复旦学报 医学版 年 月 %!! %!%!%!,! %% %%!, %! (/!, %%!, -% (!!,!!!%%%! %% %!%, %!!! % %!! % (! %!!!!!! (!,-/ 胆囊结石是消化系统的常见病 随着生活方式和饮食结构等的改变 其发病率呈较快的上升趋势 部分地区患病率

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1 复旦学报 医学版 胆囊胆固醇结石患者肝脏诱导低密度脂蛋白受体降解物的表达水平 林 晶 陈进宏 鲁 明 复旦大学附属华山医院普外科 上海 摘要 目的 研究诱导低密度脂蛋白受体! ( 降解物 % ( 在胆囊胆固醇结石患者肝脏中的表达水平 探讨其与胆囊胆固醇结石间的相关性 方法 选取复旦大学附属华山医院 年 月至 月收治的腹部手术患者 例 其中胆囊胆固醇结石患者 %!!!, 例 非胆囊胆固醇结石患者!!, 例 采用实时定量 -( 分别测定血清三酰甘油和总胆固醇水平 胆汁中胆固醇 胆汁酸和磷脂含量及胆固醇饱和指数 %!! 采用半定量免疫组化分析检测肝脏 及其他胆固醇代谢相关基因表达的 (/ 和蛋白质水平 最后对, 组肝脏基因表达的 (/ 和蛋白质水平与胆汁生化指标相关性分析 结果 两组患者血清三酰甘油和总胆固醇水平及胆汁中胆汁酸和磷脂含量相比 差异均无统计学意义, 组胆汁胆固醇浓度和 明显高于, 组 均, 组肝脏 (/ 和蛋白质水平低于, 组, 组肝脏 ( 表达水平高于, 组 相关性分析表明, 肝脏 蛋白质水平与胆汁胆固醇摩尔百分比及 呈明显负相关 均 结论 肝脏 基因表达水平下降与胆囊胆固醇结石的形成相关 关键词 诱导 ( 降解物 低密度脂蛋白受体 胆囊胆固醇结石 中图分类号 ( 文献标识码!!!!!!!!!! / /%!!%! %!!!! %!! %! ( %!!!!!% %% %!!!! %!!!,!!!,!%!!! %!! %!%!%! %!!! -(%(/!% % %!! -( %!% (!! %! %!!!%!(/!%! %!! %!! 国家自然科学基金!%!!

2 复旦学报 医学版 年 月 %!! %!%!%!,! %% %%!, %! (/!, %%!, -% (!!,!!!%%%! %% %!%, %!!! % %!! % (! %!!!!!! (!,-/ 胆囊结石是消化系统的常见病 随着生活方式和饮食结构等的改变 其发病率呈较快的上升趋势 部分地区患病率已超过 同时以胆固醇 %! % 为主要成分的胆囊胆固醇结石已经成为我国胆囊结石患者的主要发病类型 胆囊胆固醇结石是由肝脏分泌胆汁成分异常 胆道系统功能异常 环境及基因等多因素共同参与而形成 其中胆汁胆固醇过 饱和被认为是胆固醇结石形成的始发因素 肝脏分泌至胆汁中的胆固醇主要来源于肝脏摄取血循环中脂蛋白结合的胆固醇 仅少部分来源于自身合成的胆固醇及水解的胆固醇酯 %!! % 位于肝细胞表面的清道夫受体!!!( 低密度脂蛋白受体! ( 和 ( 相关蛋白 ( (- 可将 脂蛋白所携带的 % 摄取入肝细胞 许多研究表明 ( 在 % 代谢和 % 分泌中起重要作用 且 与胆囊胆固醇结石的形成密切相关 ( 的表达水平受到转录和转录后两方面的调节 激活固醇调节元件结合蛋白! ( - 可以诱导 基因的转录 使其 (/ 水平增加 同时激活 ( - 也能诱导前蛋白转化酶枯草溶菌素!!!- 的表达 - 在转录后水平下调 ( 蛋白质水平 近年来还发现了另外一种在蛋白质降解水平调控 ( 的蛋白质 诱导 ( 降解物 % ( 具有 泛素连接酶活性 可通过不同于 - 的途径降解 ( 从而影响肝脏 % 代谢和 % 分泌 全基因组关联分析发现 基因上的一些单核苷酸多态性 与 % 代谢相关 在人类胆囊胆固醇结石中的作用未见报道 本文对胆囊胆固醇结石患者肝脏 的表达进行研究 资料和方法 一般资料 收集复旦大学附属华山医院普外科 年 月至 月住院行腹部手术的 例胆囊胆固醇结石患者 %!!!, 及 例行其他腹腔手术的非胆囊胆固醇结石患者!!, 的血清 胆汁及肝脏组织标本 所有结石患者的结石均参照傅培彬 法和肉眼观察证实 % 含量 非胆囊结石患者经 超证实胆囊无结石且偏光显微镜下胆汁无胆固醇结晶 所有入组患者排除糖尿病 高胆固醇血症 肥胖 酒精滥用史及肝脏恶性肿瘤等可能影响肝脏功能的情况 同时无服用脂质代谢药物史 本研究经复旦大学附属华山医院伦理委员会批准 所有患者签署知情同意书 比较两组患者性别 年龄 体重指数!! 和空腹血糖等一般资料 差异均无统计学意义 表 表 ( 与 ( 患者一般资料比较! ( (! 4,,,!! 5%!!%!!! 生化检测 按照试剂盒说明书 采用酶法测定

