期李明川张雅利卢晓云等 $ 羟基丁酸 $$ 羟基己酸共聚酯纳米颗粒作为雷帕霉素缓释载体的应用研究 0 纳米技术在药物递送领域的应用已显示出其比 $ 传统药物剂型的明显优势特别是在抗肿瘤药物递送领域其可以明显改善药物的生物利用度降低其全身毒副作用延长药物半衰期等目前已有包括脂质体高

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樽纪
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!" #$# # %&'&!& 论著羟基丁酸羟基己酸共聚酯纳米颗粒作为雷帕霉素缓释载体的应用研究李明川张雅利卢晓云朱新亮陈旭李崇马惺锋唐秉韬西安交通大学生命科学与技术学院生物医学信息工程教育部重点实验室陕西西安 "# 摘要目的研究生物可降解高分子材料 $ 羟基丁酸 $$ 羟基己酸共聚酯 %&'&& 作为疏水性药物雷帕霉素缓释载体的效果及其体外条件下对疏水性药物的缓释情况方法超声乳化分散法制备 %&'&& 载药纳米微球颗粒尺度分析仪对颗粒粒径进行表征透析袋法进行雷帕霉素体外缓释高效液相色谱法检测雷帕霉素释放量用包裹雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒处理体外培养的 % 细胞法检测细胞活力!! () 检测 * +, 底物 "-./ 磷酸化情况结果包裹雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒平均粒径为 * 对雷帕霉素的包封率为 # 01 包裹雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒可以实现雷帕霉素的体外缓释且能够抑制人前列腺癌细胞系 % 的体外增殖和胞内 "-./ 的磷酸化结论 %&'&& 是一种很有潜力的疏水性药物包封和递送载体材料关键词 $ 羟基丁酸 $$ 羟基己酸共聚酯 %&'&& 雷帕霉素纳米颗粒药物递送载体 % 细胞 "-./ 中图分类号文献标志码文章编号."$ 0#$$0!!!"! # #"$! %& 2$34& 56 73$( 8 9 3)$ 4&8 9 $( 32 &:5 9 )2 9 2$;!2 56' 2$3)!3 *!);' )()2 3(-!!3 ' )!2!! 2-))(); ;!-!!3!)() ))28! /! 3 ) 3) );' )*! 3( ;) *3 ) :2!! 2); );: 3 )9 3"# 3 ' # " " ()*)) " # " # + # " " & + # ""()*)) #, " +" "+ # " + "& " + #, +" # +# & " + # + #, +" " + "&)(-.,"/ # + # &(.#, ", + # "" ()*)) #" #, " + "! & "$.0+ 1, " " & " + + # ""()*)) #,&+, + # # #&0 & " + # #" " " " "& (.# " "$.0#" " + # ""()*)) #& ()*)) # + " #" " # & () *' " " ()*)) + # #" " # (.# "$.0 收稿日期 $"$ 修回日期 $$ 基金项目国家自然科学基金资助项目 5) "" 西安交通大学中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 - )!!53 )3(53 3(-!! ) 3 )); 35) ""3! 3*!3(,!!3 ;)!! 3( 8!! 通讯作者卢晓云副教授博士生导师 :$*3 (( 0*3 (! 作者简介李明川 # "$ 男汉族硕士研究方向生物活性材料 :$*3 ( 3!3 (*! 网络出版时间 $$. 网络出版地址! *!3 (. ##,. *(

