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1 LTQ Orbitrap 质谱仪表征未知化合物 Kerstin Strupat, Thomas Moehring, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany Donald Daley, Russell Scammell, Argenta Discovery Limited, 8/9 Spire Green Centre, Flex Meadow, Harlow, Essex, CM19 5TR, UK 目标建立表征未知化合物的工作流程 ( 化合物 X ) 对化 合物 X 进行定性和定量分析 获取数据的步骤如下 : 准确测定化合物 X 的质量 ; 并在除质量外其它条件未 知的情况下, 推测分子式 通过将分子式和理论同位素模式进行对比, 在除质量 外其它条件未知的情况下, 排除假阳性瞬态干扰 根据环双键当量值 (RDB 当量值 ), 确认正确符合的 化合物 通过进一步的 CID 和 HCD 的 MS/MS 得到结构信息, 研究并确认化合物 将化合物 X 进行一系列的稀释进行定量分析 该研究方法中, 开始时的未知化合物, 随后通过准确 的 MS 和 MS/MS 数据分析确定了化合物结构, 并最终通 过亚 pg 级上样量分析进行定量 前言噻托四铵盐药物应用于预防气喘 呼吸急促和慢性阻 塞性肺病 (COPD) 患者的呼吸困难 COPD 包括一系列 影响肺和气管的疾病, 例如慢性支气管炎 ( 通向肺部的空 气通道肿胀 ) 和肺气肿 ( 肺中气囊的损伤 ) COPD 被列 入包括心脏病 中风 癌症和阿尔采末病在内的五大杀 手疾病之一 噻托铵盐属于支气管扩张药物类, 它通过放 松支气管肌肉, 扩张空气通道, 使呼吸顺畅 详情请见 : a html 该化合物的阳离子特性使得它的离子化效率不依赖电 离源和 PH 值, 从而使它成为研究仪器性能的理想选择 实验方法 LC-ESI-MS 和 MS/MS 采用具有高分离能力和准确质量测量的液相色谱 - 电喷雾离子化 (LC-ESI) 串连质谱仪确定未知化合物 X 的 结构 Thermo Scientific 公司生产的 LTQ Orbitrap 质 谱仪是组合式质谱仪, 包括线性离子阱和轨道阱质量分 析仪 用含 0.1% 甲酸的乙腈 / 水 (95/5) 配制储备液用于定 量分析 将该储备液稀释为浓度为 10~10,000fg/μL 的一 系列溶液 液相泵 :Surveyor HPLC 泵 (Thermo Scientific) 色谱柱 :HypersilGOLD (Thermo Scientific),2.1mm 50mm 1.9μm 流速 :100μL/min 进样量 :20μL 满环进样 图 1 三种他汀类化合物的化学结构 流动相梯度如下 : 表 1 LC 流动相梯度 Time A% B% μl/min 定量实验中 MS 设置目标化合物 MS/MS 轨道阱检测 FTMS + p norm 分辨率 15,000,MS/MS@392.1 CID ( 碰撞诱导解离 ) 3.0u 碰撞能 35.0%,Q0.25, 驻留时间 30.0ms, 分离宽度 MS/MS 离子阱检测 ITMS + p norm MS/MS@392.1 CID 碰撞能 35.0%,Q0.25, 驻留时间 30.0ms, 分离宽度 3.0u 定性结果定量分析使用的是配有 Micro AS 自动进样器和 Surveyor MS 泵的 HPLC 系统 定量实验所采用的流速和 梯度如前所示 采用了直接输注和自动进样器进样两种进 样方式 图 1 是典型定量实验结果

