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辛充为奕
5 years ago
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1 学校编码 :10384 密级学号 : 硕士学位论文梅毒螺旋体特异性抗体胶体金免疫层析检测技术的构建及其应用 The building and application of Colloidal gold immunochromatographic assay in the detection for Treponema pallidum specific antibody 指导教师姓名 : 付左根杨天赐主任技师专业名称 : 药理学论文提交日期 : 2012 年 5 月论文答辩日期 : 2012 年 5 月 2012 年 5 月

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3 梅毒螺旋体特异性抗体胶体金免疫层析检测技术的构建及其应用付左根指导教师杨天赐主任技师厦门大学

4 厦门大学学位论文原创性声明本人呈交的学位论文是本人在导师指导下, 独立完成的研究成果本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果, 均在文中以适当方式明确标明, 并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范 ( 试行 ) 另外, 该学位论文为 ( ) 课题 ( 组 ) 的研究成果, 获得 ( 资助, 在 ( ) 课题 ( 组 ) 经费或实验室的 ) 实验室完成 ( 请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称, 未有此项声明内容的, 可以不作特别声明 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

5 厦门大学学位论文著作权使用声明本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等规定保留和使用此学位论文, 并向主管部门或其指定机构送交学位论文 ( 包括纸质版和电子版 ), 允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅借阅本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士硕士学位论文共建单位数据库进行检索, 将学位论文的标题和摘要汇编出版, 采用影印缩印或者其它方式合理复制学位论文本学位论文属于 : ( )1. 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文, 于年月日解密, 解密后适用上述授权 ( )2. 不保密, 适用上述授权 ( 请在以上相应括号内打或填上相应内容保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文, 未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文此声明栏不填写的, 默认为公开学位论文, 均适用上述授权 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

6 摘要摘要梅毒是由梅毒螺旋体 (Treponema pallidum,tp) 感染引起的严重危害人类健康的性传播疾病梅毒特异性抗体检测方法包括 TPPA,ELISA,FTA-ABS 及 Western-blot 等, 其特异性均较高一般地,TPPA,ELISA 作为临床初筛,FTA-ABS 和 Western-blot 作为确认试验其中,FTA-ABS 需要荧光显微镜, 而且其结果判断需要训练有素和较丰富经验的专业人员才能完成本文应用梅毒特异性重组蛋白 TPN17 和 TPN47 建立梅毒螺旋体 IgG/M 胶体金免疫层析技术 (Colloidal Gold-immunochromatography Assay,GICA), 设定 FTA-ABS 作为梅毒螺旋体 (TP)-IgG/M 检测的金标准采用所建立的 GICA 方法分别对厦门市临床检验中心收集的份血清 (IgG) 和 1208 份血清 (IgM) 进行检测结果表明,GICA TP-IgG/M 试验敏感性特异性与 FTA-ABS IgG/M 相当, 而且操作简单快速不需要特殊仪器肉眼直接判读室温下稳定和价廉等诸多优势, 适用于常规的梅毒实验室, 尤其是发展中国家和基层实验室的使用 GICA TP-IgG/M 法能够作为梅毒感染和复发的血清学标志物, 有望取代传统的 FTA-abs IgG/M 试验, 在医院血站及其他临床检测领域应用推广关键词 : 胶体金免疫层析技术梅毒螺旋体荧光密螺旋体抗体吸收试验 IgM IgG I

7 Abstract Abstract Syphilis is a kind of sexually transmitted disease caused by Treponema pallidum. The technologies for diagnosing syphilis whose specificity were higher, include TPPA, ELISA, FTA-ABS,Western-blot and so on. In general,tppa and ELISA were used as clinical screening and FTA-ABS and Western-blot were the confirmatory tests for syphilis. The FTA-ABS test is based on immunofluorescent methods and the determination of results could only be mastered and operated by professionally trained people. This paper aims to develop new colloidal gold immunochromatography technology (GICA) to replace the fluorescent treponema antibody absorption test (FTA-Abs). Syphilis-specific immunoglobulin G/M(IgG/M) antibody was detected with GICA established on syphilis-specific recombinant proteins, TPN17 and TPN47, with FTA-Abs Treponema pallidum (TP)-IgG/M set as the gold standard. A GICA test was performed to detect the serum of 14967(IgG)or 1208(IgM)subjects who took a serologic test for syphilis at the Xiamen Center of Clinical Laboratory, Fujian, China. The T. pallidum GICA TP-IgG/M test and FTA-Abs IgG/M test revealed a significant agreement in the overall results. The results show that the GICA TP-IgG/M test is specific and sensitive for routine laboratory use, and its characteristics correspond to that of FTA-Abs IgG/M. As rapid treponemal tests emerge because of their enhanced sensitivity, userfriendly qualities, convenience (i.e., no extra equipment),stability at room temperature, and reasonable price, the traditional procedure for laboratory diagnosis of syphilis in developing countries may change. Therefore, the GICA TPIgG/M method can be used as a serologic marker for the relapse and infection of syphilis in place of the conventional FTA-Abs IgG/M test. It will be a promising method for the detection of TP antibody in clinical diagnosis and for the sereening of blood donors in the near future. Keywords: Colloidal Gold Immunochromatographic Assay; Treponema pallidum; Fluorescent Treponemal Antibody Absorption Test;detection II