2 期李明川张雅利卢晓云等 $ 羟基丁酸 $$ 羟基己酸共聚酯纳米颗粒作为雷帕霉素缓释载体的应用研究 0 纳米技术在药物递送领域的应用已显示出其比 $ 传统药物剂型的明显优势特别是在抗肿瘤药物递送领域其可以明显改善药物的生物利用度降低其全身毒副作用延长药物半衰期等目前已有包括脂质体高聚物及自组装高分子材料等多种物质作为 $ 纳米药物载体的研究报道其中生物可降解材料由于其不引起载体蓄积和其生物相容性能而备受关注聚羟基脂肪酸酯 )( ) 3( 3)3! %& 是一类由多种微生物发酵合成的脂肪族生物 0 聚酯高分子材料具有良好的生物可降解性和生物相容性是一类有广泛应用前景的生物医药材料已作为骨软骨血管心脏瓣膜等组织的支架材料和外. 周神经导管等在组织工程领域进行应用研究同时 %& 家族中的聚 $ 羟基丁酸 %&' $ 羟基丁酸 $$ 羟基戊酸共聚酯 %&'< 和 $ 羟基丁酸 $$ 羟基己酸共聚酯 %&'&& 也已有被作为药物缓释载体 "$ 的研究由于其脂肪族生物聚酯的化学性质其主要被用于疏水性药物的包封但目前报道的研究中所采用的模式药物多为 0$ 氟尿嘧啶舒巴坦庆大霉素等中小分子质量的药物尚无 %& 材料作为较大分子量疏水性药物包封的研究本研究采用 * +, 激酶抑制剂雷帕霉素相对分子质量 =# 为模式药物研究了 %& 家族中的 %&'&& 材料对雷帕霉素的包裹体外释放及对人前列腺癌细胞系 % 的体外增殖和胞内 * +, 激酶活性抑制效果为 %& 材料作为较大分子量疏水性药物的递送载体提供实验数据 + 材料与方法 +,+ 材料的纯化实验中采用的 %&'&& 材料由清华大学生命科学院陈国强教授惠赠 %&'&$ & 经多次氯仿溶解 $ 乙醇沉淀法进行纯化获得的用于实验的 %&'&& 材料分子质量约为. 其中 $ 羟基己酸 $&& 单体的摩尔百分含量约为 +,- 包裹雷帕霉素的纳米颗粒的制备及表征称取 *2%&'&& 材料和 *2 雷帕霉素溶于 * 氯仿中将溶解有药物和材料的氯仿溶液用注射器缓慢加入 0* 的 2 %< 溶液中并超声分散 * 超声功率设置为最大功率的 1 形成乳液将乳化液转移至磁力搅拌器上充分搅拌. 或过夜使 %&'&& 纳米颗粒固化室温下减压蒸馏除去体系中残留的氯仿制备的纳米颗粒悬液 # * 离心 * 上清转移至新管在 * 离心 * 两次离心的沉淀用总共 0* 双蒸水或灭菌 %'- 或细胞培养基重悬后进行后续实验和鉴定进行 0 次独立实验并采用颗粒粒度分析仪马尔文公司英国测定 %&'&& 纳米颗粒粒径及分布取 0 制备的颗粒悬液加入 0 乙腈溶解颗粒后 >? 下保存使 %&'&& 材料析出 * 离心 * 高效液相色谱安捷伦 &% 法检测上清中的药物含量选用 - )$ )* + -$'% 柱 0*.**@0** 甲醇 A 水 = A 为流动相流速 * * 在 ""* 下检测雷帕霉素出峰面积根据标准曲线计算颗粒中雷帕霉素含量并按照下述公式计算载药颗粒的药物包封率药物包封率药物包封率表示被纳米颗粒包裹的药物占总投放药物的百分比其中表示纳米颗粒体系中雷帕霉素的总量表示投放到制备体系中的雷帕霉素质量取次独立实验制备的载药纳米颗粒并计算颗粒中的药物包封率 +, 包裹雷帕霉素的纳米颗粒体外药物缓释研究将制备好的 0* 载药纳米颗粒悬液置于截留分子质量为的透析袋中以流动水为透析外液进行雷帕霉素体外释放研究于各预设时间点取透析袋中的载药纳米颗粒高效液相色谱法检测颗粒中剩余的雷帕霉素并计算其释放百分比测定次独立实验制备的载药纳米颗粒的体外释放情况 +,. 人前列腺癌细胞系的体外培养细胞活力检测及 % ) 活性检测采用添加 * 胎牛血清的,%. 培养基体外培养 % 细胞 % 细胞以个细胞孔的密度接种于 #. 孔板中过夜贴附后加入 *)( 的雷帕霉素或含有等量雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒后法检测细胞活力细胞活力检测实验每次设. 个平行样品并独立重复次实验!! () 检测 * +, 底物核糖体 - 小亚基 -. 蛋白激酶 "$ ) )*3( )! -. 3! "-./ 的磷酸化程度以反映 * +, 活性抑制情况磷酸化 "-./ 特异性抗体 #0!(- 23$ ( 2!)()2 为一抗 A 辣根过氧化氢酶标记的山羊抗兔抗体北京中杉金桥生物公司为二抗 A0 % 化学发光底物购自! *) -! ; "#"-./ 的磷酸化检测进行次独立免疫印迹实验 + / 统计学分析所有数据表示为均数 B 标准差应用软件 -%-- 进行检验 0 时认为差异具有统计学意义

