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庭宫
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1 第 25 卷第 1 期 2016 年 2 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.25No.1 Feb.2016 doi: /j.isn Stokes 参量共焦显微术用于弱各向异性物质的成像研究何燕玟 1, 程怡 1 1,2,3, 唐志列 (1. 华南师范大学物理与电信工程学院, 广东广州 ;2. 广东省量子调控工程与材料重点实验室, 广东广州 ;3. 广东省光电检测仪器工程技术研究中心, 广东广州 ) 摘要 : 提出将基于 Stokes 参量的偏振共焦显微成像技术应用于弱各向异性物质的成像研究通过将分振幅 Stokes 参量测量法与共焦扫描成像技术相结合的方法, 得到了基于 Stokes 参量测量的偏振共焦显微成像系统利用该系统对具有弱各向异性的生物组织样品进行逐点测量, 通过四个通道同时测量获得全部的 Stokes 参量再以计算得到的偏振参量作为成像物理量进行图像重建, 获得对应 Stokes 参量偏振度相位差方位角和椭率角的空间分布图像, 从而对生物组织实现细胞水平的偏振显微成像研究实验结果表明 : 基于 Stokes 参量的偏振共焦显微成像技术能够获得弱各向异性的生物组织样品的显微图像, 并通过比较样品的 Stokes 参量及相关偏振参量的分布图像, 提取样品全部的偏振信息, 从而为生物组织的特性研究提供更丰富的信息关键词 :Stokes 参量 ; 偏振光成像 ; 共焦显微成像 ; 各向异性中图分类号 :O436.3;Q 334 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) ImagingInvestigationofPolarizationConfocalMicroscopyBasedon StokesParametersofWeakAnisotropicSubstances HEYanwen 1,CHENGYi 1,TANGZhilie 1,2,3 (1.SchoolofPhysicsandTelecommunicationEngineering,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou510006, Guangdong,China;2.LaboratoryofQuantumInformationTechnology,Guangzhou510006,Guangdong,China; 3.GuangdongProvincialEngineeringResearchCenterforOptoelectronicInstrument,Guangzhou51006,Guangdong,China) Abstract:PolarizationconfocalmicroscopyimagingtechniquebasedonStokesparametersmeasurementisproposedto applytotheimagingresearchofweakanisotropicsubstances.bycombiningthedivision of amplitudestokesparameters measurementmethodwiththeconfocalscanningimagingtechnique,thepolarizationconfocalmicroscopyimagingsystem basedonstokesparametersmeasurementisachieved.byusingthesystemonthemeasurementofweakanisotropicbio logicaltisuepointbypointandthroughthefourchannelssimultaneously,wecanobtainalthestokesparameters.after calculatingthedata,theobtainedpolarizationparametersisusedasthephysicalquantityforimagerebuildandobtain thespatialdistributionimageswhichcontainthecorespondingstokesparameters,degreeofpolarization,phasedifer ence,azimuthangleandelipticityangle.therefore,thepolarizationmicroscopyimaginginvestigationofbiologicaltis 收稿日期 : ; 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 广东省自然科学基金重点项目 (S ) 作者简介 : 何燕玟 (1990- ), 女, 华南师范大学物理与电信工程学院硕士研究生, 主要从事光信息处理方面的研究 ( 电子邮箱 )heyanwen199010@163.com 通讯作者 : 唐志列 (1963- ), 男, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事光信息处理和激光共聚焦显微镜等方面的研究 ( 电子邮箱 )tangzhl@scnu.edu.cn