8 目录目录摘要... I ABSTRACT... II 第一章绪论梅毒及梅毒螺旋体概述梅毒的流行病学梅毒螺旋体的生物学特征梅毒的致病机理梅毒的临床表现梅毒螺旋体实验室检测技术梅毒病原学检测梅毒螺旋体血清学检测梅毒的基因诊断胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术的发展历程胶体金的概念及特点胶体金免疫层析技术的应用及发展胶体金免疫层析技术原理梅毒螺旋体膜蛋白的研究本论文的研究目的和意义第二章材料和方法材料实验方法第三章重组抗原 TPN17 和 TPN47 构建的胶体金免疫层析技术在梅毒螺旋体特异性 IGG 检测中的应用引言研究对象结果 III

9 目录 3.1 梅毒组血清 TRUST TPPA FTA-ABS TP-IgG 和 GICA TP-IgG 检测结果 GICA 的敏感性和特异性分析交叉反应和干扰稳定性分析 GICA TP-IgG 试验可行性使用梅毒特异性重组抗原 TPN17 和 TPN47 检测 TP-IgG 讨论第四章胶体金免疫层析技术在梅毒血清固定反应梅毒螺旋体特异性 IGM 抗体检测中的评估引言血清分组情况结果不同组之间 TRUST TPPA FTA-ABS IgM 和 GICA TP-IgM 试验结果 GICA 敏感性和特异性分析 GICA TP-IgM 的交叉反应和干扰实验稳定性分析讨论参考文献致谢攻读硕士学位期间的研究成果 IV

10 Table of Contents Table of Contents Abstract in Chinese Ⅰ Abstract in English Ⅱ Chapter 1 Introduction 1 1. The description of syphilis and Treponema pallidum The epidemiology of syphilis The biologic characteristic of Treponema pallidum The pathogenesis of syphilis The clinical manifestation of syphilis 5 2. The detection methods of Treponema pallidum The etiological detection of Syphilis The serological tests of Treponema pallidum The genetic diagnosis of Syphilis Colloidal Gold Immunochromatographic Assay The etiological detection of Syphilis The development process of Colloidal Gold Immunochromatographic Assay The application and development of Colloidal Gold Immunochromatographic Assay The principle of Colloidal Gold Immunochromatographic Assay The study of membrane proteins of Treponema pallidum the purpose and significance of this paper 23 Chapter 2 Materials and methods Materials methods 25 Chapter 3 Development of a colloidal gold-immunochromatography assay to detect immunoglobulin G antibodies to Treponema pallid- um Introduction The group of serum Result 32 V

11 Table of Contents 3.1 Reactivity of the TRUST, TPPA, FTA-Abs TP-IgG, and GICA TP-IgG tests in syphilis group sera Analysis of sensitivity and specificity of GICA Cross reactivity and interference Stability assay Practicability of the GICA TP-IgG test TP-IgG detection using syphilis-specific recombinant antigens TPN17 and TPN Discussion 36.Chapter 4 Evaluation of a colloidal gold immunochromatography assay in the detection of Treponema pallidum specific IgM antibody in syphilis serofast reaction patients Introduction The group of serum Result Reactivity of the TRUST, TPPA, FTA-Abs TP-IgM, and GICA TP-IgM tests in syphilis group sera Analysis of sensitivity and specificity of GICA Cross reactivity and interference Stability assay Discussion 43 Reference 45 Acknowledgement 59 Publications 62 VI