. 西安交通大学学报医学版第卷 - 结果 -,+ 包裹雷帕霉素纳米颗粒的制备及表征采用乳化溶剂挥发方法制备得到了包裹雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒空白 %&'&& 纳米颗粒和载雷帕霉素 % 纳米颗粒所制备的 %&'&& 纳米颗粒透射电镜照片如图所示载药 %&'&& 纳米颗粒与空白 %&'&& 纳米颗粒相比粒径显著增大 0 载药 %&'&& 纳米颗粒与载药

纳米颗粒对雷帕霉素的包封率显著高于载药 % 纳米颗粒对雷帕霉素的包封率表图 + 纳米颗粒透射电镜照片 2 :! );%&'&& 3)3 (! @ 载雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒 ' 空白 %&'&& 纳米颗粒表 + 空白及载雷帕霉素纳米颗粒的粒径分散性及药物包封率 3! 3*!! )(! 3! 3*!!; $! );;!!3 33* $()3! 3)3 (! 纳米颗粒粒径 * B 分散性 % 药物包封率 1 空白 %&'&& #.

3 . 西安交通大学学报医学版第卷 - 结果 -,+ 包裹雷帕霉素纳米颗粒的制备及表征采用乳化溶剂挥发方法制备得到了包裹雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒空白 %&'&& 纳米颗粒和载雷帕霉素 % 纳米颗粒所制备的 %&'&& 纳米颗粒透射电镜照片如图所示载药 %&'&& 纳米颗粒与空白 %&'&& 纳米颗粒相比粒径显著增大 0 载药 %&'&& 纳米颗粒与载药药物始终无法从纳米颗粒中完全释放两种载药颗粒在体外释放 0 后未释放的残余药物量分别为 "1 和 01 差异具有统计学意义这一现象可能与 %&'&& 和 % 两种材料结构有关与 % 相比 %&'&& 材料中的羟基己酸单体具有较长的侧链结构使其不易形成稳定规则的晶体结构因而相对形成的纳米颗粒更加疏松多孔更有利于药物从颗粒内部充分释放 % 纳米颗粒粒径无统计学差异载药 %&'&& 纳米颗粒对雷帕霉素的包封率显著高于载药 % 纳米颗粒对雷帕霉素的包封率表图 + 纳米颗粒透射电镜照片 2 :! );%&'&& 3)3 载雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒 ' 空白 %&'&& 纳米颗粒表 + 空白及载雷帕霉素纳米颗粒的粒径分散性及药物包封率 3! 3*!! )(! 3! 3*!!; $! );;!!3 33* $()3! 3)3 (! 纳米颗粒粒径 * B 分散性 % 药物包封率 1 空白 %&'&& #. B " > %&'&& $ 雷帕霉素 B. 0 # # 0B % $ 雷帕霉素 B" 0. B 0 % 多分散指数 )(!! 与空白 %&'&& 纳米颗粒粒径相比 0 与载雷帕霉素 % 纳米颗粒的药物包封率相比 %&'&& 颗粒制备进行 0 次独立实验每次实验取个样品进行粒径分析 %&'&& $ 雷帕霉素和 % $ 雷帕霉素颗粒制备进行次独立实验每次实验取个样品进行粒径分析 -,- 载药纳米颗粒中雷帕霉素的体外缓释采用透析法研究了包裹雷帕霉素的 %&'&& 和 % 纳米颗粒体外药物释放的情况结果如图所示 %&'&& 纳米颗粒能够很好地实现对雷帕霉素的缓释作用其在内没有明显的突释阶段释放的药物约为包封药物总量的 1 其缓释过程可以至少持续 " 相比之下包裹雷帕霉素的 % 纳米颗粒在最初内有较明显的突释阶段释放的药物约为包封药物总量的 1 而在药物释放 " 后 %&'&& 纳米颗粒中的雷帕霉素能够继续缓慢释放而 % 纳米颗粒中仍有约 01 的图 - 包裹雷帕霉素的和 0 纳米颗粒体外药物缓释曲线 2!(!3! ); (! ); 33* $()3! %&'&$ & 3 % 3)3 (! -, 载雷帕霉素纳米颗粒对细胞体外增殖的影响 % 细胞以个细胞孔的密度接种于 #. 孔板中过夜贴附后加入 *)( 的雷帕霉素或含有等量雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒分别在加药和后检测细胞活力以加药时的细胞活力为 1 计算各处理组相对细胞活力结果如图所示 *)( 游离的雷帕霉素可以抑制 % 细胞体外增殖包裹有等量雷帕霉素的 %&'$ && 纳米颗粒对 % 细胞体外增殖同样具有显著的抑制作用且作用强于游离的雷帕霉素而空白的 %&'&& 纳米颗粒对 % 细胞体外增殖同样具有抑制作用 -,. 载雷帕霉素纳米颗粒对细胞 % ) 活性的抑制作用 "-./ 是 * +, 调控下游通路时直接的作用底物本研究通过!! () 方法采用磷酸化 "-./ 特异性抗体检测了经雷帕霉素和载雷帕霉素 %&'&& 纳米颗粒处理的 % 细胞中 "-./ 的磷酸化程度以反映雷帕霉素和载雷帕霉素 %&'&& 纳米颗粒对 * +, 活性的抑制情况结果显示空白的 %&'&& 纳米颗粒对 * +, 活性无影响其 "-./ 磷酸化水平和对照组无统计学差异而游离的雷帕霉素和载雷帕霉素的 %&'&$ & 纳米颗粒均可充分抑制 * +, 的活性磷酸化

