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泗红汪
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1 广西医科大学学报 JOURNL OFUNXIMEDICL UNIVERSITY 2018 May ;35(5) 587 非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征对血红蛋白 E 及血红蛋白 E 复合 β- 地中海贫血的影响 * 李琦, 陈萍, 肖璇, 林伟雄, 陈文强 ( 广西医科大学第一附属医院地方病科中国医学科学院地中海贫血防治研究重点实验室, 南宁 ) 摘要目的 : 探讨非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征 (d-hpfh) 对血红蛋白 E(Hb)E 及 HbE 复合 β- 地中海贫血 (HbE - 地中海贫血 ) 临床特征的影响方法 : 选取 2016 年 1 月至 2017 年 12 月于广西医科大学第一附属医院行地中海贫血筛查及基因诊断的患者对患者进行血常规及 Hb 分析 ; 应用荧光 PCR 熔解曲线法进行 β- 地中海贫血基因型检测 ; 应用 DN 测序法进行 γ- 珠蛋白基因启动子分析结果 :HbE 杂合子复合 d-hpfh 的 HbF 水平高于单纯 HbE 杂合子 (P<0.05); 两组血常规的 Hb 平均红细胞容积 (MCV) 平均红细胞血红蛋白量 (MCH) 平均红细胞血红蛋白浓度 (MCHC) 差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05) HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 的 HbF 水平高于单纯 HbE - 地中海贫血 ( 均 P<0.05);HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 血常规的 Hb MCV MCH MCHC 均高于单纯 HbE - 地中海贫血 ( 均 P<0.05) 结论:d-HPFH 可使 HbE 杂合子与 HbE - 地中海贫血的 HbF 水平升高, 并改善 HbE - 地中海贫血的贫血症状关键词 d-hpfh;hbe; β - 地中海贫血 ; 基因突变中图分类号 :R 文献标志码 : 文章编号 : X(2018) DOI: /j.cki /r LiQi,ChePig,XiaoXua,Li Weixiog,Che Weqiag.(DepartmetofEdemicDiseases,TheFirst Efectsofo-deletioalhereditarypersisteceoffetalhemoglobiohemoglobiE -thalassemia filiatedhospitalofuagximedicaluiversity,keylaboratoryofthalassemiamedicie,chiesecademyofmedicalscieces,naig530021,chia) bstract Objective:Toexploretheefectsofo-deletioalhereditarypersisteceoffetalhemoglobi(d- HPFH)ocliicalfeaturesihemoglobi(Hb)Ead HbE -thalassemiapatiets.methods:patietsuderwetthalassemiadiagosisiourhospitalfromjauary2016todecember2017 wereivolvedithis study.hematologicalaalysiswereperformed.eotypesofβ-thalassemiaweredetectedbypcr.mutatios ofγḡlobipromoterwereaalyzedbydnsequecig.results:thefetalhb(hbf)levelihbeheterozygotescombiedwithd-hpfh group werehigherthathati HbEheterozygoteswithoutd-HPFH group(p<0.05).nosigificatdifereceswereotedi Hb,meacorpuscularvolume(MCV),meacorpuscularhemoglobi(MCH)ad meacorpuscularhemoglobicocetratio(mchc)levelsbetweethe twogroups(p >0.05).Patietswith HbE -thalassemiacoiheritedd-hpfh hadicreased HbF,Hb, MCV,MCHad MCHClevelscomparedwiththoseofHbE -thalassemiawithoutd-hpfh(p<0.05). Coclusio:d-HPFHcouldresultiaicreasedlevelofHbFadateuatecliicalsymptomsi HbE adhbe -thalassemiapatiets. Keywords d-hpfh;hbe; β -thalassemia;geemutatio * 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ); 中国医学科学院地中海贫血防治研究重点实验室课题资助项目 (No.2017PT32012); 广西重点实验室建设资助项目 (No ); 广西地中海贫血防治临床医学研究中心建设课题资助项目 (No. 