12 第一章绪论第一章绪论 1. 梅毒及梅毒螺旋体概述 1.1 梅毒的流行病学梅毒 (syphilis) 是一种由梅毒螺旋体 (Treponema pallidum,tp) 引起的性传播性疾病, 该病潜伏期长短不等, 临床表现复杂, 可感染人体各种器官并产生多种临床表现近年来我国梅毒发病率急剧上升, 年增长 51.63% 梅毒病人是梅毒螺旋体唯一的传染源, 可通过胎盘先天传给胎儿, 后天性梅毒主要通过性交传染, 少数可通过血液传染 [1] 梅毒在全球已有五百多年的流行历史 [2] 目前大多数学者支持的说法是: 在 1493 年哥伦布第 1 次探险时, 将梅毒带回西班牙,4 年后梅毒几乎传遍欧洲大陆, 1498 年传入印度,1505 年由印度新加坡传入我国的广东, 随后蔓延至全国 [3] 数百年来, 人类一直为消灭梅毒长期不懈地努力着, 但遗憾的是, 迄今为止, 梅毒仍在全世界范围内广泛流行据世界卫生组织估计, 全世界每年新发成人梅毒约为 1200 万例, 主要分布在发展中国家 [4] 发达国家的梅毒发病率在 20 世纪 90 年代呈现下降的趋势, 但之后又发生了新的流行美国自 2001 年后, 报告发病率开始上升,2005 年报告病例数为 8724 例, 较 2004 年上升 9.3%; 英国 2005 年报告的新发早期梅毒病例数为 2814 例, 较 2004 年上升 23%, 较 1996 年上升了 20 倍 [5] 与发达国家相比, 发展中国家不仅梅毒的发病率更高, 且其发病人群已从高危人群蔓延至一般人群, 如越南的性工作者梅毒感染率为 10.7%, 柬埔寨为 19.0%, 喀麦隆的孕产妇人群梅毒感染率高达 17.4% [6] 近些年来, 艾滋病和同性恋对梅毒的发病起到推波助澜的作用据国外统计, 同性恋感染梅毒的发病人数占整个新发梅毒人数的 50% 左右 [7] 解放前及解放初期, 梅毒在我国广泛流行北京医学院资料表明,1949 年北京妓女的梅毒感染率高达 84%, 皮肤科门诊就诊者中梅毒患者占 10% 以上内蒙古自治区人群梅毒的平均患病率为 35.0%,15 岁以下儿童先天梅毒的发病率高达 25.0%~28.0% [8] 据统计, 全国当时性病 ( 主要是梅毒 ) 患者为 1000 万解放后我国政府高度重视性病防治, 于 1964 年向全世界宣布基本消灭了性病 ( 包 1

13 第一章绪论括梅毒 ), 成为全世界第一个在国家层面上消除梅毒的国家 [9] 80 年代以后, 随着对外开放, 人口流动增加, 梅毒再次传入我国 [10] 梅毒的发病率自 1988 年 ~ 2006 年每年平均上升 18.3%;1998 年较 1992 年梅毒发病例数增长 20 倍, 年均增长 52.7% [11] ;2001 年 ~2006 年的梅毒平均发病率是 1991 年 ~2000 年的 3.4 倍, 是 1988 年 ~1990 年的 44.4 倍 [12] 近年来, 梅毒病例年增长率大约是 20%~ 30%, 尤其是潜伏梅毒和胎传梅毒报告数明显增多地区分布资料表明, 目前我国梅毒的高发地区仍然是经济相对发达的长江流域珠江三角洲京津地区以及少数民族相对集中的新疆青海和内蒙古地区 [12] 人群分布集中于性活跃的青壮年, 低年龄组中女性发病率明显高于男性, 老年梅毒发病人数显著增加, 职业分布以工人农民和无业人员为主 [13] 21 世纪以后, 我国性传播疾病发病率呈逐年上升趋势, 高危人群中性病尤其是梅毒的发病率居高不下, 疫情上升迅速 1991 年全国不包括港澳台其他 31 个省市报告梅毒 1892 例, 发病率 0.16 /10 万 [14] 2007 年全国梅毒报病例, 发病率 17.16/10 万 [12] 到 2008 年全国梅毒报病例, 发病率 21.60/10 万 [12] 而 2009 年报病例, 发病率 24.66/10 万, 其中一期和二期梅毒报告发病较 2008 年上升了 12.44% 和 11.01%, 部分高危人群梅毒感染率甚至高达 47% [15] 2011 年我国梅毒的发病例数为例, 比 2010 年同期增长 16.95%, 居全国乙类传染病第 3 位 [15] 值得高度关注的是, 感染和传播并存在民工等流动人口中, 同时缺乏规范治疗 [14] 鉴于梅毒的流行尤其是女性二期梅毒的逐年增多, 使胎传梅毒呈快速上升趋势,1991 年全国胎传梅毒报告 2 例, 报告发病率 0. 01/10 万活产数, 2007 年全国胎传梅毒报告 8408 例, 报告发病率 50.3/10 万活产数 1991 年至 2007 年全国胎传梅毒发病率增长 92 倍, 年增长 57.32% [12] 2008 年全国胎传梅毒报告 9480 例, 发病率 56.76/10 万活产数, 比 2007 年增加 31.5%; 2009 年全国胎传梅毒报告例, 同比 2008 年增加 13.47%; 2010 年全国胎传梅毒报告例, 仅广西广东浙江四川湖南 5 省共计胎传梅毒 6228 例, 占 31 个省市的 54.89%, 其中广西报告病例数最多, 为 1884 例, 胎传梅毒发病率为 /10 万活产数 ; 依次是上海, 发病率为 /10 万活产数 ; 浙江发病率为 /10 万活产数 ; 重庆为 /10 万活产数 ; 广东为 /10 万活产数 [16] 2

