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1 第 3 卷第 6 期 018 年 11 月 西安交通大学学报 ( 医学版 ) JouoX JoogUvsy ( MdSs) Vo.3No.6 Nov.018 基础研究 二甲双胍介导的增强 CD8 阳性 T 细胞肿瘤浸润与增加的肿瘤灌注的相关性 王吉昌 1, 李雄雄, 李光月 3 ( 西安交通大学第一附属医院 :1. 血管外科 ;. 乳腺外科 ;3. 科技部, 陕西西安 ) 摘要 : 目的探讨二甲双胍产生的增强 CD8 阳性 T 细胞肿瘤浸润作用与增加的肿瘤灌注之间的相关性 方法 6~ 8 周雌性小鼠乳腺脂肪垫接种 4T1 细胞后 d, 随机分为对照组及二甲双胍干预组 提取标本前 15m, 经尾静脉注射 TRITC 标记的 L 溶液, 提取标本并制备成冰冻切片后行 CD8 抗体荧光染色, 用激光共聚焦显微镜采集结果 用 Spm 分析方法观察相关性 结果二甲双胍干预组的 CD8 阳性细胞浸润数量 [(18±6.) 个 /mm vs. (67.±.) 个 /mm ] 及 L 阳性信号面积 [( ±5865.0) 像素 / μ m vs.(1033.0±4434.0) 像素 / μ m ] 显著高于对照组 (P<05) 两组的 CD8 阳性 T 细胞浸润数量与 L 阳性信号面积均呈线性相关 ( 对照组 :R= 884,P=007; 二甲双胍组 :R=8,P<001) 结论 细胞肿瘤浸润密切相关 关键词 : 二甲双胍 ;CD8;CD8 阳性 T 细胞 ; 肿瘤灌注 ; 线性相关 增加的肿瘤灌注与二甲双胍介导的增强 CD8 阳性 T 中图分类号 :R73 文献标志码 :A DOI:1765/jdyxb Mom-mddhmohooCD8 Ts oumosssodwhvdumoboodpo WANGJ-hg 1,LIXoḡxog,LIGuḡyu 3 (1.DpmoVsuSugy;.DpmoBsSugy; 3.DpmoSdThoogy,ThFsAdHospo X JoogUvsy,X ,Ch) ABSTRACT:Objv Tovsghoobwmom-dudshumb ocd8 Tsdohdmom-mddvooumoboodpo.Mhods 4T1mubsswohoopyjdohpdoh4hbsoBALB/Cm.N dys,h m wdomy dvddoh ood mom goups.f m bo xo,tritc-ojugdwsjdohvohm.th,hxdumos wppdoozsos,whhwhsdwh-cd8bodyouhmmuouos do.spmooysswspomdoobsvhoobwhpms.rs BohhooCD8 Ts [(18±6.)/mm vs.(67.±.)/mm ]d-pd [( ±5865.0) pxs /μm vs.(1033.0±4434.0) pxs /μm ]wsgyhgh momdgouphhudgoup.ibohgoups,humbohdcd8 Tswsy odwh-pd (oo:r =884,P =007;mom:R =8,P <001). Coo Isdumopososyodwh mom-dudshoo CD8 Tsohumo. KEY WORDS: mom ;CD8;CD8 T;umopo;oo 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ,No ), 陕西省自然科学基金支持项目 (No.016JM815) SuppodbyhNoNuSFoudooCh(No ,No )dhNuSFoudoo ShxPov(No.016JM815) 通信作者 : 李光月, 助理研究员.E-m:gymoo@16.om 优先出版 :hp://ks.k./kms/d/61.13.r hm( ) hp://yxxb.xju.du.

