2015 年第 5 期陈加雄等, 球形棕囊藻的负趋光性和硝酸盐饥饿诱导鞭毛脱落试验 59 分别取含有游动单细胞 不动单细胞和群体 3 种形态球形棕囊藻培养液, 充分振摇均匀, 从 U 形管顶端开口注入藻液, 使水平面至竖管 5.0cm 高处, 排除管内气泡 用 3 块不透光纸遮挡光线, 置于室内自然

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1 第 36 卷第 5 期 2015 年 11 月 DOI: /j 水生态学杂志 JournalofHydroecology Vol.36,No.5 Nov 球形棕囊藻的负趋光性和硝酸盐饥饿诱导鞭毛脱落试验 陈加雄, 李伟滨, 廖小珊, 林传旭 ( 中国科学院汕头海洋植物实验站, 广东汕头 ) 摘要 : 为了解释自然界中球形棕囊藻 (Phaeocystisglobosa) 赤潮的生消现象, 对其负趋光性和硝酸盐饥饿诱导鞭毛脱落进行试验 通过制作简易的实验装置, 对球形棕囊藻生活史中的游动单细胞 不动单细胞和群体 3 种形态进行趋光性试验 结果显示, 具有鞭毛的游动单细胞形态的球形棕囊藻负趋光性明显, 其他 2 种形态则无负趋光性 ; 当培养基中硝酸盐完全缺失时, 或者用等量氮素的亚硝酸盐或尿素代替, 球形棕囊藻细胞均不能正常生长 ; 在硝酸盐饥饿状态下, 诱导游动单细胞鞭毛脱落成为不动单细胞, 并逐渐聚集形成群体, 不动单细胞和群体培养液添加硝酸盐继续培养后又出现大量游动单细胞 试验表明, 球形棕囊藻具有负趋光性, 硝酸盐饥饿能够诱导游动单细胞鞭毛脱落并逐渐形成群体, 当硝酸盐营养得到补充时, 游动单细胞即可再生, 与其在自然界中的赤潮生消现象相吻合 关键词 : 球形棕囊藻 ; 负趋光性 ; 硝酸盐 ; 饥饿诱导 ; 鞭毛脱落中图分类号 :Q142 文献标志码 :A 文章编号 : (2015) 球形棕囊藻 (Phaeocystisglobosa) 属金藻门 (Chrysophyta) 定鞭藻纲 (Haptophyceae), 是一种广温 广盐性海洋微藻, 经常引起大规模的赤潮, 对海洋生态系统和全球碳循环 硫循环具有重要的影响, 并进而对地球气候产生影响 (Baumanneta1,1994; 齐雨藻等,2001) 在我国东南沿海多次爆发大面积赤潮, 给当地渔业生产造成巨大的经济损失, 严重破坏了海洋生态环境 ( 赵雪等,2009; 徐宁等,2003; 王超等,2010) 棕囊藻具有独特的生活史, 生活周期中不仅包含不同形式的自由生活细胞 ( 不动营养细胞 具鞭毛营养细胞和小游动孢子 ), 更有与众不同的胶质群体形式 棕囊藻群体基质中凝胶状的黏多糖使其在湍流中通过增加浮力而漂浮于表层海水中, 从而在与其它浮游植物的竞争中占据优势 ; 同时, 由于其群体的体积较大, 也免于被水层中的中等浮游动物所摄食 (Verityetal,1989; 沈萍萍等,2000) 棕囊藻群体的光合特性决定其常出现在早春的低光照条件和浑浊 湍流的水环境中 (Lancelotetal,1998), 而且在黎明和傍晚时出现最大生物量聚集 球形棕囊 收稿日期 : 基金项目 : 汕头市科技项目 (2013 年 99 号,2014 年 14 号 ); 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室开放课题 (LMB131004) 作者简介 : 陈加雄,1964 年生, 男, 高级工程师, 主要从事海洋植物生理生态研究 E mail:cjx@scsio.ac.cn 藻含有的溶血毒素对其他微藻有化感作用, 能抑制其他赤潮藻的生长, 从而形成竞争优势 (LIUetal, 2010) 对球形棕囊藻的生理生态特性已经有大量的研究, 但关于其生活史中游动单细胞的负趋光性和硝酸盐饥饿对鞭毛脱落的诱导作用目前未见报道 本文所述的负趋光性对于自然海区棕囊藻群体常出现于早春的低光照条件和浑浊 湍流的水环境中作了较为科学的解释, 硝酸盐饥饿诱导鞭毛脱落试验, 有助于分析其生活史中不动单细胞和群体形态的成因 基于自然海区球形棕囊藻赤潮的发生和消亡现象以及硝酸盐对其生长的重要影响, 旨在为探索其赤潮的发生和消亡规律提供了理论基础 1 材料和方法 1.1 材料球形棕囊藻 (Phaeocystisglobosa) 藻种 ( 编号 GY H37) 购于上海光语生物科技有限公司 培养条件为 f/2 培养基, 温度 25, 光暗比为 12h 12h, 光通量密度 80μmol/(m 2 s) 1.2 趋光性和负趋光性试验用 1 根外径 1.0cm 内径 0.8cm 长 60.0cm 的玻璃管, 两端加热弯曲成底 30.0cm 高 15.0cm 的 U 形管, 开口两端朝上, 固定于支架上, 底管保持水平, 置于太阳光或照明灯光下照射, 在顶端玻璃管开口注入藻液后, 用 3 块 5.0cm 的不透光纸在底管每 10.0cm 的中点遮挡光线 ( 图 1)

