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而缮褚
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1 32 卷 06 期 Vol.32,No.06 DOI: \j.issn.1001G G0575 草业科学 PRATACULTURALSCIENCE /2015 牛奎举, 俞玲, 李玉珠, 马晖玲. 甘肃野生草地早熟禾原生质体分离与培养研究 [J]. 草业科学,2015,32(6):927G934. NIU KuiGju,YULing,LIYuGzhu,MA HuiGling.ProtoplastisolationandcultureofwildKentuckyBluegrassinGansu[J].PratacG ulturalscience,2015,32(6):927g934. 甘肃野生草地早熟禾原生质体分离与培养研究牛奎举, 俞玲, 李玉珠, 马晖玲 ( 甘肃农业大学草业学院草业生态系统教育部重点实验室中 - 美草地畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃兰州 ) 摘要 : 建立高效的原生质体再生体系是通过原生质体融合技术培育草地早熟禾 (Poapratensis) 新品种的重要前提. 以甘肃陇西野生草地早熟禾 (LX) 和定西野生草地早熟禾 (DX) 胚性愈伤组织为材料, 探索其原生质体游离和培养条件. 结果表明,LX 和 DX 原生质体分离的最佳酶液组合为 1.5% 纤维素酶 RG10+0.5% 果胶酶 YG % 离析酶 RG10+0.3% 崩溃酶 ; 酶解时间为 16h;LX 原生质体最适宜的甘露醇浓度为 0.6 mol L -1, 而 DX 原生质体的最适甘露醇浓度为 0.5mol L -1.LX 原生质体的产量最高可达个 g -1,DX 可达个 g -1.DX 原生质体培养的最适密度为个 ml -1, 最适 2,4GD 浓度为 1.0 mg L -1, 此时,DX 原生质体再生细胞的分裂频率可达 9.56%, 植板率为 4.62%. 关键词 : 野生草地早熟禾 ; 原生质体 ; 分离 ; 培养中图分类号 :S ;Q943.1 文献标识码 :A 文章编号 :1001G0629(2015)06G0927G08 ProtoplastisolationandcultureofwildKentuckyBluegrasinGansu NIU KuiGju,YU Ling,LIYuGzhu,MA HuiGling (PrataculturalColege,GansuAgriculturalUniversity,KeylaboratoryofGrasslandEcosystem,Ministryof Education,SinoGU.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China) Abstract:Inthepresentstudy,theconditionsofprotoplastisolationandculture wereexplored using embryogeniccalusfrom wild KentuckyBluegrassvariety Longxi (LX)and Dingxi (DX).Theresults showedthattheoptimalconditionsforprotoplastisolationwasenzymecompositionincluding1.5% CeluG laserg10+0.5% PectolaseYG23+1.0% MacerozymeRG10+0.3% Driselasewith16hdigestion.TheoptiG malmannitolconcentrationwas0.6mol L -1 forlxprotoplastand0.5mol L -1 fordxprotoplast.the highestyieldofprotoplastswas number g -1 forlxand number g -1 fordx.after purification,dxprotoplastswereculturedinkm8pliquidmedium.with number ml -1 plating densityand1.0mg L -1 2,4GD,DXprotoplastshadhighestceldivisionfrequencyof9.56% andplating eficiencyof4.62%. Keywords:wildKentuckybluegrass;protoplast;isolation;culture Correspondingauthor:MA HuiGling EGmail:mahl@gsau.edu.cn 收稿日期 :2014G12G18 接受日期 :2015G03G25 基金项目 : 国家自然科学基金草地早熟禾种间体细胞杂交的研究 ( ) 第一作者 : 牛奎举 (1991G), 男, 甘肃通渭人, 在读硕士生, 研究方向为草种质资源及育种.EGmail:niukuiju@163.com 通信作者 : 马晖玲 (1966G), 女 ( 回族 ), 甘肃兰州人, 教授, 博士, 研究方向为牧草及草坪草育种.EGmail:mahl@gsau.edu.cn

2 928 PRATACULTURALSCIENCE(Vol.32,No.06) 06/2015 草地早熟禾 (Poapratensis) 作为一种优良的冷地型草坪草种, 在温带地区使用非常广泛. 但由于其抗旱性差易感病, 且我国的草种几乎全部靠进口, 引进品种难以很好的适应我国当地环境, 使得草地早熟禾的应用受到严重限制. 我国分布有大量草地早熟禾的野生种和近缘种, 且具有许多优良性状 [1G2], 是良好的育种材料. 利用育种技术来培育具有优良性状的草地早熟禾新品种是解决以上问题的途径之一. 由于草地早熟禾是兼性无融合生殖植物, 有些品种的无融合生殖率高达 98% [3], 故利用常规杂交在品种选育和性状改良方面存在一定的困难和局限性. 植物原生质体融合技术可以针对性地将早熟禾野生种中的优良性状向栽培种中转移, 特别是对于转移那些多基因控制的性状而言, 原生质体融合技术将是一条捷径. 植物原生质体融合技术是以原生质体的分离和培养为基础的. 目前, 国内外已建立起一些草地早熟禾栽培品种的原生质体再生体系.1988 [4] 年,VanderValk 等建立了 Kimono 与 Merion 这两个草地早熟禾品种的悬浮细胞原生质体再生 [5] 体系 ; 随后,Nielsen 等对草地早熟禾 GeroniG mo 进行原生质体培养, 得到了 127 株再生植株 ; [6] 马晖玲等和赵小强等分别建立了草地早熟禾 MidnightⅡ 和 Nuglade 愈伤组织的原生质体培养体系, 并获得了再生植株. 然而, 不同品种的原生质体分离和培养条件差别较大 [5G6].Vander [4] Valk 等和 Nielsen [5] 等选用悬浮细胞系作为原生质体的分离材料, 而由悬浮细胞分离得到的原生质体, 存在其再生植株发生染色体数目和倍性变化的概率较大的问题. 另外, 在前期的研究中曾 [6] 尝试将马晖玲等和赵小强等建立的草地早熟禾商用品种原生质体的分离和培养体系应用于本研究, 但所得原生质体的产量很少, 不能满足后续试验的要求. 因此, 本研究以具有较强抗旱性的 [8] 陇西和定西野生草地早熟禾的胚性愈伤组织为材料, 对其原生质体分离和培养条件进行一定的探索, 以期为进一步开展草地早熟禾商用品种与野生种的原生质体融合奠定基础. 1 材料和方法 1.1 供试材料及胚性愈伤组织的获得以陇西野生草地早熟禾 (LX) 和定西野生草地早熟禾 (DX) 的种子为材料, 诱导胚性愈伤组织. 愈 [9] 伤组织的诱导和培养条件及方法同俞玲和马晖玲的报道, 愈伤组织每 25d 左右继代一次, 每次继代时挑选胚性愈伤组织 ( 淡黄色颗粒状质地坚硬 ), 连续继代 7~8 次后, 愈伤组织生长能力明显提高, 此时, 显微镜下可观察到细胞多为小椭圆形细胞, 其大小均一细胞质浓分裂旺盛, 并且细胞排列紧密, 这种愈伤组织即为胚性愈伤组织. 1.2 原生质体分离和纯化取继代培养 8~10 次, 且在新鲜培养基上生长 10d 左右的胚性愈伤组织约 1.0g, 放入 10 ml 酶 [6] 液中. 酶溶剂同马晖玲等和赵小强等的报道, 为 CPW 溶液,pH 为 5.8, 经 0.22μm 微孔滤膜过滤灭菌. 酶解混合物静置 30min 后, 置于 25 黑暗条件 50r min -1 的恒温摇床上震荡酶解 16h. 