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1 第 33 卷第 8 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2011 年 8 月 Vol.33 No.8 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Auġ 2011 文章编号 : (2011) 分子氨对黄河鲤鱼血清抗氧化反应的影响 张红梅, 姜会民 菏泽学院山东省动物生理生化重点实验室, 山东菏泽 摘要 : 为了探讨养殖水域中分子氨对水生生物的毒性效应, 在前期毒性试验的基础上设置 3 个试验组 ( 分子氨质量浓度分别为 0.071,0.143,0.284 mg/l) 1 个对照组对黄河鲤鱼 (Cyprinuscarpiohaematopterus Temminket Schlegel) 进行毒性试验, 在试验的 7,14,28,35d 取样检测, 测定试验鱼血清超氧化物歧化酶 (SOD) 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 的活力和丙二醛 (MDA) 质量浓度. 结果表明 : 随着分子氨质量浓度的增加, 黄河鲤鱼血清中 SOD 酶活力呈先升后降的趋势, 质量浓度为 0.28mg/L 时,SOD 活力低于对照组,GSH-Px 的活力和 MDA 质量浓度呈现上升的趋势, 方差分析表明分子氨极显著地提高血清 MDA 质量浓度 (p<0.01), 二者存在剂量 效应关系 ; 随着分子氨暴露时间的延长,SOD 活力呈下降趋势,MDA 质量浓度呈上升趋势, 方差分析差异不显著 (p>0.05). 在试验质量浓度范围内分子氨可降低鲤鱼抗氧化能力, 且 MDA 可作为一种有效的生物标志物评价分子氨的毒性. 关键词 : 分子氨 ; 黄河鲤鱼 ; 血清 ; 超氧化物歧化酶 ; 谷胱甘肽过氧化物酶 ; 丙二醛中图分类号 :S 文献标志码 :A 氨氮 (AmmoniaNitrogen) 主要来源于水生动物排泄物及水体中死亡的动植物, 它是中无机氮的主要 存在形式, 以离子氨 (NH4 + ) 和非离子氨 (NH3) 这两种形式保持水体动态平衡.pH 酸碱度是影响水体平衡 的重要因素, 高 ph 值的情况下, 氨 (NH3) 质量浓度较高 [1], 由于这种氨分子很小, 能轻易穿透鱼鳃表面的 粘膜进入鱼的体内, 更容易对鱼体造成危害. 环境检测显示, 氨氮过量已成为黄河流域水体污染的一个显 [2] [3-5] 著特征, 而大量研究也证明, 分子氨对鱼类生长产生有害. 但目前关于分子氨对鱼类抗氧化系统的 影响的报道却不多见. 本研究以黄河鲤鱼 (CyprinuscarpiohaematopterusTemminketSchlegel) 为研究对 象, 探讨分子氨对黄河鲤鱼血清抗氧化系统 ( 超氧化物歧化酶 (SuperoxideDismutase,SOD) 谷胱甘肽过 氧化物酶 (GSH-Px) 活性的变化及丙二醛 (Malondialdehyde,MDA) 质量浓度 ) 的影响, 拟为进一步研究分 子氨毒理提供理论依据, 为黄河流域环境检测提供科学依据. 1 材料和方法 1.1 试验材料 试验用鱼黄河鲤鱼购自菏泽鱼苗场, 共 160 尾, 体长 (10.24±1.56)cm, 体质量 (93.54±15.46)g. 1.2 试剂与仪器 试剂 : 氯化氨 (Ammoniumchloride), 国产分析纯 ( 北京精求化工有限责任公司 ). 1 收稿日期 : 基金项目 : 山东省自然科学基金资助项目 (ZR2010CM046). 作者简介 : 张红梅 (1977 ), 女, 河北沧州人, 硕士研究生, 主要从事鱼类毒理研究. 通信作者 : 姜会民, 讲师.

