* 中国防痨杂志 年 月第 * 卷第 期 27!8-!$)&.(.7"*6 论著 结核分枝杆菌 -13 亚单位疫苗的构建与免疫原性研究 李志 达泽蛟 章国平 李瑞营 刘万波 苏娟 张颖 祝秉东 摘要 目的构建 ()-13 早期分泌抗原靶 复活促进因子 的原核表达载体 表达和纯化融合蛋白 并对其免疫原性进行研究 方法分别以 ()4 及临床株的基因组为模板 2 扩增 基因 依次插入 31 质粒并在大肠埃希菌 9 中表达纯化 -13 蛋白 采用完全随机的方法将 29 小鼠分组 每组 只 共进行了两次实验 第一次实验分为 -13-1320 五组 佐剂为二甲基三十六烷基胺!&7:"!:"&:"!$).!&55- 第二次实验有 -13 20 三组 佐剂为 5055-3":;2 明胶 分别于 周皮下免疫 29 小鼠 末次免疫 周后 用特异性抗原 -1 及 3 刺激 检测其分泌 ;6 的水平 9;- 检测血清特异性抗体 ;0);0 结果 2 扩增的 基因序列与 0& 报道一致 融合蛋白主要以包涵体形式表达 亚单位疫苗免疫动物能够分泌 3 特异性 ;6 的脾淋巴细胞数量 *+B+* 显著高于 组 +B+*C+* + 分泌 -1 刺激特异性 ;6 的脾淋巴细胞数量 +B*+* 明显高于 组 +B*+ C++ 和 20 组 +B*+*C++-13 免疫组能诱导产生特异性抗体 结论成功构建并表达 -13 融合蛋白 此融合蛋白可在 29 小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答 可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究 关键词 疫苗 亚单位 重组融合蛋白质类 细菌蛋白质类 细胞因子类 免疫活性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基金项目 十一五 国家科技重大专项 * 国家自然科学基金 * 作者单位 兰州大学结核病研究中心暨病原生物学研究所 李志 达泽蛟 章国平 李瑞营 刘万波 苏娟 祝秉东 美国霍普金斯大学布隆博格公共卫生学院分子微生物学与免疫学系 张颖 通信作者 祝秉东!")=7$"=$&$
中国防痨杂志 年 月第 * 卷第 期 27!8-!$)&.(.7"*6 /&/!29!&-1 3$/!3.&!)&$/& /!&7&/$)$!4!& $.7&./$: &!&//$)$!&)!$/!3.&!/&.!"3.&!/2:!&/;$ 3&&& 结核病 $)&.$"/!/1 是由 () 引起的疾病 据 年世界卫生组织报道 每年约 * 万例患者中 万例死于此病 并且 () 和 ; 双重感染的出现 使 1 的防治更加困难 20 作为惟 一有效的 1 疫苗 虽然广泛应用于新生儿的 1 防治 但是不能有效阻止成人肺结核的发生 同时环境分枝杆菌 寄生虫的感染都会影响 20 的效 * 果 因此 迫切需要发展更加有效的预防性和治 疗性的 1 疫苗 亚单位疫苗组成成分明确 使 用安全 不受环境分枝杆菌的影响 能诱导有效的免疫应答 由于亚单位疫苗的免疫保护效果难以超过 20 采用 20 初始免疫 亚单位疫苗增强 免疫的策略 可以提高成人的免疫效果 同时符合我国新生儿预防接种 20 的国情 结核病难以彻底治愈的重要原因是 () 能以 休眠状态存在于宿主体内 并保持持久活性 复活促进因子.&/$/!!3.!.3 最初在藤黄微球菌 6 中发现 该因子可以促进休眠菌的复苏和生长 经杂交试验证实 3 基因也存在于多种分枝杆菌中 () 含有 个 3 样基因 4( 4 4* # 4 和 4* 有文献报道 3 蛋白引起的免疫应答可有效抵抗 () 的激 * 活 其中 3 蛋白对 29 小鼠有免疫保 护作用 重组 3 蛋白对 20 休眠菌有促生长 作用 联合不同时相表达的蛋白所制成的融合 蛋白疫苗 可用于 1 的预防和治疗 本实验同时也选择了 () 感染早期分泌性蛋白 -1-1 编码基因位于 5 区 全长 )320 中缺乏 仅存在于有毒力的 () 中 一 材料 材料和方法 ()4 株 临床株由甘肃省兰州市肺科医院提供 20 菌株 丹麦株 由兰州生物制品研究所惠赠 31 65695 重组质粒 3131-1 蛋白由本实验室制备保存 各种限制性内切酶 连接酶及 56- 聚合酶均购自宝生物工程 大连 有限公司 质粒提取试剂盒 产物纯化试剂盒 56- 胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公 司 寡核苷酸引物的合成 重组质粒的测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成 二甲基三十六烷基铵 55- 购自!