2 2 激光生物学报第 25 卷 sueatcelularlevelisrealized.theexperimentalresultshowsthat:themicroscopyimageofweakanisotropicbiological tisuecanbemeasuredbythepolarizationconfocalmicroscopytechniquebasedonstokesparametersmeasurement.and throughthecomparisonamongthedistributionimagesofthestokesparametersandtherelativepolarizationparameters, althepolarizationinformationofthesampleisextracted.itprovidesmorerichinformationinthestudyofbiologicaltis sueproperties. Keywords:stokesparameters;polarizationimaging;confocalmicroscopyimaging;anisotropy 0 引言偏振光成像技术能够提取与物质发生相互作用后的光束的偏振信息, 从而获得物体的偏振特性图像, 比单纯的强度成像能够提供更多待测物体的信息近年来, 偏振光成像技术在天文成像 [1], 目标识别 [2] [3] [4 7],3D 偏振积分成像和生物医学成像上取得重要进展当生物组织的结构或功能发生变化时, 其偏振特性也会发生改变 [8 12] 因此可以通过偏振光成像技术研究生物组织的特性但是, 传统的偏振光成像技术只能获得物体表面的偏振信息, 无法得到成像物体内部的偏振信息为了获得物体内部的偏振信息, 文献 [13] 所采用的偏振相干层析技术 ( 偏振 OCT) 是将偏振光成像技术与光学层析成像技术相合而成的, 但该方法的分辨率较难获得细胞内部的偏振信息另外, 传统的偏振光成像技术只是以光的偏振态中的某个投影作为成像物理量进行成像研究, 并没有将物体的偏振信息与结构信息分开为了实现细胞内部的全偏振层析成像, 文献 [14] 利用基于 Stokes 参量的共焦显微成像技术对具有各向异性的晶体方解石进行成像研究但该方法并没有实现对具有弱各向异性的生物组织样品的偏振特性的提取与研究近年来, 虽然新兴的 Mueler 矩阵方法论在研究生物组织的成像特性方面取得重要进展 [4,9,10], 但 Mueler 矩阵中元素多且对应的物理意义并不清晰, 因此在对生物组织进行偏振信息度量时容易造成困难因此本文提出将基于分振幅 Stokes 参量的偏振共焦显微成像技术用于具有弱各向异性的生物组织的成像研究, 该方法可以同时获得成像样品全部的 Stokes 参量, 并通过计算与图像重建, 得到生物组织的全偏振参量的同时成像再通过所获得的生物组织的 Stokes 参量及相关偏振参量的显微图像, 提取样品全部的偏振信息, 为研究生物组织特性提供更丰富的信息 1 偏振共焦显微成像的实验原理与装置根据偏振光学传输理论 [15], 物质的光学各向异性可由其 Mueler 矩阵来描述 : M 11 M 12 M 13 M 14 M 21 M 22 M 23 M 24 M= M 31 M 32 M 33 M 34 M 41 M 42 M 43 M 44 (1) 当光束通过具有光学各向异性的物质时, 出射光的 Stokes 参量 S 与入射光的 Stokes 参量 S 之间可由以下关系描述 : s 0 M 11 M 12 M 13 M 14 s 0 s 1 M S =MS 或 21 M 22 M 23 M 24 s = 1 s 2 M 31 M 32 M 33 M 34 s 2 s 3 M 41 M 42 M 43 M 44 s 3 (2) 由 (2) 式可知, 当入射光的偏振态 S 已知时, 样品的 Mueler 矩阵唯一地确定了其出射光的 Stokes 参量 S, 即通过出射光的 Stokes 参量 S 能够表征物体的光学各向异性分布因而, 利用已知偏振态的入射光, 再通过测量从物体出射光束的 Stokes 参量 S, 就可以获得该物体的光学各向异性分布采用分振幅 Stokes 参量测量法, 可以同时测量样品出射光的 Stokes 参量 S 而利用共焦扫描成像技术, 可以获得成像物体的显微结构图像为了进一步得到样品的光学各向异性的显微分布图像, 我们将分振幅 Stokes 参量测量法与共焦扫描成像技术相结合, 得到基于 Stokes 参量测量的偏振共焦显微成像系统, 系统光路图如图 1 所示图 1 中 S 为样品,G 为光阑,P 0 P 1 P 2 P 3 P 4 为偏振片,BS 0 为载玻片,BS 1 BS 2 BS 3 为偏振无关分束镜,L 0 L 1 L 2 L 3 L 4 L 5 为凸透镜,W 0 W 为 λ/4 波片,D 1 D 2 D 3 D 4 D 5 为五个相同的光电探测器光束从 He Ne 激光器 ( 北京大学物理系,JDW 3 型, 波长 632.8nm, 功率 2mW) 出射后, 经过反射镜 Mir ror 和偏振态发生器 P 0,W 0, 通过 40 物镜聚焦到样品表面使成像的物点足够小为了实现物点 Stokes 参量的共焦测量, 应使物面与探测面满足共轭关系 [16] 从样品出射的待测光束以平行光进入分振

