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1 中国人兽共患病学报２０１８,３４ ( １２) １０７９ Ch J Z 论 DOI: １３９６９/ １２２６９４２０１８０２０３ j 著云南新现蝙蝠样冠状病毒密码子偏性及其聚类分析田明明,魏雪玲,杨摘要:目的兴,宋秀锋,李光华,刘奇探索云南新现蝙蝠样冠状病毒 ( CV)密码子偏性及其与冠状病毒 ( CV)及其他地区 CV 密码子偏性的进化关系.方法运用 L EMBOSS CdW 等生物信息软件,以 CV 为对照,对云南新现蝙蝠 CV 各蛋白的编码序列进行密码子偏性分析,并基于此与不同时期报道的 CV 及 CV 进行聚类分析.结果１１株云南新现蝙蝠 CV 各蛋白有效密码子数目均接近６１,密码子偏性较弱;各蛋白偏性的密码子有差异,但均以 A U 结尾的密码子为主.ENC P 中性绘图分析与 PR２规则分析均提示新现蝙蝠 CV 在进化过程中主要受到自然选择因素的影响. 基于密码子偏性的聚类分析发现,部分云南蝙蝠 CV 与 CV 关系极为密切.同时,其他云南 CV 分散聚类于其他地区的 CV 中. 结论新报道的蝙蝠 CV 的密码子偏性与 CV 相似度较高,在进化过程中主要受到自然选择因素的影响,跨种传播至人的风险较高. 关键词:冠状病毒;密码子;偏性分析;聚类分析中图分类号: R３７３１文献标识码: A 文章编号: １２２６９４( ２０１８) １２１０７９０８ Cd b d d m b d YP,Ch TIAN M m,weix,yang X,SONG X,LIG h,liu Q ( Dp m Md M b dimm,i dlb P h B, Sh B Md,D U ６７１０,Ch ),D Ab :Txp h d b hm b d ( CV) YP d h h CVd h CV,w dl pw,emboss,cdw d h b m w z d b d hp d h q m b CV YP, CV,d h CV R hwd h hmb d ( ENC) h m b CVp w ６１, h d b w w k ThR SmCdU ( RSCU) hwd h hp d d hp w d,b d h dd w ha U I hh p d d, h wm b CVw h h w h CV ENC P, p dpr２ d d h h m d h h m b CV C b d d b d d h hm b CVw d CV I dd, h m b CVw d p d dw h CV d h A h hw h hwm b CV Y hh d m CVdhh k p m Th h d d h h h hb CV Ymb h CVd CV h m h p d p p K d : ; d;p ; w 国家自然科学基金资助项目 (N ８１６６０３３７, N ８１７０３５７３)和云南省教育厅科学研究基金项目( N ２０１５Y３８３)联合资助通讯作者:刘奇, Em : Q m 作者单位:大理大学基础医学院病原生物学综合实验室,医学微生物学与免疫学教研室,大理６７１０ Spp db hn N S Fd Ch ( ) N ８１６６０３３７ & ８１７０３５７３ d hs R h Fd Y P Ed Dp m (N ) ２０１５Y３８３ C pd h :L Q,Em :q m

2 1080 中国人兽共患病学报 2018,34(12) 严重急性呼吸道综合症 (SpG dm,) 是由冠状病毒 (GCV) 引起的一种严重的呼吸道疾 [1] 病, 是 21 世纪第 1 个在全球暴发流行的传染病. 该病以其起病急发展迅猛死亡率高的特点, 引起 [2] 了全世界民众的恐慌.GCV 初步认为起源于蝙蝠样冠状病毒 (GCV) [3], 其中从菊头蝠体内分离出的冠状病毒基因组结构与 GCV 相似, 且核苷酸一致性在 88%~92% 之 [4] 间. 虽然到目前为止 GCV 还未出现暴发流行, 但其核苷酸与 GCV 的高度一致性, 仍应引起相关部门的高度重视. 