14 第一章绪论 1.2 梅毒螺旋体的生物学特征梅毒螺旋体也称苍白螺旋体, 属于螺旋体目 (spirochaetales) 螺旋体科 (Spirochaetaceae) 密螺旋体属 (Treponema) 梅毒螺旋体为一种呈螺旋状的厌氧微生物, 大小约 6-15μm 不等, 直径约为 0.2 μm 临床和实验室观察研究中主要通过暗视野对这种小而纤细的有机体进行观察 [17] 电镜下观察梅毒螺旋体结构复杂, 由内而外分别由松散的外膜轴丝和圆柱形菌体组成, 透明一般染料不易着色, 见图 1 [18] 图 1 梅毒螺旋体的电镜扫描电镜图 Fig.1 Scanning electron micrograph image of T pallidum ( 引自 :Fitzgerald TJ, Cleveland P, Johnson RC, Miller JN, Sykes JA.Scanning electron microscopy of Treponema pallidum (Nichols strain) attached to cultured mammalian cells[j].j Bacteriol,1977 Jun,130(3): ) 研究用梅毒螺旋体标准株 ( Treponema pallidum Nichols Strain) 是 Nichols 于 1912 年从梅毒病人的脑脊液中分得到的, 但至今不能离开哺乳动物宿主培养成功, 收集菌体后几小时或几天就会失去感染能力为了获得足够多的菌体进行实验的操作, 梅毒螺旋体必须在家兔组织内 ( 例如睾丸 ) 中培养增殖 [19] 到目前为止, 研究者还一直无法在组织培养中使梅毒螺旋体扩大 100 倍 ( 相当于约七代 ) 3

15 第一章绪论 [20] 预期如果提供新鲜的培养基并从培养体系中除去毒素将能扩大梅毒螺旋体的代谢能力,Norris and Edmondson 尝试用这种方式进行体外梅毒螺旋体的培养, 但最终没能得到确切的生物体 [21] 无法在除哺乳动物宿主以外生存和增殖是梅毒螺旋体研究的最大的障碍梅毒螺旋体的生长缓慢, 接种培养显示, 梅毒螺旋体在体内每 30 到 33 个小时增殖一倍 ; 从组织培养时的复制周期时间推断体外增殖一倍的时间要 30 到 50 个小时 [22] 一些生物因素可能导致梅毒螺旋体复制率的低下, 由于缺乏三羧酸循环和电子传递链, 梅毒螺旋体合成 ATP 的唯一途径就是依靠糖酵解事实上, 有机体理论上进行有氧呼吸产生能力, 比如大肠杆菌产生 38 个 ATP, 这比单独糖酵解产生 2 个 ATP 大了 19 倍大肠杆菌大约每二十分钟扩增一倍, 这比梅毒螺旋体扩增一倍快了 90 倍, 这表明低能力的产生并不是唯一抑制梅毒螺旋体复制的因素由于缺乏一些酶 ( 如过氧化氢酶和氧化酶去除活性氧 ), 梅毒螺旋体在低浓度氧下能够延长存活时间, 其基因组上几个氧保护酶的基因也已经确定, 从而表明梅毒螺旋体可能严重依赖人或哺乳动物宿主体内化合物 [23] 1.3 梅毒的致病机理人类是唯一已知的梅毒螺旋体天然宿主, 密螺旋体可能通过正常粘膜或通过轻微擦伤的皮肤进入到宿主体内 [24] 在家兔动物模型中, 接种梅毒螺旋体后能在淋巴系统中检测到梅毒螺旋体并随时进行全身性扩散 [25] 梅毒通常由性接触进行传播, 也可能通过潜伏期梅毒献血者的血液传播梅毒螺旋体能够通过胎盘, 未经治疗的早期梅毒孕妇可通过此方式感染胎儿, 可导致围产期死亡高达 40% 如果孕妇在怀孕前 4 年内感染上梅毒, 可导致超过 70% 的胎儿感染梅毒螺旋体复制非常缓慢, 分裂一次大约需要 33 小时, 这部分解释了该病情的长期性和相对较长的潜伏期梅毒螺旋体不产生毒素, 大部分密螺旋体在细胞间隙中发现, 偶尔见一些螺旋体在巨噬细胞中, 但这并没有延长其生存时期 [26] 其致病性是由于表面存在的荚膜样粘多糖导致, 梅毒螺旋体不能自行合成荚膜中所含的 N- 乙酸 -D- 半乳糖胺, 需要从宿主细饱获得梅毒螺旋体通过自身粘多糖酶, 吸附在寄主组织细胞表面的粘多糖受体上, 分解宿主细胞的粘多糖从而获取 N- 乙酞 -D- 半乳糖胺由于粘多糖是宿主组织和血管支架的重要基质组成成分, 粘多糖被梅毒螺旋体分解后, 寄主组织受到损伤破坏. 引起血管塌陷血供受阻, 4