3 林 晶 等 胆囊胆固醇结石患者肝脏诱导低密度脂蛋白受体降解物的表达水平 血清和胆汁的总 % 总胆汁酸 三酰甘油, 及磷脂等指标 % 饱和指数 %!! 按照 % 磷脂 胆汁酸含量 根据 量表计算得到 实时定量 检测 运用实时定量 -( ( -( 方法检测肝脏组织相关基因 (/ 水 平 按照试剂盒说明书从肝脏提取总 (/ 逆转录 基因引物序列见表 后行 -( 反应 条件如下!!! 共 个循环!!! 采用相对表达量法 法 进行数据分析 内参选用 ( 基因 表, 实时定量 检测人基因引物序列,!!!!,!!!,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, -,,,,,,,, -,,,,,,,,,,,,,,,,,,, (,,,,, 免疫组化检测 运用免疫组化方法检测肝脏 和 ( 蛋白质水平 甲醛固定的石蜡块切成 切片 预处理和封闭后 抗 抗体按 稀释 抗 ( 抗体按 稀释后 反应过夜 洗涤后 (- 标记的二抗室温孵育 显色液显色 后苏木精复染 酒精脱水 透明 封片 切片于 倍显微镜下观察 并用 相机拍照 使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件一次完成所有照片 并将照片保存为 格式 和 ( 蛋白质存在于胞 质 使用! 软件分析照片的区域光密度平均值! 代表蛋白质的相对水平 统计学方法 统计采用 - 统计软件进 行分析 计量数据以! 表示 采用双样本! 检验或 5% 检验 相关性分析采用 -!! 分析 取双侧 为检验标准 结 果 两组患者血清和胆汁生化指标比较, 组血清总 % 血清, 高密度脂蛋白和低密度脂蛋白与, 相比 差异均无统计学意义 表, 组胆汁 % 含量和 明显高于, 组 差异均有统计学意 义 均 表 而, 组胆汁中磷脂和总胆汁酸浓度与, 组相比 差异无统计学意义 表 表 两组患者血清脂类含量比较!! ( (! 4,, %!!! 表 两组患者胆汁成分比较 4!( (! 4,, %! -%!%! %! -%!%!!!! 5%!! % 5%!