密码子 (d) 是生物体内遗传信息传递不可缺少的物质, 在编码氨基酸过程中, 多种密码子可以 [5] 编码同一种氨基酸, 即同义密码子. 在不同的生物体内, 甚至同一种生物不同的蛋白质基因对密码子的使用频率不尽相同, 具有一定的偏性, 即同义密 [6] 码子使用的偏性. 密码子偏性在单细胞物种和多 [7G8] 细胞物种的基因组和基因形成中起着重要作用. 同时, 病毒密码子偏性的使用情况也可揭示不同毒 [5] 株间的进化关系年 12 月, 中科院武汉病毒研究所石正丽课题组再次报道了 11 株云南新现蝙蝠 G CV, 并与 GCV 的基因序列具有高度相似性, 且其 S 蛋白上具有 GCV 的受体结合区 (RBD) [3]. 本研究以这 11 株云南新现的蝙蝠 GCV 为主要对象, 分析了它们与 G CV 密码子偏性的异同, 并以密码子偏性为基础进行聚类分析, 探索不同时期和地点发现的 G CV 与 GCV 密码子偏性之间的关系. 1 材料与方法 1.1 材料目的序列来源本研究涉及的冠状病毒基因编码序列 (CDS) 均来自 NCBI 数据库 (hp:// 使用软件本研究使用 EMBOSS(hp:// mb.../) 子程序 CUSP 计算密码 [9] 子 Fq 值,CdW (hp://. /pj/dw/) 计算密码子 ENC GC [10] GC3S RSCU 值,L 子程序 EdSq 和 MA 用于比对和截取蛋白编码序列. 使用 Smp 绘图 SPSS22.0 进行聚类分析. 1.2 方法有效密码子数有效密码子数 (E mbd,enc) 是由 Wh [11] 于 1990 年提出的一种描述密码子使用偏离随机选择程度的方法. 它是一个基因的密码子使用频率与同义密码子平均使用频率的量化值. 同时该值可单独由密码子使用数据计算得出, 与基因的长度及氨基酸组成无 [12] 关, 因此可以对基因的密码子偏性程度提供一个比较客观的标准. 本研究采用 CdW 计算出特定序列中有效密码子的 ENC 值. 其取值范围为 20 ( 每个氨基酸只使用一个密码子的极端情况 )~61 ( 各个密码子均被平均使用 ). 因此, 当 ENC 值越接近 20 时其偏性越强, 而 ENC 值越接近 61, 其偏 [6] 性就越弱甚至没有偏性相对密码子使用度相对密码子使用度 (RSmCd U,RSCU) 是指对于某一特定的密码子在编码对应氨基酸的同义密码子间的相对频率, 它去除了氨基酸组成对密码子 [13] 使用的影响, 当密码子不存在偏好时, 该密码子的 RSCU 值等于 1. 当某一密码子的 RSCU 值大于 1 时, 代表该密码子为使用相对较多的密码子, 即 [14] 偏性密码子, 反之亦然 ENCGP 分析 ENCGP 分析是用于确定密码子使用偏爱性的影响因素 ( 尤其是突变偏倚 / 突变压力 ).GC3S 值代表同义密码子的第 3 个密码子位置中的鸟嘌呤或胞嘧啶的频率, 不包括 M Tp 和终止密码子.ENCGP 分析方法是用 GC3S 为横坐标,ENC 为纵坐标, 来预测 ENC 和 GC3S 之 [11] 间的功能关系. 即针对 GC3S 值绘制 ENC 值. 其中, 标准曲线是指在不存在选择压力, 密码子的偏 [15] 性完全取决于突变压力的情况. 故当基点位于标准曲线上或散布在标准曲线附近时, 说明密码子的偏爱性受突变影响较大. 反之, 说明密码子使用模式受到自然选择的影响比较大中性分析中性分析 (NP) 是另外一种确定密码子使用偏性的影响因素 ( 尤其是自然选择偏倚 / 自然选择压力 ), 是以每一个编码基因的密码子的 GC1 GC2 平均值为纵坐标,GC3 为横坐标绘制的二维散点图. 如果散点的趋势线分布于对角线 ( 斜率 =1), 则表明基因仅受突变的影响. 反之, 斜率为 0 说明该基因在进化过程中受到选择压 [14] 力的影响奇偶规则分析奇偶规则分析 (PR 2p) 也被应用于密码子使用偏性的分析. 此规则是一种核苷酸内链规则, 如果在 2 个互补链 DNA 之间不存在任何突变或选择效应上的偏倚, 则预测 A=T 和 G=C [16]. 如果由 4 个密码子