16 第一章绪论从而造成管腔闭合性动脉内膜炎动脉周围炎及坏死和溃疡等病变 [27] 1.4 梅毒的临床表现根据梅毒发展可以分为一期梅毒 (primary syphilis) 二期梅毒(second syphilis) 三期梅毒(tertiary syphilis) 以及潜伏梅毒 (latent syphilis) 性伴侣患有一期或二期梅毒的人感染梅毒的概率是 50-75% 此外 30% 的性接触者开始没有临床症状或血清学感染证据, 但随后发现感染了梅毒被感染患者 3 周后出现典型硬下疳, 硬下疳一般无痛并能够逃避检测, 尤其存在于没有阴道损伤的女性和没有直肠损伤的男同性恋之中典型的病损非化脓性疮面较清洁, 少量浆液性渗出物, 边界清晰的隆起, 触之软骨样硬度, 可能发生多发性下疳, 尤其是在感染了 HIV 的患者中 60% 的病例中可见非典型病损, 可能完全没有一期的皮肤症状硬下疳伴随着近卫淋巴结肿大, 不同的症状可以由螺旋体的感染量患者的免疫状态一致的抗菌治疗和可能的硬下疳脓疱化来解释 [28] 以前有过梅毒感染史的患者一般不会出现任何病损或者只有一些小的非典型性丘疹因此, 有低阈的生殖病损梅毒疑似患者应该立即进行诊断学研究确认病原学 [29] 硬下疳一般 3-6 周痊愈, 有时会留下细小萎缩性瘢痕, 淋巴结肿大一般持续时间较长当硬下疳还存在时二期梅毒的体征和症状就经常出现, 尤其是在感染了 HIV 的患者身上 [29] 二期梅毒的表现是在硬下疳出现的 4-10 周后梅毒疹是超过 70% 的患者的现在症, 同时体格检查时发现存在在于超过 90% 的患者梅毒疹一般是全身性而对称的, 在脸上躯干手掌脚底和生殖道区域均能见数不清的小红斑斑疹和丘疹随后的发展可能包括粘膜损害, 掌跖光滑圆形铜鳞状丘疹细小鳞状玫瑰糠状梅毒疹也经常可见不常见的症状有环状丘疹梅毒纤维瘤和脓疱性梅毒疹, 粘膜损害也并不常见扁平湿疣 - 湿疣丘疹经常发生在阴肛部区域, 也见于口腔粘膜上颚和咽的红斑是另外一种特征, 一些病人可能出现眉毛脱落和脱发, 通常也可见流感样征状和近卫淋巴结肿大二期梅毒主要在第一年流行附后会自然消退, 约 25% 的未治疗梅毒患者四年内会复发 [28] 早期和晚期潜伏梅毒是分别在一年内和一年后都没有症状的时期大约三分之一的未治疗患者感染后 3-15 年出现晚期后遗症晚期梅毒存在三种不同的形式 : 晚期良性梅毒, 心血管梅毒和神经梅毒晚期梅毒是由于组织中存在的大量密螺旋体而引发的迟发性超敏反应晚期良性梅毒大约占所有晚期梅毒病例的一 5

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