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和年谢
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1 60 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (1): 双载体断裂 CFTR 基因转移及翻译后的连接和功能朱甫祥 *, 刘泽隆, 屈慧鸽, 迟晓艳 ( 鲁东大学生命科学学院, 山东烟台 ) 摘要 : 囊性纤维化跨膜电导调节体 (CFTR) 基因突变导致一种常染色体隐性遗传病囊性纤维化 (CF), 利用腺辅助病毒 (AAV) 载体转运 CFTR 基因的基因疗法受到 AAV 载体容量的限制本文采用 intein 的蛋白质反式剪接技术, 以双载体转运 CFTR 基因, 研究了于其调节结构域 (R) 断裂成两部分的 CFTR 基因翻译后的连接及其产生的 Cl 通道功能将人 CFTR cdna 于 R 结构域的 Ser 712 密码子前断裂, 构建一对融合 Ssp DnaB intein 编码序列的真核表达载体将这对载体共转染培养的幼年仓鼠肾 (BHK) 细胞, 通过瞬时表达, 全细胞和单通道膜片钳记录 Cl 电流, 并用 Western blotting 观察 CFTR 蛋白的剪接结果表明, 共转染细胞显示较高的全细胞 Cl 电流和单个 Cl 通道开放活性, 说明 CFTR 的 Cl 通道功能的恢复, 用 CFTR 特异性抗体进行的细胞总蛋白 Western blotting 显示有完整的 CFTR 蛋白条带形成, 表明 intein 可有效连接翻译后的两部分 CFTR 蛋白结果提示, 蛋白质剪接技术可有效用于双载体系统转运 CFTR 基因, 为进一步应用双 AAV 载体转运 CFTR 基因的 CF 基因治疗研究提供了实验依据关键词 : 蛋白质反式剪接 ; 囊性纤维化跨膜电导调节体基因 ; 氯离子通道 ; 双载体系统中图分类号 : Q73 文献标识码 : A 文章编号 : (2010) Post-translational ligation and function of dual-vector transferred split CFTR gene ZHU Fu-xiang *, LIU Ze-long, QU Hui-ge, CHI Xiao-yan (Life Science College of Ludong University, Yantai , China) Abstract: The mutation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene leads to an autosomal recessive genetic disorder cystic fibrosis (CF). The gene therapy for CF using adeno-associated virus (AAV) vectors delivering CFTR gene is restricted by the contents limitation of AAV vectors. In this study the split CFTR genes severed at its regulatory domain were delivered by a dual-vector system with an inteinmediated protein trans-splicing as a technique to investigate the post-translational ligation of CFTR half proteins and its function as a chloride ion channel. A pair of eukaryotic expression vectors was constructed by breaking the human CFTR cdna before Ser 712 codon and fusing with Ssp DnaB intein coding sequences. After co-transfection into baby hamster kidney (BHK) cells followed by transient expression, patch clamps were carried out to record the chloride current of whole-cell and the activity of a single channel, and the ligation of two halves of CFTR was observed by Western blotting. The results showed that the intein-fused half genes co-tansfected cells displayed a high whole cell chloride current and activity of a single channel indicating the functional recovery of chloride channel, and an intact CFTR protein band was figured out by CFTR-specific antibodies indicating that intein can efficiently ligate the separately expressed half CFTR proteins. The data demonstrated that protein splicing strategy could be used as a strategy in delivering CFTR gene by two vectors, 收稿日期 : 基金项目 : 山东省自然科学基金资助项目 (Y2005D14); 烟台市科技计划项目 ( ); 教育部留学回国人员科研启动基金项目 ; 鲁东大学学科建设经费资助项目. * 通讯作者 Tel: , Fax: , fuxiangmail@163.com