-".!7 公司 弱阴离子交换柱 ;5- 及 ;2:" 层析柱均购自 07&"7.& 公司 鼠 ;69;- 检测试剂盒 (;* 培养基购自深圳达科为生物科技有限公司 其余试剂均为国产或进口分析纯 29 小鼠 级 雌性 周龄 体重 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司 饲养于甘肃中医学院 级实验动物室 二 方法 () 基因组 56- 的提取 取少量临床 () 接种于罗氏培养基 D 培养 周 取适量培养物重悬于 *" 的 1 缓冲液中 D 水浴 *! 杀灭菌株 加入 " 溶菌酶 " 充分研磨后 D 水浴过夜 加入 ",5 十二烷基硫酸钠 "" 蛋白酶 混匀 D 孵育! 加入 "6- 酶 " 摇匀后室温放置! 依次加入 ""96 2"" 21- 十六烷基三甲基溴化铵 6 2"D 孵育! 用等体积氯仿 A 异戊醇 *A 抽提 E 离心! 将上清液移至干净离心管 加一倍体积异丙醇颠倒混匀 沉淀 56-, 乙醇漂洗后吹干 溶于 *"1 缓冲液 D 保存 目的基因的扩增 通过信号肽预测软件预测 信号肽 设计引物 上游引物 2000--112-100-20-20200021100- 下划线为 酶切位点 下游引物 -1- --021112-02202002002202-0- 下划线为 ' 酶切位点 2 反应体系 +" 水 E)$&." 61 脱氧核糖核苷三磷酸 " 上下游引物 各 +"56- 模板 +"56- 聚合酶 +"2 反应条件 D 变性 /D 退火 /D 延伸 / 共 个循环 2 产物用胶回收试剂盒纯化回收 重组质粒的构建 2 产物和重组质粒 31 分别经 ' 双酶切后 在 1*56- 连接酶催化下 D 过夜连接 转化 6 5 实验中常用的宿主菌 感受态细胞 随机筛选阳性克隆接种于 " 含卡那霉素 "
中国防痨杂志 年 月第 * 卷第 期 27!8-!$)&.(.7"*6 的 9"$.!)&.! 液体培养基 D 过夜振荡培养 小量提取质粒 56- 经酶切 2 鉴定后由北京六合华大基因科技股份有限公司进行基因测序 * 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析 将经测序验证的重组质粒转化 95 表达菌 筛选阳性单克隆接种于含卡那霉素 " 的 9 液体培养基 过夜培养 按 A 的接种量进行转接 D 振荡培养 7 至 值为 ++ 加 ;10 异丙基 5 硫代吡喃半乳糖苷 至终浓度为 +"9D 诱导表达 *7 收集菌体超声裂菌 离心后将上清 沉淀分别制样 通过, 5-05 聚丙烯酰胺凝胶 进行分析 融合蛋白的纯化 培养 " 菌液 ;10 诱导表达融合蛋白 E 离心! 收集细菌 细菌重悬于 " 磷酸盐缓冲液 缓冲液 3+* 冰浴下超声破碎细菌 7 超声波处理 / 停 /E 离心! 收集包涵体 将包涵体溶于 " 的尿素 溶解的蛋白依次用尿素梯度浓度 *+" 尿素 "9 1.!/2"3+*D 透析 7 复性后的蛋白按照 -1- 蛋白纯化系统 制备型液相色谱蛋白分析仪纯化步骤进行纯化 - 液 "" 6 2"3 +* 液 ""6 2" 3+* 先安装弱阴离子交换柱 ;5- 一种纯化柱型号 收集不同吸收峰下的洗脱液, 5-0 检测 将纯度较高的目的蛋白富集后 再用疏水层析柱 ;2:" 一种纯化柱型号 进行纯化 方法同上 5-0 分析收集目的蛋白 透析过夜 考马斯亮蓝法.. 法 测定蛋白质浓度 蛋白 3 表达及纯化 将带有!