 轻 微 的 冷 却 不 要 打 开 盖 子 ; 震 荡 每 支 试 管 5-10 min; 再 水 浴 25 min; 移 开 和 放 置 试 管 架 室 温 冷 却 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 脂 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 2.0 ml[ 试 剂 II]; 栓 紧 盖 子 震 荡 5-10 min; 水 浴 加 热 试 管 min; 移 开 且 快 速 用 龙 头 水 冷 却 至 室 温 萃 取 ( 甲 基 脂 脂 肪 酸 移 出 从 酸 性 水 相 转 移 到 一 个 有 机 相 液 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25 ml[ 试 剂 III] 萃 取 溶 剂 在 每 个 试 管 中 ; 盖 紧 盖 子, 放 此 批 的 试 管 在 一 个 旋 转 器 温 和 混 合 旋 转 10 min; 打 开 管 盖, 利 用 干 净 的 移 液 管 取 出 每 个 样 本 的 下 层 似 水 部 位, 弃 去 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 酸 ) 加 入 3.0 ml[ 试 剂 IV]; 栓 紧 盖 子 和 温 和 震 荡 试 管 旋 转 约 5 min; 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移

377 372 出 约 2/3 体 积 的 上 层 有 机 体 到 干 净 的 GC 检 体 小 瓶 2.4 上 样 脂 肪 酸 检 测 2.5 数 据 库 比 对 3. 试 验 结 果 共 测 试 17 株 菌 株, 测 试 结 果 如 下 : 菌 株 编 号 SimIndex 菌 种 名 Bacillus-GC group 22 (No 16S match to known species) Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 无 匹 配 Brevibacillus-reuszeri Bacillus-viscosus" (was Arthrobacter) Bacillus-sphaericus-GC subgroup E Brevibacillus-reuszeri Bacillus-cereus-GC subgroup B Brevibacillus-reuszeri 无 匹 配 Bacillus-cereus-GC subgroup A Bacillus-mycoides-GC subgroup B (Bacillus cereus group) Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) Bacillus-cereus-GC subgroup A 无 匹 配 Bacillus-cereus-GC subgroup A 无 匹 配 4. 试 验 讨 论 检 测 结 果 的 峰 值 显 示 某 些 脂 肪 酸 中 可 能 含 有 杂 质, 也 就 是 可 能 在 提 取 取 过 程 中 操 作 可 能 有 问 题, 应 注 意 确 保 提 取 脂 肪 酸 的 纯 度 另 外, 在 提 取 的 过 程 中 可 能 也 有 操 作 不 规 范 的 地 方, 比 如, 在 水 浴 加 热 试 管 min 这 一 步 可 能 存 在 时 间 以 及 温 度 控 制 不 当 的 问 题, 特 别 是 温 度 不 在 80 上, 从 而 对 实 验 的 结 果 会 造 成 一 定 的 误 差, 这 些 都 是 在 以 后 的 实 验 中 应 该 注 意 的, 尽 量 避 免 因 操 作 而 造 成 的 误 差 在 本 次 实 验 中 出 现 了 2 个 匹 配 值 很 低 的 菌 株,14277 和 这 几 株 菌 的 匹 配 值 均 在 0.3 以 下, 其 原 因 很 可 能 是 在 提 取 的 时 候, 挑 菌 后, 接 种 环 灭 菌 不 够, 没 完 全 灭 活, 从 而 带 入 其 他 菌, 使 其 匹 配 值 很 低

378 参 考 文 献 [1] 刘 梦 坛, 李 超 伦, 孙 松. 脂 肪 酸 对 中 华 哲 水 蚤 摄 食 两 种 海 洋 微 藻 的 指 示 作 用 [J]. 生 态 学 报, 2011, 31(4): [2] MIDI 微 生 物 鉴 定 系 统. 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 余 谦

379 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 耐 高 温 芽 孢 杆 菌 的 分 离 试 验 人 员 : 余 谦 试 验 负 责 : 刘 国 红 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

380 375 1 试 验 目 的 土 壤 是 微 生 物 生 活 的 大 本 营, 是 寻 找 和 发 现 有 重 要 应 用 潜 力 的 微 生 物 的 主 要 菌 源 不 同 土 壤 微 生 物 [1] [1] 的 含 量 不 同, 土 壤 是 芽 孢 杆 菌 最 丰 富 的 来 源 另 外, 在 水 中 也 可 以 筛 选 出 少 量 的 芽 孢 杆 菌 芽 孢 杆 菌 多 样 性 的 研 究 在 科 学 领 域 研 究 的 和 很 少, 采 用 现 代 分 类 手 段 对 其 中 芽 孢 杆 菌 资 源 进 行 调 查 和 分 类 研 究 可 望 获 得 芽 孢 杆 菌 的 一 些 生 产 年 应 用 或 者 潜 在 应 用 价 值 的 菌 株, 具 有 重 要 的 科 学 意 义 和 经 济 价 值, 对 建 立 相 应 的 芽 孢 杆 菌 资 源 库 和 数 据 库 有 重 要 意 义 所 以 芽 孢 杆 菌 的 研 究 蕴 涵 着 巨 大 的 经 济 效 益 和 科 学 价 值, 而 开 发 和 应 用 这 种 效 益 与 价 值 的 前 提 就 是 资 源 的 获 得 和 资 源 的 探 入 研 究, 因 此 芽 孢 杆 菌 的 资 源 分 类 是 有 着 重 要 意 义 的 科 研 项 目 本 实 验 从 温 泉 附 近 采 集 土 壤 及 水 样, 从 中 筛 选 出 耐 高 温 的 芽 孢 杆 菌 [1,2,3] 本 实 验 主 要 是 采 用 稀 释 平 板 法 从 土 壤 中 分 离 耐 高 温 的 芽 孢 杆 菌, 将 类 似 芽 孢 杆 菌 的 菌 落 挑 出 进 行 培 养, 纯 化 培 养 得 到 的 菌 落 斜 面 保 存, 作 为 下 一 步 实 验 的 菌 种 材 料 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 与 仪 器 2.1. 样 品 本 实 验 所 用 的 实 验 材 料 均 采 集 于 温 泉 附 近 的 土 壤 及 水 中 仪 器 振 荡 器 摇 床 2.2 试 验 方 法 称 样 : 称 取 5 g 土 壤 至 装 有 45 ml 无 菌 水 的 三 角 瓶, 摇 床 振 荡 15 min, 使 之 充 分 溶 解, 即 配 成 10-1 浓 度 ; 稀 释 土 壤 原 液 : 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 ; 水 浴 : 将 稀 释 好 的 土 样 溶 液 放 在 80 水 浴 锅 水 浴 10 min, 期 间 振 荡 2-3 次 ; 平 板 涂 布 : 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 s, 吸 取 200 μl 至 相 应 标 记 浓 度 的 平 板 上, 溶 液 滴 至 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 透 进 平 板 中 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 培 养 :: 将 涂 好 的 平 板 用 报 纸 包 好, 分 成 两 份, 分 别 倒 置 于 30 和 75 恒 温 箱 中 培 养 2 d; 划 线 分 离 : 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 上 标 记, 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 取 平 板 上 要 分 离 纯 化 的 菌 落 至 相 应 标 记 的 平 板 上, 划 线 完 后 放 在 30 和 75 温 箱 中 培 养.; 结 果 计 算 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 3 个 平 板 上 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数

381 试 验 结 果 本 试 验 的 土 样 分 离 结 果 如 表 2. 土 样 5.0 中 芽 孢 杆 菌 的 含 量 最 高, 土 样 5.0 和 5.2 的 芽 孢 杆 菌 含 量 基 本 一 致,5.1 的 含 量 最 少,5.0 样 本 中 菌 的 种 类 数 最 少. 其 它 四 个 样 的 芽 孢 杆 菌 的 种 类 数 差 不 多 一 样. 根 据 菌 落 特 征 观 察 3 个 土 样 芽 孢 杆 菌 分 离 的 结 果 见 表 2 表 2 不 同 土 样 分 离 芽 孢 杆 菌 数 量 土 样 编 号 土 样 原 始 编 号 肉 眼 观 察 重 复 总 含 量 均 值 Ⅰ 种 菌 Ⅱ Ⅲ 0 Ⅰ 种 菌 Ⅱ Ⅲ 0 Ⅰ 种 菌 Ⅱ Ⅲ 种 菌 Ⅰ Ⅰ Ⅲ 种 菌 Ⅰ Ⅰ Ⅲ 0 表 3 菌 落 特 征 菌 株 正 面 颜 色 表 面 特 征 边 缘 形 状 菌 落 形 状 光 学 特 征 乳 白 色 粗 糙 整 齐 近 圆 形, 湿 润, 不 透 明, 有 光 泽 突 起 乳 白 色 光 滑 整 齐 圆 形, 湿 润, 隆 不 透 明, 有 光 泽 突 白 色 粗 糙 整 齐 近 圆 形, 扁 平, 半 透 明, 无 光 泽 湿 润 乳 白 色 粗 糙 整 齐 圆 形, 干 燥, 突 不 透 明, 有 光 泽 起 乳 白 色 粗 糙 整 齐 圆 形, 干 燥, 突 不 透 明, 有 光 泽 起 灰 白 光 滑 齿 状 近 圆 形, 扁 平, 半 透 明, 无 光 泽 干 燥 乳 白 色 光 滑 整 齐 圆 形, 隆 起, 湿 不 透 明, 无 光 泽 润 米 黄 色 粗 糙 丝 状 圆 形, 隆 起, 湿 不 透 明, 有 光 泽 润 乳 白 色 不 光 滑 整 齐 近 圆 形, 扁 平, 半 透 明, 有 光 泽 湿 润 乳 白 色 光 滑 整 齐 圆 形, 扁 平, 干 不 透 明, 无 光 泽 燥 乳 白 色 光 滑 整 齐 圆 形, 扁 平, 湿 润 不 透 明, 有 光 泽

382 乳 白 色 光 滑 整 齐 隆 突, 圆 形, 湿 润 浅 黄 色 光 滑 整 齐 圆 形, 湿 润, 隆 突 不 透 明, 有 光 泽 不 透 明, 有 光 泽 表 3 70 下 筛 选 菌 落 数 量 土 样 编 号 肉 眼 观 察 编 号 总 含 量 均 值 3 1 种 菌 种 菌 以 下 是 几 种 代 表 性 菌 株 菌 落 图 : 图 1 菌 株 14340( 反 面 ) 图 2 菌 株 14340( 正 面 ) 图 3 菌 株 14338( 反 面 ) 图 4 菌 株 14338( 正 面 ) 图 5 菌 株 14342( 反 面 ) 图 6 菌 株 14342( 正 面 ) 图 7 菌 株 14341( 反 面 ) 图 8 菌 株 14281( 正 面 ) 图 9 菌 株 14344( 反 面 ) 图 10 菌 株 14344( 正 面 ) 图 11 菌 株 14343( 反 面 ) 图 12 菌 株 14343( 正 面 ) 4. 试 验 结 论 土 壤 是 芽 孢 杆 菌 的 主 要 来 源 本 试 验 选 择 的 3 个 土 样 和 2 个 水 样 中 的 芽 孢 杆 菌 的 含 量 均 很 少 分 析 其 原 因 很 可 能 是 在 高 温 下 菌 的 蛋 白 质 和 酶 发 生 凝 固 或 变 性 而 导 致 其 死 亡 芽 孢 杆 菌 的 总 数 量 与 土 壤 悬 液 是 否 加 热 有 关, 文 献 中 有 提 到 过 热 处 理 后 测 定 的 数 量 显 著 低 于 非 热 处 理 的 菌 的 总 量 和 菌 的 种 类 的 多 少 也 和 土

383 378 壤 的 营 养 状 况 温 度 和 ph 有 一 定 的 关 系, 另 外, 采 样 的 时 间 也 可 能 对 其 有 一 定 的 影 响 本 次 实 验 中 1 3 和 5 号 样 均 采 自 80 的 环 境 中, 菌 的 数 量 很 少, 只 有 10 2 数 量 级, 而 2 和 4 号 样 采 集 的 温 度 是 50 的 环 境, 菌 的 数 量 相 对 就 要 多, 达 到 10 3 一 般 来 说, 土 壤 中 芽 孢 杆 菌 的 的 数 量 差 异 是 很 大 的, 大 概 在 10 3 到 10 6 之 间, 本 实 验 测 得 的 结 果 是 与 理 论 不 相 符 合 的, 不 在 此 范 围 之 内, 其 主 要 原 因 是 大 部 分 菌 都 不 耐 高 温, 在 高 温 下 不 能 生 长 本 次 筛 选 到 2 株 菌 均 能 在 75 的 高 温 下 生 长, 但 是 其 数 量 相 当 的 少 5 参 考 文 献 [1] 钱 存 柔, 黄 仪 秀. 微 生 物 学 实 验 教 程. 北 京 大 学 出 版 社 年. [2] 魏 雪 生, 陈 颖, 牛 静 怡. 天 津 地 区 土 壤 中 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 调 查. 天 津 农 学 院 学 报 年, 13(3):30-3 [3] 李 峰, 郭 瑞 雪, 张 林 普. 芽 孢 杆 菌 属 一 新 种 的 鉴 定. 淮 北 煤 炭 师 范 学 院 学 报. 2005, 26(2): 试 验 设 计 : 余 谦 试 验 负 责 : 刘 国 红 试 验 人 员 : 余 谦 刘 国 红