2 第 8 期 张红梅, 等 : 分子氨对黄河鲤鱼血清抗氧化反应的影响 89 仪器 :723 型可见光分光光度计 ( 上海天普 ); 台式高速冷冻离心机 (Eppendor). 1.3 试验设计 根据急性毒性试验结果设定试验的质量浓度梯度. 本试验采用两因素四水平设计, 第 1 组为对照组, 其余 3 组为试验组, 由分析纯 NH4Cl 调节分子氨水平, 使最终质量浓度分别为 0,0.071,0.143,0.284 mg/l. 每 24h 测量氨氮质量浓度, 每 48h 更换 1/2 相同质量浓度的试验液, 添加 NH4Cl 以保证水中氨氮质量浓度稳定. 试验期间用饱和 Na2CO3 使水的 ph 值维持在 (7.7±0.1), 水温 (11±1), 总硬度 (6.58±0.21)mmol/L, 分子 [1] 氨质量浓度由氨氮质量浓度 ph 值和水温计算求得. 试验的 7,14,28,35d 分别取样. 1.4 酶活力测定 暴露时间结束后, 随机取鲤鱼 3 尾, 先后用自来水 蒸馏水冲洗, 擦干后测量体长 称质量, 然后迅 速解剖. 采用断尾静脉取血后混合, 肝素钠抗凝, 按 V( 血液 ) V(0.65% 的生理盐水 )=1 2 混匀, 4,3000r/min, 离心 20min, 取上清液待用, 血清中 SOD,GSH-Px 活性 MDA 质量浓度的测定采用 试剂盒 ( 南京建成 ). 1.5 数据的整理与统计分析 调用 SPSS13.0 软件包的 OneWayANOVA 过程进行单因素方差分析和 PostHocTests 多重比较, 用 Excel2003 作图. 2 结果 2.1 分子氨对于黄河鲤鱼血清 SOD 活力的影响 分子氨暴露时间对血清 SOD 活力的影响见图 1. 由图 1 可知, 对照组鲤鱼血清中的 SOD 活力无规律 性变化, 各试验组鲤鱼血清中的 SOD 活力呈下降趋势, 方差分析差异不显著 (p>0.05). 分子氨质量浓度对血清 SOD 活力的影响见图 2. 由图 2 可知, 随分子氨质量浓度的增加, 各时间段 SOD 活力都出现先上升后下降的规律性的变化, 且试验 Ⅲ 组 SOD 活力均低于对照组 ;7,14,28d 试验 Ⅱ 组 血清 SOD 活力达到最高, 方差分析各质量浓度之间差异不显著 (p>0.05);35d 时试验 Ⅰ 组血清 SOD 活 力达最高, 方差分析各试验组与对照组之间差异不显著 (p>0.05). 图 1 血清 SOD 活力与分子氨暴露时间关系 2.2 分子氨对于黄河鲤鱼血清 MDA 的影响分子氨暴露时间对于鲤鱼血清 MDA 质量浓度的影响见图 3. 由图 3 可知, 随着分子氨暴露时间的延长, 鲤鱼血清中的 MDA 质量浓度出现规律性上升趋势, 方差分析表明各质量浓度组内血清 MDA 差异不显著 (p>0.05). 分子氨质量浓度对于鲤鱼血清 MDA 质量浓度的影响见图 4, 随着分子氨质量浓度的增加, 鲤鱼血清中的 MDA 质量浓度呈现上升趋势, 方差分析表明各时间段内血清 MDA 质量浓度差异极显著 (p<0.01),

3 90 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 33 卷 表明 MDA 质量浓度和分子氨质量浓度二者之间存在剂量 效应关系, 多重比较显示 7,14d 时对照组 试 验 Ⅰ 组与试验 Ⅱ 组 试验 Ⅲ 组差异极显著 (p<0.01), 对照组 试验 Ⅰ 组之间差异不显著 (p>0.05), 试验 Ⅱ 组 试验 Ⅲ 组之间差异显著 (p<0.05);28,35d 时各试验组与对照组之间差异显著 (p<0.05). 图 2 血清 SOD 活力与分子氨质量浓度的关系 图 3 血清 MDA 与分子氨暴露时间关系 图 4 血清 MDA 与分子氨质量浓度的关系

4 第 8 期 张红梅, 等 : 分子氨对黄河鲤鱼血清抗氧化反应的影响 分子氨暴露时间对于黄河鲤鱼血清 GSH-Px 活力的影响分子氨暴露时间对于鲤鱼血清 GSH-Px 活力的影响见图 5. 由图 5 可知, 随着分子氨暴露时间的延长, 鲤鱼血清中的 GSH-Px 活力变化规律不明显. 分子氨质量浓度对于鲤鱼血清 GSH-Px 活力的影响见图 6, 随着分子氨质量浓度的增加, 鲤鱼血清中的 GSH-Px 活力呈现上升趋势, 方差分析表明各时间段内血清活力差异不显著 (p>0.05). 图 5 血清 GSH-Px 活力与分子氨暴露时间关系 图 6 血清 GSH-Px 活力与分子氨质量浓度的关系 3 讨论 正常情况下, 在细胞代谢过程中不断产生的自由基会被体内的 SOD GSH-Px 等抗氧化酶清除, 以保 持平衡状态. 当鱼类暴露于污染环境时, 由于污染物参与鱼体内氧化还原循环并产生大量的活性氧, 造成 鱼体内抗氧化酶活力 自由基质量浓度变化, 从而对鱼体造成损伤, 因而测定鱼体内 SOD GSH-Px 活力 [6] 和 MDA 质量浓度变化, 已成为鱼类毒理学和病理学的研究热点. SOD 是生物消除超氧化物自由基的天然抗氧化剂, 能有效地将 O - 2 [7] 歧化并生成 H2O2 及 O2. 