桂科 D ) 通信作者, cpig62@hotmail.com 收稿日期 : 血红蛋白 (hemoglobi,hb)e 是由于 β- 珠蛋白基因第 26 个密码子发生点突变 ( ), 赖氨酸取代谷氨酸 (lu Lys) 所致的一种特殊的 β- 地 [1] 中海贫血基因突变类型 HbE 杂合子无临床症状, 纯合子可有轻度贫血当 HbE 复合 β- 地中海贫血 (HbE - 地中海贫血 ) 时, 可导致轻型中间型 [2] 或重型 β- 地中海贫血非缺失型遗传性持续性胎

2 588 广西医科大学学报 2018 May;35(5) 儿血红蛋白综合征 (o-deletioalhereditarypersisteceoffetalhemoglobi,d-hpfh) 是一组由 γ- 或 γ- 珠蛋白基因启动子点突变或小片段缺失引起 γ- 珠蛋白基因表达增加而导致胎儿血红蛋白 (HbF) 持续增高的遗传性血红蛋白病 [3] 而目前关于 d-hpfh 对 HbE 及 HbE - 地中海贫血临床特征影响的研究报道较少因此, 本研究对 HbE 及 HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 进行分析, 探讨 d-hpfh 对 HbE 及 HbE - 地中海贫血临床特征的影响 1 资料与方法 1.1 病例来源选取 2016 年 1 月至 2017 年 12 月在广西医科大学第一附属医院行地中海贫血筛查及基因诊断的患者病例纳入标准 :Hb 电泳筛查为 HbE 及 HbE - 地中海贫血, 年龄 1 岁 1.2 血常规分析常规操作抽取患者外周静脉血 2mL, 应用血细胞自动分析仪 (CELL-DYN1700, 美国 bbot 公司 ) 进行血常规检测, 收集红细胞计数 (RBC) Hb 平均红细胞容积 (MCV) 平均红细胞血红蛋白量 (MCH) 平均红细胞血红蛋白浓度 (MCHC) 等资料 1.3 Hb 分析应用高效液相色谱法 (HPLC)(Hb VariatⅡ, 美国伯乐公司 ) 对 HbF HbE 水平进行定量分析 1.4 全血 DN 提取采用自动核酸提取仪 (Lab- id820, 中国厦门百维信生物科技有限公司 ) 提取全血 DN, 用微量紫外分光光度计 (Nao Drop ND-8000, 美国 Thermo 公司 ) 进行 DN 浓度检测 1.5 β- 地中海贫血基因分析根据试剂盒说明书 ( β - 地中海贫血基因检测试剂盒, 中国厦门致善生物科技有限公司 ), 采用荧光 PCR 熔解曲线法进行 β- 地中海贫血基因型检测 1.6 γ- 珠蛋白基因分析引物设计参照文献 [4], 分别设计两对引物扩增 γ γ 珠蛋白基因启动子 γ 上游引物 :5 -CCTCTTCTT- TT-3, γ 上游引物 5 -CCTCTTT- CTTTT-3, 两者共同下游引物 :5 - C-TCTCTCTTTT-3, 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成采用普通 PCR 法扩增 γ- 珠蛋白基因启动子 PCR 反应条件 : 95 预变性 3 mi;94 40s,60 45s,72 2mi, 共 30 个循环 ;72 延伸 5mi PCR 产物经 1.5% 琼脂凝胶电泳后于凝胶成像系统 (UVIFire Reader. 英国 UVItec 公司 ) 观察, 记录结果 PCR 产物进行 DN 测序 (BI 华大基因 ), 用 Chromas 软件对测序结果进行分析, 并与基因库中的 HB1 HB2 序列比对分析 1.7 统计学方法采用 SPSS16.0 软件进行数据分析, 计量资料以均数 ± 标准差 ( x±s ) 表示, 组间比较采用 t 检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 一般情况共检出 HbE 杂合子 76 例, 其中复合 d-hpfh 36 例, 未检出 HbE 纯合子 ; 检出 HbE - 地中海贫血 36 例, 其中复合 d-hpfh 20 例年龄 1~74 岁, 男 52 例, 女 60 例 2.2 各年龄段血常规分析结果由于病例年龄差距较大, 分为儿童组 ( 年龄 14 岁 ) 与成人组 ( 年龄 >14 岁 ), 比较不同年龄段血常规的差异 HbE 杂合子儿童组与成人组血常规分析比较, 差异无统计学意义 (P>0.05),HbE - 地中海贫血儿童组与成人组血常规分析比较, 差别无统计学意义 (P > 0.05), 因此, 排除年龄因素对血常规参数的影响, 见表 1 表 1 HbE 杂合子 HbE - 地中海贫血各年龄段血常规分析比较 ( x±s ) (g/dl) MCV/fL MCH/pg HbE 杂合子儿童组 ± ± ± ± ±7.63 成人组 ± ± ± ± ±7.03 HbE - 地中海贫血儿童组 ± ± ± ± ±15.50 成人组 ± ± ± ± ± 血常规 Hb 分析结果 HbE 杂合子复合 d- HPFH 组的 HbF 水平明显高于单纯 HbE 杂合子组, 而两组 Hb MCV MCH MCHC 水平比较, 差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05), 见表 2 HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 的 Hb F Hb MCV MCH MCHC 水平较单纯 HbE - 地中海贫血明显升高, 差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05), 见表基因分析结果共检测出 HbE 杂合子复合