构域 (R) 断裂成两部分的 CFTR 基因翻译后的连接及其产生的 Cl 通道功能将人 CFTR cdna 于 R 结构域的 Ser 712 密码子前断裂, 构建一对融合 Ssp DnaB intein 编码序列的真核表达载体将这对载体共转染培养的幼年仓鼠肾 (BHK)

2 朱甫祥等 : 双载体断裂 CFTR 基因转移及翻译后的连接和功能 61 encouraging our ongoing research program on dual AAV vector system based gene transfer in gene therapy for cystic fibrosis. Key words: protein trans-splicing; CFTR gene; chloride ion channel; dual-vector system 囊性纤维化跨膜电导调节体 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病囊性纤维化 (cystic fibrosis, CF) [1] 由于 CF 属于单基因缺陷性疾病, 特别适合于体细胞基因治疗在已开发使用的基因载体中, 腺辅助病毒 (adeno-associated viruses, AAV) 载体由于具有非致病性可感染非分裂期细胞等优点, 是治疗基因转移的理想载体, 而且 AAV5 具有呼吸道上皮细胞靶向特异性感染的特性, 特别适合 CFTR 基因的靶器官定向转移 [2] AAV 的容量上限为 4.7 kb, 而 CFTR cdna 为 4.4 kb, 加上启动子 / 增强子序列后, 将超过 AAV 的容量上限, 使得 AAV 在 CFTR 基因转移中遇到困难 Intein 的蛋白质剪接功能为利用双 AAV 载体的 CFTR 基因转移提供了可能 Intein 是包埋于前体蛋白中的多肽, 翻译后通过蛋白质剪接作用被切除, 伴以两侧宿主蛋白间肽键的连接, 成为有生物学功能的蛋白 [3] 蛋白质剪接分为顺式 (cis) 和反式 (trans) 两种, Ssp DnaB intein 是一种顺式作用 intein, 人工断裂后可产生反式剪接作用 [4] 本文基于 Ssp DnaB intein 具有的蛋白质反式剪接功能, 于 CFTR 分子中部的调节结构域 (regulatory domain, R) 的 Ser 712 密码子前将其 CFTR 的 cdna 断裂成两段, 分别与 Ssp DnaB intein 基因融合构建一对真核表达载体, 共转染 BHK 细胞, 全细胞和单通道膜片钳技术记录到较高的 Cl 电流和通道开放活性, Western blotting 观察到细胞内剪接形成的完整 CFTR 蛋白, 表明蛋白质剪接技术可有效地用于双载体 CFTR 基因转移, 为进一步动物体内运用双 AAV 载体转运 CFTR 基因的 CF 基因治疗研究提供了实验依据材料与方法质粒菌株和细胞含有 Ssp DnaB intein 编码 cdna 的质粒 pmst 由加拿大 Dalhousie 大学医学院生物化学与分子生物学系 Paul Liu 教授实验室提供, 含有人 CFTR 全长 cdna 的真核表达质粒 pires2- EGFP-CFTR 和幼年仓鼠肾脏细胞 (baby hamster kidney, BHK) 由加拿大 Dalhousie 大学医学院生理与生物物理学系 Paul Linsdell 教授实验室提供真核表达载体 pegfp-n1 和 peyfp-n1 购自 Clontech 公司大肠杆菌菌株 DH5α 为本室保存工具酶和主要试剂限制性内切酶 DNA 连接酶试剂盒 DNA 分子量标准产自 New England Biolabs 公司 ; 高保真 Pfu Turbo DNA 聚合酶购自 Stratagene 公司 ; Gel Extraction Kit PCR Purification Kit 和 Spin Miniprep Kit 均为 Qiagen 公司产品 DMEM 和 Opti-MEM 培养基 Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自 Invitrogen 公司, 胎牛血清购自 Hyclone 公司山羊抗人 CFTR 的 N 端和 C 端抗体 N-20 和 C-19 购自 Santa Cruz; 兔抗山羊 HRP- 二抗和 ECL plus Western Blotting Detection 试剂盒购自 Amersham Pharmacia Biotech (GE) 公司其他试剂均为国产或进口分析纯, 电生理实验所用试剂除注明外均为 Sigma 公司产品真核表达载体的构建选择于第 771 位的 Ser 密码子前将 CFTR 的 cdna 断裂为 N 端和 C 端两部分, 该断裂位点位于 CFTR 分子的 R 结构域用引物 P1 P2 和 Pfu Turbo DNA 聚合酶进行 PCR, 从质粒 pires2- EGFP-CFTR 扩增 CFTR 的 N 端编码序列, 用引物 P3 和 