3 12 期田明明等 : 云南新现蝙蝠样冠状病毒密码子偏性及其聚类分析 1081 编码的氨基酸的第 3 位密码子中的奇偶规则存在显著偏倚, 则在进化过程中则以自然选择压力为 [17] 主. 因此规则规定仅选择由 4 个密码子编码的氨基酸. 以 G3/(G3+C3) 4 为横坐标, 以 A3/(A3 [15] +T3) 4 为纵坐标绘制二维散点图. 图的中心处遵循 PR2 原则,A=T 且 G=C, 即横纵坐标都为 0.5. 从这个中心出发的矢量表示了 PR2 偏倚的程度和方向基于密码子偏性的聚类分析本研究采用 CdW 计算出所需的 GCV 及 G CV 基因序列的密码子使用频数, 使用 SPSS22.0 进行聚类分析. 2 结果 2.1 有效密码子数目分析 GCV 的全基因组由个核苷酸组成, 由 11 个开放阅读框 (ORF). 共编码 S E M 和 N 共 4 种结构蛋白和 ORF1 ORF1b ORF3 ORF3b ORF6 ORF7 [18] ORF7b ORF8 等多种功能未知的蛋白. 研究表明, 新发现的 11 株云南蝙蝠 GCV 各蛋白有效密码子数目 (ENC) 值均接近 61( 如表 1 所示 ), 初步表明密码子偏性总体较低. 并且, 云南新现蝙蝠 GCV 与 GCV 相同蛋白的 ENC 值非常接近. 表 1 云南新现蝙蝠 GCV 与 GCV 的 ENC 值 ( 均值 ) Tb.1 ENCmbGCVYpdGCV (A) S M N E ORF1 ORF1b ORF3 ORF3b ORF6 ORF7 ORF7b ORF8 GCV 均值 (X) 标准差 (SD) GCV 均值 (X) 标准差 (SD) 相对密码子使用度运用 CdW 软件分别计算新现 11 株云南蝙蝠 GCV 与 G CV(SZ3 GZ02 T2 BJ01 PC4G227)12 条蛋白各同义密码子的 RSCU 平均值 ( 结果见表 2). 结果显示,S M N E ORF1 ORF1b ORF3 ORF3b ORF6 ORF7 ORF7b ORF8 分别具有个偏性密码子 (RSCU>1), 并以 A U 结尾的密码子为主 ; 其中, ACU 为新现云南蝙蝠 GCV 的 12 种蛋白共有的偏爱密码子, 而 GGG CGG AGC UGG UAG AUC AUG 为非偏性密码子. 表 2 云南新现蝙蝠 GCV 的同义密码子平均使用度 (RSCU) Tb.2 Rmd(RSCU)mbGCVYp AA Cd S M N E ORF1 ORF1b ORF3 ORF3b ORF6 ORF7 ORF7b ORF8 Ph UUU UUC L UUA UUG CUU CUC CUA CUG I AUU AUC AUA M AUG

4 1082 中国人兽共患病学报 2018,34(12) 表 2( 续 ) AA Cd S M N E ORF1 ORF1b ORF3 ORF3b ORF6 ORF7 ORF7b ORF8 V GUU GUC GUA GUG S UCU UCC UCA UCG P CCU CCC CCA CCG Th ACU ACC ACA ACG A GCU GCC GCA GCG T UAU UAC TER UAA UAG H CAU CAC G CAA CAG A AAU AAC L AAA AAG Ap GAU GAC G GAA GAG C UGU UGC TER UGA Tp UGG A CGU CGC CGA