2 8 CD8 阳性 T 细胞是人体 T 淋巴细胞群中非常重要的一群细胞, 在介导机体细胞免疫中发挥极其重要的作用 目前, 在众多肿瘤治疗的研究方向中, 以增强 CD8 阳性 T 细胞杀伤肿瘤细胞为基础的免疫疗法被认为是一种可能治愈肿瘤的方法 而抗肿瘤免疫中, 只有当 CD8 阳性 T 细胞浸润到肿瘤内部才可能通过接触性杀伤导致肿瘤细胞凋亡 研究表明,CD8 阳性 T 细胞向包括肿瘤在内的组织内浸润的程度与肿瘤的灌注情况存在密切关系 本课题组在前期研究中发现, 抗代谢异常药物二甲双胍可增加恶性肿瘤内部的血液灌注, 从而抑制肿瘤的严重缺氧 近来有研究发现, 二甲双胍可以增加 CD8 阳性 T 细胞在肿瘤内的浸润数量 而关于二甲双胍介导的增强 CD8 阳性 T 细胞浸润与增加的肿瘤灌注是否有关, 目前仍不十分清楚 本研究通过检测原位小鼠 4T1 乳腺癌中 CD8 阳性 T 细胞的浸润数量 肿瘤灌注情况及两者间的相关性, 探讨二甲双胍介导的增加肿瘤灌注与增强 CD8 阳性 T 细胞浸润之间的关系 1 材料与方法 1.1 细胞 动物及试剂 6~8 周雌性 BALB/C 小鼠 0 只, 体质量 16~0g, 全部由西安交通大学医学动物实验中心提供 本研究所涉及动物实验通过西安交通大学第一附属医院伦理委员会审核 兔抗小鼠 CD8 抗体购自上海生工生物工程有限公司 ;TRITC 标记的 L 由 VoLbs 公司提供 ;F 标记的山羊抗兔二抗购自 Ivog 公司 ;Dp 核复染试剂购自 Sgm 公司 ;40g/L 多聚甲醛及 PBS 购自西安壮志生物有限公司 ; 胎牛血清蛋白及 DMEM 培养基购自 Gbo 公司 ; 实验用二甲双胍粉剂及 To X-100 购自 Sgm 公司 ;4T1 小鼠转移性乳腺癌细胞购于空军军医大学细胞库 ;OCT 冰冻标本包埋剂购自日本樱花公司 1. 细胞准备 4T1 小鼠乳腺癌细胞使用含有 100mL/L 胎牛血清的 DMEM 进行培养 并连续传代 3 代后行分皿培养 当细胞生长融合接近 80%~ 0% 时, 用 PBS 充分冲洗后, 胰蛋白酶消化细胞 镜下观察视野内多数细胞变圆并开始脱离培养皿底板时, 终止消化 离心后弃去上清, 并使用 PBS 冲洗后再次清洗后离心 弃去 PBS 上清后使用不含胎牛血清蛋白的 DMEM 培养基重悬细胞, 经细胞计数后将悬液中细胞密度调整至 /ml, 置于冰上备用 1.3 原位乳腺癌模型构建及动物分组原位接种细胞前用移液器充分重悬细胞 用胰岛素针穿刺 BALB/C 小鼠的第四对乳腺的脂肪垫, 并注射细胞悬液 100μL 接种后第 天平均肿瘤体积达到 50mm 3 时, 将 0 只小 鼠随机分为对照组和二甲双胍组 对照组小鼠给予普通饮用水, 干预组小鼠给予含有二甲双胍的饮用水 小鼠平均饮水量为 3mL/d 二甲双胍干预剂量为 50 mg/kg 1.4 血管灌注实验及标本准备连续干预 周后, 使用 10g/L 戊巴比妥钠麻醉小鼠 后经尾静脉注射 TRITC-L 共约 100μL 15m 后过量注射戊巴比妥钠处死小鼠后, 经心脏灌注 40g/L 多聚甲醛约 50mL, 完整提取肿瘤组织, 并于 40g/L 多聚甲醛中避光固定约 4h 后使用 00~300g/L 蔗糖溶液对标本行避光脱水后吸干, 并使用 OCT 包埋剂包埋标本, 后置于 -80 备用 于 - 下进行切片, 厚度约 6μm, 于 -80 避光保存备用 1.5 免疫荧光染色冰冻切片经 PBS 清洗和 ml/l ToX-100 溶液透膜, 再次清洗后用 50g/LBSA 于 37 下封闭切片 30m 甩掉 BSA 后滴加 CD8 抗体 ( 工作液稀释比为 1 0), 于 4 下孵育过夜后, PBS 清洗并滴加 F 标记的荧光二抗, 室温孵育 1h, 清洗并复染 Dp 充分清洗切片后, 使用盖玻片及抗荧光淬灭剂封片 避光 37 下烘干 1h,L 共聚焦荧光显微镜下记录染色结果 1.6 CD8 阳性 T 细胞浸润程度及灌注程度测定荧光共聚焦显微镜下连续观察 10 个视野 ( 同时记录红色信号的灌注图像 ), 记录每个视野中的 CD8 阳性 T 细胞 ( 绿色荧光 ) 的数量, 并取平均值作为每一个标本的平均 CD8 阳性 T 细胞浸润数量, 并换算计量为数量 /mm 灌注情况的测定: 首先取与测量 CD8 阳性 T 细胞浸润数量视野相对应的红色荧光信号视野 使用 ImgJ 软件测量红色 L 阳性信号的面积,10 个视野的平均值作为每个标本的 L 阳性信号面积 ( 即肿瘤血管的灌注面积 ), 并最终换算为 μm 的计量形式 1.7 统计学分析使用 GphpdPsm5 进行统计学分析 比较计量资料之前, 行 Lv 方差齐性检验 两组间的计量资料采用独立样本的 检验进行分析 每一标本的 CD8 阳性 T 细胞浸润数量及相应的 L 阳性信号面积用于进行相关性分析, 采用 SpmCoo 方法进行统计学分析 P < 05 为差异有统计学意义 结果.1 二甲双胍增加 CD8 阳性 T 细胞的浸润数量对照组和二甲双胍干预组肿瘤组织内 CD8 阳性 T 细胞 ( 绿色信号 ) 数量差异有统计学意义 (=4.707, P<001) 两组结果的 Lv 方差齐性检验 P> 05, 提示方差齐 结果分析显示, 二甲双胍干预组 hp://yxxb.xju.du.