3 李琦, 等. 非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征对血红蛋白 E 及血红蛋白 E 复合 β- 地中海贫血的影响 589 d-hpfh36 例其中 8 例复合 γ-225~-222 缺失 ( 图 1);21 例复合 γ-158c>t 突变杂合子 ( 图 2); 5 例复合 γ-158c>t 突变纯合子 ( 图 2B);2 例同时复合 γ-225~-222 缺失及 γ-158c>t 突变杂合子共检出 HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh20 例, 其中 2 例复合 γ-225~-222 缺失,17 例复合 γ- 158C>T 杂合子突变,1 例复合 γ-158c>t 纯合子突变检出的 β- 地中海贫血的基因型有 : β -28 β CD17 CD41-42 CD71-72 IVS-I-654, 见表 4 单纯 HbE 杂合子组表 2 HbE 杂合子复合 d-hpfh 与单纯 HbE 杂合子的血常规 Hb 分析结果 ( x±s ) (g/dl) MCV/fL MCH/pg HbE,% HbF,% ± ± ± ± ± ± ±0.54 HbE 杂合子复 ± ± ± ± ± ±2.85 合 d-hpfh 组 1.30±0.83 * 与单纯 HbE 杂合子对比, * P<0.05 表 3 HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 与单纯 HbE - 地中海贫血的血常规 Hb 分析结果 ( x±s ) (g/dl) MCV/fL MCH/pg HbE,% HbF,% 单纯 HbE - 地 ± ± ± ± ± ± ±7.33 中海贫血组 HbE - 地中海贫血 ±0.48 复合 d-hpfh 组 7.53± ± ± ± ± ±16.99 与单纯 HbE-β 地中海贫血对比, P<0.05 表 4 β- 地中海贫血基因型 γ-225~-222 缺失 β -28 γ-158c>t 杂合子 γ-158c>t 纯合子 β CD17 β CD41-42 β CD71-72 β IVS-I-654 β CD71-72 HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 基因分析结果 (g/dl) MCV/fL MCH/pg HbE,% HbF,% ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± : 正常 γ 基因启动子序列 ( 箭头所指为正常者 γ-225~-222 位点 );B: γ-225~-222c4 个碱基缺失图 1 γ 启动子突变测序结果 : γ-158c>t 突变杂合子 ;B: γ-158c>t 突变纯合子 ( 箭头所指为突变位点 ) 图 2 γ 启动子突变测序结果

4 590 广西医科大学学报 2018 May;35(5) 3 讨论 d-hpfh 的 γ 或 γ 珠蛋白基因启动子发生点突变或小片段缺失, 激发了 γ- 珠蛋白基因的持续表达, 导致 HbF 水平增高 [5] 研究发现,d-HPFH 与镰状红细胞性贫血 (sickleceldisease,scd) - 地中海贫血的 Hb F 水平增高及临床症状改善相关 [6] 3.1 d-hpfh 对 Hb E 杂合子的影响关于 HbE 杂合子复合 d-hpfh, 本研究共有 36 例 HbE 杂合子复合 d-hpfh, 其 HbF 水平高于单纯 HbE 杂合子病例 (1.3% vs0.85%) 两组血常规的 Hb MCV MCH 比较差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05) Kerdpoo 等研究发现,HbE 杂合子复合 d-hpfh( 基因型为 γ-158 C>T 突变 ) 时 HbF 升高, 其中 HbE 杂合子复合 d-hpfh 基因型为 γ-158c>t 突变杂合子和纯合子的 HbF 分别为 (1.01±0.90)% (1.33±1.21)%, 该研究认为 d-hpfh( 基因型为 γ-158c>t 突变 ) 可使 HbE 杂合子的 HbF 升高, 同时发现 d-hpfh 可使其 MCH 含量升高有研究报道,d-HPFH( 基因型为 γ-158c>t 突变 ) 可使 HbE 纯合子的 HbF 升高 [8-9] 本研究的 HbE 杂合子复合 d-hpfh 的病例与 Kerdpoo 等报道相似, 均有 HbF 升高, 提示 d-hpfh 可引起 HbE 杂合子的 HbF 水平升高此外, 本研究 HbE 杂合子复合 d-hpfh 的 Hb MCV 及 MCH 含量与单纯 HbE 杂合子无差异, 提示 d-hpfh 对 HbE 杂合子的血液学参数无明显影响, 这与 Kerdpoo 等报道的 d-hpfh 可使 HbE 杂合子的 MCH 