P4 从 pmst 扩增 Ssp DnaB intein 的 N 端编码序列, 分别用 EcoR I 和 BamH I 酶切上述两种 PCR 产物, 与 EcoR I/BamH I 双酶切线性化的载体 pegfp-n1 连接, 得到 CFTR 的 N 端与 Ssp DnaB intein 的融合表达质粒 pegfp-ni 用 P5 P6 和 P7 P8 引物对, 分别从 pmst 和 pires2-egfp-cftr 扩增 Ssp DnaB intein 的 C 端和 CFTR 的 C 端编码序列, 分别以 EcoR I/ApaL I 和 ApaL I/BamH I 酶切, 与经 EcoR I/BamH I 双酶切线性化的载体 peyfp-n1 连接, 得到 Ssp DnaB intein 与 CFTR C 端融合表达质粒 peyfp-ic 同时构建不含 Ssp DnaB intein 的 CFTR 的 N 端和 C 端的表达载体 pegfp-n peyfp-c 和全长 CFTR 的表达载体 pegfp-cftr 作为对照, 所用引物及序列见表 1, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成细胞培养及基因转染 BHK 细胞在 5% CO 2 37 条件下贴壁培养于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液转染前一天用胰蛋白酶消化分散细胞, 按每孔 2 ml DMEM 培养液含个细胞接种于含盖玻片的 6 孔培养板, 待细胞生长融合至 80% 以上时, 用 Lipofectamine 2000 脂质体按试剂盒说明书进行基因转染, 将两种质粒 pegfp-ni 和 peyfp-ic 按 1 1 比率 ( 各 4 μg) 混合稀释于 250 μl 的 Opti-MEM 培养液,

遗传疾病囊性纤维化 (cystic fibrosis, CF) [1] 由于 CF 属于单基因缺陷性疾病, 特别适合于体细胞基因治疗在已开发使用的基因载体中, 腺辅助病毒 (adeno-associated viruses, AAV) 载体由于具有非致病性可感染非分裂期细

3 62 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (1): Table 1 Primers used for construction of vectors Primer Sequence Endonuclease site P1 5'-CGGAATTCACCATGCAGAGGTCGCCTCTG-3' EcoR I P2 5'-AAATTTTCGTATAGAGTTGATTGGA-3' P3 5'-TGCATCAGTGGAGATAGTTTGATC-3' P4 5'-CGGGATCCCGCAATTGTAAAGAGGAGCTTTCTAG-3' BamH I P5 5'-CGGAATTCACCATGTCACCAGAAATAGAAAAGTTGT-3' EcoR I P6 5'-CGGTGCACGAAGATGTCATTGGCGACAA-3' ApaL I P7 5'-CGGTGCACAACTCCATTGTGCAAAAGACTCCCT-3' ApaL I P8 5'-CGGGATCCCGAAGCCTTGTATCTTGCACCTCTTC-3' BamH I 与室温放置 5 min 的含脂质体 20 μl 的 Opti-MEM 培养液 (250 μl) 混合, 室温继续放置 20 min, 共转染 BHK 细胞 ; 同时, 用 4 μg 的 pegfp-n 和 peyfp-c 共转染 BHK 细胞, 并分别用 pegfp-n 和 peyfp-c 转染 BHK 细胞用 4 μg 的 pegfp-cftr 作为阳性对照 4 μg 的质粒载体 pegfp 为阴性对照 (Mock) 转染 BHK 细胞培养箱内温育 5 h 后换以 2 ml 的新鲜 Opti-MEM 培养液, 继续培养 48 h, 进行电生理学实验 ; 同时收集转基因 BHK 细胞用于 Western blotting 检测全细胞膜片钳记录实验 [5] 参照文献的方法进行荧光显微镜下观察于盖玻片贴壁生长的转基因 BHK 细胞, 根据转基因所带有的荧光蛋白基因的表达, 选择荧光强度高且在细胞膜上表达的细胞进行记录细胞浴池液 ( 细胞外液 ) 的成分及浓度为 : 140 mmol L 1 HCl, 2 mmol L 1 MgCl 2, 10 mmol L 1 N- tris-(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES); 电极液 ( 细胞内液 ) 的成分及浓度为 : 110 mmol L 1 aspartic acid, 30 mmol L 1 HCl, 1 mmol L 1 MgCl 2, 10 mmol L 1 TES, 1 mmol L 1 MgATP, 0.1 mmol L 1 EGTA 两种液体均用 N- 甲基 -D- 葡糖胺调 ph 至 7.4 用电极吸附细胞获得全细胞构型后, 记录背景电流, 然后滴加以下混合液至细胞浴池中激活 CFTR 通道蛋白 : 2 μmol L 1 forskolin, 100 μmol L 1 8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3':5'-cyclic monophosphate (pcpt-camp), 100 μmol L 1 3-isobutyl-1- methylxanthine (IBMX) 单通道膜片钳记录实验 [6] 参照文献的方法进行电极液 ( 细胞外液 ) 