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1 名称 胰泌素 英文名 secretin 别名 促胰腺素 概述 胰泌素 (Secretin) 是由十二指肠粘膜 S 细胞和分散在空肠 ( 主要是上端 ) 的 S 细胞释放的消化道激素 ( 又称促胰液素 胰液素 ), 胰泌素为一碱性多肽, 由 27 个氨基酸组成, 与抑胃肽, 血管活性肠肽及胰高血糖素的氨基酸序列分别有 个氨基酸序列完全相同 提示它们由同一激素祖先演化而来, 故把这四个肽归为一族, 称为胰泌素族 胰泌素主要由肾脏消除 胃酸是刺激胰液素释放的主要的生理作用最强的因素 刺激其释放的 ph 阈值为 4.5, 其他如胆汁 胆酸钠和脂肪 钙离子 酒精等均刺激胰液素升高 胰泌素具有如下生理作用 :1 强烈刺激胰脏外分泌腺分泌水和碳酸氢钠 2 刺激胆汁分泌 3 抑制胃泌素释放和胃酸分泌, 抑制生长抑素的局部释放 4 抑制胃肠蠕动, 并延缓胃液和固体食物的排空, 增强胆囊收缩素的胆囊收缩作用 原理 本法是标记抗原 (Ag ) 和非标记抗原 (Ag) 对特异性抗体 (Ab) 的竞争抑制反应, 其反应为 Ag +Ag+Ab (Ag Ab)+(AgAb) 当 Ag 和 Ab 的量保持恒定,Ag 与 Ag 之和大于 Ab 上的有效结合点的数目, 在该条件下,Ag 与 Ag 间存在着函数关系, 亦即随着 Ag 浓度增加,Ag-Ab 生成量多, 而 Ag -Ab 的数量则减少, 游离的 Ag 就增多 因为 Ag 对 Ab 的结合, 可因 Ag 竞争结合而遭抑制 反之, 当 Ag 量少时,Ag-Ab 生成量就少,Ag -Ab 量增多, 而游离的 Ag 减少 ( 图 1) 将结合的抗原抗体复合物(B) 与游离抗原 (F) 分离, 分别测定 B 和 F 的放射活性, 计算出 B/F 或 B/B+F 值, 可制出 B/F 或 B/B+p 对 Ag 量的关系曲线图 测定时, 需用一系列已知浓度的 Ag 和一定量 Ag 及相应抗体 Ab 混合, 然后测出各标准浓度 Ag 参加下的 Ag -Ab 放射结合率 (B/B+F) 或 (B/F), 绘出竞争抑制标准曲线 ( 图 2) 试验时, 在同样条件下, 根据被测 Ag 的放射性结合率, 从标准曲线上查知相应 Ag 含量

2 试剂 (1) 抗原的纯化 : 试验需用高纯度的抗原 通常, 蛋白质抗原的纯度应达到电泳分析纯, 电泳后仅显示单一区带, 并具有足够或完整的免疫原性 一般先经聚丙烯酰胺电泳鉴定, 再用等电聚焦 SDS 聚丙烯酰胺双相电泳鉴定为单一区带, 然后用于免疫动物和核素标记 纯抗原因其溶液中缺乏其他蛋白质作稳定剂, 或因贮存在纯离子浓度的缓冲液中, 故易形成聚合物, 因此在纯化抗原时需加注意 若采用聚合物抗原的标记, 用于 RIA 中将会显著增加非特异性结合, 降低测定的灵敏度 (2) 抗原的标记方法 : 标记用的核素有 γ 射线和 β 射线两大类 前者常用 I I Cr, 后者多用 H P 和 C 选择放射性核素首先要考虑比放射性, 比放射性愈高, 参与反应的抗原化学量就愈小, 测定方法的灵敏度相对就愈