含量升高不同, 推测 d- HPFH 对轻型 β- 地中海贫血的临床特征可能影响不大, 也可能与种族或个体差异相关目前尚未见关于 HbE 杂合子复合 d-hpfh 基因型为 γ-225~-222 缺失的报道 γ-225~-222 缺失位于正常 γ- 珠蛋白基因启动子上游 γ-224~ -219 的 C 重复序列区域, 一些小片段缺失经常发生在此区域中的同向重复短序列片段中研究发现, γ-225~-222 缺失可能通过下调 γ- 珠蛋白基因的表达, 使 β- 地中海贫血的 γ/ γ 比例增高, 从而导 [10] [11] 致 HbF 水平升高 Huag 等发现 1 例 γ- 226~-223 缺失纯合子和 1 例 γ-226~-223 缺失杂合子,HbF 水平均升高, γ/ γ+ γ 比率分别为 89.5% 和 83.4%, 推测 γ-226~-223 缺失可能通过升高 γ- 珠蛋白基因表达从而使 HbF 水平升高本研究首次发现 8 例 HbE 复合 γ-225~-222 缺失杂合子 2 例 HbE 同时复合 γ-225~-222 缺失与 γ-158c>t 突变杂合子,HbF 分别为 (1.19± 0.70)% (1.35±0.64)%, 轻度升高, 增高幅度与复合 γ-158c>t 突变杂合子相似, 推测 γ-225~-222 缺失可能通过增高 γ/ γ 比例或者上调 γ- 珠蛋白基因表达使 HbE 杂合子的 HbF 水平升高 3.2 d-hpfh 对 HbE - 地中海贫血的影响 HbE - 地中海贫血是 HbE 复合 β- 地中海贫血的双重杂合子关于 HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh, 本研究中 HbE - 地中海贫血复合 d- HPFH 的 Hb F 较单纯 Hb E - 地中海贫血高 (30.10% vs14.42%) 有研究发现,d-HPFH 与 HbE - 地中海贫血的 HbF 水平增高及临床症状 [12-13] [12] 改善相关 Nuioo 等对 HbE - 地中海贫血研究发现,d-HPFH( 基因型为 γ-158c>t 突变 ) 与 HbF 水平升高相关,HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 基因型为 γ-158c>t 突变杂合子与纯合子的 HbF 约为 18%~38% 22%~48% Ma [13] 等研究发现,d-HPFH 可使 HbE - 地中海贫血患者的 HbF 升高, 表型为轻型与重型的病例 Hb F 水平有差异 [ 分别为 (39.2±11.6)% (32.7± 11.7)%] 本研究中复合 d-hpfh 的 HbE - 地中海贫血病例其 HbF 水平与上述报道相似, 提示 d-hpfh 可导致 HbE - 地中海贫血的 HbF 水平升高本研究发现 1 例 HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 基因型为 γ-158 C> T 突变纯合子, [12] HbF 为 46%, 与 Nuioo 等报道 HbE - 地中海贫血复合 d-hpfh 基因型为 γ-158c>t 突变纯合子的病例相似, 高于其报道中基因型为 γ-158c >T 突变杂合子的病例, 提示 d-hpfh 的 γ-158c >T 突变纯合子可导致 HbE - 地中海贫血的 γ- 珠蛋白基因更高水平的表达, 从而引起较高水平的 Hb F, 由于病例数较少, 须更多病例证实本研究首次探讨了 d-hpfh 对 HbE - 地中海贫血血液学参数的影响复合 d-hpfh 的 HbE - 地中海贫血的 Hb 水平明显高于单纯 Hb E - 地中海贫血 (P < 0.05), 其 MCV MCH MCHC 水平也高于单纯 HbE - 地中海贫血 (P < 0.05), 提示 d-hpfh 可改善 HbE - 地中海贫血的贫血症状, 原因可能为 d-hpfh 导致 HbF 水平升高, 从而减轻珠蛋白链的失衡, 进而改善其临床贫血症状关于 d-hpfh 复合其他类型的 β- 地中海贫

5 李琦, 等. 非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征对血红蛋白 E 及血红蛋白 E 复合 β- 地中海贫血的影响 591 血, 有研究发现 d-hpfh 可导致中间型或重型 β- 地中海贫血患者 Hb F 水平升高及临床症状改 [4,14] [4] 善蒋南华等报道了 6 例 β- 地中海贫血纯合子或双重杂合子复合 d-hpfh( 基因型为 γ-158c >T 突变杂合子 ),HbF68.9%~74.9%, 表型均为 [14] 中间型 β- 地中海贫血雷蓓蓓等报道 1 例 d- HPFH( γ-158c>t 突变 ) 复合 β CD43 CD17 合双重杂合子,HbF96.8%, 仅表现为轻度贫血与上述其他类型的 β- 地中海贫血相似,d-HPFH 可使 HbE/ β- 地中海贫血 HbF 升高及贫血症状减轻有研究认为,d-HPFH 在红细胞生成压力条件下可使 β- 地中海贫血的 HbF 升高 [15], 推测 d-hpfh 也可能在这种压力下使 HbE - 地中海贫血的 HbF 升高, 进而减轻贫血症状 HbE - 地中海贫血复合 d- HPFH 的 HbF 水平低于上述研究报道病例, 原因可能为 β E 基因导致异常 β E mrn 合成增加, 从而使得变异的 β- 珠蛋白链增加, β E - 珠蛋白链与 α- 珠蛋白链结合产生 HbE, 一定程度上减少了 α- 珠蛋白链与 γ- 珠蛋白链结合, 从而使得 HbF 水平下降综上,d-HPFH 可引起 HbE 杂合子 HbF 水平轻度升高, 对其血液学参数无明显影响 d- HPFH 可使 HbE - 地中海贫血的 HbF 升高及改善其临床贫血症状, 为 β- 地中海贫血的临床诊治提供了新的参考资料参考文献 : [1] FUCHROEN S,WETHERLL DJ.Thehemoglobi E thalassemias[j].cold Sprig Harb Perspect Med,2012,2(8):a [2] 吴教仁, 林炳忠, 陈钊. 