5 １２期田明明等:云南新现蝙蝠样冠状病毒密码子偏性及其聚类分析１０８３表２(续) AA Cd S AGU A AGA G GGU S M N E CGG ０２４５ AGC ３７９４９０８７８７４７２３８７０６０４８３ AGG ７０８７４８６７３１９０ GGC １９９０４１ GGA ８０３３６４ GGG １４３６３６ ORF１ ORF１b ORF３０８１０５０４９８３２５０９７８３０８０７５１６２７２５８２１７８３８６１４终止密码子及 T ( RSCU 值为１)未列入表中; AA 表示氨基酸 p 和 M ０２４４２７９３５８５８１ ORF３b ORF６ ORF７５１０９１１０８９９６２３６４４０６７８４７２０６８２９１１５１２ ORF７b ORF８２７６５３７２７１５５５３１３ ENCP 关联分析本研究进一步绘制了 CV 与新现的１１株云南蝙蝠 CV 各蛋白的 ENC 和 GC３S 的散点图(图１),可以看出两者几乎落在了同一区域,这进一步说明两者的密码子偏好受到了相似因素的影响.其中大部分点落在了远离标准曲线的位置,这说明云南新现蝙蝠 CV 与 CV 受自身突变和自然选择的双重影响,但以自然选择为主. ４中性分析为进一步分析１１株云南新现蝙蝠 CV 与 CV 密码子偏爱性的影响因素,我们以 S 蛋白 ORF１两蛋白作为结构蛋白与非结构蛋白的代表,分析突变及自然选择压力对两者密码子偏性的影响(图２). 如图２所示,云南新现蝙蝠 CV 与 CV 的 S ORF１两蛋白的斜率 ( b)分别是２０８４和２５７９,更接近０,表明两者主要受到自图１云南新现蝙蝠 CV 与 CV 相关蛋白编码基因的 ENC P 分析 F １ ENC P b h p d m b CV Y q d CV p 然选择的影响. 图２云南新现蝙蝠 CV 及 CV 相关蛋白编码基因的中性绘图分析 F ２ N h p d m b CV Yp P d CV

6 １０８４中国人兽共患病学报２０１８, ３４( １２) ５奇偶规则分析为进一步明确新现的１１株云南蝙蝠 CV 与 CV 密码子偏性形成中自然选择压力的作用,我们分析了由４个密码子编码的氨基酸的第３位密码子中的奇偶规则.如图３所示,两者大部分基因落在了 PR２图的左下方, 这意味着在密码子第３位 C 和 T(嘧啶)的使用频率高于 G 和 A(嘌呤).即其频率存在显著偏倚,提示两者在进化过程中主要受自然选择压力为主 [１７]. ６基于密码子偏性的聚类分析我们进一步从密码子偏爱性角度分析了新发现的１１株蝙蝠 CV 毒株与以往发现的 CV 毒株以及 CV 毒株之间的进化关系. 为了能够和石正丽课题组基于基因序列构建系统进化树的结图３云南新现蝙蝠 CV 与 CV 相关蛋白果进行比较,我们同样选择了包膜蛋白 S 和非结构 F ３ P A ( PR２) h p d R 蛋白基因 ORF１２个蛋白的密码子使用频率进行聚类分析,如图４. 编码基因的奇偶规则分析( PR２) m b CV Yp d CV CV 为紫色字体;云南新现的蝙蝠 CV 为红色加粗字体;其余在云南省发现的 CV 为黑色加粗字体. 图４基于 S 蛋白 ORF１蛋白密码子偏爱性的聚类分析 F ４ C SdORF１p b d db 蝙蝠 CV 分散聚类于先前报道的 /YN２０１３ R /WIVI /WIV１６与其中, R １ R CV 进化关系最为密切. 新报道的６株云 /YN２０１３ / 往报道的３株云南 CV ( R R / ) WIVI １ R WIV１６一起与 CV 聚为一类. /GX２０１３)发现的 HKU３１３) 广西( R CV _ 聚为一类.既往报道的云南株 YNLF ３１C YNLF_ 对 S 蛋白的聚类分析发现,云南新报道的１１株 CV 中.其中,新报道的 R ７３２７ R ９４０１ R ４０８４ R ４２３１ R ４８７４这５株云南蝙蝠 CV 与既南蝙蝠 CV (R ４０８１ R ４２５５ A ６５２６ R ４２３７ R ４２４７ R ４０９２)则与香港 (HKU３１~

7 12 期田明明等 : 云南新现蝙蝠样冠状病毒密码子偏性及其聚类分析 C RS3367 与贵州 (R/R672) 广西 (R/Rp3) 湖北 (R1 Rm1 HB2013) 河北 (HB2013) 吉林 (RJL2012) 发现的病毒株聚在了一起 ; 此外, 山西毒株 R/SX2013 和陕西毒株 Rp/SAX2011 则单独聚为一类. 而非结构蛋白 ORF1 的聚类分析发现, 云南蝙蝠 GCV( 包括 11 株新报道 GCV 及以往报道的 YNLF_31C 和 YNLF_34 C) 均与 GCV 聚在了一起, 提示这些毒株与 G CV 的密码子偏爱性相似度较高, 该分支同时包括了来自于贵州 (R/R672) 广西 (R/Rp3 R/ GX2013) 湖北 (R1 Rm1) 的毒株. 