/ 标签的重组质粒 31 转化 9 诱导表达方法同上 收集菌体重悬于 缓冲液 3+* 冰浴下超声破碎细菌! 超声波处理 / 停 /E 离心! 收集上清 亲和层析法纯化蛋白 纯化步骤同上 - 液 "6 * + "6 2" "!!="& 咪唑 3 +* 液 "6 *+"6 2" "!!="&3+* 收集不同吸收峰下的洗脱液 5-0 检测 富集目的蛋白 透析后保存 亚单位疫苗的配制及动物分组 亚单位疫苗选用了 种佐剂 进行了 次动物实验 第一次实验选用 55- 为佐剂 55- 用 制成 +" D 水浴! 促溶 冷却至室温后使用 蛋白用 稀释至 +" 取 "55- 溶液与等量蛋白充分乳化 实验动物雌性 29 小鼠共 只 完全随机分为 组 分别为 -13-1320 组 每组 只 分别将蛋白 -13-13 与佐剂 55- 制备的蛋白疫苗 腹股沟皮下免疫小鼠 " 只 免疫 次 每次间隔 周 组注射 " 只 20 组接种 20E 2 只 末次免疫 周后测定小鼠 ;6 水平和血清特异性抗体 ;0);0 第二次实验选用 5055-3":;2 明胶 为佐剂 蛋白用 稀释至 +*"3": ;2 用 制成 " 明胶用 配制成 " 于 *D 水浴! 冷却至室温 55- 用 制成 "D 水浴! 促溶 冷却至室温后使用 取 " 蛋白与等量的 3":;2 55- 充分混匀后 缓慢加 " 明胶 充分乳化 将融合蛋白 -13 与佐剂 5055-3": ;2 明胶 制备疫苗 免疫策略同上 同时设立 和 20 组对照 末次免疫 周后 采用酶联免疫斑点法 9;1 测定分泌表达 ;6 的细胞数 9;- 检测免疫小鼠脾细胞分泌 ;6 水平 末次免疫 周后处死小鼠 无菌分离脾脏 经研磨 尼龙网过滤后用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞 将终浓度为 E " 的淋巴细胞 加入 * 孔板 " 孔 3" 蛋白刺激 阴性对照用培养基代替刺激物 阳性对照用 " 的刀豆蛋白 2- 刺激 均设复孔, 2 孵箱中 D 共孵育 7 收集培养液 参照试剂盒说明书检测样品中 ;6 含量 9;1 测定脾细胞分泌 ;6 分泌能力 将分离的淋巴细胞 加入 孔 9;1 板中 E 孔 给予 -1+"3 +" 蛋白刺激 共孵育 *7 后 按试剂盒说明书操作 依次加入检测抗体等试剂 洗板 显色 计数斑点数 9;- 检测抗体水平 用 " 的蛋白 -13 包被 孔板 " 孔 *D 过夜 洗涤后加入, - 牛血清白蛋白 " 孔 D 封闭 7 洗涤后 从 A 开始至 A 加入倍比稀释的血清样品 " 孔 D 孵育 7 洗涤后 分别加入 A 或 A 稀释的兔抗鼠 ;0;0)" 孔 D 孵育 7 洗涤后 加入 1( 四甲基联苯胺
中国防痨杂志 年 月第 * 卷第 期 27!8-!$)&.(.7"*6 显色液 " 孔 显色! 后 加入终止液 "*" 孔 * 检测吸光度 统计学处理 实验数据以 B 表示 统计学分析采用单因素方差分析 ++ 为差异有统计学意义 四 重组蛋白 3 的表达及纯化带有!/ 标签的重组 3 蛋白 以上清的形式在大肠埃希菌中表达 图 显示 3 蛋白纯化产物 经 6!61-!/! 柱 64& 纯化可以得到高纯度的 3 蛋白 结 果 一 基因的 2 扩增及序列测定以临床 () 基因组为模板 用合成的 扩增引物进行 2 扩增 可扩增出长度为 *)3 片段 图 测序结果与 0& 上公布的! 252 序列一致 ( 标准蛋白 3 超声上清 纯化的 3 蛋白 图 3 蛋白的诱导表达和纯化分析 ( 分子量标准 基因 基因 图 2 产物的, 琼脂凝胶电泳 二 重组载体的构建及序列测定 2 产物 和重组质粒 31 分别经 ' 双酶切后连接 转化 随机筛选阳性克隆 进行 2 酶切鉴定 可以得到 和 *)3 的基因片段 证明克隆正确 测序再次验证后 将阳性克隆命名为 31! 