3 第 1 期何燕玟等 :Stokes 参量共焦显微术用于弱各向异性物质的成像研究 23 幅 Stokes 参量测量系统, 最后聚焦到相应的光电探测器 D 1 D 2 D 3 D 4 的探测面上, 实现物面 Stokes 参量的共焦测量在进行 Stokes 参量测量前, 先采用 Equator Poles [18] 定标法测量出系统矩阵 A, 再通过理论值与实验值的比较来确定 Stokes 参量测量系统的可靠性为减小由激光器光强跳变引起的定标误差, 利用载玻片制成的分束器 BS 0 反射 ( 反射角小于 5 ), 聚焦后进入第五个探测器得到参考光信号 i 5 将已知偏振态光束作为入射光, 利用归一化的光强矩阵 I=[i 1 / i 5 i 2 /i 5 i 3 /i 5 i 4 /i 5 ] T 来确定系统矩阵 A 定标过程中, 激光先通过偏振态发生器产生线偏振光, 对应 Stokes 参量为 S=[1cos2βsin2β0] T (β 为起偏器的方位角 ), 计算得到系统矩阵 A 的前三列矩阵元再利用右圆偏振光 S R =[1001] T 和左圆偏振光 S L =[10 0-1] T, 求得最后一列矩阵元实验测量出的系统矩阵 A 为 : A= (5) 图 1 基于 Stokes 参量测量的透射式偏振共焦显微成像系统 Fig.1 Thetransmisivepolarizationconfocalmicros copyimagingsystembasedonstokesparametersmeas urement 由分振幅 Stokes 参量测量原理, 四个光电探测器 D 1 D 2 D 3 D 4 同时得到的四路光强信号 I 与其入射光 Stokes 参量 S 可由以下关系描述 [17] : i 1 α 11 α 12 α 13 α 14 s 0 i 2 α I=AS 或 21 α 22 α 23 α 24 s = 1 i 3 α 31 α 32 α 33 α 34 s 2 i 4 α 41 α 42 α 43 α 44 s 3 (3) 其中 A 为分振幅 Stokes 测量系统的系统矩阵由 (3) 式可知, 当系统矩阵 A 可逆时, 系统入射光的 Stokes 参量 S 可由以下关系得出 : S=A -1 I (4) 此时, 只要利用四个探测器得到的光强矩阵 I, 就能同时获得从样品出射后的光束的 Stokes 参量, 即为描述样品光学各向异性的偏振参量其行列式的值为 , 则系统矩阵 A 存在逆矩阵在进行验证实验时, 为简化操作和计算, 将偏振态发生器中的起偏器 P 0 的方位角 β 固定为 0, 旋转 λ/4 波片 W 0 产生已知偏振光此时, 由偏振态发生器产生的偏振光归一化后 Stokes 参量为 : s 0 1 s 1 cos S(β=0 )= 2 2θ = s 2 sin2θcos2θ s sin2 θ 3 (6) 其中 θ 为四分之一波片的方位角 λ/4 波片 W 0 旋转产生 19 个不同偏振态的入射光, 用 Stokes 参量测量系统测出光束相应的 Stokes 参量, 归一化后的结果如图 2 所示图中实线为 Stokes 参量的理论值, 点为相应 Stokes 参量的实验测量值由图 2 可见, Stokes 参量测量系统的理论值与测量值基本一致, 故本实验得到的系统矩阵是可靠的 2 实验结果分析为了将基于 Stokes 参量的偏振共焦成像技术用于弱各向异性物质的偏振显微成像研究, 我们利用图 1 所示的实验系统, 选取生物组织作为样品, 进行细胞水平的偏振显微成像研究许多生物组织的本

4 24 激光生物学报第 25 卷图 2 归一化后 Stokes 参量测量系统的测量值 ( 点 ) 与理论值 ( 线 ) 对比图 Fig.2 A comparisonoftheexperimentalvalue(point)andcalculatedvalue(line)ofthenormalized Stokesparameters 身成分具有偏振特性, 并且当其结构或功能改变时, 也会相应引起偏振特性发生变化因而获得生物组织全部的偏振信息, 并实现其结构的显微成像, 对研究生物组织特性具有独特的优势实验中将分振幅 Stokes 参量测量法与共焦扫描成像技术相结合, 对具有弱各向异性的生物组织样品进行逐点测量, 通过四个通道同时测量获得全部的 Stokes 参量计算得到相关的偏振参量后, 以这些偏振参量作为成像物理量进行图像重建, 获得相应的 Stokes 参量偏振度相位差方位角和椭率角的空间分布图像, 从而实现对生物组织达到细胞水平的偏振显微成像为测试该系统的成像性能, 实验中先用标准分辨率板 (Thorlabs,1951USAF 轮式图样 ) 进行显微成像实验, 结果如图 3 所示图 3 为分辨率板的二维测试图像, 即出射光 Stokes 参量中 s 0 的分布图像, 其扫描范围为 385μm 252μm 从图中结果可知, 