384 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 二 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

385 试 验 目 的 传 统 养 猪 模 式 产 生 的 大 量 粪 便 给 环 境 带 来 极 大 的 负 担, 造 成 严 重 的 污 染 而 目 前, 发 酵 床 养 猪 是 一 个 非 常 热 门 的 话 题, 又 称 零 污 染 养 猪, 即 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 [1] 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 发 酵 床 养 猪 模 式 中 垫 料 的 原 材 料 由 谷 壳 和 木 屑 组 成, 由 于 目 前 生 产 上 该 原 材 料 紧 缺, 价 格 较 高, 急 需 寻 找 其 他 廉 价 的 农 产 品 废 弃 物 作 为 新 原 材 料 本 实 验 用 菌 渣 和 椰 子 壳 替 代 垫 料 原 材 料 进 行 发 酵, 并 模 拟 猪 场 零 排 放 模 式 将 猪 粪 直 接 加 入 垫 料 中 进 行 堆 肥 实 验, 采 用 稀 释 涂 布 平 板 法 研 究 堆 肥 发 酵 过 程 中 微 生 物 的 变 化 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 福 清 渔 溪 农 场 的 堆 肥 实 验 样 品 组 成 如 下 表 2-1: 表 2-1 垫 料 样 品 配 方 组 合 设 计 编 号 组 合 1 菌 渣 + 椰 子 壳 (1;2) 2 谷 壳 + 锯 末 (1:1) 3 菌 渣 4 菌 渣 + 椰 子 壳 (1:1) 5 椰 子 壳 2011 年 07 月 18 日 在 不 同 配 比 的 垫 料 中 各 加 入 50 公 斤 新 鲜 猪 粪, 堆 积 发 酵 采 样 批 次 及 信 息 见 表 2-2: 表 2-2 采 样 批 次 信 息 批 次 时 间 备 注 第 一 批 无 第 二 批 无 第 三 批 采 样 后 翻 堆 2.2 实 验 器 材 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 浸 膏 3g 蛋 白 胨 5g 葡 萄 糖 10g 琼 脂 15-20g 水 定 容 1000ml ph 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 (PDA): 马 铃 薯 200g 葡 萄 糖 20g 琼 脂 15-20g, 配 制 时 将 土 豆 切 块 煮 沸 后 过 滤, 加 葡 萄 糖, 蒸 馏 水 定 容 1000ml 溶 液 或 试 剂 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 盛 90ml 无 菌 水 并 带 有 玻 璃 珠 的 250ml 三 角 瓶

386 仪 器 或 其 他 用 具 采 样 袋 无 菌 涂 布 棒 灭 菌 试 管 1ml 移 液 枪 无 菌 1ml 移 液 枪 头 200 μl 移 液 枪 无 菌 200 μl 移 液 枪 头 接 种 环 无 菌 培 养 皿 酒 精 灯 超 净 工 作 台 振 荡 器 等 2.3 实 验 方 法 制 备 样 品 稀 释 液 称 取 样 品 10g, 无 菌 条 件 下 操 作, 放 入 盛 有 90ml 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 ) 的 三 角 烧 瓶 中, 振 荡 约 20min, 使 样 品 与 水 充 分 混 合, 配 成 10-1 的 稀 释 度, 再 从 10-1 液 中 吸 取 1ml 悬 液 加 入 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 中 充 分 混 匀, 配 制 成 10-2 稀 释 度 样 品 溶 液, 以 此 类 推 配 制 不 同 稀 释 度 的 样 品 溶 液 涂 布 平 板 培 养 超 净 台 上 无 菌 操 作, 取 两 个 稀 释 度 溶 液, 振 荡 器 上 振 荡 10-20s 后 分 别 吸 取 100μL 至 NA 和 PDA 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 后 室 温 静 置 会, 使 菌 液 充 分 吸 附 到 培 养 基 里 而 后 平 板 倒 置,NA 平 板 于 30 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1 天, 观 察 计 数 ;PDA 平 板 于 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 2 天 后, 观 察 计 数 每 个 梯 度 重 复 2 次 结 果 计 数 肉 眼 观 察 计 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数, 按 公 式 计 算 : 每 克 菌 落 形 成 单 位 = 同 一 稀 释 度 平 均 菌 落 数 10 稀 释 倍 数 ( 单 位 cfu/g) 3. 试 验 结 果 3.1 垫 料 堆 肥 实 验 细 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 细 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 表 样 品 分 离 的 细 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 白 色, 圆 形, 扁 平, 表 面 蜡 状, 湿 润, 无 光 泽 2 大, 白 色, 形 状 不 规 则, 表 面 凹 陷, 湿 润, 无 光 泽 3 大, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 粘 稠, 有 光 泽 4 小, 乳 白, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 5 小, 透 明, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 6 小, 白 色, 不 规 则, 表 面 不 平, 湿 润, 无 光 泽 7 中, 白 色, 圆 形, 凸 起, 表 面 褶 皱, 湿 润, 无 光 泽 8 大, 白 色, 边 缘 齿 状, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 9 小, 白 色, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 样 品 一 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.1.1, 经 过 一 周 发 酵 后 细 菌 种 类 剧 减, 仅 剩 1 号 和 2 号 两 种 菌, 但 总 含 菌 量 并 未 明 显 减 少 ; 两 周 后, 细 菌 种 类 仍 未 增 加, 但 总 含 菌 量 明 显 下 降 表 样 品 1 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.8 \ \ \ \ 6.95

387 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-1 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 3-1 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 图 样 品 1 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 二 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 样 品 二 经 过 一 周 发 酵 后 细 菌 种 类 剧 减, 仅 剩 1 号 和 2 号 两 种 菌, 且 总 含 菌 量 也 随 之 急 剧 下 降 ; 发 酵 两 周 后, 细 菌 种 类 仍 未 增 加, 总 含 菌 量 明 显 下 降 至 cfu/g 表 样 品 1 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 6.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-2 细 菌 菌 落 图 (10-4 ) 3-2 细 菌 菌 落 图 (10-4 ) 图 样 品 2 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 三 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.1.3, 样 品 三 发 酵 起 始 含 菌 种 类 和 总 含 菌 量 都 较 低, 前 期 发 酵 过 程 中 变 化 不 明 显 表 样 品 3 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.55 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.15 \ \ \ \ 2.1

388 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-3 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 3-3 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 图 样 品 3 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 四 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.1.4, 经 过 一 周 发 酵 后 细 菌 种 类 剧 减, 只 有 1 号 和 2 号 两 种 菌 含 量 较 高, 总 含 菌 量 明 显 减 少 ; 两 周 后, 细 菌 种 类 仍 未 增 加, 总 含 菌 量 下 降 已 不 明 显 表 样 品 4 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.25 \ \ \ \ 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-4 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 3-4 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 图 样 品 4 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 五 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.1.5, 经 过 一 周 发 酵 后 细 菌 种 类 剧 减, 仅 剩 1 号 和 2 号 两 种 菌, 且 这 两 种 菌 含 量 大 幅 增 加 ; 两 周 后, 细 菌 种 类 仍 未 增 加, 但 总 含 菌 量 明 显 下 降 表 样 品 5 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.55 \ \ \ \ 3.2

389 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-5 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 3-5 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 图 样 品 5 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 3.2 垫 料 堆 肥 实 验 真 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 真 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 表 样 品 分 离 的 细 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 青 色, 圆 形, 扁 平 2 中, 白 色, 圆 形, 菌 丝 长, 竖 起 3 大, 绿 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 4 大, 白 色 带 黑 色 点 状, 短, 松 散 5 小, 白 色, 圆 形, 紧 密, 凸 起 6 中, 白 色 圆 形, 菌 丝 短, 絮 状 7 小, 圆 形, 反 面 黄 色, 正 面 绿 色, 紧 密, 凸 起 8 中, 反 面 白 色, 正 面 带 点 黄 色, 菌 丝 短, 松 散 9 大, 白 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 样 品 一 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.2.1, 经 过 一 周 发 酵 后 真 菌 种 类 剧 减, 仅 剩 1 号 真 菌, 总 含 菌 量 也 明 显 减 少 ; 两 周 后, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 cfu/g 表 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.2

390 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-1 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-1 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 样 品 1 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 二 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.2.2, 经 过 一 周 发 酵 后 真 菌 种 类 明 显 减 少, 总 含 菌 量 也 明 显 减 少 ; 两 周 后, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 cfu/g 表 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.05 \ \ \ 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-2 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-2 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 样 品 2 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 三 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.2.3, 经 过 一 周 发 酵 后 真 菌 总 含 菌 量 也 明 显 减 少 ; 两 周 后, 仅 剩 1 号 真 菌, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 cfu/g 表 样 品 3 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 2.9

391 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-3 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-3 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 样 品 3 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 四 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.2.4, 经 过 一 周 发 酵 后 真 菌 总 含 菌 量 也 明 显 减 少 ; 两 周 后, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 cfu/g 表 样 品 4 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.05 \ \ \ 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-4 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-4 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 样 品 4 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 五 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 和 图 3.2.5, 五 号 样 品 中 起 始 含 菌 种 类 很 少, 发 酵 一 周 后 总 含 菌 量 明 显 减 少 ; 两 周 后, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 cfu/g 表 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 1.35

392 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-5 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-5 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 样 品 5 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 4. 试 验 结 论 (1) 经 过 一 周 发 酵, 样 品 温 度 升 高, 样 品 中 含 菌 量 明 显 减 少, 虽 然 样 品 五 的 细 菌 总 含 菌 量 没 有 下 降, 但 其 含 菌 总 类 明 显 下 降 ; 经 过 一 周 发 酵 后, 样 品 中 仍 大 量 存 在 的 细 菌 为 细 菌 1 号 和 2 号, 真 菌 1 号 (2) 发 酵 第 二 周, 样 品 中 菌 含 量 仍 有 下 降, 但 随 着 温 度 的 下 降, 部 分 样 品 中 下 降 已 不 太 明 显, 甚 至 有 所 升 高 5 参 考 文 献 [1] 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 05. 试 验 设 计 : 试 验 负 责 : 朱 育 菁 试 验 人 员 : 王 洁

393 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 三 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

394 试 验 目 的 传 统 养 猪 模 式 产 生 的 大 量 粪 便 给 环 境 带 来 极 大 的 负 担, 造 成 严 重 的 污 染 而 目 前, 发 酵 床 养 猪 是 一 个 非 常 热 门 的 话 题, 又 称 零 污 染 养 猪, 即 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 [1] 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 发 酵 床 养 猪 模 式 中 垫 料 的 原 材 料 由 谷 壳 和 木 屑 组 成, 由 于 目 前 生 产 上 该 原 材 料 紧 缺, 价 格 较 高, 急 需 寻 找 其 他 廉 价 的 农 产 品 废 弃 物 作 为 新 原 材 料 本 实 验 用 菌 渣 和 椰 子 壳 替 代 垫 料 原 材 料 进 行 发 酵, 并 模 拟 猪 场 零 排 放 模 式 将 猪 粪 直 接 加 入 垫 料 中 进 行 堆 肥 实 验, 采 用 稀 释 涂 布 平 板 法 研 究 堆 肥 发 酵 过 程 中 微 生 物 的 变 化 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 福 清 渔 溪 农 场 的 堆 肥 实 验 样 品 组 成 如 下 表 2-1: 表 2-1 垫 料 样 品 配 方 组 合 设 计 编 号 组 合 1 菌 渣 + 椰 子 壳 (1;2) 2 谷 壳 + 锯 末 (1:1) 3 菌 渣 4 菌 渣 + 椰 子 壳 (1:1) 5 椰 子 壳 2011 年 07 月 18 日 在 不 同 配 比 的 垫 料 中 各 加 入 50 公 斤 新 鲜 猪 粪, 堆 积 发 酵 采 样 批 次 及 信 息 见 表 2-2: 表 2-2 采 样 批 次 信 息 批 次 时 间 备 注 第 一 批 无 第 二 批 无 第 三 批 采 样 后 翻 堆 第 四 批 无 第 五 批 采 样 后 翻 堆 2.2 实 验 器 材 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 浸 膏 3g 蛋 白 胨 5g 葡 萄 糖 10g 琼 脂 15-20g 水 定 容 1000ml ph 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 (PDA): 马 铃 薯 200g 葡 萄 糖 20g 琼 脂 15-20g, 配 制 时 将 土 豆 切 块 煮 沸 后 过 滤, 加 葡 萄 糖, 蒸 馏 水 定 容 1000ml