3 6期 王吉昌,李雄雄,李光月.二甲双胍介导的增强 CD8 阳性 T 细胞肿瘤浸润与增加的肿瘤灌注的相关性 小鼠 4T1 乳 腺 癌 肿 瘤 组 织 内 浸 润 的 CD8 阳 性 T 细 胞数量 [( 1 8±6. )个/mm ]显 著 高 于 对 照 组 [( 67. ±. )个/mm ](图 1 图,表 1),这提示持 83 续二甲双胍干预明显增加了小鼠乳腺癌中的 CD8 阳 性 T 细胞的浸润数量 图 1 对照组 4T1 肿瘤内部仅可见少量浸润 CD8 阳性 T 细胞及 L 灌注区域 F 1 O umb o CD8 T sd -p d w oud hu d4t1 g. ysm 绿色荧光: CD8 抗体染色;红色信号:预先经心脏灌注的 L ;蓝色: Dp 核染色 标尺: 100μm. 二甲双胍可增加 4T1 肿瘤灌注 对照组及二甲 双胍干预组4T1 肿瘤内部的 L 阳性信号面积差异 两组数据方差齐 有统计学意义( =3. 4 4, P = 0 0 3) 性( L v 检验 P> 05) 二甲双胍干预组4T1 肿瘤 内的 L 阳性面积[( ± )像素/μm ] 显著 高 于 对 照 组 [( ± )像 素/μm ] (图 1 图,表 1) 这提示二甲双 胍 可 增 强 肿 瘤 血 液 灌注 图 二甲双胍组增加 4T1 肿瘤内部的 L 灌注区域及浸润的 CD8 阳性 T 细胞数量 F M o m dm s o s d -p d d h dcd8 T s s d4t1 g. 白 色箭头:伴随血流灌注进入肿瘤内部的 CD8 阳性 T 细胞;绿色荧光: CD8 抗体染色;红色信号:预先经心脏灌注的 L ;蓝 色: Dp 核染色 标尺: 100μm 表 1 各组 4T1 肿瘤内部 CD8 阳性 T 细胞浸润数量及被 L 灌注的信号面积 Tb. 1 Numb o CD8 T s d h4t1 ( d -p d umo hg oup x±s) 参数 CD8 T s( /mm ) 对照组 二甲双胍干预组 P 67. ±. 1 8± ± ± L 信号( μm ) CD8 阳性 T 细 胞 通 过 血 流 进 入 肿 瘤 内 部 二 甲双胍 干 预 组 的 4T1 肿 瘤 中,观 察 显 示 有 3 个 CD8 阳性 T 细胞与红 色 L 信 号 共 定 位;其 中 有 1 个 细胞的一侧 已 经 突 出 L 信 号 的 边 界 以 外,提 示 该细胞可能正在从 灌 注 血 管 内 向 肿 瘤 实 质 内 发 生 迁 移(图 ) 这提示外周血中的 CD8 阳性 T 细胞可通. 4 肿 瘤 灌 注 面 积 与 CD8 阳 性 T 细 胞 浸 润 数 量 呈 对 CD8 阳 性 T 细 胞 浸 润 数 量 及 L 线性相 关 灌注面 积 进 行 Sp m Co o 分 析 两 组 的 CD8 阳性 T 细胞浸润数量与 L 灌注面积均呈线 性相关 (图 3) 二 甲 双 胍 干 预 组 的 相 关 系 数 R 为 884, P = 007;非干预组的相关系数 R 为 8, P < 001(图 3) 3 讨 论 二甲双胍是临床治疗 型糖尿病的传统药物,其 良好的耐 受 性 及 低 毒 性 一 度 使 其 成 为 首 选 治 疗 [1] 随着研究的不断深入,科学家们在临床前实验研究中 过血流灌注进入肿瘤内部并最终进入肿瘤实质,进而 逐渐发现,二 甲 双 胍 具 有 显 著 抑 制 肿 瘤 生 长 的 作 用 发挥杀伤作用 此外,基于人群的数据研究证实:服用二甲双胍的糖尿 //yxxb. h x u. du. p: j