经过一定时间的酶解, 将酶液混合物经无菌尼龙网筛 (76 40μm) 过滤, 滤液经常温低速离心机离心 8 min(500r min -1 ), 收集原生质体, 去掉上清液, 用清洗液 (CPW 溶液 +0.6 mol L -1 甘露醇 ) 重新悬浮, 再离心, 这样反复两次, 最后用原生质体培养液洗涤一次. 本试验共设定 7 个酶处理组合 ( 表 1), 其他酶解条件参照赵小强等的报道. 酶解时间为 16h, 甘露醇的浓度为 0.7mol L -1 甘露醇. 在上述研究的基础上, 在 Ⅳ 号酶组合处理下分别对甘露醇浓度 ( 酶解 16 h) 和酶解时间 (0.7 mol L -1 甘露醇 ) 进行研究. 甘露醇浓度为 mol L -1 共 4 个梯度, 酶解时间为 h 共 7 个处理. 所有处理均重复 3 次. 1.3 原生质体产量和活力的测定原生质体产量和活力的测定及计算方法同李玉 [10] 珠等的报道. 1.4 原生质体培养将分离和纯化后的 2 ml DX 原生质体悬浮液以不同的密度 ( 和个 ml -1 ) 培养于 60 mm 培养皿中进行静置浅层培养. 液体培养基为添加了 1.0% 蔗糖 100 mg L -1 水解酪蛋白 200 mg L -1 水解乳蛋白 0.4mol L -1 甘露醇 1.0 mg L -1 2,4GD 和 0.1 mg L -1 6GBA 的 KM8P 培养基,pH 为 5.8, 培养温度为 (25±1), 暗培养, 每隔一周, 添加 0.4mL

3 06/2015 草业科学 ( 第 32 卷 06 期 ) 929 表 1 不同的酶处理组合 Table1 Enzymetreatmentwithdiferentenzymespeciesandconcentrations 酶解液处理编号纤维素酶果胶酶离析酶崩溃酶 EnzymetreatmentNo. Celulase/% Pectinase/% Macerozyme/% Driselase/% Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ 左右甘露醇浓度依次减半的新鲜培养基, 并于显微镜下观察细胞的生长情况, 统计原生质体再生细胞的分裂频率 (15d 后 ) 和植板率 (30d 后 ). 另外, 以个 ml -1 的密度将原生质体培养于含有不同 2,4GD 浓度 ( 和 3.0mg L -1 ) 的培养基中, 培养条件同上, 统计细胞分裂频率和植板率. 1.5 统计分析用 SPSS13.0 对试验数据进行单因素方差分析. 2 结果与分析 2.1 野生草地早熟禾愈伤组织原生质体的分离甘露醇浓度对原生质体分离的影响 0.5 和 0.6mol L -1 的甘露醇有利于 DX 和 LX 原生质体的游离, 但对两种草地早熟禾原生质体产量与活力的影响不同 ( 图 1).DX 原生质体游离的最适甘露醇浓度为 0.5 mol L -1, 此时其产量和活力均达到最高, 分别为个 g -1 和 65.12%, 但与 0.6 mol L -1 的甘露醇处理下相比差异不显著 (P> 0.05); 对 LX 而言, 当甘露醇浓度为 0.6 mol L -1 时, 其原生质体的产量和活力均达到最高, 分别为个 g -1 和 68.43%. 因此,0.6 和 0.5 mol L -1 可分别作为 LX 和 DX 原生质体分离所需的最适甘露醇浓度不同的酶处理组合对原生质体分离的影响在不同酶液处理下, 原生质体的分离结果相差很大 ( 图 2). 酶组合 Ⅱ 下,LX 和 DX 原生质体的产量和活力均高于 Ⅰ 和 Ⅲ, 表明 1.5% 的纤维素酶更有利于原生质体的游离 ; 组合 Ⅳ 和 Ⅵ 的 LX 和 DX 原生质体的产量和 LX 的原生质体活力均分别显著高于图 1 甘露醇浓度对 LX 和 DX 原生质体产量及活力的影响 Fig.1 EfectofmannitolconcentrationonprotoplastyieldandviabilityofLXandDX 注 : 不同字母表示同一种不同处理间差异显著 (P<0.05);LX 表示陇西野生草地早熟禾,DX 表示定西野生草地早熟. 下同. Note:Diferentlowercaseletersforthesamevarietyindicatesignificantdiferenceamongdiferenttreatmentsat0.05level.LXrepresents Longxiwildkentuckybluegrass.DXrepresentsDingxiwildkentuckybluegrass.Thesamebelow.