395 溶 液 或 试 剂 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 盛 90ml 无 菌 水 并 带 有 玻 璃 珠 的 250ml 三 角 瓶 仪 器 或 其 他 用 具 采 样 袋 无 菌 涂 布 棒 灭 菌 试 管 1ml 移 液 枪 无 菌 1ml 移 液 枪 头 200 μl 移 液 枪 无 菌 200 μl 移 液 枪 头 接 种 环 无 菌 培 养 皿 酒 精 灯 超 净 工 作 台 振 荡 器 等 2.3 实 验 方 法 制 备 样 品 稀 释 液 称 取 样 品 10g, 无 菌 条 件 下 操 作, 放 入 盛 有 90ml 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 ) 的 三 角 烧 瓶 中, 振 荡 约 20min, 使 样 品 与 水 充 分 混 合, 配 成 10-1 的 稀 释 度, 再 从 10-1 液 中 吸 取 1ml 悬 液 加 入 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 中 充 分 混 匀, 配 制 成 10-2 稀 释 度 样 品 溶 液, 以 此 类 推 配 制 不 同 稀 释 度 的 样 品 溶 液 涂 布 平 板 培 养 超 净 台 上 无 菌 操 作, 取 两 个 稀 释 度 溶 液, 振 荡 器 上 振 荡 10-20s 后 分 别 吸 取 100μL 至 NA 和 PDA 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 后 室 温 静 置 会, 使 菌 液 充 分 吸 附 到 培 养 基 里 而 后 平 板 倒 置,NA 平 板 于 30 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1 天, 观 察 计 数 ;PDA 平 板 于 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 2 天 后, 观 察 计 数 每 个 梯 度 重 复 2 次 结 果 计 数 肉 眼 观 察 计 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数, 按 公 式 计 算 : 每 克 菌 落 形 成 单 位 = 同 一 稀 释 度 平 均 菌 落 数 10 稀 释 倍 数 ( 单 位 cfu/g) 3. 试 验 结 果 3.1 垫 料 堆 肥 实 验 细 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 细 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 表 样 品 分 离 的 细 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 白 色, 圆 形, 扁 平, 表 面 蜡 状, 湿 润, 无 光 泽 2 大, 白 色, 形 状 不 规 则, 表 面 凹 陷, 湿 润, 无 光 泽 3 大, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 粘 稠, 有 光 泽 4 小, 乳 白, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 5 小, 透 明, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 6 小, 白 色, 不 规 则, 表 面 不 平, 湿 润, 无 光 泽 7 中, 白 色, 圆 形, 凸 起, 表 面 褶 皱, 湿 润, 无 光 泽 8 大, 白 色, 边 缘 齿 状, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 9 小, 白 色, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 样 品 一 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.2, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 继 续 减 少, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 开 始 上 升, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化

396 391 表 样 品 1 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.8 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 6.05 样 品 二 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.3, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 继 续 减 少, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 开 始 上 升, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化 表 样 品 2 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 6.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 样 品 三 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.4, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 继 续 减 少, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 开 始 上 升, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化 表 样 品 3 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.55 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.15 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.3 \ \ \ 1.95 样 品 四 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.5, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 总 含 菌 量 已 经 开 始 回 升, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 下 将, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化 表 样 品 4 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.25 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.6 \ \ \ 1.85 样 品 五 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.6, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 继 续 减 少, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 继 续 下 降, 仍 未 回 升, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化

397 392 表 样 品 5 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.55 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 垫 料 堆 肥 实 验 真 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 真 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 表 样 品 分 离 的 真 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 青 色, 圆 形, 扁 平 2 中, 白 色, 圆 形, 菌 丝 长, 竖 起 3 大, 绿 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 4 大, 白 色 带 黑 色 点 状, 短, 松 散 5 小, 白 色, 圆 形, 紧 密, 凸 起 6 中, 白 色 圆 形, 菌 丝 短, 絮 状 7 小, 圆 形, 反 面 黄 色, 正 面 绿 色, 紧 密, 凸 起 8 中, 反 面 白 色, 正 面 带 点 黄 色, 菌 丝 短, 松 散 9 大, 白 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 样 品 一 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.2, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 回 升, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 开 始 下 降 表 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.15 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.26 样 品 二 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.3, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 回 升, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 开 始 下 降 表 样 品 2 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.05 \ \ \ \ \ 0.4 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.65

398 393 样 品 三 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.4, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 回 升, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 开 始 下 降 表 样 品 3 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.1 \ \ \ \ 1.9 样 品 四 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.5, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 回 升, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 开 始 下 降 表 样 品 4 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.05 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 2.6 样 品 五 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.6, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 继 续 下 降, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 回 升 并 不 明 显 表 样 品 5 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 试 验 结 论 (1) 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵, 样 品 温 度 升 高, 样 品 细 菌 总 含 菌 量 继 续 下 降, 翻 堆 两 周 后, 样 品 中 细 菌 总 含 量 开 始 回 升 (2) 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵, 样 品 真 菌 总 含 菌 量 有 所 回 升, 翻 堆 两 周 后, 样 品 中 真 菌 总 含 量 开 始 下 降 5 参 考 文 献 [1] 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 05.

399 试 验 设 计 : 试 验 负 责 : 朱 育 菁 试 验 人 员 : 王 洁 394

400 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 四 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

401 试 验 目 的 传 统 养 猪 模 式 产 生 的 大 量 粪 便 给 环 境 带 来 极 大 的 负 担, 造 成 严 重 的 污 染 而 目 前, 发 酵 床 养 猪 是 一 个 非 常 热 门 的 话 题, 又 称 零 污 染 养 猪, 即 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 [1] 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 发 酵 床 养 猪 模 式 中 垫 料 的 原 材 料 由 谷 壳 和 木 屑 组 成, 由 于 目 前 生 产 上 该 原 材 料 紧 缺, 价 格 较 高, 急 需 寻 找 其 他 廉 价 的 农 产 品 废 弃 物 作 为 新 原 材 料 本 实 验 用 菌 渣 和 椰 子 壳 替 代 垫 料 原 材 料 进 行 发 酵, 并 模 拟 猪 场 零 排 放 模 式 将 猪 粪 直 接 加 入 垫 料 中 进 行 堆 肥 实 验, 采 用 稀 释 涂 布 平 板 法 研 究 堆 肥 发 酵 过 程 中 微 生 物 的 变 化 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 福 清 渔 溪 农 场 的 堆 肥 实 验 样 品 组 成 如 下 表 2-1: 表 2-1 垫 料 样 品 配 方 组 合 设 计 编 号 组 合 1 菌 渣 + 椰 子 壳 (1;2) 2 谷 壳 + 锯 末 (1:1) 3 菌 渣 4 菌 渣 + 椰 子 壳 (1:1) 5 椰 子 壳 2011 年 07 月 18 日 在 不 同 配 比 的 垫 料 中 各 加 入 50 公 斤 新 鲜 猪 粪, 堆 积 发 酵 采 样 批 次 及 信 息 见 表 2-2: 表 2-2 采 样 批 次 信 息 批 次 时 间 备 注 第 一 批 无 第 二 批 无 第 三 批 采 样 后 翻 堆 第 四 批 无 第 五 批 采 样 后 翻 堆 第 六 批 无 第 七 批 无 2.2 实 验 器 材 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 浸 膏 3g 蛋 白 胨 5g 葡 萄 糖 10g 琼 脂 15-20g 水 定 容 1000ml ph

402 397 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 (PDA): 马 铃 薯 200g 葡 萄 糖 20g 琼 脂 15-20g, 配 制 时 将 土 豆 切 块 煮 沸 后 过 滤, 加 葡 萄 糖, 蒸 馏 水 定 容 1000ml 溶 液 或 试 剂 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 盛 90ml 无 菌 水 并 带 有 玻 璃 珠 的 250ml 三 角 瓶 仪 器 或 其 他 用 具 采 样 袋 无 菌 涂 布 棒 灭 菌 试 管 1ml 移 液 枪 无 菌 1ml 移 液 枪 头 200 μl 移 液 枪 无 菌 200 μl 移 液 枪 头 接 种 环 无 菌 培 养 皿 酒 精 灯 超 净 工 作 台 振 荡 器 等 2.3 实 验 方 法 制 备 样 品 稀 释 液 称 取 样 品 10g, 无 菌 条 件 下 操 作, 放 入 盛 有 90ml 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 ) 的 三 角 烧 瓶 中, 振 荡 约 20min, 使 样 品 与 水 充 分 混 合, 配 成 10-1 的 稀 释 度, 再 从 10-1 液 中 吸 取 1ml 悬 液 加 入 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 中 充 分 混 匀, 配 制 成 10-2 稀 释 度 样 品 溶 液, 以 此 类 推 配 制 不 同 稀 释 度 的 样 品 溶 液 涂 布 平 板 培 养 超 净 台 上 无 菌 操 作, 取 两 个 稀 释 度 溶 液, 振 荡 器 上 振 荡 10-20s 后 分 别 吸 取 100μL 至 NA 和 PDA 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 后 室 温 静 置 会, 使 菌 液 充 分 吸 附 到 培 养 基 里 而 后 平 板 倒 置,NA 平 板 于 30 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1 天, 观 察 计 数 ;PDA 平 板 于 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 2 天 后, 观 察 计 数 每 个 梯 度 重 复 2 次 结 果 计 数 肉 眼 观 察 计 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数, 按 公 式 计 算 : 每 克 菌 落 形 成 单 位 = 同 一 稀 释 度 平 均 菌 落 数 10 稀 释 倍 数 ( 单 位 cfu/g) 3. 试 验 结 果 3.1 垫 料 堆 肥 实 验 细 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 细 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 表 样 品 分 离 的 细 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 白 色, 圆 形, 扁 平, 表 面 蜡 状, 湿 润, 无 光 泽 2 大, 白 色, 形 状 不 规 则, 表 面 凹 陷, 湿 润, 无 光 泽 3 大, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 粘 稠, 有 光 泽 4 小, 乳 白, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 5 小, 透 明, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 6 小, 白 色, 不 规 则, 表 面 不 平, 湿 润, 无 光 泽 7 中, 白 色, 圆 形, 凸 起, 表 面 褶 皱, 湿 润, 无 光 泽 8 大, 白 色, 边 缘 齿 状, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 9 小, 白 色, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 样 品 一 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.2, 样 品 一 中 细 菌 含 量 较 高, 经 一 次 高 温 发 酵 后 细 菌 种 类 和 含 量 都 有 较 明 显 下 降, 而 后 续 发 酵 过 程 中 变 化 不 明 显

403 398 表 样 品 2 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.8 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 6.45 样 品 二 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.3, 样 品 二 初 始 细 菌 含 量 较 高, 经 一 次 高 温 发 酵 后 急 剧 下 降, 后 续 发 酵 过 程 中 细 菌 含 量 一 直 较 低, 无 明 显 回 升 表 样 品 3 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 6.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 样 品 三 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.4, 样 品 三 初 始 细 菌 含 量 并 不 多, 发 酵 过 程 中 变 化 缓 慢, 翻 堆 后 有 下 降, 但 回 升 快 表 样 品 4 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.55 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.15 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.3 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 1.35 样 品 四 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.5, 随 着 发 酵 升 温 其 细 菌 含 量 会 明 显 下 降, 温 度 一 旦 降 低 细 菌 含 量 也 会 随 之 升 高 表 样 品 4 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ 2.15

404 \ \ 0.25 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.6 \ \ \ \ \ 0.06 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 1.6 样 品 五 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.6, 样 品 五 在 最 初 发 酵 过 程 中 虽 然 细 菌 种 类 有 减 少, 但 其 含 量 有 上 升 ; 随 着 发 酵 时 间 的 延 续, 其 细 菌 含 量 下 降 表 样 品 5 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.55 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 细 菌 总 含 量 (10 7 cfu.g -1 ) 样 品 1 样 品 2 样 品 3 样 品 4 样 品 样 品 批 次 图 1 垫 料 堆 肥 实 验 细 菌 总 含 量 变 化 图 从 图 1 中 可 以 看 出, 不 同 配 比 的 垫 料 在 对 猪 粪 进 行 发 酵 的 过 程 中, 细 菌 含 量 变 化 差 异 较 大, 相 对 于 传 统 材 料 的 2 号 样 品, 其 它 材 料 在 发 酵 前 期 下 降 不 够 明 显, 且 后 期 波 动 较 大, 回 升 快 3.2 垫 料 堆 肥 实 验 真 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 真 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 3.2.1

405 400 表 样 品 分 离 的 真 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 青 色, 圆 形, 扁 平 2 中, 白 色, 圆 形, 菌 丝 长, 竖 起 3 大, 绿 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 4 大, 白 色 带 黑 色 点 状, 短, 松 散 5 小, 白 色, 圆 形, 紧 密, 凸 起 6 中, 白 色 圆 形, 菌 丝 短, 絮 状 7 小, 圆 形, 反 面 黄 色, 正 面 绿 色, 紧 密, 凸 起 8 中, 反 面 白 色, 正 面 带 点 黄 色, 菌 丝 短, 松 散 9 大, 白 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 样 品 一 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.2, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升 表 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.15 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.1 \ \ \ \ \ \ \ \ 0.15 \ \ 0.65 样 品 二 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.3, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升 表 样 品 2 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.05 \ \ \ \ \ 0.4 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.2 \ \ \ \ \ \ 0.1 \ \ 1.2 样 品 三 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.4, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升