和细胞浴池液 ( 细胞内液 ) 的成分和浓度为 : 150 mmol L 1 NaCl, 2 mmol L 1 MgCl 2, 10 mmol L 1 TES, 用 NaOH 调 ph 至 7.4 形成内面向外式 (inside-out membrane patches) 记录结构后, 在细胞浴池中滴加蛋白激酶 A 催化亚基 (PKA, 80~120 nmol L 1, Promega 公司产品 ) 和 1 mmol L 1 MgATP 溶液激活 CFTR 通道细胞电流以 2 khz ( 全细胞 ) 或 50 Hz ( 单通道 ) 的低频过滤, 用 pclamp8 软件 (Axon Instrument) 进行分析用 pclamp8 软件测得的平均全细胞电容为 (25.9 ± 1.7) pf (n = 19) 蛋白剪接结果的 Western blotting 检测收集培养的细胞, 液氮 3 min 37 水浴 3 min 反复冻融 3 次, 提取细胞总蛋白用 Bradford 法进行蛋白定量, 取总蛋白 12 μg 上样进行还原性 SDS-PAGE, 半干电转法将蛋白印迹至硝酸纤维素膜, 5% 脱脂奶粉溶液室温封闭 2 h, 分别用稀释的 CFTR 的 N 端抗体 N-20 和 C 端抗体 C-19 于 37 轻摇孵育 1 h, 探测 CFTR 的 N 端或 C 端蛋白的表达以及由他们连接而成的全长 CFTR 蛋白, 再用 HRP- 抗山羊血清 37 轻摇孵育 1 h, ECL plus 法曝光 X 胶片统计学处理实验数据均采用 x ± s 表示, 组间比较采用 t 检验结果 1 Intein 融合真核表达载体的构建将 CFTR 于其 R 结构域的 Ser 712 密码子前一分为二, 与 Ssp DnaB intein 融合后插入 pegfp-n1 和 peyfp-n1, 得到一对真核表达载体 pegfp-ni 和 peyfp-ic, 如图 1 所示 Figure 1 Schematic representation of expression vectors for intein-fused CFTR half genes (N and C parts) 小量提取质粒进行酶切电泳鉴定, 用 Xho I/Age I 酶切质粒 pegfp-cftr, 阳性克隆可见 4.7 kb 的载体片段和 4.4 kb 的插入目的基因片段 ; 用 EcoR I/BamH I 酶切 pegfp-ni, 阳性克隆可见 3 个分别为

5'-CGGTGCACGAAGATGTCATTGGCGACAA-3' ApaL I P7 5'-CGGTGCACAACTCCATTGTGCAAAAGACTCCCT-3' ApaL I P8 5'-CGGGATCCCGAAGCCTTGTATCTTGCACCTCTTC-3' BamH I 与室温放置 5 min 的含脂质体 20 μl 的 Opti-MEM 培养液 (250

4 朱甫祥等 : 双载体断裂 CFTR 基因转移及翻译后的连接和功能 63 和 1.1 kb 的片段 ; 用 EcoR I/BamH I 酶切 peyfp-ic, 阳性克隆可见 3 个分别为和 0.9 kb 的片段 ; 用 Xho I/Age I 酶切质粒 pegfp-n, 阳性克隆可见 4.7 和 2.1 kb 两个片段 ; 用 Xho I/Age I 酶切质粒 peyfp-c, 阳性克隆可见 4.7 和 2.3 kb 两个片段, 如图 2 所示 DNA 测序结果进一步得到确认 2 全细胞和单通道膜片钳记录结果全细胞电压钳结果显示, 经 camp 激活后, 阳性 Figure 2 Agarose gel electrophoresis for digestion identification of recombinant plasmids. Lane 1: Xho I/Age I digested pegfp- CFTR; Lane 2: EcoR I/BamH I digested pegfp-ni; Lane 3: EcoR I/BamH I digested peyfp-ic; Lane 4: Xho I/Age I digested pegfp-n; Lane 5: Xho I/Age I digested peyfp-c; M: 1 kb DNA ladder 对照转染 pegfp-cftr 的 BHK 细胞 (wtcftr) 记录到较大的 Cl 电流, 而空载体转染 (Mock) 细胞未记录到 Cl 电流 ( 图 3A) Intein 融合的 NI+IC 共转染细胞记录到明显的 Cl 电流, 表明 intein 介导形成的完整的 CFTR 蛋白使其 Cl 通道功能得到恢复 ; 未融合 intein 的 N+C 共转染细胞也可记录到低水平的 Cl 电流, 而单独转染 N 或 C 基因的细胞未记录到 Cl 电流, 说明 N 和 C 两段蛋白尽管没有 intein 介导的共价连接, 也可形成一定的 Cl 通道功能 ( 图 3B) 根据细胞膜电容进行标准化处理得到电流密度 ( 用 pa/pf 表示 ) wtcftr 转染细胞经 camp 激活后的电流密度为 (495 ± 76) pa/pf; NI+IC 共转染细胞为 (417 ± 71) pa/pf, 两者无显著差异 ; 而 N+C 共转染细胞为 (198 ± 37) pa/pf, 与 NI+IC 相比显著减小 (P < 0.001), 表明 intein 介导连接的两段 CFTR 蛋白, 具有与 wtcftr 相似的 Cl 通道功能, 单独转染 N 或 C 基因的细胞分别为 (8 ± 6) 和 (7 ± 3) pa/pf, 与 NI+IC 相比差异显著 (P < 0.001), 如图 3C 