2 2015 年第 5 期陈加雄等, 球形棕囊藻的负趋光性和硝酸盐饥饿诱导鞭毛脱落试验 59 分别取含有游动单细胞 不动单细胞和群体 3 种形态球形棕囊藻培养液, 充分振摇均匀, 从 U 形管顶端开口注入藻液, 使水平面至竖管 5.0cm 高处, 排除管内气泡 用 3 块不透光纸遮挡光线, 置于室内自然光 [ 光通量密度约为 80μmol/(m 2 s), 光暗比为 12h 12h] 室温培养,24h 后取下遮光纸, 观察微藻聚集情况, 拍照记录试验结果 ( 图 1) 1.3 硝酸盐饥饿诱导鞭毛脱落试验用 f/2 作为基础培养基, 调整其中的氮素配制试验培养基并编号标记 (1 号为正常培养基即 f/2; 2 号缺失氮素 ;3 号等量尿素氮代替硝酸盐 ;4 号等量亚硝酸氮代替硝酸盐 ;5 号为 f/2 正常培养基加等量氮素的尿素 ) 取生长对数期的球形棕囊藻游动单细胞培养液 250mL, 细胞计数并记录细胞浓度, 准确分成 5 等份, 各 50mL, 以 4000r/min 离心除去原培养液, 沉淀细胞用对应标号培养基冲洗 2 次, 再次离心, 收取沉淀细胞, 用试验培养基 100mL 冲洗转移至已编号的三角瓶中, 置于光照培养箱中培养, 培养箱设置温度为 25, 光照强度为 72μmol/ (m 2 s), 光暗比为 12 12h, 每天振摇 2 次并观察外观变化, 每 3d 显微镜观察藻细胞鞭毛脱落情况并计算细胞浓度, 连续观察 20d 1.4 游动单细胞再生试验将因硝酸盐饥饿培养后出现的不动单细胞或群体球形棕囊藻培养液 ( 上述 号样品, 检查并确认藻液中不含游动单细胞 ), 分别添加等量正常 f/2 培养基和加倍硝酸盐含量培养基, 每个样品做 3 个平行试验, 在温度 25 光照强度 72μmol/ (m 2 s) 光暗比为 12h 12h 的培养箱中培养, 每天振摇 2 次, 观察微藻细胞变化情况, 记录游动单细胞出现时间 2 结果 2.1 球形棕囊藻的负趋光性球形棕囊藻的 3 种形态分别在自然光下经过 1 昼夜培养,24h 后取下遮光纸 游动单细胞形态的微藻明显聚集在底管遮光处, 竖管和底管透光处基本透明, 没有微藻积聚 ; 而不动单细胞和群体形态则均匀沉淀于底管底部 试验表明, 游动单细胞形态的球形棕囊藻具有负趋光性, 而不动单细胞和群体形态则没有 ( 图 1 D) 2.2 硝酸盐饥饿诱导鞭毛脱落各样品在前 5d 外观没有明显变化, 第 6 天开始,1 号和 5 号样品开始颜色变深, 经过计数, 细胞 A.U 形管 ;B. 藻液 ;C. 挡光纸 ;D. 细胞聚集图 1 球形棕囊藻试验装置与趋光结果观察 A.U shapedtube;b.algaesolution;c.lightbarierpaper;d.celaggregation Fig.1 TestapparatusandobservableresultsforthePhaeocystisglobosaphototaxisexperiment

3 60 第 36 卷第 5 期水生态学杂志 2015 年 11 月 表 1 球形棕囊藻游动单细胞密度 Tab.1 CeldensitiesofPhaeocystisglobosaforeachtreatment 样品编号 3d 6d 9d 12d 浓度 / 个 ml -1 形态浓度 / 个 ml -1 形态浓度 / 个 ml -1 形态浓度 / 个 ml -1 形态 a a a a a ab abc 0 bc a ab abc 0 bc a ab abc 0 bc a a a a 注 :a 为游动单细胞,b 为不动单细胞,c 为群体 Note:a.motilesinglecel;b.staticsinglecel;c.celcolonies 浓度有明显差别 ( 表 1); 按样品编号依次为 :5 号 > 1 号 >4 号 >3 号 >2 号 第 9 天显微镜检查,2 3 4 号样品开始有不动单细胞和群体出现, 藻液颜色变浅, 藻液中仍有游动单细胞存在 从第 12 天起, 1 号和 5 号样品仍只有游动单细胞 1 种形态,2 3 4 号则只有不动单细胞和群体 2 种形态 由此说明, 在硝酸盐饥饿状态下, 随着硝酸盐的完全缺失, 球形棕囊藻的游动单细胞鞭毛脱落, 逐渐转化为不动单细胞和群体 ; 而 5 号样品细胞浓度最高, 达到 个 /ml, 说明在硝酸盐营养满足棕囊藻要求的情况下, 增加有机氮素能够促进其生物量的增长 从各样品早期培养细胞浓度看,4 号的亚硝酸盐氮素高于 3 号的尿素氮, 完全缺失氮素的 2 号样品最低 ;12d 后, 缺乏硝酸盐氮素的样品中游动单细胞数均为 0, 只存在不动单细胞和群体 2 种细胞形态 2.3 游动单细胞再生试验进行到第 4 天,3 个样品藻液均由浅黄色变成浅棕色, 经显微镜检查, 所有样品中都有游动单细胞棕囊藻出现, 样品之间细胞浓度差异不大, 为 ~ 个 /ml, 培养 15d 后, 游动单细胞浓度达到 个 /ml 以上 f/2 正常培养基和硝酸盐加倍培养基之间也没有显著差异, 