406 401 表 样 品 3 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.1 \ \ \ \ \ \ 0.05 \ \ \ \ \ \ 0.15 \ \ 3.65 样 品 四 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.5, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升 表 样 品 4 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.05 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.05 \ \ \ 1.85 样 品 一 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.6, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升 表 样 品 5 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 总 含 量 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0.1 \ \ \ 0.65

407 真 菌 总 含 量 (10 6 cfu.g -1 ) 样 品 1 样 品 2 样 品 3 样 品 4 样 品 样 品 批 次 图 2 垫 料 堆 肥 实 验 中 真 菌 总 含 量 变 化 图 从 图 2 中 可 以 看 出, 不 同 配 比 的 垫 料 在 对 猪 粪 进 行 发 酵 的 过 程 中, 真 菌 含 量 变 化 大 体 相 似, 发 酵 前 期 真 菌 含 量 迅 速 下 降, 后 期 回 升 较 小 4. 试 验 结 论 利 用 菌 渣 和 椰 子 壳 代 替 传 统 的 垫 料 材 料, 在 对 猪 粪 进 行 发 酵 的 过 程 中, 细 菌 总 含 量 变 化 有 明 显 差 别, 在 发 酵 后 期 前 者 细 菌 含 量 回 升 较 快 ; 真 菌 总 含 量 大 体 一 致 本 实 验 监 测 了 不 同 配 方 垫 料 对 猪 粪 堆 肥 过 程 中 的 微 生 物 变 化 情 况, 还 需 结 合 其 他 实 验 做 进 一 步 比 较, 进 一 步 判 断 各 种 配 比 的 垫 料 的 性 能 5 参 考 文 献 [1] 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 05. 试 验 设 计 : 试 验 负 责 : 朱 育 菁 试 验 人 员 : 王 洁

408 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 不 同 施 肥 方 式 和 施 肥 量 对 葡 萄 叶 绿 素 的 影 响 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

409 试 验 目 的 叶 绿 素 含 量 是 反 映 作 物 光 合 能 力 的 一 个 重 要 指 标, 与 作 物 产 量 形 成 有 着 极 其 密 切 的 关 系 叶 绿 素 是 叶 绿 体 中 最 重 要 的 色 素, 是 叶 绿 酸 的 酯, 主 要 含 有 叶 绿 素 a 和 叶 绿 素 b, 它 们 不 溶 于 水, 但 能 溶 于 酒 精 丙 酮 等 有 机 溶 剂, 因 此 可 以 通 过 实 验 用 丙 酮 液 提 取 叶 绿 素 并 对 其 进 行 含 量 测 定 同 一 种 植 物 生 长 的 环 境 对 其 叶 绿 素 的 合 成 有 不 同 程 度 的 影 响, 采 集 不 同 生 境 下 的 植 物 进 行 实 验, 测 定 [1] 其 叶 绿 素 的 含 量, 从 而 验 证 不 同 生 境 对 叶 绿 素 的 影 响 本 文 对 不 同 施 肥 方 式 不 同 施 肥 量 下 葡 萄 的 叶 片 叶 绿 素 含 量 进 行 测 定 比 较, 探 讨 施 肥 方 式 和 施 肥 量 对 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 含 量 的 影 响 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 2011 年 7 月 26 采 集 自 福 安 的 新 鲜 葡 萄 叶 片, 具 体 信 息 见 表 1 表 1 葡 萄 叶 片 样 品 信 息 编 号 施 肥 量 (kg/ 株 ) 施 肥 方 式 叶 片 形 态 1 号 对 照 老 叶 2 号 对 照 嫩 叶 3 号 3 沟 施 老 叶 4 号 3 沟 施 嫩 叶 5 号 3 撒 施 老 叶 6 号 3 撒 施 嫩 叶 7 号 4 沟 施 老 叶 8 号 4 沟 施 嫩 叶 9 号 4 撒 施 老 叶 10 号 4 撒 施 嫩 叶 11 号 5 沟 施 老 叶 12 号 5 沟 施 嫩 叶 13 号 5 撒 施 老 叶 14 号 5 撒 施 嫩 叶 15 号 丰 产 树 老 叶 16 号 丰 产 树 嫩 叶 2.2. 仪 器 和 试 剂 分 光 光 度 计, 电 子 天 平 ( 感 量 0.01g), 研 钵,25ml 棕 色 容 量 瓶, 小 漏 斗, 定 量 滤 纸 (9cm), 擦 镜 纸, 滴 管,95% 乙 醇 2.3 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 的 提 取 取 正 常 的 葡 萄 叶 片, 擦 净 组 织 表 面 污 物, 剪 碎 ( 去 掉 中 脉 ), 分 别 混 匀 称 取 剪 碎 的 样 品 0.2 g, 放 入 研 钵 中, 加 少 量 95% 乙 醇 研 成 匀 浆, 再 加 95% 乙 醇 10 ml, 继 续 研 磨 至 组 织 变 白, 静 置 3~5 min 取 滤 纸 1 张, 置 漏 斗 中, 用 95% 乙 醇 湿 润, 沿 玻 棒 把 提 取 液 倒 入 漏 斗 中, 过 滤 到 25 ml 棕 色 容 量 瓶 中, 用 少 量 乙 醇 冲 洗 研 钵 研 棒 及 残 渣 数 次, 最 后 连 同 残 渣 一 起 倒 入 漏 斗 中 用 滴 管 吸 取 95% 乙 醇, 将 滤 纸 上 的 叶 绿 体 色 素 全 部 洗 入 容 量 瓶 中 直 至 滤 纸 和 残 渣 中 无 绿 色 为 止 最 后 用 95% 乙 醇 定 容 至

410 ml, 摇 匀 把 叶 绿 体 色 素 提 取 液 倒 入 比 色 杯 内 以 95% 乙 醇 为 空 白, 在 波 长 665nm 649nm 和 下 测 定 吸 光 度 2.4 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 含 量 的 计 算 叶 绿 素 a 的 含 量 (Ca):Ca=13.95A A649( 单 位 mg/l) 叶 绿 素 b 的 含 量 (Cb):Cb=24.96A A665( 单 位 mg/l) 总 叶 绿 素 含 量 (C 总 ):C 总 = C a +C b ( 单 位 mg/l) 3. 试 验 结 果 不 同 施 肥 方 式 和 施 肥 量 下 的 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 含 量 见 表 2 表 2 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 含 量 样 品 A649 A665 Ca(mg/L) Cb(mg/L) C 总 (mg/l) C 总 (mg/g) 不 同 施 肥 量 和 施 肥 方 式 对 老 叶 和 嫩 叶 叶 绿 素 影 响 见 图 1 和 图 2, 在 所 有 老 叶 中, 叶 绿 素 含 量 最 高 的 是 3kg/ 亩 撒 施 的 样 品, 为 2.676mg/g, 相 对 应 最 低 的 是 5kg/ 亩 沟 施 的 样 品, 含 量 为 1.444mg/g; 在 嫩 叶 中 叶 绿 素 含 量 最 高 的 是 5kg/ 亩 沟 施 的 mg/g, 最 低 的 是 4kg/ 亩 沟 施 的 1.245mg/g; 在 施 肥 方 式 方 面 撒 施 总 体 上 高 于 沟 施

411 kg 撒 施 叶 绿 素 含 量 ( mg.g -1 ) 对 照 3kg 沟 施 4kg 沟 施 4kg 撒 施 5kg 沟 施 5kg 撒 施 丰 产 株 样 品 图 1 不 同 施 肥 量 和 施 肥 方 式 对 老 叶 叶 绿 素 影 响 对 照 5kg 沟 施 叶 绿 素 含 量 ( mg.g -1) kg 沟 施 3kg 撒 施 4kg 沟 施 4kg 撒 施 5kg 撒 施 丰 产 株 样 品 图 2 不 同 施 肥 量 和 施 肥 方 式 对 嫩 叶 叶 绿 素 影 响 4. 试 验 结 论 本 实 验 研 究 发 现 在 施 肥 方 式 上, 撒 施 效 果 明 显 比 沟 施 效 果 好 ; 且 叶 绿 素 含 量 并 不 随 着 施 肥 量 的 增 加 而 有 规 律 的 上 升 与 对 照 相 比, 不 论 是 施 肥 方 式 还 是 施 肥 量 的 变 化 都 不 能 提 高 叶 绿 素 的 含 量, 需 结 合 其 它 实 验 对 其 进 行 进 一 步 分 析 5 参 考 文 献 [1] 李 建 锋, 张 荣, 董 莹 莹 等. 施 用 尿 素 对 冬 萝 卜 产 量 形 成 及 叶 绿 素 含 量 的 影 响 [J]. 安 徽 农 业 科 学, 2010, 38(4): , 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 王 洁

412 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 微 波 诱 变 后 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 弱 化 指 数 的 测 定 试 验 人 员 : 周 游 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 : 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

413 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 ( Ralstonia solanacearum) 引 起 植 物 青 枯 病, 是 一 种 毁 灭 性 土 传 病, 可 造 成 作 物 严 重 减 产 甚 至 绝 产, 是 严 重 威 胁 农 业 生 产 的 主 要 病 害 之 一 青 枯 雷 尔 氏 菌 寄 主 广 泛, 可 侵 染 4 4 个 科 数 百 种 植 物 大 量 研 究 和 试 验 表 明 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 株 在 植 物 青 枯 病 防 治 中 具 有 重 要 的 生 防 应 用 潜 力, 揭 示 其 生 防 机 理 对 其 实 际 生 产 应 用 及 提 高 植 物 青 枯 病 防 治 水 平 具 有 重 要 意 义 致 病 性 强 弱 不 同 的 青 枯 菌 其 形 态 上 和 弱 化 指 数 是 有 所 差 异, 其 中 强 致 病 性 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 落 形 态 表 现 为 : 流 动 性 强, 中 间 为 粉 红 色, 并 且 白 边 比 较 宽, 表 面 比 较 湿 润 弱 致 病 性 或 无 致 病 性 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 落 形 态 表 现 为 : 无 流 动 性, 中 间 为 暗 红 色, 并 且 白 边 比 较 窄, 表 面 比 较 干 燥 ( 刘 波, 2005) 本 试 验 从 弱 化 指 数 来 识 别 不 同 致 病 性 的 青 枯 菌, 为 今 后 的 试 验 提 供 依 据 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 病 原 菌 供 试 病 原 菌 由 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 所 微 生 物 研 究 中 心 提 供, 为 FJAT 培 养 基 1)TTC 培 养 基 : 蛋 白 胨 10.0 g; 水 解 酪 蛋 白 1.0 g; 葡 萄 糖 5.0 g;ttc(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 0.05 g;ph 7.0~7.2 ( 注 :TTC 用 蒸 馏 水 配 成 1% 溶 液 并 用 细 菌 过 滤 器 过 滤 灭 菌, 在 培 养 基 倒 平 板 前 ( 冷 却 至 约 50 ) 每 100. ml 培 养 基 加 入 0.5 ml ) 2)SPA 培 养 基 :5g 蛋 白 胨,20g 蔗 糖,0.5g KH2PO4,0.25g MgSO4,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 仪 器 设 备 微 波 炉 ;HPG-280 人 工 气 候 培 养 箱 ;Leica M165FC 高 级 电 动 荧 光 体 视 显 微 镜 ; 2.2 试 验 方 法 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 FJAT-1458 在 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基 上 活 化,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 SPA 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 16h); 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 微 波 诱 变 将 原 始 菌 株 扩 大 培 养 后, 把 菌 悬 液 放 在 灭 过 菌 的 平 板 上, 用 封 口 膜 将 平 板 封 住, 将 平 板 放 在 冰 上, 直 接 放 入 微 波 炉 中 分 别 以 中 高 强 度 微 波 处 理 60s,120s,180s,240s,300s 五 个 时 间 梯 度, 每 隔 120s 换 冰 冷 却 以 消 除 热 效 应 处 理 后 的 菌 液 稀 释 不 同 梯 度 涂 于 固 体 培 养 基 平 板 上, 并 以 没 有 经 过 微 波 处 理 的 菌 液 涂 板 进 行 对 照, 放 置 于 30 C 培 养 箱 中 培 养,48h 后 计 算 其 弱 化 指 数

414 弱 化 指 数 的 测 定 将 要 检 测 的 菌 株 的 平 板 放 在 电 动 荧 光 体 视 显 微 镜 下, 以 此 测 出 其 白 边 的 直 径 和 红 边 的 直 径 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 菌 株 分 离 纯 化 根 据 菌 落 的 形 态 特 征, 我 们 将 致 病 力 弱 的 菌 株 挑 选 出 来, 放 在 TTC 培 养 基 上, 放 在 30 C 的 培 养 箱 中 培 养 48 小 时 DNA 制 备 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 通 过 DPS 软 件 分 析 不 同 菌 落 的 差 异 性 3. 试 验 结 果 3.1 微 波 诱 变 处 理 后 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 情 况 图 1 微 波 120s 后 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 FJAT-1458 的 菌 落 形 态

