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1 ICS B0 中国实验动物学会团体标准 T/ CALASx XXXX 实验动物爪蟾遗传质量要求 Laboratory animal -- clawed frog genetic quality control ( 征求意见稿 ) XXXX - XX - XX 发布 中国实验动物学会 发布 XXXX - XX - XX 实施 I

2 目次 前言... II 1 范围 规范性引用文件 术语和定义 种质检验 遗传质量要求 判定... 3 附录 A( 规范性附录 ) 实验爪蟾 DNA 条形码引物及序列...4 I

3 前 言 本标准按照 GB/T 给出的规则编写 实验动物爪蟾 分为四个部分 : 第 1 部分 : 遗传质量要求 ; 第 2 部分 : 微生物学和寄生虫学等级及监测第 3 部分 : 配合饲料 ; 第 4 部分 : 设施与环境 本部分为第 1 部分 本标准附录 A 为资料性附录 本标准由中国实验动物学会归口 本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC281) 技术审查 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草 本部分起草单位 : 广东省实验动物监测所 本部分主要起草人 : 蔡磊 II

4 实验动物爪蟾遗传质量要求 1 范围 本部分规定了实验爪蟾的形态和 DNA 条形码检验及其封闭群繁殖方法等遗传质量要求 本部分适用于非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 和热带爪蟾 (Xenopus tropicalis) 的遗传质量控制 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本文件 GB 实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 实验爪蟾 laboratory clawed frog 人工繁育, 对其携带的病原微生物及寄生虫进行控制, 遗传背景明确或来源清楚, 用于科学研究 教学 生产 检测 鉴定及其他科学实验的爪蟾 3.2 封闭群 closed colony 不从外部引入新的基因的条件下, 采用随机交配方式, 基因频率趋于稳定的实验动物种群 4 种质检验 4.1 要求实验室引进实验爪蟾必要时应进行种质检验 4.2 抽样按引进实验爪蟾数量的 6 % 抽样, 优先抽取可疑样品, 最大取样量不多于 30 只 4.3 形态检验 非洲爪蟾非洲爪蟾的形态特征 : 无舌, 上颚有齿, 耳咽管 ( 欧式管 ) 汇合成一个, 仅有一耳咽管口, 开口在上颚的后端 颅骨原始, 蝶筛骨和副蝶骨愈合在一起 上颚骨退化, 具有愈合的前锄骨 身体遍布粘液腺, 后肢有五趾, 趾间有 1

5 蹼, 其中三趾上生有黑色锐利的爪 终生保留侧线器官, 终生生活在水中, 幼体从卵中孵出时已无外鳃 热带爪蟾热带爪蟾的形态特征 : a) 热带爪蟾眼小, 位于头背上方, 无眼睑 无舌, 咽鼓管孔单个, 成体仍有侧线器官 体肥壮, 流线型, 后肢粗壮, 趾蹼极发达 终生水栖, 无鸣囊 b) 吻至泄殖腔长度 : 雌性 51±10mm, 雄性 42±2mm c) 眼脊处侧线 (eye ridges)8~12, 口部侧线 (oral lateral lines)9~12, 中部侧线 (medial lateral lines) 16~21, 侧面测线 (lateral lateral lines)17~22, 腹面测线 (ventral lateral lines)16~ DNA 条形码检验 基因组 DNA 提取按照常规方法提取样本基因组 DNA, 双蒸水溶解后 -20 保存备用 PCR 扩增引物序列见附表 A.1 PCR 总反应体积为 50 μl, 其中含 10 PCR Buffer 5 μl(mg2+ Plus),dNTP (2.5 mmol/l each)4 μl, 上下游引物 (20 μmol/l) 各 1 μl, 基因组 DNA 4 μl( 100 ng~1000 ng),taq 酶 (5 u/μl)0.4 μl, 双蒸水补齐至 50 μl PCR 反应程序为 94, 预变性 4 min;94 变性 30 s,52 退火 40 s,72 延伸 40 s,30 个循环, 最后于 72 下延伸 10 min 序列测定 PCR 产物经回收纯化后, 在 DNA 测序仪上测序 为保证测序的可靠性和准确性, 采用双向测序, 并进行人工核对 校正 结果计算实验爪蟾的 DNA 条形码序列见附表 A.2 序列歧异度(D) 按照公式 (1) 计算 D= 序列内变异碱基数 / 序列碱基总数 100 % 5 遗传质量要求..(1) 5.1 封闭群命名封闭群由 2~4 个大写英文字母命名, 种群名称前标明保持者的英文缩写名称, 第一个字母须大写, 后面的字母小写, 一般不超过 4 个字母 保持者与种群名称之间用冒号分开 5.2 封闭群的繁殖 引种实验爪蟾引种数目应不少于 25 对, 并建立包含种名 来源 数量 雌雄比例等记录的引种档案 亲本选择宜选择来源于不同亲本 健康的爪蟾作为繁殖亲本 在培育和维持过程中, 除对异常个体进行淘汰之外, 应避免对任何特征进行选择 2