4 期李明川张雅利卢晓云等 $ 羟基丁酸 $$ 羟基己酸共聚酯纳米颗粒作为雷帕霉素缓释载体的应用研究 " "-./ 水平均有显著降低图图载药纳米颗粒及游离雷帕霉素 +1% 0 对增殖的影响 2 :;!); 33* $()3! %&'&& 3)3 (! 3 ;!! 33* ) )( ;! 3 ));% 与对照组相比 0 雷帕霉素 *)( 组与载雷帕霉素 %&'&& 组相比 0 图. 磷酸化 1' 的 (! 结果 2!! ()33( );) ) (3! "-./ 对照组游离雷帕霉素 *)( 处理组空白 %&'&& 2 处理组载雷帕霉素 %&'&& 纳米颗粒包裹 *)( 雷帕霉素处理组与对照组相比讨论 %& 是一类可由多种微生物合成的生物可降解材料 %&'&& 是 %& 家族中的一员其生物相容性及可加工性能都优于其他已工业化生产的 %& 材料如 %&' 和 %&'<%&'&& 在组织工程领域的应用已被广泛报道而其作为药物载体的应用研究尚处在起步阶段虽然 %&'&& 是一种生物可降解高分子材料但目前尚无 %&'&& 纳米颗粒体内外降解情况的报道其作为药物载体的应用仍主要基于其良好的生物相容性且 %&'&& 膜材料在体外经过 " 的降解只有约 1 的失重故药物从 %&'$ && 纳米颗粒中的释放仍被认为主要依赖于药物的扩散作用我们在前期研究中已经分别以 0$ 氟尿嘧啶和 69 为模式药物对 %&'&& 作为小分子质量和中等分子质量疏水性药物递送载体进行了研究证实了 %&'&& 材料对中等分子质量和小分子质量疏水性药物的有效包封能力和释放能力雷帕霉素是一种分子质量较大的疏水性药物本研究以雷帕霉素为模式药物探索 %&'&& 材料对较大分子质量疏水性药物的包封能力和体外释放效果结果显示 %&'&& 能够有效包封雷帕霉素且能够实现其体外缓释对比 %&'&& 对不同分子质量药物的释放曲线可以发现对 0$ 氟尿嘧啶相对分子质量 = 这样的小分子药物 %&'&& 纳米颗粒的缓释效果较差其存在明显的突释阶段在释放最初内已经有约 1 的包裹的药物被释放而对 69 相对分子质量 =. 其释放相对比较缓慢最初内释放的药物为全部被包裹药物的 1 左右而本研究结果表明 %&'&& 纳米颗粒对于较大分子量的雷帕霉素释放速度最慢在其体外缓释后只有约 1 的药物被释放图且释放曲线走势平缓缓释可至少持续 " 由于 %&'&& 是一种由短链的羟基丁酸单体和中等链长的羟基己酸单体组成的共聚物高分子材料其形成的纳米颗粒内部结构较为疏松小分子质量的疏水性药物能够很容易地从纳米颗粒内部扩散出来因此 %&'&& 纳米颗粒对其的缓释能力不强其体外缓释时可以观察到明显的突释现象而随着药物分子质量的增加其从颗粒内部扩散的速率逐渐降低故对中等分子质量和较大分子质量的疏水性药物而言 %&'&& 纳米颗粒能够很好实现其缓释作用本研究采用的人前列腺癌 % 细胞是一株 % :5) 33!3! )*)()2!(!! ) )*) )*! 缺失的细胞系 % :5 作为酯性磷酸酶可通过对磷酸酰肌醇 $0 三磷酸酯 % % 的去磷酸化而负性调节 % / 信号通路抑制肿瘤细胞的增殖能力而 * +, 是磷脂酰肌醇 $ 激酶蛋白激酶 ') 3 ( ) )($ 3! )! 3! '% / 信号通路的下游分子参与基因转录蛋白质翻译核糖体生物合成和细胞凋亡等多种生物学功能在肿瘤细胞的增殖和侵袭也发挥着重要作用作为 * +, 的直接底物 "-./ 是 * +, 调控下游通路时直接的作用底物被 * +, 磷酸化

