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王昙国
5 years ago
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1 中国临床新医学年月第卷第期课题研究论著外显子测序技术在一个尿道下裂家系基因分析及产前诊断中的应用杨冬艳刘俐伶庞丽红基金项目国家自然科学基金编号年广西研究生教育创新计划项目编号广西卫计委科研课题编号作者单位广西百色市妇幼保健院优生遗传科杨冬艳南宁广西医科大学杨冬艳刘俐伶庞丽红南宁广西医科大学第一附属医院产前诊断与遗传病诊断科庞丽红作者简介杨冬艳女医学硕士主治医师研究方向优生遗传!"#$ %&&! 通讯作者庞丽红女医学博士主任医师研究方向产前诊断与优生遗传!"#$ " ($#) (%&&! 摘要目的采用外显子测序 *+,*&-* # (. 联合." (*/ 测序技术检测个尿道下裂家系的致病基因并对这一致病基因进行产前诊断方法采集先证者及其父母的外周血并提取 01 对先证者的 01 进行性腺疾病相关基因的外显子测序找到致病基因并针对该致病基因对先证者父母的 01 进行." (*/ 验证明确是遗传自亲代对先证者母亲再次妊娠的羊水标本提取 01 采用." (*/ 测序对该致病基因行产前诊断结果先证者 $3.*/ 杂合突变及 2 /( $ 杂合突变组成的复合杂合突变而其表型正常的母亲为 $3.*/ 杂合突变其表型正常的父亲为 /( $ 杂合突变先证者母亲再次妊娠产前诊断结果为 /( $ 杂合突变结论. 联合." (*/ 测序可用于检测尿道下裂家系的致病基因及进行产前诊断且此方法快速准确经济关键词尿道下裂还原酶型基因外显子测序." (*/ 测序产前诊断中图分类号文献标识码文章编号 # #,!" # " $!"# $%&"% $% " % "$" % " %"$ " % # % ( ) %& & 7 *8* 88)* "8) (* *8# (* *, ")3, "#","!#$3-,# (*+,*&-* # (. "." (*/,*&-* # ( / /* "8"$#"(,#,! 7)* */# )*/"$$ ", $* 8* /! / "," 8)*#/ "/* 8, " 01, */**+8/" 8*7)* "8) (* # #83/*$"8* (* *, */* )*01,/*$"8* 8 8)*( ""$#,*",* 8)* /* -/, / " 8)*01, 8)* "/* 8,; "/* 8, */* */##* 3." (*/,*&-* # (8)"88)*3 */* $*"/$3# )*/#8* /!8)* "/* 8,01, */**+8/" 8* /!8)*"! # 8# $-#,"! $*, 8)* / "! 8)*/" ("# " 8)*." (*/(* * ",-,* / /* "8"$#"(,#,! - )*8*/ 3( -,!-8"8# $3.*/ " 2 /( $ )*8*/ 3( -,!-8"8# */* - # 8)* / " 7)* /!"$ )* 83 * 8)*! 8)*/ ", $3.*/ )*8*/ 3( -,!-8"8# " 8)* /!"$ )* 83 * 8)* "/* 8 ", /( $ )*8 */ 3( -,!-8"8# 7)* /* "8"$#"(,#, 8)* / "! 8)*/ ",. 0 1 " 2 /( $ )*8*/ 3( -,!-8"8#.!# * #8)." (*/,*&-* # ( " *-,* 8 *8* 88)* "8) (* # (* *,8 #"(,*"!#$#*,)3, "#", /* "8"$3" 8)*!*8) #,",8 " -/"8*" *!# "$ " ( 3, "#", "$ )"/*- 8",*83 * (* *+,*&-* # (." (*/,*&-* # ( 2/* "8"$#"(,#, 尿道下裂是一种常见的男性泌尿生殖系统先天性畸形由于孕周胚胎发育过程中尿生殖沟未能自后向前在中线完全闭合而造成主要表现为尿道外口位置异常阴茎向腹侧弯曲畸形阴茎背侧包皮堆积尿道海绵体发育不全阴茎勃起疼痛不能站立排尿成年后不能进行正常性生活等给患者