4 复旦学报!医学版!! 年 月 %! %!!! 两 组 患 者 肝 脏 相 关 基 因 的 L;?7 和 蛋 白 质 水 平! 采 用 荧 光 定 量 检 测 肝 脏 7 代 谢 相 关 基 因表达情况 发 现 D, 组 肝 脏 B?C> :@GH 水 平 显 著低于 D,! 组!!/ 图 %两组其他肝脏 7 代谢相关基因的 :@GH 水平差异无统计学意义!图 蛋白质水平呈明显负相关!图 (H%D, 肝脏 >V@ :@GH 水 平 与 肝 脏 B?C> 蛋 白 质 水 平 呈 明 显 正 相 关性!图 (N%D, 肝 脏 B?C> 蛋 白 质 水 平 与 胆 汁 7 摩尔百分 比 及, B 的 水 平 呈 明 显 负 相 关 性!图 ( (?% %定量免疫组化分析发现 D, 组肝脏B?C> 蛋白 质水平同样低 于 D,! 组!! / 图!H!N这 与两组患者B?C> :@GH 水平 结果相 一致%而 D, 组肝 脏 >?>@ 蛋 白 质 水 平 则 高 于 D,! 组!! 图 % /!!? 图 H!K@ 肝脏基因%蛋白质与胆汁生化指标相关性分析 - 5% :@GH ( % D,! -!% D,!!! J4 %( (! H!< 5! -%< % M ;=L@K9E@/!!/ / =!/! L( K@ 5 ( 图 C! 两组患者肝脏相关基因表达 (! K@!K@ C!S( 讨!!! 论 胆囊 胆 固 醇 结 石 病 因 复 杂胆 汁 中 7 过 饱 和 进而 析 出 7 结 晶 是 形 成 胆 固 醇 结 石 的 先 决 条 件,!-%我们研究发现 D, 胆汁 7 含 量 和, B明 显 高于 D,!这 与 以 往 许 多 报 道 一 致,!!(-% 由 肝 脏 分泌至胆汁中的 7 主要 来 源 于 肝 脏 摄 取 血 循 环 中,脂蛋 白 结 合 的 7,(-%W% %5 等 报 道 小 鼠 喂 养 致石饲料后肝 脏 分 泌 至 胆 汁 中 的 7 主 要 来 源 于 由 >?>@ 介 导 而 摄 取 的 7%>?>@ 是 肝 脏 摄 取 血,浆脂蛋白中 7 的重 要 介 质%44 等 发 现 ((O 野生型小鼠在喂养致石饲 料 ( 周 后 形 成 胆 囊 7 结 9 (::%7-7: % 74!! H,: L% = B?C>4 % %D,! -!%D,!! -% N J4-4 :% < ::%7-7: % B?C>!/ = 晶而 ;;< 基因敲除小鼠在 同样 条 件 下 不 形 成 胆 囊 7 结晶这提示在缺失 >?>@ 情况下血浆 7 不 U% (::%7-7: % 74 ->?>@4 % = 能正常转运 进 入 肝 细 胞肝 脏 分 泌 的 胆 汁 中 7 含 %D D,!?J4-4 :% < ::%7-7: = 量下降导致不 易 形 成 胆 囊 胆 固 醇 结 石% 这 些 研 究 % >?>@!//!!/ / 结果说明 >?>@ 在 7 代 谢 和 胆 汁 7 分 泌 中 起 重 图 D! 两组患者肝脏 TU8P 和 PUP; 蛋白质水平 ( TU8P!PUP; K@!K@ D!M!!K@ 肝 脏 基 因 蛋 白 质 水 平 与 胆 汁 生 化 指 标 相 关 性分析!D, 肝 脏 B?C> 蛋 白 质 水 平 与 肝 脏 >?>@ 要作用% 近年来研究发现一种具有 8( 泛素连接酶活性的 B?C> 可在蛋白质水平降解 >?>@%=>; 基因启动 子区存在 >V@ 结 合位 点激 活 >V@ 能 上 调 B?C>

5 林 晶 等 胆囊胆固醇结石患者肝脏诱导低密度脂蛋白受体降解物的表达水平 表达 我们研究发现 (/ 和蛋白质水平在, 肝脏中均下降 相关性分析表明 蛋白质水平与胆汁 % 含量及 均呈明显的负相关 这提示肝脏 表达水平的下降提高了患者胆汁 % 含量及 而且, 组肝脏 ( 蛋白质水平高于, 同时, 组 蛋白质水平与 ( 蛋白质水平也呈明显负相关 这提示 可能通过 ( 来影响胆汁 % 浓度 进而在胆囊胆固醇结石的形成中发挥作用 虽然, 组肝脏 的表达量低于, 组 但是两组 8( (/ 的水平未见明显差异 这提示除 8( 外 可能还存在其他影响 表达的途径 ( 的表达除了受 转录后水平调节外 还受 ( - 途径调节 当细胞内 % 水平下降时 可激活 ( - 在转录水平增加 基因的表达 但同时也增加 - 的表达 - 可在转录后水平降解 ( 我们的研究结果显示 两组患者肝脏 ( - 和 - 的表达量差异无统计学意义 这可能是因为本研究样本量较少 不能完全除外抽样误差 因此 ( - 和 - 与 ( 的关系还需要进一步研究 综上所述 胆囊胆固醇结石的始发原因为患者胆汁中 % 含量过饱和 肝脏 表达水平的下降与胆囊胆固醇结石的形成有关 其作用机制可能是通过提高肝脏 ( 蛋白质水平 增加肝脏 % 水平 进而影响胆汁中的 % 含量 影响胆囊胆固醇结石形成的具体机制还有待深入研究 参 考 文 献 蒋兆彦 吴健 韩天权 等 胆固醇结石病防治研究的再发展 外科理论与实践 4// / /,4/ (- -%!!!!! ( /!!! % / (, / 9! (!%%! //, /(5/ % (!/!/, (5/, / % %!%!!! // -- 9 :,/,-:: 8!!! %!! 9/ /, (,!!% %! %! (,(/ /- / /, : -!!! % % %!!!!! / (, 5 (: ( /,8( -!%!!!%!% %!!! %!% /- 9 ( / /, : / (8(! %! %% % // 4 /( 4! / -(, ( %!! %!! %!!! 9 (! %! %!! %! (:! %%!!%! 4,/!!!!! -( % %- %! 9 /5(, 8 %!!% / 4/ ( 5 - : 4(,(/ ( %! %!!! - % / (/ ( // /! %! ( (/,! (, -( / - - /, %!!!!/ :/,/!! %!!! /,9:-(/ -,,(/,!!! 8( %,, ( %! %!!!%! 5/, 9: 7! /-!!% %!!! %!! 收稿日期 编辑 段佳

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