4 930 PRATACULTURALSCIENCE(Vol.32,No.06) 06/2015 图 2 不同的酶处理组合对 LX 和 DX 原生质体产量和活力的影响 Fig.2 EfectofenzymecompositionsonprotoplastyieldandviabilityofLXandDX Ⅱ 和 Ⅲ(P<0.05), 表明 1.0% 的离析酶会提高原生质体的产量与活力 ; 同样, 处理 Ⅴ 和 Ⅶ 下 DX 和 LX 原生质体的产量显著高于 Ⅳ 和 Ⅵ (P <0.05), 表明 0.3% 的崩溃酶可提高原生质体的产量 ; 在组合 Ⅴ 下,LX 原生质体的产量和活力最高, 分别为个 g -1 和 82.70%, 在组合 Ⅶ 下,DX 原生质体的产量高于组合 Ⅴ, 但是活力却明显低于组合 Ⅴ. 综上所述, 组合 Ⅴ 即 1.5% 纤维素酶 +0.5% 果胶酶 +1.0% 离析酶 +0.3% 崩溃酶最有利于 LX 和 DX 原生质体的游离酶解时间对原生质体分离的影响在 8~18 h 内,LX 和 DX 原生质体的产量随着酶解时间的延长而逐渐增高 ( 图 3), 其活力先缓慢增加 (8~16 h), 后降低 (18h).8h 不利于甘肃野生草地早熟禾原生质体的分离, 此时 LX 和 DX 原生质体产量均为最低, 并且原生质体的细胞壁有残留, 原生质体多粘成一团, 不利于观察统计 ; 当酶解时间为 16h 时, LX 原生质体的产量显著地提高 (P<0.05), 当时间延长到 18h 时, 其产量虽有所增加, 但活力则开始明显地降低, 并且有大量的碎片产生 ; 当酶解时间在 14~18h 内,DX 原生质体的产量虽逐渐增高, 但差异并不显著 (P>0.05), 其活力同样在 18h 时有明显的下降. 上述结果表明,16h 是 LX 和 DX 原生质体的最佳酶解时间, 此时 LX 和 DX 原生质体产量分别为和个 g -1, 活力分别为 89.6% 和 85.3%. 2.2 DX 原生质体培养培养密度对原生质体培养的影响不同原生质体培养密度对其再生细胞分裂频率和植板率的影响各异 ( 表 2), 较高的培养密度有利于提高再生图 3 酶解时间对 LX 和 DX 原生质体产量和活力的影响 Fig.3 EfectofenzymedigestiontimeonprotoplastyieldandviabilityofLXandDX

5 06/2015 草业科学 ( 第 32 卷 06 期 ) 931 表 2 培养密度对 DX 原生质体再生细胞分裂频率及植板率的影响 Table2 Efectsofprotoplastdensityontheceldivision frequenciesandplantingeficienciesofdxprotoplasts 原生质体密度 Protoplastdensity/ 10 5 number ml -1 细胞分裂频率 Celdivision frequencies/% 植板率 Plating eficiencies/% ±0.44c 0.17±0.04c ±0.35bc 0.55±0.09c ±0.69a 4.02±0.87a ±0.48b 1.79±0.31b 注 : 同列不同字母表示不同处理间差异显著 (P<0.05). 下同. Note:Diferentlowercaseleterswithinthesamecolumnindicate significantdiferenceamongdiferenttreatmentsat0.05level.the samebelow. 细胞分裂频率和植板率, 当培养密度较低时 ( 个 ml -1 ) 时, 再生细胞的分裂频率和植板率均较低, 尤其是植板率 ( 仅为 0.17% 和 0.55%); 当培养密度为个 ml -1 时, 细胞分裂频率和植板率显著地高于其他处理 (P < 0.05), 其植板率约为个 ml -1 的 24 倍 ; 但当培养密度继续增加到个 ml -1, 再生细胞分裂频率和植板率都开始降低. 故 DX 原生质体的最佳培养密度为个 ml ,4GD 对原生质体培养的影响 2,4GD 对 DX 原生质体再生细胞的分裂频率及植板率也有一定的影响 ( 表 3), 当 2,4GD 的浓度从 0.5mg L -1 增至 1.0 mg L -1 时, 细胞分裂频率由 3.89% 提高到 9.56%, 而当 2,4GD 过高 ( 2.0 mg L -1 ) 时, 反而会抑制细胞生长, 导致分裂频率和植板率均显著地降低 (P <0.05). 