2 )# *,*C -/ "$ 1* $# # "$ *# # * -(-,8D $-!*1-!*/ 身心发育造成不良影响尿道下裂在我国报道发病率为平均出生男婴且呈逐渐上升趋势故引发对其病因学的广泛关注目前多致力于在青春前期尤其是在新生儿期对该疾病进行早期明确的诊断但现阶段仍缺乏进行特异性诊断的检查方法随着二代测序技术的发展使我们能从基因层面了解其致病的原因近年来已有很多对尿道下裂患者. 0 基因突变的研究在中国人群中也有相关报道年首次报道了还原酶型缺乏症其相关基因. 0 基因位于号染色体短臂有个外显子个内含子还原酶是雄激素合成途径中一个关键酶催化睾酮转化为双氢睾酮而双氢睾酮比睾酮的作用要高倍能诱导并保证男性外生殖器的发育由于在怀孕的前三个月男性尿道和外生殖器的形成完全依赖于雄激素因此用雄激素代谢异常来解释下尿道下畸形有其合理性还原酶有两种类型类固醇还原酶和类固醇还原酶类固醇还原酶则主要分布在雄激素的靶组织中与外生殖器发育关系密切其作用下降将影响睾酮转化为双氢睾酮从而影响尿道和外生殖器的形成越来越多的研究证实. 0 基因突变与尿道下裂的发病相关分子遗传学的研究表明. 0 的突变导致了类固醇的类固醇还原酶缺乏这是一种染色体为的性发育障碍的常染色体隐性遗传病受这一突变影响的男性通常表现为双性的外生殖器小阴茎尿道下裂前列腺发育不全隐睾或腹股沟睾丸尿道下裂分为四种类型阴茎头型阴茎型阴囊型会阴型其中阴茎头型及阴茎型为轻型阴囊型及会阴型为重型手术矫正是治疗尿道下裂的唯一方法手术宜在学龄前实施虽然该病可手术矫正但疗效不一特别是重型尿道下裂患者术后有的仍无法进行正常性生活甚至有的仍无法站立小便但尽可能早诊断早治疗以尽早确定社会性别可更大限度减少疾病对患者身心造成的影响目前临床上对尿道下裂的产前诊断研究较少多见于超声下诊断且诊断仍较困难易漏诊及误诊且尚无使用外显子测序联合." (*/ 测序技术对尿道下裂致病基因进行产前诊断的病案报道本研究旨在探讨外显子测序在一个尿道下裂家系基因分析及产前诊断中的应用 )$ 对象与方法 )*)$ 研究对象 $ 先证者男岁家属诉出生后即发现外生殖器发育异常当时检查阴茎短小下弯尿道口位于腹侧阴囊偏小双侧阴囊内可触及睾丸其余系统检查未见异常于年前就医在外院检查激发峰值 <. 明显增加激发后睾酮双氢睾酮明显增加性腺超未见卵巢及子宫染色体检查先证者已于年前行外生殖器矫正术故无法上传尿道下裂的图片术后阴茎仍短小可站立小便先证者父母表型正常父母家系中均无类似病人先证者母亲既往体健孕期检查未见异常孕期无药物及其他不良接触史现先证者母亲再次妊娠中孕要求产前诊断 )*+$ 样本的采集 $ 在先证者父母知情告知并签署送检同意书的情况下分别采集先证者先证者父母外周血各!$ 共份羊水样本的采集术前孕妇排空膀胱取平卧位无菌消毒铺巾后在超引导下经腹部行羊膜腔穿刺术采集胎儿羊水样本!$ )*,$ 外周血 01 的提取采用 =#"(* <$*+# * * 01 >#8 提取试剂盒德国 =#"(* 公司提取血液样本的基因组 01 于? 保存待用 01 提取操作步骤严格按照试剂盒说明书进行 )*-$ 先证者. 测序 01 的浓度测定提取的 01 采用 1" / 超微量分光光度计美国 7)*/! <#,)*/. #* 8## 公司测定其含量样本基因组 01 的 0 范围在目标基因的选取及探针设计参考数据库 A 以及 0 选取了与性腺疾病相关的共计个基因利用 (#$* 8 美国 (#$* 8 公司.-/* 0*,#( 在线设计工具设计针对目标基因外显子及侧翼序列的靶向捕获探针定制专门的目标基因捕获试剂盒基因组 01 文库的构建采用.-/*.*$* 8 7"/(*8 /# )!* 8.3,8*! 目标序列富集试剂盒美国 (#$* 8 公司对性腺疾病患者的 01 样本制备目标基因捕获文库操作步骤严格按照说明书进行杂交和捕获将制备好的基因组 01 文库杂交至靶向特异性捕获文库杂交后使用链霉亲和素标记的磁珠捕获目标分子在通过 2 加入 # *+# (8"( 前每个 01 文库样本必须单独进行杂交和捕获捕获文库与基因组 01 文库之间的比例是捕获能够成功的关键测序前样本处理.-/*.*$* 8* /# )* 01 捕获的文库首先采用带 # *+ 接头引物进行扩增再采用带 # *+ 的 # *+# ( 接头引物进行扩增之后 2-/* 2 进行磁珠纯