血红蛋白 E 及血红蛋白 E 复合 β 地中海贫血的临床分析 [J]. 临床血液学杂志, 2004,17(4): [3] ROVERSIF M,D CUNH F,BRUNEROTTO F,etal.eeexpressioaalysisoftheBraziliatype ofhereditarypersisteceoffetalhemoglobi:idetifica- tioofgeesthatcouldberelatedtogammaḡlobiac- tivatio [J].Hemoglobi,2013,37(6): [4] 蒋南华, 梁徐, 金琪. 广西地区 6 例重症 β 地贫复合遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征的基因型和临床表现 [J]. 中华血液学杂志,1995,16(4): [5] KINBMI O,CMPBELL D,HN ZJ,etal. Hereditarypersisteceoffetalhemoglobicausedby sigleucleotidepromotermutatiosisicleceltrait adhbscdisease[j].hemoglobi,2016,40(1): [6] 曾溢滔. 人类血红蛋白 [M]. 北京 : 科学出版社,2002: KERDPOOS,LIMWEERPRJK E,TTU T.EfectofSwiss-typeheterocelularHPFHfrom XmI-γ adhbbp1polymorphismsohbf,hbe,mcvad MCHlevelsiThaiHbEcarriers[J].ItJHematol, 2014,99(3): [8] PKDEE N,YMSRIS,FUCHROEN,etal.Variabilityofhemoglobi Fexpressioi hemoglobi EE disease:hematologicaladmolecularaalysis.[j].blood CelsMolDis,2014,53(1-2): [9] EKWTTNKITS,MONTEERRT Y,RIOLU- ENS,etal.ssociatioofxmIpolymorphismad hemoglobiehaplotypeso postatalgammaglobi geeexpressioihomozygoushemoglobie[j].dv Hematol,2012,2012(5a): [10] ILMN J,JOHNSON M E,MISHIM N.Four base-pairdn deletioi huma gammaglobigeepromoterassociated withlow gammaexpressioiadults[j].brjhaematol,1988,68(4): [11]HUN XD,YN X O,HUN RB,etal.ovelfourbase-pairdeletio withitheagammaḡlobi geepromoterassociatedwithslighticreaseofagammaexpressio i adult[j].m J Hematol,2000, 63(1): [12] NUINOON M,MKRSR W,MUSHIROD T,etal.geome-wideassociatioidetifiedthecommogeeticvariatsifluecediseaseseverityiβ 0 - thalassemia/hemoglobi E [J].Hum eet,2010, 127(3): [13]M Q,BELK,SRIPICHIO,etal.Betaḡlobigee clusterpolymorphismsarestroglyassociatedwithseverityof Hb E/beta(0)-thalassemia[J].Cli eet, 2007,72(6): [14] 雷蓓蓓, 陈萍, 肖璇, 等. 广西地区非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征的研究 [J]. 广西医科大学学报,2013,30(1): [15]DDHEECH S,JINS,MDHHULTH D,etal. ssociatioofxm1-158gamma()variatwithseverityad HbFlevelsibeta-thalassemia majorad sicklecelaimia[j].molbiolrep,2014,41(5): ( 本文编辑 : 杜顺霞 )

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