同序号样品添加不同浓度硝酸盐培养后细胞浓度几乎一致, 但 3 号样品浓度最高, 达到 个 /ml 由此说明, 硝酸盐是游动单细胞球形棕囊藻再生的必备条件, 而且高浓度的硝酸盐并不能加快游动单细胞形态的再生, 也不能增加其生物量, 并再次证明在硝酸盐营养满足的条件下, 尿素能够促进棕囊藻的生物量增长 3 讨论 3.1 球形棕囊藻避光应对营养快速消耗在自然海区, 海水中营养盐 ( 主要是氮和磷等 ) 微量元素 ( 铁 锰等 ) 以及某些特殊有机物 ( 维 生素 蛋白质等 ) 的存在形式和浓度, 直接影响着赤潮生物的生长 繁殖和代谢, 是赤潮形成和发展的物质基础 当温度 盐度等条件适合时, 在低光照和浑浊 湍流的水环境中, 游动单细胞形态的球形棕囊藻生物量急速增加, 这是赤潮爆发的前提 水体中高浓度的磷或氮是球形棕囊藻细胞快速生长的主要因子 (Caietal,2009); 在海洋中, 氮是浮游植物生长繁殖必需的营养元素 浮游植物对不同氮源的获得 吸收和同化速率对其生长起着重要作用, 其中硝酸盐是氮素的主要形式, 硝酸盐能够提高硝酸还原酶的活性, 从而促进藻细胞的生长, 含有较高硝酸盐的富营养化海域有利于球形棕囊藻的持续生长 ( 王艳等,2006) 在高光照条件下, 硝态氮的光能转化率高于有机氮 ; 而在低光照条件下, 球形棕囊藻对有机氮 ( 尿素 ) 的吸收强于硝态氮 ( 陈园等,2011) 实验结果表明, 球形棕囊藻游动单细胞具有较强的负趋光性, 其生物体聚集在光线强度较低的背光处, 这种现象可以解释为球形棕囊藻游动单细胞适合在中低光照强度下生长 在一定范围内, 光合作用的效率与光强成正比, 但是达到一定强度后, 若继续增加光强, 光合作用的效率不仅不会提高, 反而下降 (Thompson,1999) 当细胞达到一定浓度后, 随着光合作用的加强, 水体中硝酸盐营养快速消耗, 造成硝酸盐营养缺失, 从而诱导游动单细胞球形棕囊藻鞭毛脱落, 形成不动单细胞并逐步聚集成群体 3.2 球形棕囊藻对硝酸盐营养缺失的生活史对策在球形棕囊藻异型生活史中, 其形态是应对环境变化的一种生活史策略 (Verityetal,1996) 藻华发生时, 囊体漂浮在水体中, 为其生活史中的优势形态, 单细胞甚至不存在 (Verityetal,2007); 但囊体是由单细胞转化而来, 单细胞是囊体存在的物质基础 在自然海区中, 球形棕囊藻游动单细胞因为具备负趋光性而聚集在低光照区域, 在低光照条件下吸收富营养化海水中的有机氮, 导致其细胞大量繁殖 在环境条件变化的刺激下, 当强光照射而无

4 2015 年第 5 期陈加雄等, 球形棕囊藻的负趋光性和硝酸盐饥饿诱导鞭毛脱落试验 61 法及时避光时, 光合作用大量消耗硝酸盐并无法补充, 游动单细胞在硝酸盐饥饿状态下诱导鞭毛脱落成为不动单细胞, 最终成为囊体外层细胞, 形成胶质囊被 构造紧密的胶质囊被保护囊体内细胞免受侵害, 其内部成为独立的生长环境, 游动单细胞继续生长 ; 当囊体内部营养枯竭, 排放废物达到一定浓度时, 囊体出现极化现象, 藻细胞死亡或形成孢囊脱离囊体, 导致囊体衰亡 ( 晏荣军等,2006) 如果外部环境条件允许, 孢囊脱离囊体后又能长成游动单细胞, 所以球形棕囊藻赤潮常出现在低光照和浑浊 湍流的水环境中, 黎明和傍晚时有最大生物量聚集, 赤潮以囊体为主要形态 由于水体流动硝酸盐营养得到补充, 脱离囊体后的孢囊或不动细胞再生成为游动单细胞大量繁殖, 又因环境变化使其生活史中的 3 种形态循环出现, 赤潮得以持续 参考文献陈园, 徐宁, 段舜山 有机氮比例和光强对赤潮藻球形棕囊藻生长和光合作用的影响 [J]. 生态环境学报,20 (3): 齐雨藻, 沈萍萍, 王艳 棕囊藻属的分类与生活史 [J]. 热带亚热带植物学报,9(2): 沈萍萍, 王艳, 齐雨藻, 等 球形棕囊藻的生长特性及生活史研究 [J]. 水生生物学报,24(6): 王超, 李新辉, 赖子尼, 等 珠江口球形棕囊藻 (Phaeo cystisglobosa) 赤潮后期的浮游植物群落结构特征研究 [J]. 生态科学,29(2): 王艳, 唐海溶, 蒋磊, 等 硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响 [J]. 植物学通报,23(2): 徐宁, 齐雨藻, 陈菊芳, 等 球形棕囊藻 (Phaeocystis globosascherfel) 赤潮成因分析 [J]. 环境科学学报,23 (1): 晏荣军, 尹平河, 潘剑宇, 等 棕囊藻囊泡的培养与去除研究 [J]. 热带海洋学报,25(3): 赵雪, 杨凡, 郭娜, 等 年 2 月汕头赤潮事件水文气象及海水理化因子影响分析 [J]. 