3 * (-.*!!中国临床新医学!&%#" 年!" 月!第 ## 卷!第 " 期化& 通过 ap*k对每个?r C 2 R 文库进行定量& D? RE =S > 3 <S > 3 < /R;# 设计引物并合准备测序样本& 成& 对突变位点进行 P*K扩增后进行一代测序验 #]/]$!上机测序及数据分析!按照捕获文库 HIJ 证%将获得序列与之前的序列进行比对& 样本浓度及测序深度要求%应用 I1^UF1a%% 测序 #]]-!羊水染色体核型分析!应用 N显带技术对 E3?公司# 上机测序%操作步骤严格按仪" 美国 e 羊水进行染色体核型分析& 照仪器厂商提供的操作说明进行& 然后%运用 P; 2 C结果 PA?2 &]&]& 软件JIIdhJK软件 [NLH数据库外显子测序 ff? 验证的结果!"# # 先证者 RXFIP数据库# %%% N?; 3数据库进行变异注释& FKHJ& 基因发现 $"%NOJ%P( " J?# " 编先证者外显子测序结果!发现 FKHJ& 基因 $"%NO 码区第 $"% 号核苷酸由 N变为 J% 该突变导致第 J%P "J?#和 $%(NOJ%P" N &%-F # 的复 &&( 号氨基酸由 J 变为 N?# ) 和 $%(NOJ%> 合杂合核苷酸变异& ( " N &%-F # " 编码区第 $%( 号核苷酸由 N变为 J% #]/](!先证者父母 HIJ的验证!针对先证者 1F 该突变导致第 &%- 号氨基酸由 N 变为 F # ) 的复检测的致病基因 FKHJ& 对先证者父母的 HIJ进合杂合核苷酸变异%该突变均为错义突变& "&#先证行 F? 验证%在人类基因组数据库 N?+?i 中获者父亲 FKHJ& 基因发现 $"%NOJ%P "J?#& 得上述先证者的突变位点基因序列%在引物设计网 $%(NOJ%> "-# 先证者母亲 FKHJ& 基因发现站 P 3," A >! SS? > >? 3D? RE =S " N &%-F # & 有报道上述突变可导致蛋白质功能 > 3 <S > 3 < /R; # 设计引物并合成& 对突变位点受到影响%且已有研究证明该变异与男性假两性畸进行 P*K扩增后进行一代测序验证%将获得序列与形雌激素合成或作用紊乱非综合征尿道下裂尿之前的序列进行比对%排除掉二代测序中假阳性的道下裂相关 (#&%#-) & 该先证者的复合杂合突变一个位点& F? 验证结果! 该先证者的父亲 FKHJ& 遗传自其父亲%一个遗传自其母亲%父母均为杂合基因 $"%NOJ%P" J?# 杂合突变%其母亲子%符合常染色体隐性遗传方式" 见图 #%&# & 明确 $%(NOJ%P" N &%-F # 杂合突变%父母均为杂致病基因后%对先证者母亲再次的妊娠羊水标本针合子& 说明该先证者的复合杂合突变一个遗传自其? 测序%产前诊断结果为对 FKHJ& 基因进行 F 父亲%一个遗传自其母亲& $"%NOJ%P" J?# & 杂合突变%家系分析 AF产前诊断显示该突变点遗传自其表型正常的父亲& 羊水细胞 #]]#!羊水 HIJ的提取!应用 Ue JIN1I细胞基的染色体核型分析结果为 /$%^I& 遗传咨询!根据产因组 HIJ提取试剂盒抽提羊水细胞 HIJ& HIJ提前诊断结果%同时结合家系资料%告知此次妊娠胎儿与取操作步骤严格按照试剂盒说明书进行& $"%NO 先征者的父亲同样携带了 FKHJ& 基因的 #]]&!羊水 HIJ的 F? 测序!在人类基因组数 J%P" J?# 杂合突变%可继续妊娠& 之后随据库 N?+?i 中获得上述先证者的突变位点基因序访至新生儿出生%&%#" 年 & 月在当地医院足月顺产列%在引物设计网站 P 3,"A >! SS? > >? 3 一外观正常男性婴儿& 结合病史该家系见图 -& 图 #!尿道下裂家系 FKHJJ& 基因 A &!-#(/-. 位置突变情况图