谢文 平等研究了氯氰菊酯可使草鱼鱼种 SOD 活力先升高后抑制 [8] ; 韩英等研究表明亚硝酸盐低质量浓度组鲤 鱼血液的 SOD 活力明显高于高质量浓度组 [9] ; 赵元凤等研究表明 0.01,0.1,0.5mg/L 低质量浓度 Cd 2+ 对 鲢鱼组织 SOD 活力起诱导作用,1.00mg/L 高质量浓度 Cd 2+ 对鲢鱼组织 SOD 活力起抑制作用 [10] ; 赵海 [11] 涛等研究表明低质量浓度分子氨具有相对较高的 SOD 活力, 高质量浓度分子氨中 SOD 活力下降. 本研 究表明, 分子氨质量浓度影响黄河鲤鱼血清 SOD 活力, 表现为低质量浓度促进, 高质量浓度抑制, 与已有

5 92 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 33 卷 研究一致. 其原因是生物体合成 SOD 常受 O - 2 质量浓度的影响, 低质量浓度的污染物可引起生物体内 O - 2 增多, 进而出现 SOD 诱导效应, 当污染物质量浓度进一步升高, 产生的大量氧自由基消耗了过多 SOD, 进 而 SOD 活力下降. MDA 是生物膜中多价不饱和脂肪酸受自由基作用生成的脂质过氧化代谢产物, 其质量浓度可以直 接反映动物细胞和亚细胞水平的脂质过氧化水平和机体受损伤的程度 [12]. 本研究表明, 随着分子氨暴 露时间的延长和质量浓度的增加, 黄河鲤鱼血清 MDA 质量浓度都出现明显的上升趋势, 且方差分析表 明, 质量浓度对于血清 MDA 质量浓度影响效果显著, 存在剂量 效应关系, 与已有研究相一致. 王琨 等研究表明分子氨在试验质量浓度范围内使 MDA 质量浓度显著上升 (p<0.05) [13] ; 徐军等研究表明臭 氧处理可使草鱼血液 MDA 活力显著升高 (p<0.05) [14] ; 李瑷伶等研究表明随着镉染毒时间的延长 [15] MDA 质量浓度上升. 分析原因可能与污染物暴露引起生物体内自由基浓度升高有关. 同时 MDA 质 [16] 量浓度的变化与 SOD 活力存在差异, 与 Martinez 等结论相一致. 这可能与试验初期鱼体发生应激损 伤导致氧自由基大量堆积有关. 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 可以清除由活性氧和 OH 诱发的脂质过氧化物, 保护细胞膜结构和 功能的完整性. 本研究发现, 随分子氨质量浓度的增加, 黄河鲤鱼血清 GSH-Px 活力存在上升趋势但是不 显著, 且随时间延长, 先升后降, 这与徐军等高质量浓度组臭氧处理使草鱼血液 GSH-Px 先升后降结论一 [14] 致. 究其原因可能是当污染物达一定质量浓度时, 鱼体多余的自由基对细胞中的各种酶造成损伤, 使 GSH-Px 活力下降. 综上所述, 我们认为在试验质量浓度范围内水体中分子氨损害鲤鱼抗氧化系统, 且血清 MDA 质量浓 度与分子氨质量浓度呈现剂量 效应, 准确地反映了氧化损伤的程度. 致谢 : 本试验过程得到了菏泽学院生命科学系朱道玉教授 张贵生副教授悉心帮助, 在此表示感谢. 参考文献 : [1] 陈佳荣. 水化学 [M]. 北京 : 中国农业出版社,1996: [2] 武雪萍, 蔡典雄, 梅旭荣, 等. 黄河流域农业水, 资源与水环境问题及技术对策 [J]. 生态环境,2007,16(1): [3] COLTJE,ARMSTONGDA.NitrogenToxieitytoCrustaeeansFishandMolusks[J].AmerieanFisheriesSoeietyand NortheastSoeietyofEonservationEngineers,1981,78(1): [4] 余瑞兰, 聂湘平, 魏泰莉, 等. 分子氨和亚硝酸盐对鱼类的危害及其对策 [J]. 中国水产科学,1999(3): [5] IPY K,CHEW SF,LEONGIA,etal.TheSinensis(FamilyEleotridae)StoresGlutamineandRedueesSleeperAmmoniaProduetionDuringAerialExposure[J].JournalofComparativePhysiology.BioehemiealSystemieandEnviroṉ mentalphysiology,2001(5): [6] ORBEA AF,AHIMIH D,CAJARAVILLE M P,etal.ImmunolocalizationofFourAntioxidantEnzymesinDigestive GlandsofMolusksandCrusṯaceansandFishLiver[J].Histochem CelBio,2000,114(5): [7] WILLMA M F,KAZINA S B.LocalizationofSuperoxide Dismutase Activityin Rat Tissues [J].Free Radical Biology&Medicine,1997(22): [8] 谢文平, 马广智. 