三 融合蛋白表达及纯化 -13 融合蛋白在大肠埃希菌中能稳定高效表达 主要以包涵体形式存在 图 显示 -13 蛋白的表达及纯化结果 可见经离子交换 疏水层析的方法纯化 可得到高纯度的 -1 3 蛋白 五 免疫小鼠脾细胞诱导的 ;6 水平第一次实验 -13 组 体外脾细胞受 3 刺激时分泌 ;6 分泌水平 +B+ 9 高于 20 组 +*B+ 9C ++ 显著高于 组 B 9 C++ 图 * 第二次实验 -1 3 组体外脾细胞用 3 刺激 分泌 ;6 的脾淋巴细胞数量 *+B+* 显著高于 组 +B+*C+*+ 用 -1 刺激 分泌 ;6 的脾淋巴细胞数量 +B *+* 显著高于 +B*+C ++ 显著高于 20 组 +B *+*C++ 图 29 小鼠免疫 周脾淋巴细胞受 3" 蛋白刺激分泌表达 ;6 水平 佐剂为 55- + 图 ( 第一次实验免疫小鼠脾细胞分泌 ;6 水平 ( 标准蛋白 9 超声上清 -13 超声上清 -13 超声沉淀 * 纯化的 -13 蛋白 图 -13 蛋白的诱导表达和纯化分析 六 免疫小鼠血清特异性抗体检测 9;- 方法检测免疫小鼠血清 -13 的特异性 ;0 和 ;0) 抗体水平 图 生理盐水对照组血清抗体为阴性 20 免疫组未检测到抗 -1 抗体 较单个蛋白 -13 组 融合蛋白 -13 引起体液免疫应答强
中国防痨杂志 年 月第 * 卷第 期 27!8-!$)&.(.7"*6 29 小鼠免疫 周脾淋巴细胞 E 受 -1+" 和 3+" 蛋白刺激分泌表达 ;6 细胞数 左图为 3 刺激 右图为 -1 刺激 佐剂为 50 +) + 图 ) 免疫小鼠脾淋巴细胞分泌 ;6 水平 图 -2 检测 -1 特异性抗体 图 5 检测 3 特异性抗体 图 免疫小鼠特异性抗体水平 讨 论 预防 1 的主要手段是接种 20 但是 20 对 * 于防治 1 在全球的流行效果不甚明显 对成人肺结核保护效果不佳 因此寻求互补或者替代 20 的疫苗刻不容缓 当前研究的新型疫苗包括重组 20 疫苗 构建减毒突变株 蛋白疫苗 56- 疫苗 及病毒载体疫苗等 其中蛋白亚单位疫苗因其成分明确 使用安全 成本低 备受研究者的关注 疫苗免疫策略表明 初始 增强免疫策略可以提高疫 苗的免疫效果 尤其提高成人肺结核免疫保护力 故研究有效的亚单位疫苗加强 20 或重组 20 成 为疫苗研究的主要方向 本研究选择了 -1 3 种个抗原进行融合表达 其中 -1 是 () 早期分泌性蛋白 是效应性 1 细胞的主要靶抗 原 具有较强的免疫原性和良好的抗原刺激性 3 对 20 休眠菌具有复苏作用 年 4 全基因组序列的发表 使 1 的研究有了突破性进展 基因组信息在研究基因表达 为药物研究筛选靶点中起着重要的作 用 4 被广泛作为标准毒力株来研究 1 然而 ;&.&. 等对来自不同实验室的 种 4 菌株进行全基因组测序 发现有遗传变异 过去认为 () 尤其是 4 基因组比较稳定 然而体内 * 体外的研究证实 () 一直在进化中 所以仅仅拿过去的标准株来研究现在流行的 1 存在一定的缺陷 因此本实验采用临床株作为模板扩增目的基因 在构建原核表达载体时 笔者设计去除 的信号肽 预测信号肽的切除位点 -6-55 的引物 扩增出 基因片段 序列比对发现该基因序列与 ()252 一致 () 252 菌株是在 * 年暴发的 1 中分 离出来的 因其感染率高及 5 反应强烈 引起研究人员的广泛关注 研究发现 252 能诱导快速强烈的宿主反应 推断其产生的免疫刺激因子 能诱导强的 17 型反应 从而减慢疾病进展 后基因组学时代利用融合蛋白的标签选择性与层析基质上的配体结合的原理来纯化蛋白 该方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性 可以纯化任何蛋白 但是进一步研究蛋白质的结构和临床应 用 就应避免亲和标签所带来的潜在干扰 过去主要通过蛋白酶 内含肽剪切融合蛋白来获得天然无标签蛋白 然而针对某些特定的融合蛋白 此剪切过程比较困难 本研究在构建原核表达载体时 去除了标签 避免了再剪切标签的过程 生产工艺更加便利 本研究选择了 55- 为佐剂 因为 55- 毒性 ** 低 可诱导较强的细胞免疫反应 且已有多个 * 以 55- 为佐剂的重组蛋白疫苗进入临床实验 一直以来 ;6 分泌水平作为评价疫苗保护性的 ** 一个指标 本研究检测结果表明 针对 -13 的组分 3 刺激 -13 组免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的 ;6 水平最高 3 组及 20 组均次之 说明融合蛋白 -13 保留了 3 的免疫原性 在佐剂 50 的辅助下 9;1 检测脾细胞分泌 ;6 的细胞数 -13 组受 -13 蛋白刺激时 明显高于 及 20 组 抗体水平检测发现 -1 3-13 组小鼠血清均能诱导体液免疫应答 -13 组引起体液免疫应答较单个蛋