4 * (/%* *A? D g ; E? ; WI =*? L R? %JE ED &%#"%h; E3##%IE3X "!! 图 &!尿道下裂家系 FKHJJ& 基因 A &!-#(//$" 位置突变情况图生殖结节中出现肿胀和折叠%形成阴茎和阴囊& 由于基因突变而导致!2 类固醇还原酶 & 作用下降% 降低了 H[U的水平%从而导致了尿道下裂等一系列生殖系统发育异常的临床表型& 如外生殖器可表现为外阴性别不明%阴茎短小%阴囊壁裂%会阴型尿道下裂%尿生殖窦%盲会阴窝类似于阴道$内生殖器可表现为 j; W W? 分化%无苗勒管结构%隐睾%前列腺小& 此类患者虽然青春期男性化表现%但血浆双氢睾酮降低%H[U形成缺陷%血浆睾酮正常或增多2 还原酶2 & 酶缺乏$遗传检测!染色体核型性染色体为 ^)组型%基因分析可发现 FKHJ& 基因突变& 图 -!尿道下裂家系图 DC据报道在 FKHJ& 中有超过 $ 个突变%包括?等 (##) 对 & 例点突变删除和插入突变 (#%) & j D讨论中国尿道下裂的男孩进行的研究证明 FKHJ& 基因突 DA近年有关尿道下裂致病原因的研究很多%总的变的发病率为 #-] k& 共有四个突变位点!> K&&(a% 说来其致病原因主要包括两个方面!遗传因素和环 > N&%-F%>K&/$a和 >_&%P& >K&&(a和 >_&%P 境因素& 遗传因素包括染色体异常和基因突变& 染这两个位点可能是中国人中 FKHJ& 基因突变的热色体异常又包括性染色体异常和常染色体异常$基点%指出 FKHJ& 基因突变与中国男孩的尿道下裂因因素主要分为三类!性别决定基因决定性腺分化的相关性较大& 由于 FKHJ& 基因是假阴道会阴阴和发育的基因和男性尿道发育相关基因& 有研究发囊型尿道下裂的致病基因%而该基因为常染色体隐现该病的患者如果 )染色体" FK)# 的性别决定区性遗传" JK# & 对于该类遗传方式来说%复合杂合突域正常%性腺是睾丸%则主要的基因突变发生在雄性变" 即双重杂合子# 可能是导致发病的变异& 激素受体" JK# 和 FKHJ& 基因上& 另外%FKHJ& DD本研究是应用外显子测序技术对先证者进行基因编码的人类的!2 类固醇还原酶 & 有一种组织与性腺疾病相关的共计 #$/ 个基因的所有外显子进特异性的表达方式%主要存在于内外生殖器官的基行测序%找出致病基因后再对先证者父母进行一代质细胞中& 在胚胎发生的过程中%这种酶通过催化测序 F? 验证明确致病基因遗传自亲代%当先证睾酮" U# 转化为!2 二氢睾酮" H[U# 起作用%在男性者母亲再次妊娠时%抽取羊水细胞%应用 F? 测表型的形成中扮演着重要的角色& H[U的作用是序对胎儿进行产前诊断& 本家系研究发现 FKHJ& 促进男性尿道和前列腺在泌尿生殖窦的形成%并在基因突变是 $"%NOJ" 编码区第 $"% 号核苷酸由

5 中国临床新医学年月第卷第期变为及编码区第号核苷酸由变为先证者为上述突变的复合杂合突变其突变的个位点分别遗传自其父母其父母均分别为单个位点的杂合突变携带者由于本例研究所检测. 0 基因的上述两个杂合突变的致病性均已有文献报道与男性假两性畸形雄激素合成或作用紊乱非综合征型尿道下裂尿道下裂相关本研究家系的先证者染色体核型为激发峰值 <. 明显增加激发后睾酮双氢睾酮明显增加与该基因突变引起的症状相符而位点的致病性与先证者的表型相符因此上述两个突变位点考虑为该家系的致病位点研究发现上述两个突变位点均位于. 0 基因的第外显子上已有周李等人研究发现例尿道下裂患者. 0 基因的个突变亦均位于第外显子表明. 0 基因第外显子很可能为中国人突变的热点区域." (*/ 测序属于经典的一代测序主要用于检测单基因的点突变小缺失和小插入等准确性高而. 是一种在二代测序基础上建立的新型的基因组分析技术外显子组测序技术是以外显子在基因组中为目标捕获外显子区域的 01 同时通过第二代测序技术行测序分析的外显子即蛋白编码序列只占基因组序列的但却包含了约的人类致病突变外显子测序可以更经济快速地确定致病基因及突变位点目前. 广泛应用于单基因疾病的分子诊断上已发现了数百种遗传病的致病基因,*-$ 临床上对尿道下裂的产前诊断研究较少目前尚无使用外显子测序联合." (*/ 测序技术对尿道下裂致病基因进行产前诊断的病案报道本研究首先应用测序范围广而深的. 来确定尿道下裂家系中先证者的致病基因再结合准确性高的," (*/ 测序方法针对该致病基因对家系其他成员及胚胎进行验证和产前诊断此方法切实可行且对出生缺陷起到了精准诊断及有效干预的作用并为今后临床上遗传病的病因诊断及产前诊断提供参考方法参考文献 C# * )* (C*8"$.