6 5.2.3 繁殖方法 按 GB 附录 B 的规定执行 封闭群至少应培育 4 代以上, 群体有效大小应不少于 25 对 6 判定 种质检验判定方法如下 : a) 形态符合规定, 判定为合格 ; b) 形态不符合规定或不可检测时, 增加 DNA 条形码检测, 序列歧异度均 1.0 %, 判定为合格 3

7 附录 A ( 资料性附录 ) 实验爪蟾 DNA 条形码引物及序列 A.1 实验爪蟾 DNA 条形码检测引物序列见表 A.1, 条形码序列见表 A.2 表 A.1 实验爪蟾 DNA 条形码检测引物序列表 实验爪蟾序列 (5-3 ) 12S 16S COI CTGGGATTAGATACCCCACTATGCC CTTACCATGTTACGACTTGCCTC CGCCTGTTTATCAAAAACAT CCGGTCTGAACTCAGAT TCAACAAATCACAAAGACATYGGCAC TASACTTCTGGGTGSCCAAAGAATCA 表 A.2 实验爪蟾 DNA 条形码序列 实验爪蟾基因序列 (5-3 ) 非洲爪蟾 12S 16S COI TAGCCATAAACTTTGACTACTTACGCAAAAATCCGCCAGGGAACTACGAGCCTAAGCTTAAA ACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTCCAAACCCACCTAGAGGAGCCTGTTCTGTAATCGATACCC CTCGCTAAACCTCACCACTTCTTGCCAAACCCGCCTATATACCACCGTCGCCAGCCCACCTCG TGAGAGATTCTTAGTAGGCTTAATGATTTTTCATCAACACGTCAGGTCAAGGTGTAGCATATG AAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTATACCTTAGAATAAACGAAAGATCTCTATGAAAC CAGATCGGAAGGCGGATTTAGCAGTAAAGAGAAACAAGAGAGTTCTCTTTAAAACGGCCCT GGAGCGCGCACACACCGCCCGTCACCCTCTTCTACAAAAATCAACCAATTTTATAAACACAC AATTAACACAAAGAA CGCCTCTTGCTAAAAAACATGTATAAGAGGTCCAGCCTGCCCAGTGACTATATGTTCAACGG CCGCGGTATTCTGACCGTGCAAAGGTAGCGTAATCACTTGTCTTTTAAATAAAGACTGGTAT GAACGGCACCACGAAGGTTCAACTGTCTCCTGCATCCAATCCATTAAACTGACCTCCCCGTG CAGAGGCGGGGATACAACCATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAAACTAAAGGCAAC TGCCAACTTCAACCTAACCCATAAGGAAATAACAATTAAACAAGCAGAAACTGACCTAAAG TTTTCGGTTGGGGCGACCACGGAGAATAAAAAATCCTCCTTGAAGAATAGGGCCTACCACCC TTAACCAAGAACCACCATTCTAAGTAACAAAATTTATGACTATAATTGATCCAGTCCTACTG ATCAACGAACCAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCATTTCAAAAGTTCCTATCGACA AATGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGGCATCCCAGTGGTGCAGCCGCTACTAAAGGT TCGTTTGTTCAACGATTAAAGCCCTACGTG CCTTTACTTAGTTTTTGGTGCTTGAGCAGGGATGGTCGGAACCGCTCTTAGCTTATTAATTCG AGCTGAACTTAGCCAGCCCGGAACACTACTTGGAGATGACCAAATTTATAATGTTATCGTTA CAGCACATGCTTTTATTATAATTTTCTTCATAGTCATGCCTATTATAATCGGTGGATTTGGGA ACTGATTAGTTCCATTAATAATTGGAGCCCCAGATATAGCATTTCCGCGAATAAATAATATA AGCTTTTGACTTCTTCCCCCATCATTTCTTTTATTACTAGCATCATCTGGGGTTGAAGCAGGA GCCGGAACAGGTTGAACTGTGTACCCGCCTTTAGCTGGAAACCTAGCACATGCTGGAGCATC AGTTGACCTAACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCTGGTATTTCATCTATTTTAGGAGCAATTAAC 4