3 高 核放射性和半衰期要适宜, 便于使用和防护 标记后的抗原要保持其免疫原性 标记技术要简便 经济 标记方法有直接标记和间接标记两大类, 以最常用的 I 为例分述如下 1 直接标记 : 将 I 直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上, 步骤单一, 操作简便, 标记物的比放射性较高, 但此法仅能用于标记含酪氨酸的化合物, 如所含的酪氨酸残基为蛋白质的特异性和生物活性所必需, 则该活性易因标记而失活 最常用的直接标记法为氯胺 T 标记法 ( 简称 h-t): 氯胺 T 是对甲基苯磺基酰胺的 N 氯衍生物的钠盐, 在水溶液中分解形成次氯酸成为一种氧化剂 在偏 碱溶液中 (ph 值 7.5) 能使带负电荷的 I 离子 (Na- I) 氧化成带正电荷的 I 离子, 借以取代蛋白质酪氨酸苯环的氢, 形成二碘酪氨酸 I 标记率的高低与抗原 ( 蛋白质或多肽 ) 分子中酪氨酸的含量及其在分子中 的暴露程度有关 标记方法的原则是将纯化抗原和 I 加入小试管底部, 继将配制的氯胺 T 快速冲入, 混匀振荡 1~2min 后加入偏重亚硫酸钠终止反应 再加碘化钾溶液稀释, 然后在葡聚糖 G50 柱上分离, 分别用井型闪烁计数器测定放射性强度 ( 脉 冲数 /min cpm), 前部为标记抗原峰, 后部为游离 I 峰 在标记抗原峰试管中加等量 1% 白蛋白作为稳定剂即为标记抗原液 2 间接标记 : 是先将 I 标记在载体上, 纯化后再与蛋白质或肽抗原结合, 用 N 琥珀酰亚胺 -3-[4- 羟 5-( I) 碘苯 ] 丙酸盐 (NSHPP) 作为间接标记试剂, 该试剂的 N 琥珀酰亚胺基与多肽游离氨基缩合为结合物, 使 I 标记的苯基与蛋白质的氨基结合 本法先以氯胺 T 使 I 接上 NSHPP, 由于在水溶液中它迅速水解为 3-(4- 羟苯基 ) 丙酸, 故在碘化反应中要尽快减少这种水解作用 这种碘标记物必须从水 箱抽提到有机溶液中去, 再除去有机溶剂后, 使 I-NSHPP 与蛋白质结合, 制 成 I-NSHPP- 蛋白质标记物 本法可标记缺乏酪氨酸残基的多肽, 其最大优点是不损伤蛋白质的活性, 能保存标记物高度的酶活性或免疫活性, 适合于对不稳定的蛋白质标记, 缺点是操作复杂, 标记率低

4 (3) 标记抗原的鉴定 : 为保证放射免疫测定的质量, 制备的标记物必需作如下鉴定 : 游离放射性碘的含量用三氯乙酸将所有蛋白质沉淀, 分别测定沉淀物和上清液的 cpm 值 一般要求游离碘占总放射性碘的 5% 以下 标记抗原贮存过久时, 可出现标记物的解离, 一旦超过 5% 则应废弃 免疫活性用小量标记抗原加过量抗体, 反应后分离 B 和 F, 分别测定其放射性, 算出百分结合率, 此值应在 80% 以上, 值越大, 表示损伤抗原越少 放射强度它是指单位重量抗原的放射强度, 比放射性越高, 测定越敏 感 标记抗原的比放射性以 I 的标记率或利用率表示 (4) 抗体的制备和鉴定 RIA 中所用的抗体应具有高亲和力和高特异性, 制备高价单相抗血清, 最好以标记用的纯化抗原免疫动物, 制备半抗原的抗血清, 需先将半抗原与载体结合, 使成免疫原, 常用的载体为牛血清白蛋白 抗血清同样也要加以严格鉴定, 包括其灵敏度 亲和力和特异性 在固定量标记抗原与不同浓度的抗血清作用的条件下, 测定 B/F 值, 制得一条 B/F 值对不同稀释度抗血清的曲线图 ( 图 3), 该曲线的直线部分上段的斜率是抗体最大亲和力的定性标志, 也是灵敏度的标志 斜率越大,RIA 灵敏度越高, 在许多 RIA 反应系统中, 呈最大灵敏度的抗体浓度为 B/F=1