该成像系统的分辨率至少为 2μm, 可以实现基于 Stokes 参量的偏振共焦显微成像选用甲状腺癌组织切片 (95% 酒精制作的冰冻切片 ) 作为成像样品, 在光学显微镜下观察到样品的结构如图 4(a) 所示利用图 1 所示实验系统进行偏振显微成像研究在图 1 所示的实验装置中, 以 120 线偏振光为入射光, 利用二维扫描平台对生物组织样品进行范围为 300μm 300μm 的逐点扫描, 图 3 Stokes 参量的偏振共焦显微成像系统的分辨率测试图像 Fig.3 Theresolutionimageofthepolarizationconfo calimagingsystem basedonstokesparametersmeas urement 测出样品各点出射光的 Stokes 参量将扫描区域内的每一像素点对应的出射光 Stokes 参量 s,s 0,s 1 2,s 3 分别进行二维图像重建, 获得甲状腺癌组织样品的偏振参量二维分布图像, 结果如图 4 所示, 其中 (b) ~(e) 分别为该区域内 Stokes 参量中 s 0,s 1,s,s 2 3 的二维分布图像, 并将 s,s 1,s 2 3 的分布用彩色显示在图 4 中, 比较 (a) 与 (b),stokes 参量中 s 0 的共焦显微图像, 即样品的结构分布图, 它与成像区域的光学显微镜图像基本一致, 证明了偏振共焦显微成像系统的可靠性观察图 (c)~(e) 可见,s 1,s,s 2 3 的

第 1 期何燕玟等 :Stokes 参量共焦显微术用于弱各向异性物质的成像研究 25 分布图像所反映的信息并不相同例如, 对比 s 1,s 2, s 3 图中白色方框部分可见, 三图所反映的样品的偏振特性并不相同这是由于所选取的甲状腺癌组织具有光学各向异性对于相同偏振态的入射光, 样品的各向异性影响了出射光的偏振态结果证明基于 Stokes

5 第 1 期何燕玟等 :Stokes 参量共焦显微术用于弱各向异性物质的成像研究 25 分布图像所反映的信息并不相同例如, 对比 s 1,s 2, s 3 图中白色方框部分可见, 三图所反映的样品的偏振特性并不相同这是由于所选取的甲状腺癌组织具有光学各向异性对于相同偏振态的入射光, 样品的各向异性影响了出射光的偏振态结果证明基于 Stokes 参量的偏振共焦显微成像技术可以对生物组织这类弱各向异性物质进行显微成像研究, 从而获得样品全部的偏振信息图 4 甲状腺癌组织样品的光学显微图像及 Stokes 参量的二维分布图像 (a) 光学显微镜图像 ; (b)s 0 分布图 ;(c)s 1 分布图 ;(d)s 2 分布图 ;(e)s 3 分布图 Fig.4 Theopticalmicroscopeimageandthestokesparameters2D distributionimagesofthethyroid cancertisuesample.(a)theimageoftheopticalmicroscope;(b)thedistributionimageofs ;(c) 0 Thedistributionimageofs 1 ;(d)thedistributionimageofs ;(e)thedistributionimageofs 2 3 在获得样品出射光的 Stokes 参量 s 0,s 1,s,s 2 3 的空间分布后, 为了得到更多关于样品偏振特性的信息, 通过计算得到样品的偏振度 P 振幅比 γ 相位差 φ 方位角 θ 椭率角 ε 分布图其中各偏振参量的公式分别描述为 : P(x,y)= s2 1 (x,y)+s2 2 (x,y)+s2 (x,y) 3 槡 s 2 (x,y 0 ) (7) γ(x,y)=tan( 1 2 arccos(s 1 )) (8) φ(x,y)=arctan s 3 (x,y) s 2 (x,y) θ(x,y)= 1 2 arctans 2 (x,y) s 1 (x,y) ε(x,y)= 1 2 arcsin s 3 (x,y) 槡 s 2 1 (x,y)+s2 2 (x,y)+s2 (x,y 3 ) (9) (10) (11) 所获得的其他偏振参量的图像结果如图 5 所示, 其中 (a)~(e) 分别对应样品的出射光的偏振度 P 振幅比 γ 相位差 φ 方位角 θ 椭率角 ε 的分布图偏振度 P 表征了样品出射光中完全偏振光所占的比例, 振幅比 γ 表征了样品光在 Y 轴和 X 轴方向上的光强谁占优势, 相位差 φ 表征了样品光在 Y 轴和 X 轴方向上的相位差, 方位角 θ 表征了椭圆偏振光的主轴与 X 轴正方向的夹角, 而椭率角 ε 表征了椭圆偏振光的半短轴与半长轴之比 [14] 在图 5 中, 比较各图中的白色方框部分可见, 图中轮廓的差异反映了生物样品的不同偏振特性再结合图 4 中 Stokes 参量 s 1,s 2,s 3 的分布图像, 提取了样品全部的偏振信息, 并且不同偏振参量的二维分布图像可以直观地观察到样品的不同偏振特性因而, 通过进一步分析这些偏振参量图像可以对生物样品特性的研究提供更丰富的信息