海洋预报,26(1): BaumannM EM,CLancelot,FPBrandini,eta The taxonomicidentityofthecosmopolitanprymnesiophytepha eocystis:a morphologicalandecophysiologica1approach [J].JournalofMarineSystems,5:5-22. CaiZhouping,HuangWeiwei,DuanShunshan.2009.Celpro liferationofphaeocystisglobosa,aredtidecausativemarine microalgainvariousphosphorus(p) andnitrogen(n) re pleteconditions[j].ecologyandenvironmentalsciences, 18(2): LancelotC,KelerMD.1998.Autecologyofthemarinehapto phytephaeocystissp.[a].in:andersondm,cembelaa D,HalegraefGM(ed).PhysiologicalEcologyofHarmful AlgalBlooms[C].Springer, LIUJiesheng,VAN RIJSSELMarion,YANG Weidong,etal NegativeefectsofPhaeocystisglobosaonmicroalga [J].ChineseJournalofOceanologyandLimnology,28 (4): ThompsonP.1999.Theresponseofgrowthandbiochemical compositiontovariationsinday length,temperatureandir radianceinthemarinediatom Thalasiasira pseudonana [J].JPhycol,35: VerityPG,SmaydaTJ.1989.NutritionalvalueofPhaeocystis poucheti(prymnesiophyceae)andotherphytoplanktonfor Acartiaspp.(Copepoda):ingestion,eggproductionand growthofnaupli[j].marbiol,100: VerityPG,SmetacekV.1996.Organism lifecycles,preda tion,andthestructureofmarinepelagicecosystems[j]. MarEcolProgSer,130: VerityPG,WhippleSJ,NejstgaardJC,etal.2007.Colony size,celnumber,carbonandnitrogencontentsofphaeo cystispouchetifromwesternnorway[j].jplanlres,29: ( 责任编辑万月华 )

5 62 第 36 卷第 5 期水生态学杂志 2015 年 11 月 NegativePhototaxisandLow nitrateinducedflagelum AbscisioninPhaeocystisglobosa CHENJia xiong,liwei bin,liaoxiao shan,linchuan xu (ShantouMarinePlantsExperimentStation,ChineseAcademyofSciences,Shantou ,P.R.China) Abstract:PhaeocystisglobosaredtidesfrequentlyoccurinthesoutheastcoastalwatersofChinaandadverselyaf fectthelocaleconomyandmarineenvironment.phaeocystisglobosaisaeurythermal,euryhalinemarinemicroalgae withacomplexlifecyclealternatingbetweenfree livingcelsandcolonies.theunicelularstageinvolvesdiferent formsincludingstaticsinglecel,motilesinglecelandmicrozoospore.basedontheoccurenceanddisappearance characteristicsofphaeocystisglobosaredtidesandtheimportanceofnitratetothedevelopmentofredtides,we conductedexperimentstoexplorethenegativephototaxisofphaeocystisglobosaandtheflagelumabscisionofmo