氯氰菊酯对草鱼鳃和肝组织超氧化物歧化酶 (SOD) 活性的影响 [J]. 水产科学,2003,22(6):5-7. [9] 韩英, 张辉, 王琨. 亚硝态氮对鲤鱼种血液 SOD 及 GSH-Px 的影响 [J]. 淡水渔业,2007,37(1): [10] 赵元凤, 吕景才, 宋晓阳. 镉污染对鲢鱼超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响 [J]. 农业生物技术学报,2002, 10(3): [11] 赵海涛. 氨氮对南方鲶 (SilurusmeridionalisChen) 幼鱼血液生理 生化及非特异性免疫指标的影响 [D]. 重庆 : 西南农业大学,2006. [12] 陈缓, 周玫. 自由基医学 [M]. 北京 : 人民军医出版社,1991:30-31.

6 第 8 期 张红梅, 等 : 分子氨对黄河鲤鱼血清抗氧化反应的影响 93 [13] 王琨, 韩英. 喹乙醇和分子氨对鲤幼鱼血清 SOD 和 MDA 的影响 [J]. 东北农业大学学报,2007,19(2): [14] 徐军, 马光智. 臭氧对草鱼鱼种血液 MDA GSH 浓度以及 GPX 活性的影响 [J]. 华南师范大学学报 : 自然科学版, 2004(2): [15] 李瑷伶, 蓝昕, 司万童. 等. 己烯雌酚对染镉草鱼 GSH-Px SOD 和 MDA 影响的研究 [J]. 农业环境科学学报, 2008,27(1): [16]MARTINEZALVAREZR M,HIDALGO M C,DOMEZAIN A,etal.PhysiologicalEhangesofStrugeonAcipEnseṟ naccaricausedbyincreasinggenvironmentalsalinity[j].jexpbiol,2002(205): EffectofAmmoniaonAntioxidantResponses inserumofyelowrivercarps ZHANG Hong-mei, JIANG Hui-min KeyLaboratoryofAnimalPhysiologyandBiochemistryofShandongProvince,HezeColege,HezeShandong274015,China Abstract:Tostudythetoxicefectsofammoniaontheaquaticspecies,juvenilesofYelow Rivercarpwereassignedto4groupswithanammonianitrogenconcentrationof0 (control),0.071,0.143and0.284 mg/lrespectively.samplesweretakenon7,14,28and35daysafterthestartofthetreatmentsandsodand GSH-Pxactivitiesand MDAcontentoftheserum weredetermined.theresultsdemonstratedthatwith increasingammoniaconcentration,theactivityofsodintheserumfirstincreasedandthendecreased, whiletheactivityofgsh-pxandcontentofmdashowedarisingtrend.varianceanalysisindicatedthat ammoniaexposurehadahighlysignificantinfluenceonthecontentofmda (p<0.01).withtheexteṉ sionofammoniaexposuretime,theactivityofsoddeclinedandthecontentofmdaexhibitedarising trend.varianceanalysisshowednosignificantdiference(p>0.05).withintheconcentrationrangeofthe test,ammoniareducedtheoxidationresistanceofcarp,andmdacontentcouldbeusedasanefectivebiomarkerfortoxicityassessmentofammoniainyelow Rivercarps. Keywords:ammonia;Yelow Rivercarp;serum;SOD;GSH-Px;MDA 责任编辑胡杨

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