由此可见, 过高或过低的 2,4GD 表 3 2,4GD 对 DX 原生质体再生细胞分裂频率及植板率的影响 Table3 Efectsofconcentrationsof2,4GDontheceldivision frequenciesandplantingeficienciesofdxprotoplasts 2,4GD 浓度 Concentrationsof 2,4GD/mg L -1 细胞分裂频率 Celdivision frequencies/% 植板率 Plating eficiencies/% ±1.34b 1.65±0.33c ±1.39a 4.62±0.53a ±0.63b 2.78±0.38b ±1.07b 1.53±0.39c 浓度均不利于原生质体再生细胞的分裂,DX 原生质体培养最适的 2,4GD 浓度为 1.0mg L 原生质体培养形成小愈伤组织 DX 胚性愈伤组织 ( 图 4GA) 经酶解后可产生大量活力较高的原生质体 ( 图 4GB 图 4GC), 将这些原生质体以个 ml -1 的密度培养于添加 1.0mg L -1 2,4GD 的培养基上培养 3~4d 后, 可观察到原生质体再生细胞的第 1 次分裂 ( 图 4GD), 随后继续观察可以看到第 2 3 次分裂和形成小细胞团 ( 图 4GE 图 4GF 图 4GG), 4 周后, 可产生肉眼可见的小愈伤组织 ( 图 4GH). 3 讨论 3.1 供试材料的选择对于禾本科植物而言, 用于原生质体分离的材料通常是悬浮细胞系和胚性愈伤组织. 由于愈伤组织取材方便, 且使用不受时间和季节的限制 [11], 陈 [12] 东方和夏镇澳用棒头草 (Polypogonfugax) 胚性愈伤组织作为材料, 游离出了大量活力较高的原生质体, 其研究结果表明, 以胚性愈伤组织作为材料更具有优越性. 这主要是由于获得胚性愈伤组织比建立细胞悬浮系所需的时间要短得多, 有利于植株再生能力的保持, 且培养后容易诱导植株再生. 马晖 [6] 玲等也利用草地早熟禾午夜 Ⅱ 号的胚性愈伤组织作为原生质体游离材料, 获得了大量原生质体, 并再生出完整植株. 本试验以胚性愈伤组织为分离 LX 和 DX 原生质体的材料, 得到了大量的活力较高的原生质体. 3.2 酶液组合酶解时间和甘露醇对 LX 和 DX 原生质体分离的影响影响原生质体分离的主要因素有 : 酶的种类及浓度酶解时间和甘露醇的浓度. 植物材料不同, 其酶解条件不同, 即使是同一种植物, 外植体的选择不同, 酶解条件也会不同 [5G7,10G12]. 本研究探索了 7 个酶液组合对 LX 和 DX 原生质体分离的影响, 试验结果表明, 最适宜的酶液组合为 1.5% 纤维素酶 +0.5% 果胶酶 +1.0% 离析酶 +0.3% 崩溃酶,1.0% 的离析酶和 0.3% 的崩溃酶的添加, 可显著地提高原生质体的产量, 这与赵小强等的 [10] 研究结果相似, 但李玉珠等研究表明,0.3% 离析酶可降低百脉根 (Lotuscorniculatus) 子叶和愈伤组织原生质体产量. 另外, 本试验表明当纤维素

6 932 PRATACULTURALSCIENCE(Vol.32,No.06) 06/2015 图 4 DX 原生质体分离与培养过程 Fig.4 ProgresofDXprotoplastisolationandculture 注 :A, 胚性愈伤组织 ;B, 分离的原生质体 ;C, 有活力的原生质体 ;D, 原生质体第 1 次分裂 ;E, 原生质体第 2 次分裂 ;F, 原生质体第 3 次分裂 ;G, 小细胞团 ;H, 小愈伤组织. Note:A,embryogeniccali;B,freshlyisolatedprotoplastsfromcali;C,viableprotoplasts;D,firstdivisionofprotoplastGderivedcel;E,second divisionofprotoplastgderivedcel;f,thirddivisionofprotoplastgderivedcel;g,celclusterformedfromprotoplastgderivedcel;h,microcali formedfromprotoplastgderivedcel.