415 410 图 2 微 波 180s 后 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 FJAT-1458 的 菌 落 形 态 图 3 微 波 240s 后 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 FJAT-1458 的 菌 落 形 态 图 4 微 波 300s 后 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 FJAT-1458 的 菌 落 形 态 弱 菌 株 在 微 波 辐 射 下 的 都 是 致 病 力 弱 的 菌 株 形 态 上 并 没 有 太 大 的 变 化 3.2 微 波 诱 变 处 理 后 的 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 弱 化 指 数 不 同 微 波 辐 射 处 理 青 枯 菌 体 视 显 微 镜 下 镜 局 部 照 片

416 411 图 5 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 微 波 辐 射 60s 后 弱 化 指 数 图 6 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 微 波 辐 射 120s 后 弱 化 指 数 图 7 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-145 微 波 辐 射 180s 后 弱 化 指 数

417 412 图 8 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 微 波 辐 射 240s 后 弱 化 指 数 图 9 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 微 波 辐 射 300s 后 弱 化 指 数 微 波 处 理 后 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 弱 化 指 数 结 果 通 过 测 量 各 个 菌 株 的 红 边 直 径 以 及 白 边 直 径, 根 据 弱 化 指 数 公 式, 即 : 红 边 直 径 弱 化 指 数 = ( 刘 波,2005) 白 边 直 径 试 验 结 果 见 表 1 由 表 可 知, 微 波 60s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.810, 微 波 120s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.843, 微 波 180s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.855, 微 波,240s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.755, 微 波 300s 后 平 均 弱 化 指 数 为 微 波 处 理 时 间 (s) 平 行 测 量 表 1 微 波 处 理 后 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 的 弱 化 指 数 红 边 直 径 /μm (D1) 白 边 直 径 /μm (D2) 弱 化 指 数 (D1/D2) 平 均 值

418 通 过 DPS 软 件 分 析 不 同 菌 落 的 差 异 性 的 情 况

419 414 表 2 DPS 分 析 的 结 果 当 前 日 期 计 算 结 果 :14:43 处 理 样 本 数 均 值 标 准 差 标 准 误 95% 置 信 区 间 方 差 分 析 表 变 异 来 源 平 方 和 自 由 度 均 方 F 值 p 值 处 理 间 处 理 内 总 变 异 Tukey 法 多 重 比 较 ( 下 三 角 为 均 值 差, 上 三 角 为 显 著 水 平 ) No. 均 值 字 母 标 记 表 示 结 果 处 理 均 值 5% 显 著 水 平 a A ab AB ab AB bc AB c B 1% 极 显 著 水 平 从 表 2 中 我 们 可 以 得 出, 微 波 辐 射 60s 时, 形 态 发 生 变 化 微 波 辐 射 60s 到 120s 之 间, 他 们 的 形 态 并 没 有 存 在 很 明 显 的 差 异 但 是 微 波 辐 射 120s 后 各 个 菌 株 形 态 上 存 在 差 异 微 波 对 菌 株 的 形 态 有 诱 变 作 用

420 试 验 讨 论 弱 化 结 果 表 明, 菌 株 在 不 同 时 间 的 微 波 辐 射 下, 通 过 方 差 分 析 可 知, 不 同 辐 射 时 间 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 弱 化 指 数 是 有 显 著 性 差 异, 表 明 即 使 均 为 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 形 态 学 上 还 是 有 显 著 性 差 异, 而 这 一 点 与 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 本 身 复 杂 性 是 相 关 的 5. 参 考 文 献 [1] 石 元 春. 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学 [M]. 福 州 : 福 建 教 育 出 版 社, 2002: 277. [2] 刘 波, 林 志 营,, 等. 青 枯 雷 尔 氏 菌 多 态 性 研 究 [M]. 福 州 : 福 建 科 技 出 版 社,2005,6. 试 验 负 责 周 游 试 验 人 员 周 游 郑 雪 芳

421 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 郑 雪 芳 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

422 试 验 目 的 随 着 科 技 水 平 日 益 提 高, 种 苗 培 育 以 逐 步 成 为 了 育 苗 的 重 要 手 段 之 一 而 种 苗 运 输 中 出 现 的 烂 苗 和 徒 长 现 象 成 了 限 制 种 苗 发 展 的 一 个 重 要 因 素 因 此, 找 出 一 种 有 效 防 治 运 输 过 程 中 出 现 烂 苗 和 徒 长 的 方 法 是 当 前 种 苗 发 展 急 需 解 决 的 问 题 本 试 验 采 用 农 科 院 生 产 的 苗 立 鲜, 模 拟 运 输 条 件 观 察 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 实 生 苗 保 鲜 及 徒 长 现 象 的 作 用 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 (1) 保 鲜 品 种 : 农 友 长 茄 嫁 接 苗, 由 厦 门 如 意 集 团 有 限 公 司 购 买 (2) 微 生 物 保 鲜 材 料 : 苗 立 鲜, 由 本 研 究 室 自 行 研 制, 稀 释 800 倍 使 用 2.2 试 验 方 法 微 生 物 保 鲜 菌 使 用 方 法 喷 施 嫁 接 苗 为 农 友 长 茄 14 天 苗 ( 苗 外 运 时 间 ), 实 验 组 采 用 稀 释 800 倍 苗 立 鲜 喷 施, 使 植 株 茎 杆 和 叶 片 充 分 淋 湿, 对 照 组 用 清 水 做 相 同 处 理 处 理 结 束 后, 将 苗 放 至 阴 凉 处 待 苗 晾 干, 装 箱 每 个 处 理 300 株 苗 检 测 指 标 (1) 观 察 植 株 是 否 徒 长 (2) 选 取 实 验 和 对 照 组 各 30 株 分 析 : 叶 片 数 株 高 弯 曲 度 第 二 叶 的 长 和 宽 差 异 3. 试 验 结 果 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 如 表 1, 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 株 高 为 23.6cm 而 清 水 对 照 植 株 平 均 株 高 为 23.9cm 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 曲 度 为 128.3, 清 水 对 照 平 均 表 1 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 处 理 CK 株 高 嫁 接 口 到 顶 端 距 离 叶 片 数 曲 度 第 二 叶 片 长 第 二 叶 片 宽 株 高 嫁 接 口 到 顶 端 距 离 叶 片 数 曲 度 第 二 叶 片 长 第 二 叶 片 宽

423 , 平 均 值 图 一 茄 子 处 理 的 环 境 苗 立 鲜 处 理 的 茄 子 苗 图 二 处 理 96h 后 嫁 接 茄 子 苗 清 水 处 理 的 茄 子 苗

424 419 处 理 96h 后 实 验 组 图 三 开 箱 后 茄 子 苗 处 理 96h 后 对 照 组 图 四 96h 后 实 验 组 和 对 照 组 的 对 比 图 五 试 验 田

425 试 验 讨 论 由 表 1 可 知 试 验 组 和 对 照 组 曲 度 差 别 较 大, 株 高, 叶 片 数 及 叶 长 叶 宽 差 别 较 小 综 合 以 上 因 素 可 知 苗 立 鲜 对 抑 制 种 苗 的 弯 曲 具 有 显 著 作 用 下 一 步, 将 对 试 验 苗 进 行 田 间 观 察, 以 便 进 一 步 比 较 苗 立 鲜 对 茄 子 后 续 生 长 的 影 响 5. 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 周 游

426 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 莆 田 辣 椒 1 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

427 试 验 目 的 [1] 青 枯 雷 尔 氏 菌 (Ralstonia solanacearum), 属 于 革 兰 氏 阴 性 b 蛋 白 类 细 菌 雷 尔 氏 菌 引 起 的 植 物 细 菌 性 青 枯 病 害 (Bacterial wilt), 简 称 青 枯 病, 是 一 种 世 界 范 围 的 细 菌 性 土 传 病 害 该 菌 寄 主 广 泛, 能 够 侵 染 热 带 和 温 带 地 区 多 达 450 种 以 上 的 植 物 种 类, 严 重 影 响 了 很 多 重 要 经 济 作 物, 比 如 番 茄 [2] [3] 烟 草 辣 椒 等 的 产 量 青 枯 病 的 防 治 目 前 还 没 有 有 效 的 化 学 农 药 防 治 且 易 造 成 环 境 污 染 和 残 留 利 用 无 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 对 茄 科 作 物 进 行 免 疫 接 种, 使 植 株 产 生 类 似 于 动 物 的 免 疫 系 统 以 抵 制 病 害 本 试 验 通 过 分 离 从 莆 田 病 区 采 集 回 来 的 病 株, 检 测 该 病 区 是 否 由 青 枯 病 引 起, 以 便 我 们 更 有 针 对 性 的 防 治 作 物 病 害 的 发 生 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 植 株 试 验 植 株 为 莆 田 采 集 回 来 的 辣 椒 病 株 ( 一 级 病 株 ) 培 养 基 配 制 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3, 5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 溢 菌 实 验 溢 菌 实 验 : 用 无 菌 刀 切 下 发 病 部 位 纵 切 面 切 片 置 于 载 波 片 上, 盖 上 盖 玻 片 从 盖 玻 片 的 一 边 滴 加 无 菌 水, 置 于 水 平 台 面 上 5min, 观 察 是 否 有 菌 脓 溢 出, 以 便 初 步 判 断 该 病 害 是 否 为 细 菌 性 病 害 植 株 目 标 菌 的 分 离 植 株 预 处 理 : 植 株 先 用 清 水 清 洗, 用 报 纸 将 植 株 水 分 吸 干 称 样 及 样 品 处 理 : 称 取 根 茎 基 部 茎 中 部 茎 顶 部 叶 各 1 g, 先 用 75 酒 精 消 毒 30s 再 用 10 的 NACLO 消 毒 5min, 然 后 用 无 菌 水 清 洗 3 遍, 再 用 灭 菌 滤 纸 将 样 品 吸 干, 放 至 装 有 10 ml 无 菌 水 的 研 钵, 充 分 研 磨, 即 配 成 10-1 浓 度 ; 稀 释 样 品 原 液 : 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-3 平 板 涂 布 : 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 s, 吸 取 200 μl 至 相 应 标 记 浓 度 的 平 板 上, 溶 液 滴 至 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 透 进 平 板 中 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 培 养 :: 将 涂 好 的 平 板 用 袋 子 装 好 倒 置 于 30 恒 温 箱 中 培 养 60h; 划 线 分 离 纯 化 : 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 上 标 记, 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 取 平 板 上 要 分 离 纯 化 的 菌 落 至 相 应 标 记 的 平 板 上, 划 线 完 后 放 在 30 温 箱 中 培 养.; 结 果 计 算 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 3 个 平 板 上 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存

428 423 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 3. 试 验 结 果 3.1 溢 菌 实 验 由 图 1 可 知 辣 椒 病 株 无 溢 菌 现 象, 表 明 辣 椒 病 株 可 能 不 是 由 于 细 菌 性 病 害 引 起 的 需 通 过 进 一 步 分 离 以 验 证 该 病 害 是 否 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 图 1 辣 椒 根 部 溢 菌 实 验 图 3.2 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 检 测 由 图 2 植 株 分 离 图 片, 通 过 菌 落 形 态 可 初 步 判 断 该 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在 对 筛 选 出 的 几 株 菌 株 利 用 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 起 检 测 均 无 目 标 条 带 出 现, 表 明 辣 椒 植 株 发 病 不 是 由 青 枯 病 引 起 图 2 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 检 测 (5,6 泳 道 为 + 对 照 ) 3.3 部 分 试 验 图 片

429 424 图 3 辣 椒 病 株 根 部 分 离 图 4 辣 椒 病 株 叶 部 分 离 4. 试 验 讨 论 本 试 验 从 采 集 回 来 的 辣 椒 病 株, 通 过 溢 菌 试 验 可 初 步 判 断 该 病 害 不 是 细 菌 性 病 害, 即 不 是 青 枯 病 引 起 的 发 病 现 象 通 过 对 植 株 各 部 位 的 分 离, 通 过 形 态 和 分 子 手 段 进 行 验 证 表 明 辣 椒 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 这 对 我 们 进 一 步 防 治 该 地 区 辣 椒 病 害 具 有 重 要 的 指 导 意 义 根 据 试 验 结 果 可 以 判 断 莆 田 辣 椒 病 株 不 是 青 枯 病, 可 能 由 于 枯 萎 病 或 其 他 真 菌 性 病 害 引 起 的, 这 将 更 有 利 于 我 们 有 效 防 病 害 的 发 生 另 外, 通 过 试 验 可 知, 为 分 离 到 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 菌 株 可 从 其 他 地 区 寻 找 发 病 植 株 进 一 步 分 离 检 测