2 表 2 涉及的元素 Isotope Min Max RDB equiv. Mass 14 N O C H S 表 3 由氮规则得到的元素组成 m/z Theo. Mass Delta (ppm) RDB equiv. Composition C 18 O 9 N 1 图 1 1pg/μL 溶液的基峰图谱 C 11 O 7 N C 10 H 22 O 11 N C 19 H 22 O 4 N 1 S C 23 H 14 N C 19 H 14 O 5 N C 15 O 2 N 7 S 2 C 19 H 22 O 4 N 1 S 2 进行搜索 在 chemidplus/ 的搜索表明, 噻托盐只有溴盐一种形式与之相符, 其分子量为 ( 见图 4) 该结构输入 Mass Frontier 软件, 通过获得化合物 X 的 MS/MS 数据 (CID 和 HCD) 数据来进一步确定结构, 如图 5 所示 图 2 m/z 391.5~395.5 范围内质谱图, 插图为 m/z 394 图 1 基峰中的插图显示了 LC 色谱峰内质谱测量的重现性 该 LC 峰中可以完成 20 次质谱测定 准确质量测量 RDBE 和同位素模式综合数据确定分子式为解析可能存在的硫, 在 RP 100,000@m/z 400 条件下对化合物 X 进行质谱测定 图 2 的全扫描图中的插图为 m/z 394, 该图揭示了硫 (S) 的存在 对 m/z 392 提出的分子式在 ±5ppm 的公差范围内考虑了 C H N O 和最多 2 个 S 化合物 X 所包含元素列于表 2 如表 3 所示, 假如所观察到的 m/z 392 是 ESI 典型的 MH+ 离子, 那么 RDBE 值只能是一个单电荷离子 x.5 图 3 对这七个建议结构和原始文件数据进行了对比 图 1 所示的 RDBE 值为 x.5 的推断结构是在分辨率 135,000,392@FWHM 的条件下模拟的 表 2 所示的推断分子式的元素组成是在分辨率为 135,000,392@FWHM 的条件下模拟的 没有 S 的结构推断可以立刻被排除 (S 和 34S 可以引起 A+2 及以上离子的裂峰 ) ; 只有一个 S 的情况也可以通过与原始数据信息对比而排除 ( 见 A+3 离子和 A+4 离子 ) 对比显示, 化合物 X 作为 MH+ 离子正确的化学式是 C 19 H 22 O 4 N 1 S 2 在数据库中对前面得出的化合物 X 的化学式 碰撞诱导解离 (CID) 图 5a : 轨道阱分析仪采用 MS/MS@m/z 392 和碰撞 诱导解离 (CID) 碎片技术检测 准确确定碎片 m/z 152 和 m/z 170, 并分别推断出一种分子式 结构定名由 Mass Frontier 完成 高能碰撞解离 (HCD) 图 5b : 轨道阱分析仪采用 MS/MS@m/z 392 和高能 碰撞解离 (HCD) 碎片技术检测 准确确定碎片 m/z 152 和 m/z 170, 并分别推断出一种分子式 可以观察到, 更 多的质量小于 m/z 150 的碎片可以明显的由结构式得出 结构定名由 Mass Frontier 完成 定量结果采用了适用于两种不同目标化合物 MS/MS 方法的稀 释液进行实验 图 6a 中列出了目标离子 MS/MS 和轨道 阱检测的三组数据 右侧的校正曲线给出了测试点 (10fg/ μl 到 10pg/μL) 的概观 蓝色的插入校正曲线显示了从 10fg/μL( 柱上 200fg) 到 100fg/μL( 柱上 2pg) 的详图 图 中的细节也可见图 6b 表格数据 目标离子 MS/MS 和离 子阱检测结果见图 7 结论 采用准确质量测量, 结合 RDBE 和同位素模式鉴别, 确定了化合物 X 的分子式 C 19 H 22 O 4 N 1 S 2

3 图 3 七种化学式及原始数据 左侧为同位素模式, 右侧为 A+1, A+2, A+3 和 A+4 离子 图 4 化合物 X 结构搜索噻托溴铵是唯一一个符合结构式 C 19 H 22 O 4 N 1 S 2 的化合物 该结构符合表 3 中 RDB 当量为 9.5 的结构式的双键数目以及未成对电子数

4 图 5a 轨道阱分析仪采用 392 和碰撞诱导解离 (CID) 碎片技术检测 图 5b 轨道阱分析仪采用 392 和高能碰撞解离 (HCD) 碎片技术检测

5 图 6a 系列稀释液用于目标离子 MS/MS 方法以及三组数据 目标离子 MS/MS 轨道阱检测,FTMS + p norm 分辨率 15,000/7,500,MS/MS@392.1,CID, 碰撞能 35.0%, Q0.25, 碰撞时间 30.0ms, 分离宽度 3.0u. 图 6b 图 6a 中三组数据的结果列表 图 7 目标离子 MS/MS 方法定量测量结果以及一组数据 目标离子 MS/MS 离子阱检测 ;ITMS + p norm,ms/ MS@392.1,CID, 碰撞能 35.0%,Q0.25, 碰撞时间 30.0ms, 分离宽度 3.0u. 使用互联网数据库搜索, 结合已得到的分子式, 确定 噻托为唯一符合的化合物 将所获得的碰撞诱导解离和高能碰撞阱解离的 MS/ MS 数据, 结合碎片规则应用于 Mass Frontier, 进一 步确定了化合物为噻托 CID 和 HCD 碎片由 Mass Frontier 确定完成 将系列稀释液应用于目标离子 MS/MS@m/z 392 方 法, 用离子阱和轨道阱分析仪分别检测 m/z 152 和 m/z 170 碎片, 实验证明 200fg 柱上量噻托就可以得 到可靠的标准曲线, 仅仅相当于浓度 10fg/μL 的噻托 溶液 20μL 满环进样

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