所示内面向外式 (inside-out) 单通道膜片钳实验结果显示, 共转染 NI+IC 的 BHK 细胞表现出 PKA 和 ATP 依赖性 Cl 通道开放活性, 与 wtcftr 有相似的开放活性, 表现为前者的 Cl 通道开放概率与后者接近, 而 N+C 转染细胞的 Cl 通道开放概率与前两者比较, 显著降低 (P < 0.001), 见图 4 Figure 3 Expression of CFTR Cl currents and their amounts of camp-activated Cl conductance. A: Whole cell Cl currents recorded from Mock and wtcftr transfected BHK cells, both before (control) and after (+camp) addition of forskolin (2 μmol L 1 ), pcpt-camp (100 μmol L 1 ) and IBMX (100 μmol L 1 ) to the bath solution. Voltage steps were from 60 mv to +60 mv in 20 mv increments from a holding potential of 14 mv; B: camp-activated whole cell currents recorded from NI+IC or N+C co-transfected BHK cells; C: Amounts of camp-activated Cl conductance from different gene transfected BHK cells. Mean camp-activated current density was measured at 60 mv. Mean of data from 4 patches in each case. * P > 0.05 vs wtcftr group; ** P < vs NI+IC group

1 kb 两个片段 ; 用 Xho I/Age I 酶切质粒 peyfp-c, 阳性克隆可见 4.

5 64 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (1): 从上述实验可以看出, NI+IC 共转染细胞的全细胞电流密度 ( 图 3C) 和 Cl 通道开放概率 ( 图 4B) 虽然在数值上均低于 wtcftr 转染细胞, 但差异无统计学意义 (P > 0.05), 但明显高于 N+C 共转染细胞 (P < 0.001), 说明 intein 的蛋白质剪接作用的不完全性 Figure 5 Western blotting analysis for expressed split CFTR proteins and their ligation (β-actin was used as an internal marker). A: The CFTR N-terminus antibody N-20 was used to detect the expression of CFTR N-part and ligated CFTR; B: The CFTR C-terminus antibody C-19 was used to detect the expression of CFTR C-part and ligated CFTR Figure 4 Gating properties of single intein-joined CFTR channel. A: Unitary currents recorded from inside-out membrane patches at a membrane potentials of 50 mv; B: Mean channel open probability estimated from such recordings lasting at least 60 s. C: Channel closed; O: Channel opened. * P > 0.05 vs wtcftr group; ** P < vs NI+IC group 3 CFTR 蛋白表达和剪接的 Western blotting 检测结果利用 CFTR 特异性抗体的细胞总蛋白 Western blotting 检测结果显示, 阳性对照质粒 pegfp-cftr 转染的 BHK 细胞运用 CFTR 的 N 端抗体和 C 端抗体均可见表达的 CFTR 蛋白条带 (195 kd), Mock 转染细胞未见 CFTR 蛋白条带, 共转染融合 intein 的 NI+IC 的细胞运用两种抗体也可见一个明显的与阳性对照同样大小的剪接形成的 CFTR 蛋白条带, 显示较高的剪接效率, 同时分别可见未完全剪接的 intein 融合蛋白前体蛋白 NI 和 IC 共转染 N+C 的细胞只可见分别表达的 N 和 C 两段蛋白 ( 图 5) 由结果可以看出, intein 剪接作用并不完全, 可观察到未完成剪接的 NI 和 IC, 存在两种可能的原因, 一是两种片段 (NI 和 IC) 基因转染同一细胞和 ( 或 ) 表达的不均衡性, 二是反式剪接需要 NI 和 IC 相互作用, 但此作用具有随机性因而也可以解释前面的电生理实验中 NI+IC 共转染细胞的电流密度和 Cl 通道开放概率在数值上均低于 wtcftr 转染细胞讨论本研究中, 作者运用 intein 的蛋白质反式剪接功能, 采用双载体转运 CFTR 基因, 体外培养细胞共转染实验结果显示, 