而香港报道的 GCV 毒株与 GCV 差异较大, 与一株来自湖北的毒株 (HB2013) 共同聚为一类. 山西毒株 R/SX2013 陕西毒株 Rp/SAX2011 河北毒株 HB2013 湖北毒株 R1 吉林毒株 RJL2012 等 GCV 则共同聚为一类. 值得注意的是, 与 GCV 密码子偏爱性最为密切的 GCV 毒株均来自云南. 其余省份检测到的 GCV 与 GCV 的距离较远. 3 讨论密码子是蛋白质编码基因中的基本单位和进化单位, 生物信息学的发展使得分析与计算大量基因序列数据成为可能. 本研究中, 我们使用一些常用的生物信息软件围绕密码子使用模式, 对新报道的 11 株云南蝙蝠 GCV 密码子偏性及其与 GCV 以及以往报道的 GCV 的进化关系进行分析. 本研究发现, 这 11 株 GCV 各蛋白间有效密码子数目 (ENC) 值均接近 61, 密码子偏性总体较低. 此外云南蝙蝠 GCV 与 GCV 进化过程中, 在偏爱密码子的选择上非常接近. 通过 RSCU 分析我们发现云南蝙蝠 GCV 各蛋白偏爱性密码子以 A U 结尾的密码子居多, 这与中东呼吸综合征冠状病毒 (MERSGCV) 偏爱以 A [19] U 结尾的密码子的结果相似.ENCGp 中性绘图分析 PR2 分析均显示, 云南蝙蝠 GCV 与 GCV 的密码子偏性主要受到自然选择等其 [19] 他因素的影响, 该结果也和 MERSGCV 一致. 通过基于密码子偏性的聚类分析发现, 无论是 S 蛋白还是 ORF1 蛋白, 与 GCV 密码子偏性相似度较高的 GCV 毒株均来自云南. 另发现这 11 株新报道的云南蝙蝠 GCV 在非结构蛋白基因 ORF1 上均彼此接近, 且与 G CV 紧密地聚在了一起. 这些结果提示, 不论是结构蛋白和非结构蛋白, 云南蝙蝠 GCV 的密码子偏性与 GCV 具有较高的相似性, 该结果也从密码子偏性的角度, 佐证了云南蝙蝠 G [3] CV 可能是 GCV 进化起源的观点. 此外, 不同地区来源的 GCV 其密码子偏爱性存在差异, 并与地理位置之间可能存在一定的关联. 该发现也与石正丽课题组在 ORF1 蛋白 [3] 系统进化的结果一致. 这可能与邻近地区之间蝙蝠的 GCV 相互传播过程有关. 此外, 中国其他省份发现的 GCV 几乎均可在云南找到相似密码子偏性的毒株, 这进一步验证了石正丽课题组关于云南蝙蝠 GCV 可能是 G CV 及其他地区 GCV 重要的天然基因库 [3] 的观点. 参考文献 : [1]JH,SW,GZ,.GCVpd dhmencdpkcg m[j].amjphlcmph,2009,296(3): L372GL383.DOI: /jp [2]MC,PhB,LN,.Sdbh kwkwhwdch[j].pls O,2018,13(4): DOI: /j.p [3]HB,ZL,YX,.Dhp bgdpdwhh [J].PLSPh,2017,13(11): DOI: /j.pp [4]LSKP,WPCY,LKSM,.Sp dmgkchhhb[j]. PNAdSU S A,2005,102(39):14040G14045.DOI: /p [5]NhI,BA M,ThS,.GmG dhwmp,g,dh Mb[J].BMC EB,2015,15(1):174.DOI: /12862G015G0456G4 [6]WL,HJ,JX,.AdbmG hdmbmbx md [J].BMC EB,2014,14(1):262.DOI: /12862G 014G4 [7]SH,LJ,SQ,.Cmphd bphpdhpmgd [J].FMb,2017,8:1419.DOI: /mb [8]MzmdTH,ChkbS.Ghhd ptp53h MmmSp [J].PLS O,2015,10(3): DOI: /j. p [9]MMA.ThmqhGdG [J].S,2003,300(5624):1399G1404.DOI:10.