430 参 考 文 献 [1] Hayward, A.C The hosts of Pseudomonas solanacearum. In Bacterial Wilt: the disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. Hayward, A.C., and Hartman, G.L.(eds).Walingford: CAB International, pp [2] M.Gillings, P.Fahy&C.Davies.Pestriction analysis of an amplified polygalacturonase gene fragment differentiates strains of the phytopathogenic bacterium Pseudomonas solanacearum.letters in Applied Microbiology.1993,17, [3] 何 学 友. 我 国 林 木 青 枯 病 研 究 概 况 [J]. 森 林 病 虫 通 讯,1997 (1): [2]Opina N L,Valdez R B,Opina O S.Effect of rice-tomato cropping patterns and flooding on the survival of Pseudomonas solanacearum E.F.Smith[J]. Philippine-Phytopathology.1994,30(2):93~99. [4] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [5] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4): [6] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1): [7] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [8] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1): [9] 杨 宇 红, 刘 俊 平, 等. 植 物 保 护 学 报 [J],2008,38(5): [10] 杨 威, 刘 苏 闵, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26( 增 刊 )90-94 [11] 吕 建 林, 刘 二 明, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26(2) [12] 祝 明 亮, 夏 振 远, 等. 中 国 烟 草 学 报 [J],2004, 10(1)25-27 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 周 游 郑 雪 芳 林 抗 美

431 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 郑 雪 芳 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 微 波 诱 变 条 件 摸 索 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

432 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 ( Ralstonia solanacearum) 引 起 植 物 青 枯 病, 是 一 种 毁 灭 性 土 传 病, 可 造 成 作 物 严 重 减 产 甚 至 绝 产, 是 严 重 威 胁 农 业 生 产 的 主 要 病 害 之 一 青 枯 雷 尔 氏 菌 寄 主 广 泛, 可 侵 染 4 4 个 科 数 百 种 植 物 大 量 研 究 和 试 验 表 明 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 株 在 植 物 青 枯 病 防 治 中 具 有 重 要 的 生 防 应 用 潜 力, 揭 示 其 生 防 机 理 对 其 实 际 生 产 应 用 及 提 高 植 物 青 枯 病 防 治 水 平 具 有 重 要 意 义 微 生 物 的 诱 变 方 式 有 很 多, 采 用 较 多 的 是 化 学 诱 变 和 紫 外 线 诱 变, 但 这 些 方 法 对 操 作 人 员 都 有 很 大 的 危 险 性, 操 作 不 慎 会 对 人 体 造 成 伤 害 微 波 是 高 频 交 变 的 电 磁 波, 具 有 传 导 作 用 和 极 强 的 穿 透 力, 能 够 造 成 极 性 分 子 的 迅 速 震 动, 这 种 震 动 能 引 起 菌 体 DNA 分 子 间 强 烈 的 摩 擦, 使 DNA 分 子 氢 键 和 碱 基 堆 积 化 学 力 受 损, 使 得 DNA 结 构 发 生 变 化, 从 而 发 生 遗 传 变 异 微 波 诱 变 已 在 植 物, 禽 畜, 微 生 物 育 种 等 多 方 面 得 到 应 用 利 用 微 波 诱 变 菌 株 提 高 菌 体 代 谢 产 物 的 量 已 被 证 明 是 很 好 的 诱 变 方 法 本 试 验 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 进 行 微 波 诱 变, 找 到 致 病 力 弱 的 菌 株, 进 一 步 研 究 无 致 病 力 菌 株 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 植 物 防 治 有 一 定 的 实 践 意 义 本 试 验 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 进 行 微 波 诱 变, 对 进 一 步 研 究 植 物 疫 苗 有 一 定 的 指 导 意 义 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 病 原 菌 供 试 病 原 菌 由 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 所 微 生 物 研 究 中 心 提 供, 为 FJAT 培 养 基 1)TTC 培 养 基 : 蛋 白 胨 10.0 g; 水 解 酪 蛋 白 1.0 g; 葡 萄 糖 5.0 g;ttc(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 0.05 g;ph 7.0~7.2 ( 注 :TTC 用 蒸 馏 水 配 成 1% 溶 液 并 用 细 菌 过 滤 器 过 滤 灭 菌, 在 培 养 基 倒 平 板 前 ( 冷 却 至 约 50 ) 每 100. ml 培 养 基 加 入 0.5 ml ) 2)SPA 培 养 基 :5g 蛋 白 胨,20g 蔗 糖,0.5g KH2PO4,0.25g MgSO4,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 仪 器 设 备 微 波 炉 2.2 试 验 方 法 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 FJAT-91 在 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基 上 活 化,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 SPA 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 16h); 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数

433 微 波 诱 变 将 原 始 菌 株 扩 大 培 养 后, 把 菌 悬 液 放 在 灭 过 菌 的 平 板 上, 用 封 口 膜 将 平 板 封 住, 将 平 板 放 在 冰 上, 直 接 放 入 微 波 炉 中 分 别 以 中 高 强 度 微 波 处 理 60s,120s,180s,240s,300s 五 个 时 间 梯 度, 每 隔 120s 换 冰 冷 却 以 消 除 热 效 应 处 理 后 的 菌 液 稀 释 不 同 梯 度 涂 于 固 体 培 养 基 平 板 上, 并 以 没 有 经 过 微 波 处 理 的 菌 液 涂 板 进 行 对 照, 放 置 于 30 C 培 养 箱 中 培 养,48h 后 菌 落 计 数 致 死 率 的 测 定 将 培 养 后 的 平 板 单 菌 落 计 数, 以 没 有 经 过 微 波 处 理 的 平 板 菌 落 数 作 对 照, 计 算 五 个 时 间 梯 度 的 致 死 率 疑 似 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 菌 株 分 离 纯 化 根 据 菌 落 的 形 态 特 征, 我 们 将 致 病 力 弱 的 菌 株 挑 选 出 来, 放 在 TTC 培 养 基 上, 放 在 30 C 的 培 养 箱 中 培 养 48 小 时 DNA 制 备 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 3. 试 验 结 果 3.1 微 波 诱 变 处 理 后 的 致 病 力 强 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 情 况 致 死 率 (%) 微 波 辐 射 时 间 (min)

434 429 图 1 微 波 辐 射 时 间 与 致 死 率 之 间 的 关 系 不 同 微 波 辐 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 后,TTC 平 板 上 出 现 的 菌 落 数 随 着 微 波 时 间 的 增 长, 菌 株 的 致 死 率 也 在 增 高 在 紫 外 照 射 时 间 为 240s 时, 其 致 死 率 为 94.6% 图 2 无 微 波 辐 射 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 图 3 微 波 辐 射 240s 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 图 4 微 波 辐 射 180s 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 图 5 微 波 辐 射 120s 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况

435 微 波 诱 变 处 理 后 的 致 病 力 强 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 纯 化 情 况 图 6 纯 化 后 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 图 7 纯 化 后 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 从 图 6, 图 7 中 可 以 得 到, 当 用 微 波 诱 变 强 致 病 菌 株 时, 几 乎 不 产 生 弱 致 病 的 菌 株, 也 就 是 突 变 率 很 低, 几 乎 为 零 3.3 微 波 诱 变 处 理 后 的 致 病 力 强 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 鉴 定 的 结 果 图 7 诱 变 后 的 菌 株 的 分 子 鉴 定 结 果 从 图 8 中 我 们 可 以 得 到, 我 们 纯 化 后 在 平 板 上 分 离 的 菌 株, 全 部 都 是 青 枯 雷 尔 氏 菌

436 试 验 讨 论 (1) 具 有 强 致 病 力 的 青 枯 雷 尔 氏 菌, 在 微 波 辐 射 的 诱 变 下, 很 难 突 变 成 弱 致 病 力 的 菌 株, 突 变 率 极 低, 几 乎 为 零 (2) 微 波 对 菌 株 的 致 死 率 在 120s 之 后, 随 着 时 间 的 增 加 而 增 大, 在 300s 时 致 死 率 达 到 100% 5. 参 考 文 献 [1] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [2] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4): [3] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1): [4] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [5] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1): 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 周 游

437 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 体 的 PCR 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美 试 验 负 责 : 车 建 美 林 海 云 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 7 月 (3) 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

438 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 一 种 的 重 要 土 传 植 物 病 害, 分 布 广 泛, 在 热 带 和 亚 热 带 地 区 都 有 发 现, 并 且 其 侵 染 寄 主 的 范 围 也 很 广, 包 括 单 子 叶 和 双 子 叶 植 物 (Remenant B. et al, 2010), 其 在 农 业 上 造 成 的 损 失 是 惨 重, 在 历 史 上 就 出 现 过 此 类 病 害 的 灾 难, 因 此 青 枯 菌 致 病 机 理 的 研 究 至 关 重 要 前 期 已 经 对 mini-tn5 插 入 突 变 体 的 菌 落 形 态 进 行 了 研 究, 对 其 致 病 力 进 行 了 初 步 的 判 断, 并 采 用 SDS 和 CTAB 法 提 取 菌 体 总 DNA mini-tn5 中 含 有 抗 卡 那 霉 素 基 因, 本 次 试 验 利 用 抗 卡 那 霉 素 基 因 的 引 物 进 行 PCR 扩 增, 检 测 突 变 体 是 否 有 插 入 mini-tn5 并 以 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 物 flic 引 物 和 phca 引 物 进 行 PCR 扩 增, 进 一 步 对 无 致 病 力 菌 株 进 行 检 测, 确 认 其 是 否 为 青 枯 雷 尔 氏 菌 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 菌 株 菌 株 来 源 于 FJAT-91 青 枯 雷 尔 氏 菌 Tn5 插 入 突 变 体 库, 菌 株 编 号 :FJAT-FJAT-t770 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t134 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t616 FJAT-t617 FJAT-t636 FJAT-t644 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t297 FJAT-t162 其 中 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t297 FJAT-t162 是 强 致 病 力 菌 株, 而 FJAT-t618 是 产 色 素 的 强 致 病 力 菌 株 ; 其 他 均 为 无 致 病 力 菌 株 供 试 DNA 试 验 中 所 使 用 的 基 因 组 DNA, 来 自 上 一 试 验 中 用 SDS 和 CTAB 法 提 取 的 基 因 组 总 DNA 2.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 : 无 菌 水 dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 特 异 性 基 因 引 物 flic 基 因 引 物 抗 卡 那 霉 素 基 因 引 物 和 phca 基 因 引 物,1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 :Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ;UVP 凝 胶 成 像 仪 2.3 试 验 方 法 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; 上 游 引 物 :1 μl; 下 游 引 物 :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl 扩 增 程 序 (1) 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 特 异 性 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 96 C, 预 变 性 1min; 96 C 变 性 30 s, 70 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1min, 进 行 2 个 循 环 ; 之 后 94 C 变 性 30 s, 70 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1min, 再 进 行 33 个 循 环 ; 最 后 72 C 5min (2) 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 flic 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 94 C, 预 变 性 5min; 然 后 94 C 变 性 30s, 63 C 退 火 30s, 72 C 延 伸 1min, 进 行 25 个 循 环 ; 最 后 72 C 10min

439 434 (3) 抗 卡 那 霉 素 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 94 C, 预 变 性 3 min; 然 后 94 C 变 性 30 s, 57 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1 min, 进 行 35 个 循 环 ; 最 后 72 C 10 min (4)phcA 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 : 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s, 61 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 5 min 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 6 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3. 试 验 结 果 3.1 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 物 PCR 扩 增 结 果 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 结 果 见 图 1 由 图 可 见, 大 部 分 菌 株 都 扩 增 出 500 bp 条 带, 如 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t134 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t616 FJAT-t644 FJAT-t601 FJAT-t297 和 FJAT-t162 只 有 FJAT-t770 FJAT-t617 FJAT-t618 没 有 扩 增 出 条 带, FJAT-t636 的 条 带 特 别 模 糊 ; 而 FJAT-t158 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t297 FJAT-t162 扩 增 出 了 2 条 带 图 1 注 : M maker, + 阳 性 对 照, - 阴 性 对 照 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 物 的 PCR 扩 增 结 果 3.2 青 枯 雷 尔 氏 菌 flic 引 物 PCR 扩 增 结 果 扩 增 结 果 见 图 2 由 图 可 见, 大 部 分 菌 株 均 扩 增 出 了 400 bp 的 片 段, 如 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t134 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t616 FJAT-t617 FJAT-t644 FJAT-t 618 FJAT-t601 FJAT-t297 和 FJAT-t162 但 也 有 部 分 菌 株 未 扩 增 出 条 带, 如 FJAT-t770 FJAT-t636 未 扩 增 出 条 带, 但 FJAT-t616 FJAT-t617 FJAT-t644 FJAT-t601 的 条 带 很 模 糊, 而 FJAT-t158 FJAT-t186 也 扩 增 出 了 2 条 带 图 2 注 : M maker, + 阳 性 对 照, - 阴 性 对 照 青 枯 雷 尔 氏 菌 flic 引 物 PCR 扩 增 结 果