通过表达后蛋白质水平的反式剪接作用形成完整的 CFTR 蛋白, 并记录到较高的 camp 依赖性 Cl 电流和较高的电流密度, 以及较高的 PKA 和 ATP 依赖性 Cl 通道开放活性和开放概率, 表明 Cl 通道功能的恢复为保证剪接反应的进行, 本文选择的 CFTR 断裂点后有两个与 Ssp DnaB intein 的天然宿主蛋白相同的氨基酸组成, 即 Ser 712 和 Ile 713, 其中 Ser 712 为剪接反应所必需, 即便如此, 所观察到的剪接反应并不完全, 可能的原因有基因共转染同一靶细胞的效率不一和 ( 或 ) 基因表达的不均衡性, 以及两段蛋白分子间相互识别相互作用的随机性对反式剪接的影响等对于特定的目的基因, 采用 intein 的反式剪接需要由实验来测试不同的断裂点的剪接效率, 以选择较高剪接效率的断裂位点鉴于 intein 对其天然宿主蛋白剪接反应的高效性, 在外源蛋白的剪接实验中有时为了提高剪接效率, 甚至额外引入多个与所采用的 intein 天然宿主蛋白相同的残基, 但由于剪接后所引入的残基保留在目的蛋白中, 由此有可能带来的生物活性降低和 ( 或 ) 抗原性改变均为潜在不利因素目前解决 AAV 载体转 CFTR 基因所采用策略主要有两种, 一种是利用 RNA 反式剪接机制的双 AAV 载体系统, 在两个载体中分别引

001), 说明 intein 的蛋白质剪接作用的不完全性 Figure 5 Western blotting analysis for expressed split CFTR proteins and their ligation (β-actin was used as an internal marker).

6 朱甫祥等 : 双载体断裂 CFTR 基因转移及翻译后的连接和功能 65 入 5' 端供点和 3' 端受点片段的反式剪接对, 依赖共转染靶细胞后转录的两段 RNA 前体分子形成二聚体, 通过 RNA 反式剪接形成全长 CFTR 的 mrna, 由于二聚体化方向的随机性和 AAV 载体 DNA 自身环化 [7, 的倾向, 实际头尾正确剪接的效率很低 8] ; 另一种是缩减基因表达的调控元件或采用缩减型 CFTR 基因的单个 AAV 载体 [9 11], 缺点是缺乏较强的组织特异性表达, 只能部分纠正 CF 的 Cl 通道功能缺陷, 而且 CFTR 表达的持续时间较短, 缩减型 CFTR 尽管有报道具有一定程度的 Cl 通道功能, 但缺乏广泛研究由于蛋白质剪接反应的精确性非细胞机制依赖性和不需要能量消耗, 为 intein 用于双载体基因转移的明显优点最近作者在大肠杆菌表达实验中证明 Ssp BnaB intein 可高效剪接凝血 VIII 因子 [12], 在哺乳动物细胞中运用 intein 的蛋白质剪接技术证明凝血 VIII 因子的轻链具有显著顺式促进重链分泌的作用 [13] 应该注意的是, 剪接下来的 intein 蛋白对真核细胞的影响有待进一步研究, 但大量体内外基因转移实验的文献报道中均没有发现肌体细胞对诸如 LacZ 和 GFP 等外源蛋白产生免疫反应或毒性作用因此, 细胞对较小的 intein 蛋白产生毒性作用的可能很小本文中未融合 intein 的断裂 CFTR 基因共转染实验中, 尽管没有观察到完整的 CFTR 蛋白形成, 仍可记录到较低的 Cl 电流, 说明存在某种程度的分子间协同和 ( 或 ) 互补作用产生部分的 Cl 通道电流研究表明, CFTR 的两个 6 次 α- 螺旋跨膜结构域 (transmembrane domains, TMD) 构成 Cl 通道孔隙的核心结构 [14], 并且 TMD1 的小部分结构对于 Cl 通道的稳定性和功能至为关键 [15], 一个明显的证据是去除 CFTR 的 N 端包括 TMD1 的前 4 个跨膜 α- 螺旋的 264 个氨基酸残基后对其 Cl 通道功能影响不大 [16] 本文的实验结果为进一步应用蛋白质剪接技术的双 AAV 载体转运 CFTR 基因进行 CF 基因治疗研究奠定了基础, 而且两个载体均有充分的空间选用强的组织特异性表达调控序列致谢 : 感谢加拿大 Dalhousie 大学医学院 Paul Liu 教授在蛋白质剪接实验中所提供的技术帮助以及 Xiandi Gong 博士和 Paul Linsdell 教授在膜片钳实验中提供的帮助 References [1] Gadsby DC, Vergani P, Csanády L. The ABC protein turned chloride channel whose failure causes cystic fibrosis [J]. Nature, 2006, 440: [2] Zabner J, Seiler M, Walters R, et al. Adeno-associated virus type 5 (AAV5) but not AAV2 binds to the apical surfaces of airway epithelia and facilitates gene transfer [J]. J Virol, 2000, 74: [3] Saleh L, Perler FB. Protein splicing in cis and in trans [J]. Chem Rec, 2006, 6: [4] Wu H, Hu Z, Liu XQ. Protein trans-splicing by a split intein encoded in a split DnaE gene of Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: [5] Gong