8 1086 中国人兽共患病学报 2018,34(12) 1126/ [10]CM,VM,CR,.GmGwd dbbc[j].vj,2017,14 (1):115.DOI: /12985G017G0780G [11]WhF.Th'mbd'd[J]. G,1990,87(1):23G29.DOI: /0378G1119(90)90491G 9 [12]BY.Cdph [J].KJP,2017,55(2):175.DOI: /kjp [13]ShpPM,LW.CdEhG hd d[j].ng AdR,1986,14(19):7737G7749.DOI: // [14]KmN,BBC,GbmBD,.RG dbqzg [J].PLSO,2016,11(4): DOI: /jG.p [15]HX,XJ,ChL,.Apmd mdtmg p[j].bmc Gm,2017,18(1):308.DOI: / 12864G017G3704G8 [16]SkN.TGpdp2hG mhhhdna G+C hddp[j].g,1999,238(1):53g58. DOI: /0378G1119(99)00320G0 [17]Sk N.IdpDNA bmp dbmd[j].jme,1995, 40(3):318G325.DOI: /b [18]RPA.Chz NCd whpdm[j].s,2003,300 (5624):1394G1399.DOI: / [19] 赵建岚, 胡莎莎, 罗洪, 等. 中东呼吸综合征冠状病毒结构蛋白与附属蛋白编码基因密码子偏爱性分析 [J]. 病毒学报,2016 (04):404G410.DOI: /j.k.bdxb 收稿日期 :2018G04G23 编辑 : 张智芳 «中国人兽共患病学报» 微信公众号原创素材征稿启事一征文规则 : 1. 题材及字数要求 : 凡与人兽共患病相关的小素材或是摘译国际有影响力期刊的文章都可在我们的微信公众号推送! 只要你有创意有文采有亮点, 稿酬任你拿! 作品字数无具体要求, 但为了便于阅读建议控制在 1000~1500 字以内, 提交文稿时建议附带插图及小视频以增加可读性. 2. 奖励机制 : 微信素材推送不限制时间, 发布篇数暂定每月 6 篇, 入选的稿件当月未发布的将在次月发布, 以此类推. 稿酬发放标准为基本稿酬 + 奖励稿酬. 基本稿酬为 100 元, 奖励稿酬以发布后 7 日内的单篇阅读量进行奖励. 具体规则详询编辑部. 二投稿方式及相关说明 : 1. 投稿作品请使用 wd 文档的格式以附件形式投递至我们的邮箱 hb@p..m 邮件格式 : 微信投稿 + 标题 ( 标题不宜过长,15 字以内最好 ). 提供作者联络方式 : 包括手机号码 QQ 号或微信号. 2. 请勿一稿多投, 所有投稿者保证所投文章为原创首发, 凡抄袭盗稿者一经发现, 永不录用. 三其他事宜 : 1. 投稿者无需支付任何相关费用. 2. 我们有权对全部作品进行任何形式的对外推送. 鉴于公众号的运营形式, 建议供稿者使用笔名. 3. 我们有权在原创稿件的基础上做适当修改与排版.

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