5 西安交通大学学报医学版第卷后激活活化的 "-./ 可以刺激核糖体合成加速 *,5 翻译过程缩短细胞增殖周期从而促进细胞 $0 生长 * +, 活性的降低会导致 "-./$ # 位置磷酸化程度的降低因此可采用 "-./$ # 的磷酸化水平表征 * +, 复合体的活性 % 细胞中 % :5 的缺失导致其 % / 信号通路活性相对增强因而其增殖对 % / 信号通路下游 * +, 分子的抑制剂敏感在 % 细胞体外增殖实验中包裹 *)( 雷帕霉素的 %&'&$ & 纳米颗粒能够有效抑制 % 细胞的体外增殖且其作用甚至强于 *)( 的游离雷帕霉素同时可以发现空白的 %&'&& 纳米颗粒 2 处理 % 细胞后也对细胞增殖产生了一定的抑制作用 %&'&& 材料本身具有良好的生物相容性但本实验发现 %&'&& 纳米颗粒能够被 % 细胞吞噬而在胞质内积累结果未显示且在一定程度上对细胞的体外增殖有抑制作用未来需进一步深入研究颗粒在细胞内蓄积对细胞的影响但由于 %&'&$ & 载药纳米颗粒可以进入肿瘤细胞可以通过胞内释药使得药物能够更直接地作用于其靶分子综合上述两方面原因故载雷帕霉素的 %&'&& 纳米颗粒较游离雷帕霉素对 % 细胞体外增殖的抑制作用更强本研究结果表明 %&'&& 是一种很有潜力的疏水性药物递送载体特别对于一些中大分子质量的疏水性药物能够高效包封并有效实现药物的缓释作用未来可以对 %&'&& 纳米药物载体体内分布及代谢情况进行研究并可以进一步研究其体内药物释放情况参考文献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编辑国荣 ( 0 + () #",

材料导报研究篇年月下第卷第期种球的制备单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球洗脱处理种子溶胀聚合机理种球用量的影响

材料导报研究篇年月下第卷第期种球的制备单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球洗脱处理种子溶胀聚合机理种球用量的影响水相中组氨酸单分散分子印迹聚合物微球的合成表征及其识别性能研究李思平等李思平徐伟箭较佳工艺条件下在水性体系中选用无皂乳液聚合法制得的单分散微米级聚苯乙烯微球为种球分别以组氨酸甲基丙烯酸或丙烯酸胺乙二醇二甲基丙烯酸酯为模板分子功能单体和交联剂合成了组氨酸分子印迹聚合物微球研究了形貌粒径及其分布以及模板分子与功能单体之间的相互作用分别以激光粒度分析仪紫外分光光度法和红外光谱表征功能单体与交联剂之间的共聚情况