440 青 枯 雷 尔 氏 菌 抗 卡 那 霉 素 引 物 PCR 扩 增 结 果 扩 增 结 果 见 图 3 由 图 可 见, 虽 然 有 些 条 带 模 糊, 但 所 有 菌 株 都 扩 增 出 了 700 bp 的 片 段, 表 明 这 些 菌 株 有 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 的 的 片 段 同 样 此 次 扩 增 也 有 出 现 2 条 带 的 菌 株, 如 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t162. 注 : M maker, - 阴 性 对 照 图 3 青 枯 雷 尔 氏 菌 抗 卡 那 霉 素 引 物 PCR 扩 增 结 果 3.4 青 枯 雷 尔 氏 菌 PhcA 引 物 PCR 扩 增 结 果 由 图 4 可 知, 只 有 部 分 菌 株 扩 增 出 了 约 1300 bp 的 片 段, 如 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t334 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t162 图 4 注 : M maker, + 阳 性 对 照, - 阴 性 对 照 青 枯 雷 尔 氏 菌 phca 引 物 PCR 扩 增 结 果 4. 试 验 讨 论 (1) 由 图 1 的 结 果 可 以 初 步 推 断 FJAT-t770 FJAT-t617 FJAT-t618 不 是 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 而 FJAT-t158 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t297 FJAT-t162 扩 增 出 了 两 条 带, 可 能 是 基 因 组 DNA 浓 度 高, 扩 增 不 完 全, 有 基 因 组 DNA 残 留 (2) 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 引 物 的 扩 增 结 果 显 示, 所 以 mini-tn5 插 入 突 变 体 菌 株 都 有 卡 那 霉 素 的 抗 性 基 因 片 段 (3)phcA 是 毒 力 调 节 的 关 键 基 因 (Poussier S. et al,2003),phca 引 物 的 扩 增 结 果 表 面,mini-Tn5 插 入 突 变 体 中 的 无 致 病 力 菌 株 缺 失 phca 基 因, 以 至 于 其 表 现 出 无 致 病 力 的 菌 落 形 态 ; 而 部 分 无 致 病 力 菌 株 保 留 了 phca 基 因, 却 表 现 出 无 致 病 力 的 菌 落 形 态, 其 具 体 原 因 有 待 进 一 步 的 研 究 (4) 扩 增 条 带 模 糊, 可 能 是 DNA 浓 度 太 低, 也 可 能 是 DNA 提 取 时 残 留 的 离 子 影 响 其 扩 增 和 电 泳, 具 体 原 因 有 待 下 个 试 验 的 验 证

441 参 考 文 献 (1) Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11: (2) Poussier S.,Thoquet P.,Denny D.,Barthet S.,Meyer D.,Arlat M.,Trlgalet A..Host plant-dependent phenotypic reversion of Ralstonia solanacearum from non-pathogenic to pathogenic forms via alterations in the phca gene[j]. Molecular Microbiology,2003, 49(4): 试 验 负 责 车 建 美 林 海 云 刘 波 试 验 人 员 马 桂 美

442 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 抗 生 素 敏 感 性 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美 试 验 负 责 : 车 建 美 林 海 云 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 7 月 (2) 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

443 试 验 目 的 短 短 芽 孢 杆 菌 是 革 兰 氏 阳 性 菌, 在 逆 境 中 能 形 成 芽 孢, 以 适 应 恶 劣 环 境 其 细 胞 壁 不 含 内 毒, [1-2] [3] [4] 绝 大 多 数 对 人 畜 无 毒, 并 且 在 自 然 界 分 布 比 较 广 泛, 可 以 产 生 抗 生 素 细 菌 素 抗 菌 蛋 白 及 挥 [5] 发 性 抗 菌 物 质 短 短 芽 孢 杆 菌 的 抗 菌 谱 较 广, 在 离 体 的 条 件 下 可 以 对 多 种 病 原 真 菌 和 病 原 细 菌 表 现 拮 抗 活 性, 具 有 潜 在 的 开 发 前 景 和 研 究 价 值 本 实 验 室 从 土 壤 中 分 离 到 的 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX, 对 番 茄 枯 萎 病 有 抑 制 作 用, 其 抑 菌 机 理 是 产 生 短 杆 菌 酪 肽 和 几 丁 质 酶 等 活 性 物 质 并 且 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 胞 外 物 质 较 稳 定, 对 蛋 白 酶 不 敏 感 耐 强 酸 强 碱 紫 外 线 和 反 复 冻 融 对 其 活 性 无 显 著 影 响 前 期 试 验 中, 已 经 对 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 基 因 组 进 行 了 测 序, 但 是 其 基 因 功 能 还 有 待 研 究 为 了 研 究 基 因 的 功 能, 首 先 要 找 出 该 菌 株 的 标 记 基 因, 本 次 试 验 研 究 短 短 芽 孢 杆 菌 对 抗 生 素 敏 感 性, 采 用 本 实 验 室 现 有 的 新 霉 素 和 卡 那 霉 素 进 行 抑 菌 圈 试 验, 观 察 两 种 抗 生 素 对 短 短 芽 孢 杆 菌 的 抑 制 能 力, 为 该 菌 株 标 记 基 因 的 寻 找 奠 定 基 础 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 试 验 菌 株 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 是 本 实 验 室 自 土 壤 中 分 离 得 到 的 试 验 器 材 与 试 剂 (1) 试 验 器 材 : 滤 纸 片 镊 子 涂 布 棒 (2) 试 剂 (A)NA 培 养 基 :NA 固 体 培 养 基 : 每 升 含 牛 肉 膏 3.0 g, 蛋 白 胨 5.0 g, 葡 萄 糖 10.0 g, 琼 脂 1.7%, ph ; NA 半 固 体 培 养 基 : 每 升 含 牛 肉 膏 3.0 g, 蛋 白 胨 5.0 g, 葡 萄 糖 10.0 g, 琼 脂 0.7%,pH ; NA 液 体 培 养 基 : 每 升 含 牛 肉 膏 3.0 g, 蛋 白 胨 5.0 g, 葡 萄 糖 10.0 g, ph (B) 抗 生 素 : 抗 生 素 及 其 浓 度 见 表 1 表 1 抗 生 素 及 其 浓 度 抗 生 素 浓 度 (μg/ml) 新 霉 素 卡 那 霉 素 试 验 内 容 与 方 法 (1) 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 菌 株 的 活 化 : 将 从 冰 箱 中 取 出 的 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 划 线 于 NA 培 养 基 上,30 培 养 48 h 后, 挑 取 单 菌 落 于 NA 液 体 培 养 基 中 振 荡 培 养 48 h, 菌 液 备 用

444 439 (2) 抗 生 素 敏 感 性 试 验 (A) 滤 纸 贴 片 法 : 向 含 有 0.7% 琼 脂 的 培 养 基 中 加 入 1 ml 菌 液, 混 匀, 倒 在 含 有 1.7% 的 NA 固 体 培 养 基 上, 制 备 双 层 培 养 基 将 含 有 不 同 浓 度 抗 生 素 的 滤 纸 片 置 于 平 板 上,30 培 养 48 h, 进 行 抑 菌 圈 大 小 的 测 量 和 统 计, 试 验 重 复 3 次 (B) 划 线 法 : 在 含 有 不 同 浓 度 抗 生 素 的 培 养 基 上 划 线 (C) 平 板 涂 布 法 : 取 梯 度 稀 释 的 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 加 入 含 有 不 同 浓 度 抗 生 素 的 培 养 基 上, 涂 板,30 倒 置 培 养 48 h 进 行 菌 落 计 数, 计 算 抑 菌 率 试 验 重 复 2 次 3. 试 验 结 果 3.1 滤 纸 贴 片 法 测 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 对 抗 生 素 的 敏 感 性 滤 纸 贴 片 法 试 验 结 果 见 表 2 和 图 1-4 滤 纸 片 法 的 结 果 显 示, 新 霉 素 和 卡 那 霉 素 都 不 能 抑 制 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 抗 生 素 新 霉 素 卡 那 霉 素 注 : 生 长 正 常 表 2 滤 纸 片 法 检 测 抗 生 素 敏 感 性 结 果 浓 度 (μg/ml g/ml) 敏 感 性 CK A B 图 1 新 霉 素 敏 感 性 检 测 (A: 反 面,B; 正 面 )

445 440 A 图 2 新 霉 素 敏 感 性 检 测 (A: 反 面,B: 正 面 ) B A B 图 3 卡 那 霉 素 敏 感 性 检 测 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 4 卡 那 霉 素 敏 感 性 检 测 (A: 反 面,B: 正 面 ) 3.2 划 线 法 检 测 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 对 抗 生 素 的 敏 感 性 划 线 法 试 验 结 果 见 表 3 和 图 5-11 划 线 法 试 验 结 果 显 示, 新 霉 素 浓 度 为 100 μg/ml 以 上 时, 对 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 有 抑 制 作 用

446 441 抗 生 素 新 霉 素 表 3 划 线 法 检 测 敏 感 性 试 验 的 结 果 浓 度 (μg/ml g/ml) 注 : +++ 生 长 正 常, ++ 长 势 稍 弱, + 长 势 较 弱, - 完 全 抑 制 敏 感 性 CK A B 图 5 无 新 霉 素 菌 落 生 长 情 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 6 含 有 10 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 )

447 442 A B 图 7 含 有 20 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 8 含 有 50 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 9 含 有 100 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 )

448 443 A B 图 10 含 有 150μg/mL 新 霉 素 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 11 含 有 200 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) 3.3 涂 板 法 检 测 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 对 抗 生 素 的 敏 感 性 由 前 面 2 种 方 法 的 结 果 显 示, 新 霉 素 对 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 有 抑 制 作 用, 但 是 菌 体 的 浓 度 直 接 影 响 其 抑 制 效 果, 因 此 采 用 稀 释 菌 液, 进 行 涂 板, 观 察 其 抑 制 率 涂 布 平 板 法 检 测 敏 感 性 的 试 验 结 果 见 表 4 和 图 涂 布 平 板 法 的 试 验 结 果 显 示, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 在 50 μg/ml 的 新 霉 素 平 板 上 不 生 长, 同 样 在 100 μg/ml 150 μg/ml 和 200 μg/ml 上 也 不 能 生 长 表 4 涂 布 平 板 法 的 敏 感 性 检 测 试 验 结 果 抗 生 素 抗 生 素 浓 度 (μg/ml g/ml) 菌 体 稀 释 倍 数 敏 感 性 对 照 新 霉 素 注 : 正 常 生 长, - 生 长 被 抑 制

449 444 A B 图 12 对 照 组 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 13 对 照 组 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A 图 14 新 霉 素 浓 度 50 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) B

450 445 A B 图 15 新 霉 素 浓 度 为 50 μg/ml 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 16 新 霉 素 浓 度 100 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A 图 17 新 霉 素 浓 度 100 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) B

451 446 A B 图 18 新 霉 素 浓 度 150 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 19 新 霉 素 浓 度 150 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 20 新 霉 素 浓 度 200 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 )

452 447 A B 图 21 新 霉 素 浓 度 200 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) 4. 试 验 讨 论 (1) 滤 纸 贴 片 法 的 试 验 结 果 显 示, 新 霉 素 与 卡 那 霉 素 对 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 没 有 抑 制 作 用 初 步 推 断 是 菌 液 浓 度 太 高, 以 至 于 其 敏 感 性 未 有 所 表 现 (2) 划 线 法 的 试 验 结 果 显 示, 新 霉 素 浓 度 为 100 μg/ml 时, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 被 抑 制, 初 步 论 证 了, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 新 霉 素 敏 感 性 与 菌 液 浓 度 有 关, 菌 液 浓 度 过 高 时, 其 敏 感 性 未 能 表 现 (3) 为 了 进 步 研 究 其 菌 液 浓 度 与 其 敏 感 性 的 关 系, 将 菌 液 稀 释 后 涂 于 含 有 不 同 浓 度 新 霉 素 的 培 养 基 上, 观 察 其 生 长 状 况, 试 验 结 果 显 示, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 在 新 霉 素 浓 度 为 50 μg/ml 100 μg/ml 150 μg/ml 和 200 μg/ml 的 平 板 上 不 能 生 长 (4) 综 合 3 个 试 验 的 结 果, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 在 新 霉 素 浓 度 为 100 μg/ml 时 不 能 生 长, 即 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 新 霉 素 敏 感 浓 度 为 100 μg/ml 5.. 参 考 文 献 1) Asaka O, Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping off of tomato with Bacillus subtilis RB14[J]. Appl Environ Microbiol,1996, 62(11): ) Kleinkauf H, Dohren H Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics[j]. Eur J Biochem,1990, 192(1):1-l5. 3) Zheng G, Slavik M Isolation, partial purification and characterization of a bacteriocin produced by a newly isolated Bacillus subtilis strain[j]. Lett App1 Bacterio1,1999, 28(5): ) Axe1 G, Stoverand A D. Regulation of synthesis of the Bacillus subtilis transition phase, spore associated antibacterial protenin TasA[J]. J Bacterio1,1999, 181(17): 试 验 负 责 车 建 美 林 海 云 刘 波 试 验 人 员 马 桂 美

453 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 无 致 病 力 突 变 株 的 形 态 和 分 子 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美 试 验 负 责 : 车 建 美 林 海 云 刘 波 报 告 日 期 : 计 数 月 份 :2011 年 7 月 (1) 研 究 资 格 系 数 ( ) 实 验 设 计 系 数 ( ) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% % 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : , 传 真 : fjat.yzxz.com