tilesinglecelsthatoccurswithnitratestarvation.thestudyprovidesatheoreticalbasisforunderstandingtheoc curenceanddisappearanceofphaeocystisglobosaredtides.asimpleexperimentaldevicewasdesignedandas sembledtoconductthephototaxisexperimentforthethreemorphologicalformsofphaeocystisglobosa:motilesingle cels,staticsinglecelsandcolonies.thenitratestarvationexperimentforinducingflagelum abscisionofmotile singlecelswasdividedintofiveparaleltreatments,albeginningwithf/2growthmedia,preparedwithnitrate: No.1,f/2growthmedia;No.2,f/2growthmediawithoutnitrogenelement;No.3,f/2growthmediawithane qualamountureanitrogensubstitutingfornitrate;no.4,f/2growthmediawiththesameamountnitritenitrogen substitutingfornitrate;no.5,f/2growthmediawithanextraequalamountofureanitrogen.resultsshowthatmo tilecelswithflagelumdisplaynegativephototaxis,whilestaticsinglecelsandcoloniesdonot.nitrateisanim portantlimitingfactorinthegrowthofphaeocystisglobosa.phaeocystisglobosadidnotgrownormalywhenthef/2 mediumcontainednonitrate,orwhensubstitutingnitriteorureafornitrate.itwasfoundthatnitratestarvationin ducedflagelumabscisionofphaeocystisglobosa,resultingintheaggregationofcelstoform colonies.further more,theadditionofnitrateinducedflagelumgrowthinstaticcelsofphaeocystisglobosa.inconclusion,themo tilecelsofphaeocystisglobosadisplaynegativephototaxis,explainingwhyphaeocystisglobosainitialybloomsin theturbidandturbulentwatersofearlyspringunderlowlightconditions.theexperimentonnitratestarvation showedthatalackofnitrateinducesflagelum abscisionandtheformationofstaticcelsandcoloniesinthelife historyofphaeocystisglobosa.nitratestarvationinducesflagelumabscisionofphaeocystisglobosaandcolonyfor mationbutmotilecapacityisrecoveredwhennitratelevelsincrease.thisisconsistentwiththefluctuationsofphae ocystisglobosabiomasobservedinthemarineenvironment. Keywords:Phaeocystisglobosa;negativephototaxis;nitrate;nitratestarvation;flagelumabscision

唐森铭 陈兴群 对福建省泉州湾口 大坠岛以北水域的浮游植物群落作了准同步昼夜连续观测 观测时间分 别在 年 月至 年 月内的秋 月 冬 月 春 月 夏 月 季大潮期 结果表 明 该水域的叶绿素 生物量 以下简称生物量 受湾内高生物量的影响在潮汐作用下出现波动 高 潮期出现低生物量 低潮期出现高生物量 靠近内湾的站位生物量大于湾外的站位 底层水体中的生物量普遍大于表层 底栖硅藻成为生物量变化的重要部分

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