XD, Burbridge SM, Cowley EA, et al. Molecular determinants of Au(CN) 2 binding and permeability within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl channel pore [J]. J Physiol, 2002, 540: [6] Linsdell P, Gong XD. Multiple inhibitory effects of Au(CN) 2 ions on cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl channel currents [J]. J Physiol, 2002, 540: [7] Song Y, Lou HH, Boyer JL, et al. Functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator expression in cystic fibrosis airway epithelial cells by AAV2-mediated segmental trans-splicing [J]. Hum Gene Ther, 2009, 20: [8] Mansfield SG, Kole J, Puttaraju M, et al. Repair of CFTR mrna by spliceosome-mediated RNA trans-splicing [J]. Gene Ther, 2000, 7: [9] Ostedgaard LS, Rokhlina T, Karp PH, et al. A shortened adeno-associated virus expression cassette for CFTR gene transfer to cystic fibrosis airway epithelia [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102: [10] Mueller C, Torrez D, Braag S, et al. Partial correction of the CFTR-dependent ABPA mouse model with recombinant adeno-associated virus gene transfer of truncated CFTR gene [J]. J Gene Med, 2008, 10: [11] Fischer AC, Smith CI, Cebotaru L, et al. Expression of a truncated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator with an AAV5-pseudotyped vector in primates [J]. Mol Ther, 2007, 15: [12] Zhu FX, Liu ZL, Qu HG, et al. Ssp DnaB intein-mediated ligation of heavy and light chains of coagulation factor VIII in Escherichia col [J]. Chin J Biotech ( 生物工程学报 ), 2009, 25: [13] Chen LX, Zhu FX, Li J, et al. The enhancing effects of the light chain on heavy chain secretion in split delivery of factor VIII gene [J]. Mol Ther, 2007, 15: [14] Tabcharani JA, Chang XB, Riordan JR, et al. Phosphorylationregulated Cl channel in CHO cells stably expressing the cystic fibrosis gene [J]. Nature, 1991, 352: [15] Carroll TP, Morales MM, Fulmer SB, et al. Alternate translation initiation codons can create functional forms of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator [J]. J Biol Chem, 1995, 270: [16] Sirninger J, Muller C, Braag S, et al. Functional characterization of a recombinant adeno-associated virus 5-pseudotyped cystic fibrosis transmembrane conductance regulator vector [J]. Hum Gene Ther, 2004, 15:

功能缺陷, 而且 CFTR 表达的持续时间较短, 缩减型 CFTR 尽管有报道具有一定程度的 Cl 通道功能, 但缺乏广泛研究由于蛋白质剪接反应的精确性非细胞机制依赖性和不需要能量消耗, 为 intein 用于双载体基因转移的明显优点最近作

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