454 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 是 一 种 土 传 性 病 害, 在 很 多 植 物 中 都 有 所 发 现, 寄 主 范 围 很 广, 是 常 见 的 农 作 物 病 害, 其 致 病 机 理 的 研 究 至 关 重 要 我 们 实 验 室 通 过 插 入 mini-tn5 构 建 突 变 体 库, 为 其 致 病 机 理 的 研 究 提 供 材 料 此 次 试 验 主 要 研 究 mini-tn5 插 入 突 变 体 中 的 无 致 病 力 菌 株, 前 期 试 验 从 菌 体 形 态 对 突 变 体 库 中 的 部 分 菌 株 进 行 了 鉴 别, 但 分 子 检 测 的 结 果 不 是 很 理 想, 因 此 需 要 再 次 验 证 此 次 试 验 分 别 从 菌 体 的 形 态 和 分 子 方 面 进 行 验 证 这 些 菌 株 为 无 致 病 力 菌 株, 此 次 试 验 涂 板 后, 测 其 弱 化 指 数 并 采 用 试 剂 盒 法 提 取 基 因 组 DNA, 避 免 蛋 白 和 离 子 残 留, 影 响 PCR 结 果 分 别 用 特 异 性 引 物 和 flic 引 物 检 测 进 行 PCR 扩 增, 检 测 其 是 否 为 无 致 病 力 菌 株 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 菌 株 菌 株 来 源 于 FJAT-91 青 枯 雷 尔 氏 菌 mini-tn5 插 入 突 变 体 库, 菌 株 编 号 :FJAT-FJAT-t770 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t134 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t616 FJAT-t617 FJAT-t636 FJAT-t644 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t297 FJAT-t162 其 中 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t297 FJAT-t162 是 强 致 病 力 菌 株, 作 为 阳 性 对 照 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 :TTC 培 养 基 : 每 升 含 葡 萄 糖 5 g, 蛋 白 胨 10 g, 水 解 酪 蛋 白 1 g, 琼 脂 17 g, 每 200 ml 培 养 基 中 加 入 1 ml 1%TTC 和 200 μl 50 mg/ml 卡 那 霉 素,pH SPA 培 养 基 : 每 升 含 蔗 糖 20 g, 蛋 白 胨 5 g,kh2po40.5 g,mgso g,ph 无 菌 水 dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 特 异 性 基 因 引 物 flic 基 因 引 物 1500 bpmaker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 : 超 净 工 作 台 恒 温 培 养 箱 水 浴 锅 离 心 机 分 光 光 度 计 Biometra 梯 度 PCR 仪 ; BIO-RAD 电 泳 仪 ;UVP 凝 胶 成 像 仪 2.2 试 验 方 法 菌 株 活 化 于 -80 冰 箱 中 取 出 菌 株, 在 TTC( 含 有 50 μg/ml 卡 那 霉 素 ) 平 板 上 划 线 置 于 30 恒 温 培 养 箱 中 培 养 72 h ( 注 意 : 从 冰 箱 中 取 出 的 菌 株 要 放 在 冰 盒 中, 防 止 细 菌 细 胞 破 裂 而 死 亡 ) 摇 瓶 培 养 挑 取 纯 化 后 的 单 菌 落 于 SPA 培 养 基 中 (20 ml, 卡 那 霉 素 浓 度 为 50 μg/ml) 于 30 摇 床 培 养 h, 转 速 170 r/min DNA 提 取 ( 采 用 试 剂 盒 法 ) 和 DNA 浓 度 的 测 定 (1) 取 2 ml 菌 液 于 离 心 管 中,12000 rpm 离 心 10 min, 弃 去 上 清 液, 收 集 菌 体 (2) 向 菌 体 中 加 入 600 μl Nuclei Lysis Solution 溶 液, 用 移 液 枪 轻 轻 吹 打, 使 菌 体 重 新 悬 浮, 置 于 80 水 浴 锅 内, 温 育 5min( 期 间 拿 出 反 复 颠 倒, 使 其 受 热 均 匀 ), 放 室 外 冷 却 至 室 温 ( 一 定 要 充 分 冷 却 ) (3) 加 入 3 μl RNase Solution, 反 复 颠 倒 2-5 次, 使 其 混 合 均 匀 (4) 置 于 37 水 浴 锅 中 1 h,( 期 间 每 20min 拿 出 反 复 颠 倒 2-5 次 ) (5) 充 分 冷 却 至 室 温, 加 入 200 μl Protein Previption solution 高 速 振 荡,20 s, 使 蛋 白 质 完 全

455 450 沉 淀, 冰 浴 5 min( 期 间 可 拿 出 反 复 颠 倒 ), 离 心 (14000 r/min,3 min, 时 间 可 以 更 长, 使 蛋 白 质 完 全 沉 淀 (6) 转 移 上 清 液 于 600 μl 异 丙 醇 中, 水 平 翻 转, 直 至 出 现 白 色 絮 状, 离 心 (14000 r/min,2-3min) (7) 小 心 弃 去 上 清 液, 加 入 600 μl 乙 醇, 并 垂 直 翻 转, 再 次 置 于 r/min 离 心 2-3min (8) 小 心 弃 去 上 清 液, 在 纸 上 扣 干 (9) 至 离 心 管 上 的 液 体 风 干 后, 加 入 100 μl 无 菌 水, 并 65 温 育 1 h( 期 间 20 min 取 出 颠 倒 2-5 次 ) (10) 室 内 过 夜,-20 保 存 PCR 扩 增 (1) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; 上 游 引 物 :1 μl; 下 游 引 物 :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2) 扩 增 程 序 A 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 特 异 性 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 96 C, 预 变 性 1min; 96 C 变 性 30 s, 70 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1min, 进 行 2 个 循 环 ; 之 后 94 C 变 性 30 s,70 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1min, 再 进 行 33 个 循 环 ; 最 后 72 C 5min B 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 flic 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 94 C, 预 变 性 5min; 然 后 94 C 变 性 30s, 63 C 退 火 30s, 72 C 延 伸 1min, 进 行 25 个 循 环 ; 最 后 72 C 10min

456 试 验 结 果 3.1 不 同 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 菌 株 的 菌 落 形 态 及 致 病 性 试 验 结 果 见 表 1 和 图 1-6 根 据 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 菌 落 形 态 初 步 判 断 其 致 病 性 强 弱 强 致 病 性 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 菌 落 形 态 表 现 为 : 菌 落 表 面 较 湿 润, 且 流 动 性 强, 菌 落 中 间 为 粉 红 色, 白 边 较 宽 弱 致 病 性 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 落 形 态 表 现 为 : 表 面 较 干 燥, 无 流 动 性, 中 间 为 暗 红 色, 并 且 白 边 较 窄 ( 刘 波,2005) 在 第 一 次 试 验 中 鉴 别 出 的 无 致 病 力 菌 株, 此 次 试 验 活 化 后, 出 现 部 分 强 致 病 力 菌 株, 如 FJAT-t770 FJAT-t617 FJAT-t644 FJAT-t87 FJAT-t186, 还 出 现 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 类 似 菌 株, 如 FJAT-t334 表 1 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 致 病 力 强 弱 判 断 菌 体 编 号 致 病 性 菌 体 编 号 致 病 性 菌 体 编 号 致 病 性 FJAT-t770 V FJAT-t168 A FJAT-t618 A FJAT-t65 A FJAT-t186 V FJAT-t616 A FJAT-t87 V FJAT-t200 A FJAT-t617 V FJAT-t158 A FJAT-t212 A FJAT-t636 A FJAT-t134 A FJAT-t334 A FJAT-t644 V 注 : V 表 示 强 致 病 力 菌 株, A 表 示 无 致 病 力 菌 株 A B 图 1 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t87 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 ) A B 图 2 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t186 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 )

457 452 A 图 3 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t200 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 ) B A B 图 4 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t212 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 ) A B 图 5 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t334 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 )

458 453 A B 图 6 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t626 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 ) 3.2 青 枯 雷 尔 氏 菌 基 因 组 DNA 浓 度 的 测 定 使 用 试 剂 盒 法 提 取 基 因 组 DNA, 采 用 分 光 光 度 计 测 定 所 提 取 的 DNA 浓 度 一 般 用 260/280 来 检 验 DNA 和 RNA 的 纯 度, 纯 DNA 的 比 值 约 为 1.8, 一 般 认 为 比 值 在 之 间, 其 DNA 纯 度 较 好 比 值 低 于 1.8, 表 示 有 蛋 白 质 和 酚 类 物 质 的 影 响 使 用 试 剂 盒 提 取 的 DNA 效 果 不 是 很 好,260/280 的 比 值 都 不 高 于 1.8, 蛋 白 质 污 染 比 较 严 重 具 体 结 果 见 表 2 表 2 DNA 浓 度 测 定 结 果 菌 株 编 号 OD(ng/ ng/μl) 260/ /230 FJAT-t134a FJAT-t134b FJAT-t87a FJAT-t87b FJAT-t626a FJAT-t626b FJAT-t186a FJAT-t186b FJAT-t212a FJAT-t212b FJAT-t158a FJAT-t158b FJAT-t FJAT-t 注 : a b 是 第 一 个 和 第 二 个 重 复 3.3 青 枯 雷 尔 氏 菌 PCR 检 测 特 异 性 引 物 PCR 检 测 特 异 性 引 物 PCR 检 测 结 果 如 图 7 PCR 结 果 显 示 均 具 有 500 bp 清 晰 的 条 带, 只 有 FJAT-t87a 未 跑 出 条 带, 可 能 是 DNA 浓 度 过 低, 而 FJAT-t626 FJAT-t186 FJAT-t212 都 扩 增 出 2 条 带, 可 能 是 DNA 残 留

459 454 注 : M maker 图 7 特 异 性 引 物 PCR 扩 增 结 果 flic 引 物 PCR 检 测 结 果 检 测 结 果 见 图 8 特 异 性 引 物 的 结 果 显 示,FJAT-t87a 可 能 是 DNA 浓 度 过 低, 未 扩 增 出 相 应 的 片 段, 在 此 次 检 测 中 就 直 接 用 FJAT-t87b 进 行 检 测 而 FJAT-t626a FJAT-t626b FJAT-t186a FJAT-t186b 都 有 2 条 扩 增 片 段, 所 以 此 次 检 测 就 选 其 中 之 一 进 行 扩 增 扩 增 结 果 表 明, 都 扩 增 得 到 400 bp 的 片 段 其 中 FJAT-t87b FJAT-t134b FJAT-t158b 分 别 扩 增 出 400 bp 和 1000 bp 的 片 段,FJAT-t186a 扩 增 出 了 400 bp 和 3000 bp 以 上 的 片 段 ; 而 FJAT-t626a FJAT-t212a FJAT-t334 FJAT-t200 扩 增 出 来 3 条 带, 因 此 FJAT-t87 FJAT-t134 FJAT-t158 FJAT-t626 FJAT-t186 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t200 这 些 可 能 都 不 是 青 枯 雷 尔 氏 菌 注 : M maker, + 阳 性 对 照, - 阴 性 对 照 图 8 flic 引 物 PCR 扩 增 结 果 4. 试 验 讨 论 (1) 第 一 次 试 验 中 得 到 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 体, 在 第 二 次 活 化 时 出 现 强 致 病 力 菌 株, 可 能 是 菌 种 保 存 的 时 候 被 污 染 了, 也 可 能 在 是 保 存 前 没 有 完 全 纯 化, 强 致 病 力 菌 株 和 无 致 病 力 菌 株 共 同 存 在 ; 或 者 菌 株 因 生 境 的 改 变 而 改 变 具 体 原 因 还 有 待 进 一 步 研 究

460 455 (2) 特 异 性 引 物 PCR 的 结 果 表 明,FJAT-t626 FJAT-t186 FJAT-t212 可 能 不 是 青 枯 雷 尔 氏 菌 再 次 使 用 flic 引 物 进 行 验 证 (3)fliC 引 物 的 PCR 结 果 表 明, 都 扩 增 出 了 400 bp 的 片 段, 但 FJAT-t87b FJAT-t134b FJAT-t158b 分 别 扩 增 出 400 bp 和 1000 bp 的 片 段,FJAT-t186a 扩 增 出 了 400 bp 和 3000 bp 以 上 的 片 段 ; 而 且 FJAT-t626a FJAT-t212a FJAT-t334 FJAT-t200 扩 增 出 来 3 条 带, 因 此 初 步 推 断 FJAT-t87 FJAT-t626 FJAT-t186 FJAT-t334 FJAT-t200 不 是 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-t134 FJAT-t158 FJAT-t212 是 否 为 青 枯 雷 尔 氏 菌, 还 有 待 进 一 步 验 证 5.. 参 考 文 献 [1] 刘 波, 林 志 营 等. 青 枯 雷 尔 氏 菌 多 态 性 研 究 [M]. 福 州 : 福 建 科 技 出 版 社,2005,6. 试 验 负 责 车 建 美 林 海 云 刘 波 试 验 人 员 马 桂 美