7 06/2015 草业科学 ( 第 32 卷 06 期 ) 933 酶的浓度由 1.5% 增高到 2.0% 时, 原生质体的产量和活力表现出下降的趋势, 这说明酶的浓度要适宜, [13] 过高或过低均不利于原生质体的分离, 张小红等研究同样表明, 低浓度酶液组合下小麦 (Triticum aestivum) 愈伤组织原生质体的产量和活力要高于高浓度酶液组合的. 酶解时间的长短会非常明显地影响原生质体的产量与活力, 过短会导致原生质体的产量大幅度地降低, 而过长会导致原生质体的活力下降, 且会导致分离出的原生质体破碎, 进而使得产量也随之降低 [14]. 本研究中, 当酶解时间由 8h 延长到 18h 时, 原生质体产量逐渐增加 ; 当酶解时间为 18h 时, 原生质体的产量均达到最高, 但是与 16h 时相比, 原生质体的活力均显著下降. 适宜的渗透压是获得高活力原生质体的必要条件, 植物材料不同适宜的渗透压不同, 一般植物的渗透压都在 0.4~0.7 mol L -1[15G16], 本研究结果表明,DX 和 LX 愈伤组织原生质体分离最适宜的甘露醇浓度不同, 分别为 0.5 和 0.6mol L 培养密度和 2,4GD 对 DX 原生质体培养的影响原生质体的起始培养密度对原生质体培养影响很大, 过高或过低的培养密度均不易获得较高的分 [11] [17] 裂频率和植板率.Inokuma 等研究表明, 日本结缕草 (Zoysiajaponica) 原生质体的最适培养密度为个 ml -1 [18] ; 陈文品等研究表明, 只有当多年生黑麦草 (Lolium perenne) 原生质体密度达到一定值 ( 个 ml -1 ) 时, 才能产生细胞团, 最适的培养密度为个 ml -1. 本研究结果显示, 当 DX 原生质体的培养密度较高时 ( 个 ml -1 ), 其分裂频率最高, 可达 8.87%. 大量的研究表明, 物种不同, 原生质体的最适培养密度也不相同 [17G19]. 2,4GD 是原生质体再生细胞分裂愈伤组织和诱导体细胞胚形成不可缺少的一种生长激素之一. 本研究结果表明, 较低浓度的 2,4GD(1.0 mg L -1 ) 最有利于 DX 原生质体再生细胞分裂. 许多研究 [12,17G21] 者在原生质体起始培养时, 都采用较低浓度 (0.5~2.0mg L -1 ) 的 2,4GD. 4 结论 LX 原生质体分离的最佳条件为 :1.5% 纤维素酶 RG10+0.5% 果胶酶 YG23+1.0% 离析酶 RG % 崩溃酶,16h,0.6 mol L -1 甘露醇 ;DX 原生质体分离的最佳条件为 :1.5% 纤维素酶 RG % 果胶酶 YG23+1.0% 离析酶 RG10+0.3% 崩溃酶,16h,0.5mol L -1 甘露醇 ;DX 原生质体培养的最适密度为个 ml -1, 最适 2,4GD 浓度为 1.0mg L -1. 致谢 : 该论文是第二届全国草业生物技术大会评选出的优秀论文, 并得到中国草业生物技术专业委员会提供的版面费支持. 参考文献 [1] 方强恩, 孙英, 白小明, 王靖婷, 孙吉雄. 甘肃早熟禾属野生植物资源分布研究 [J]. 中国草地学报,2010,32(6):39G45. [2] 黄丽, 王璐, 李存福, 陈浩, 郭明章, 黄体冉, 李连芳. 北京地区早熟禾属植物种质资源研究 [J]. 草地学报,2011,19(5): 760G765. [3] 田晨霞, 马晖玲, 张咏梅. 草地早熟禾胚发育类型及无融合生殖特征 [J]. 中国农业科学,2013,46(13):2633G2642. [4] VanderValkP,ZaalM,CreemersGMolenaarJ.RegenerationofalbinoplantletsfromsuspensionculturederivedprotoG plastsofkentuckybluegrass(poapratensisl.)[j].euphytica,1988,39(3):169g176. [5] NielsenK A,LarsenE,KnudsenE.RegenerationofprotoplastGderivedgreenplantsofKentuckybluegrass(Poapratensis L.)[J].PlantCelReport,1993,12(10):537G540. [6] 马晖玲, 赵小强, 白小明. 草地早熟禾午夜 Ⅱ 号原生质体培养及植株再生 [J]. 草地学报,2010,18(1):103G107. 赵小强, 马晖玲, 林栋, 周万海, 吴翔. 草地早熟禾品种新格莱德原生质体培养及植株再生的研究 [J]. 草业学报,2010, 19(2):55G60. [8] 白利国, 俞玲, 马晖玲. 野生草地早熟禾对干旱胁迫的生理响应 [J]. 草原与草坪,2014(2):86G91.

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