5 当采用固定量的抗体 (Q0) 与不同浓度的抗原作用时, 以 B/F 对 B 作图, 所 得曲线的斜率就是亲和常数 (Ka) 的负数 ( 图 4) 在 RIA 反应系统中, 测定结构相似的不同物质时, 可以鉴定抗体的特异性 操作方法 本法分三个步骤, 即抗原与抗体反应 B 和 F 分离和放射性测定 (1) 抗原与抗体反应 : 将标本 ( 非标记抗原 ) 标记抗原和抗血清顺序定量加入小试管内, 置室温 (15~30 ) 作用 24h, 使其充分竞争结合

6 (2)B F 分离 : 分离技术多种多样, 常用沉淀法 1 第二抗体沉淀法 : 又称双抗体法, 在受检抗原与第一抗体特异性反应后加入相应的第二抗体, 使形成的抗原 - 第一抗体 - 第二抗体的复合物共沉, 一经离心即可使结合标记抗原 B 与游离抗原 F 分离 本法是特异性沉淀, 分离完全, 非特异性结合力低 但第二抗体用量较大, 成本较高 此外血清浓度 抗凝剂的有无因素可在一定程度上影响结果 2 聚乙二醇 (PEG) 沉淀法 : 使蛋白质处于等电点状态, 水化层破坏而导致蛋白质沉淀 本法优点是 PEG 制备方便 价廉 分离快速, 缺点是非特异沉淀物较多, 分离不完全 3 第二抗体 - 聚乙二醇沉淀法 : 本法既有 PEG 法的快速沉淀优点, 且保持第二抗体特异性沉淀的作用, 又减少第二抗体用量, 并降低 PEG 浓度, 使非特异沉淀物减少 4 活性炭吸附法 : 利用活性炭表面活性将小分子的游离部分吸附 如在活性炭表面涂上一层葡聚糖, 使它表面具有一定孔径的网眼, 从而允许小分子游离抗原或半抗原逸入而被吸附, 而大分子复合物则被排斥在外 在抗原与抗体反应后, 加入葡聚糖 - 活性炭, 放置 5~ 10min, 使游离抗原吸附在活性炭颗粒上, 离心使颗粒沉淀, 上清液中含有结合的标记抗原 (3) 放射性强度测定 :B 和 F 分离后, 即可测定其放射性强度 测量仪器有两类 : 液体闪烁计数仪 ( 测 β 射线 ) 和晶体闪烁计数仪 ( 测 γ 射线 ) 计数单位是探测器输出的电脉冲数, 单位为 cpm( 脉冲数 /min) 每次测定均需作一标准曲线图, 以标准抗原的不同浓度为横坐标, 以测到的相应放射性强度为纵坐标作图 放射性强度可任选 B 或 F, 亦可采用计算值 B/B+F B/F 或 B/B 标本应作双份测定, 取其平均值, 在标准曲线上查出相应的受检抗原浓度 正常值 (4.4±0.38)μg/L 临床意义 (1) 高胰泌素血症 : 胃酸分泌增多的十二指肠溃疡 卓 - 艾综合征以及晚期肾功能衰竭这 3 种情况胰泌素水平明显增高 胃酸分泌增多者胰泌素浓度为 (6.9±0.64)pg/ml, 卓 - 艾综合征患者空腹血浆胰泌素水平可高于 15pg/ml (2) 饮酒者 ( 包括一般的饮量 ) 可导致免疫活性的胰泌素的释放增加

7 (3) 胰泌素分泌不足, 导致强碱性胰液不足以中和进入十二指肠的胃酸, 形成溃疡 故部分十二指肠溃疡病人, 胰液素分泌量少于正常 (4) 乳糜泻和 小肠粘膜结肠化 肠炎患者, 空肠指状绒毛消失, 表面粘膜萎缩, 肠粘膜中内分泌细胞功能减退, 血中胰液素水平降低, 不能刺激胰腺分泌大量的碳酸氢盐, 不能中和进入十二指肠的胃酸, 故常伴空肠溃疡 附注 胃泌素的释放受迷走神经的兴奋影响, 亦受食物刺激 胃幽门窦扩张 体液因素等因素兴奋, 胃肠内容物的 PH 值对胃泌素的释放有很大影响

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