* -$"/8/*, )3, "#", /* "$* * " " 8 /,", #"8* #8) #8#, -8)*",8 )# "-/# ( C #/8) 0** 8, *,2"/8 $# $7*/"8 $ "# *22/* "$* * )3, "#",# -/ *" - 8/#*,#,#8# /*",# ( C-/ / $ "#! - 2)#$#*/82 "!!", *8"$2)* 83 # "$# $ (# "$ "! $* -$"/)*8*/ (* *#83 /*- 8",**# #* 3" *+8*,# * # 8*/ "8# "$*+ */#* * "8#* 8,CC $# /# $ *8" "#! - 2)#$#*/82 "!!", *8"$ */ #/#$# "8# # * /,!"3)#*"/*- 8",**# #* 3 /* /8 8)/** *. 0 (* *!-8"8#,CA 8C / $ " ( #= - C*8"$ -8"8# " "$3,#, # * " #"8*(* *, # )# *,* "8#* 8, #8) )3, "#",C-/C -! * *8 1#* ) - = " C*8"$<# * *$!-8"8#,. 0 - # *#()8 )# *,* "8#* 8, #8) #, /*/,,*+* *$!* 8 C $ -! * /."!8" # " "# ),) 2> *8"$ 7 =" 7 /* *"8 $3! / )#,!,8*/ # "$ )"/*- 8",*83 * A(* *" 3, "#",/#,E # 1 /8) A #" )#$/* C *8" * * >"$"12)#$#*/82 ",E#.*8"$ 3, "#",# 8*/" 8#,* 8 ** * #/!* 8" (* *8#, C $ *$ /# $ ) * "!,!* *8"$ #, /*/,*+-"$* *$!* 8/*,-$8# (/!" *$! "$*$#!-8"8#.*/ 2)* # 8)*,8*/ # /*- 8",*83 *. 0 (* * C $ * *8 *!# * <- )" ( = =-. /*$"8# " / (* /* * 8 /". 0 (* *!-8"8#, #8) *#"8/# )3, "#",# 0.0 )#$/* C * *8 $ *, " ( 0 ( " ( *8"$ -8"8# " "$3,#, 8)*. 0 ".< (* *,# )# *,* 3, #8) )3, "#", CC2*#"8/ /# $ *8" # /8.# * E*/ #$* /# ( *8"$1 #, 8 #,# ($*,8/" /!"8# " "$3,#, 8)* "$ )"/*- 8",*83 * (* * / 8)*#"(,#, "$ )"/*- 8",**# #* 3 CC $# /# $ *8" " 8 2 D#$ )#,< ) * *8"$ -8"8#, 8)*/*- 8",* 83 * (* *# *#()8 *+# " "8#* 8,/!,#+#*/* 8 *#(/**, #8) /*- 8",* *# #* 3 C $# /# $ 周李梅骅刘唐彬等先天性尿道下裂与. 0 及. 基因突变关系研究 C 中华医学遗传学杂志 <"/$ C "E *8/# E >*8"$ ) $**+!*,*&-* # (# "!#$#"$ "/E#, #,*",* CC 1*-/ $." E 8". /#(- )#>7,"E" *8"$ ) $**+!*,*&-* # (,8-3 8)3/ 8/ #,* /*8# ( #8-#8"/3"*!",CC $# /# $ *8" > "E. C- ( ) *8"$ $# # "$ ) $**+!*,*&-* # (# *"/$3,*8#"*8*, "8#* 8, C0#"*8*, *, $# 2/" 8 收稿日期本文编辑黄晓红

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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