4 84 图 3 4T1 肿瘤内部的 CD8 阳性 T 细胞浸润数量与 L 灌注面积呈线性相关 Fg.3ThumboCD8 Tsdh4T1wsyodwh-pd A: 对照组 ;B: 二甲双胍干预组 SpmR 为相关系数 [] 病患者多个系统的肿瘤发生率低于未服用组患者 但是, 有关二甲双胍发挥抗肿瘤的具体作用仍不十分清楚 本研究通过构建原位小鼠乳腺癌模型并用二甲双胍持续干预 周, 发现可增加肿瘤的灌注水平及肿瘤内 CD8 阳性 T 细胞的浸润水平 大量研究数据已证实, 肿瘤内 CD8 阳性 T 细胞的浸润数量与患者 [3] 的预后密切相关 因此, 本研究结果对目前仍不十分清楚的二甲双胍抗肿瘤机制是一个重要补充 本课题组前期研究中已发现 : 小剂量二甲双胍 [<100mg/(kg d)] 仅仅产生轻微的抗肿瘤作用 由于 CD8 阳性细胞的主要作用在于直接杀伤肿瘤细胞, 因此, 本研究不适合用小剂量进行干预观察, 而所使用的剂量 [50mg/(kg d)] 是根据物种药物剂量换算公式 ( 根据体表面积 ) 换算所得 该剂量与临床剂量相匹配, 从而能更好用于阐明二甲双胍的抗肿瘤机制, 并使研究结果更具外推性 CD8 阳性 T 细胞是机体对抗肿瘤进展的一种重 [4] 要因素 CD8 阳性 T 细胞主要通过接触性杀伤对肿瘤发挥作用, 因此, 肿瘤组织内的 CD8 阳性 T 细胞的浸润数量对于机体抗肿瘤作用至关重要 近来有研究证实 : 二甲双胍可通过增加肿瘤内的 CD8 阳性 [5-6] T 细胞的浸润数量而发挥抗肿瘤作用 本研究再次证实上述结果, 并且进一步通过相关性分析的结果显示, 增加的 CD8 阳性 T 细胞的浸润数量与增加的肿瘤灌注之间存在密切相关性 事实上, 在机体处于免疫激活状态时, 比如在肿瘤发生发展中, 大量 T 细胞在胸腺中成熟后进入血液, 并随血流进入病灶从而 [7] 发挥免疫作用 因此, 在二甲双胍干预下产生的肿瘤灌注的改善可使更多的外周 CD8 阳性 T 细胞浸润到肿瘤内部 本研究发现的二甲双胍增加肿瘤血流灌注可能具有更重要的意义 目前比较认可的观点是肿瘤在早期 [8-] 生长时就出现缺氧 缺氧可以通过抑制肿瘤免疫 [10] 介导放化疗抵抗的机制以进一步促进肿瘤进展 因此, 二甲双胍通过增加肿瘤灌注带来的治疗意义不应该仅仅被局限于增加 CD8 阳性 T 细胞浸润 本课题组之前的研究发现, 二甲双胍具有抑制肿 [11] 瘤异常血管生成的作用 而对于二甲双胍是否对肿瘤血管的功能和结构状态产生影响则未进行深入报道 本研究的结果至少说明二甲双胍具有增强肿瘤血管功能状态的作用 据报道, 血管功能与血管的成熟度密切相关, 即与血管内皮层被血管平滑肌细胞 [1-13] 包被的程度有关 而且课题组新近发表的文章已经证实, 二甲双胍具有改善肿瘤血管成熟度的作 [14] 用, 这也提示是血管功能得到改善的原因 综上所述, 本研究结果提示, 二甲双胍介导的增强 CD8 阳性 T 细胞肿瘤浸润的作用与其产生的改善肿瘤灌注的作用密切相关 参考文献 : [1]FORETZ M,HÉBRARDS,LECLERCJ,.Mom hbshpguoogss mdpdyoh LKB1/AMPKphwyvdshpgys [J].JCIvs,010,10(7):355. []TSENGCH.MomdsophgskTwsps whyp dbs m[j].oog, 017,8(1): [3]MAHMOUDSM,PAISH EC,POWEDG,.Tumo-gCD8 ymphoyspdouombs [J].JCOo,011,(15): [4]KLEBANOFFCA,GATTINONIL,RESTIFO NP.CD8 T- mmoyumommuoogydmmuohpy [ J].ImmuoRv,006,11(1):14-4. [5]SCHOTTS,BIERHAUSA,SCHUETZF,.Thpu somombs:ivovmohmmysm? [J].CImmuo,Immuoh,011,60 (): ( 下转第 838 页 ) hp://yxxb.xju.du.

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