6 26 激光生物学报第 25 卷图 5 甲状腺癌组织样品的相关偏振参量二维分布图像 (a) 偏振度 P 分布图 ;(b) 振幅比 γ 分布图 ;(c) 相位差 φ 分布图 ;(d) 方位角 φ 分布图 ;(e) 椭率角 ε 分布图 Fig.5 Thedistributionimagesofthecorespondingpolarizationparametersofthethyroidcancertisue sample.(a)thedistributionimageofthedegreeofpolarizationp;(b)thedistributionimageofampli tuderelationγ;(c)thedistributionimageofphasediferenceφ;(d)thedistributionimageofazimuth angleφ;(e)thedistributionimageofelipticityangleε 3 结论通过将分振幅 Stokes 参量测量法与共焦扫描成像技术相结合的方法, 得到了基于 Stokes 参量测量的偏振共焦显微成像系统利用该系统对具有弱各向异性的生物组织样品进行成像研究通过以物体的偏振参量作为成像物理量进行图像重建, 获得相应的 Stokes 参量偏振度相位差方位角和椭率角的空间分布, 从而对生物组织实现细胞水平的偏振显微成像并通过比较该物体的 Stokes 参量及相关偏振参量的分布图像, 从而提取生物样品的全部偏振信息, 为研究生物组织特性提供更丰富的信息参考文献 [1] CHRYSOSTOMOUA,LUCASPW,HOUGHJH.Circularpo larimetryrevealshelicalmagneticfieldsintheyoungstelarob jecthh [J].Nature,2007,450: [2] CHUN CSL,SADJADIFA.Polarimetriclaserradartarget clasification[j].opticsleters,2005,30(14): [3] CARNICERA,JAVIDIB.Polarimetric3Dintegralimagingin photonstarvedconditions[j].opticsexpres,2015,23(5): [4] SUNM,HEH,ZENGN,etal.Characterizingthemicrostruc turesofbiologicaltisuesusingmuelermatrixandtransformed polarizationparameters[j].opticsexpres,2014,5(12): [5] JACQUESSL,RAMELLA ROMANJC,LEEK.Imagingskin pathologywithpolarizedlight[j].journalofbiomedicaloptics, 2002,7(3): [6] KUNNENB,MACDONALDC,DORONINA,etal.Applica tionofcircularlypolarizedlightfornon invasivediagnosisofcan ceroustisuesandturbidtisue likescateringmedia[j].journal ofbiophotonics,2014,8(4): [7] YUFFAAJ,GURTONKP,VIDEENG.Three dimensionalfa cialrecognitionusingpasivelong wavelengthinfraredpolarime tricimaging[j].appliedoptics,2014,53(36): [8] WANGLV,COTEGL,JACQUESSL.Specialsectionguest editorial:tisuepolarimetry[j].journalofbiomedicaloptics, 2002,7(3):278. [9] ALALIS,VITKINA.Polarizedlightimaginginbiomedicine:e mergingmuelermatrixmethodologiesforbulktisueasesment [J].JournalofBiomedicalOptics,2015,20(6):1 6. [10] GHOSH N,WOODM FG,LIS,etal.Muelermatrixde compositionforpolarizedlightasesmentofbiologicaltisues [J].JournalofBiophotonics,2009,2(3): [11] GHASSEMIP,L LETP,GERMERTA,etal.Out of planestokesimagingpolarimeterforearlyskincancerdiagnosis [J].JournalofBiomedicalOptics,2012,17(7):1 9. [12] SANKARANV,WALSHJT,MAITLANDDJ.Comparativestudy ofpolarizedlightpropagationinbiologictisues[j].journalof BiomedicalOptics,2002,7(3): ( 下转第 55 页 )

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