8 热带爪蟾 热带爪蟾 COI 12S 16S COI 表 A.2 实验爪蟾 DNA 条形码序列 ( 续 ) TTCATCACAACAACAATTAACATAAAACCACCAGCTATATCTCAATACCAAACCCCACTATT TGTTTGATCAGTATTAATCACAGCTGTACTTTTACTTCTTTCTCTTCCTGTCTTAGCCGCAGGA ATCACAATGTTATTAACAGATCGTAATCTGAATACAACTTTCTTTGACCCTGCCGGAGGAGGT GACCCAGTACTTTACCAACACCTGTTC TAGCCTTAAACCTTGACCAATTACACTTCAATCCGCCAGGGAACTACGAGCCCAAGCTTAAA ACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCACCTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATACCC CCCGCTTAACCTCACCACTTCTTGCCAAACCCGCCTATATACCACCGTCGCCAGCCCACCCCG TGAGGGGACACAAGTAGGCTCAATGATCAAACATCAATACGTCAGGTCAAGGTGTAGCAAA TGAAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTAATACT-AGAAAAAACGAAAGATCTTTATGAA ACC-AGATCAGAAGGCGGATTTAGCAGTAAAGAGAGACAAGAGAGCTCTCTTTAAAATGGCC CTGGGGCGCGCACACACCGCCCGTCACCCTCTTCCA--AAAACCACCTACCTTAAATAAAACA TTACAAAAACAAAGAA CGCCTCTTGCCAAACAACACGTATAAGAGGTCCAGCCTGCCCAGTGACTATATGTTCAACGG CCGCGGTATTCTGACCGTGCAAAGGTAGCGTAATCACTTGTCTTTTAAATAAAGACTGGTAT GAATGGCACCACGAAGGTTCAACTGTCTCCTGCATCCAATCCATTAAACTGACCTCCCCGTG CAGAGGCGGGGATATTCCCATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAAACTTACGGCAACT GCTAAACAATCCAACCCCACACGGGAAAACAGACAATTAAGCAACAATGACCTAAAGTTTT CGGTTGGGGCGACCACGGAGAAAAAAAAATCCTCCTTGATGTACGGGGCCTTACCCTCTTAA CCAAGAACGACAGTTCTAAGTAACAAAACATTTGACCACTATTGATCCAGTCCAACTGATCA ACGAACCAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCATTTCGAAAGTTCCTATCGACAAATG GGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGGCATCCCAGTGGTGCAGCCGCTACTAAAGGTTCGT TTGTTCAACGATTAAAGCCCTACGTG CCTTTATTTAGTCTTCGGTGCTTGAGCAGGAATAGTAGGAACAGCTTTAAGCCTCCTTATTCG AGCAGAGCTGAGTCAACCTGGAACCCTATTAGGGGACGATCAGATTTATAATGTAATTGTAA CTGCACACGCCTTTATTATGATTTTCTTCATGGTAATGCCTATTATGATCGGCGGGTTTGGCA ACTGACTCATTCCATTAATAATCGGGGCCCCCGACATGGCATTTCCTCGAATAAATAATATA AGCTTCTGACTCCTACCTCCATCATTCCTGTTACTCCTAGCCTCTTCAGGAGTAGAAGCTGGA GCCGGAACGGGCTGAACAGTCTATCCTCCATTAGCGGGGAATTTGGCACATGCCGGAGCCTC AGTAGATTTAACAATTTTCTCCCTCCATTTAGCAGGGGTTTCTTCAATTTTGGGAGCTATTAA TTTTATTACTACAACTATTAACATAAAACCCCCTGCTATATCTCAATACCAAACGCCCCTGTT TGTTTGATCCGTACTCATTACAGCTGTCCTTCTTCTTCTTTCCCTCCCTGTTCTAGCAGCCGGA ATTACAATACTACTCACAGACCGAAATTTAAACACAACCTTCTTTGACCCTGCTGGTGGAGG TGACCCAGTATTATACCAACACCTATTC 5

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