中国防痨杂志 年 月第 * 卷第 期 27!8-!$)&.(.7"*6 白 -13 组强 综上所述 融合蛋白 -1 3 保留了 -1 和 3 两个抗原的免疫原性 为排除细菌内毒素对实验结果的影响 笔者检测了蛋白的内毒素含量 其结果为 &%! $! 内毒素的效价单位 " 符合生物制品的要求 本研究成功构建了! 原核表达载体 表达 纯化融合蛋白 并初步研究了融合蛋白的免疫原性 该疫苗能诱导较强的体液免疫和细胞免疫应答 可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究 参 考 文 献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祝秉东 王洪海 结核疫苗研究的历史与现状 中华结核和呼吸杂志 0&=8(!&:8563&./!/&&"& :.$"&.&1$)&.$"/!/!)** ** 1$.!&"8((!$8&"5&"&!7&!.&/$/!!3.!.4&&.& /$"/!&":&.&!4!.7.!$)&.$"/!/;& ;$* 师长宏 徐志凯 结核分枝杆菌 蛋白的生物学特性及其在结核病疫苗研究中的应用 中华结核和呼吸杂志 ** *7"&&4 (($ "4 0>$ (& ".! "$"$.)"&&"/"!/!.: 37/&!.&/3/&.#7$&./$)3!"!!/ 7&!.3&!&.&/$/!!(!.)!":* 薛莹 姜鸿 高雪 等 结核分枝杆菌 4* 基因的克隆 表达及纯化 第四军医大学学报 * 郭晓雅 师长宏 史皆然 等 重组结核分枝杆菌 3 蛋白对 20 休眠菌的促生长作用 中国人兽共患病学报 &!.!7"/&-4!%&.&9-(&&"/9& ".&!!&#!7 $)&.$"/!//$)$!4!&)/& $/!3.&!!&) &/;&;$ 45&!//!&-$"&1& $1&".&/3 /&/7&-1!&. 8 ;&5!/* ".!7/1($ (("&3& 5!&.&!"1 &".&/3/&/-1!$)&.$ "/!/3!&/ 7&"7:./$.8;$" *.)&(&!&.1!&.0&"4!&&.$..&&7&-13.&!! 4!.$"&.!/ )/&&!! 20;&;$* &7.(-!"/(-0!"&"23.!4&&!/ 204!&/):#7"&&&56-!...:!&& ** 0&=(87/0&.(9;&!!!/&.&& 3.&!/ ): )!!.! 3 3.7;&;$* ($ "4 01$.34->$5;& "-!": $.!&.#7./! (" (!.)!"* *9!(>&716#& /"&&3!!&#! /!7/!7/37&!&.!/!&!:&#.&/. 4!!!/"&!&!!"27&* -&./&14!&/3..&// 3.)"&/1.&/; $" $#!$":.!)$&7&." $)&.$"/!/# 6&4;$" $((!7&"-8-$"! &.$/"!!/ 4!!/.&!&/!/ -;5 $)&.$"/!/ 6 (&*$33"**.&;(.&"!!"&/!!&/.$)&.$"/!/ 3.&7&/!4&.&4!&#!&* &!:>-82-4&/!$)&.$"/!/4!&/. &!&/6&4(!.)!"*** -&./&57&.:1(17&/$&//!"$.&20! 3"!!/. 4&"$)&.$"/!/4!&6&4(!.)!" 张海 师长宏 薛莹 等 结核分枝杆菌 &/3 融合基因疫苗的构建及表达 第四军医大学学报 2"&1./7.7!"8& "5&!37&.!7&)!":. 7&3"&&&&/& '$&&6$.&** ;&.&.1&>0&/$" &".!! & &/&'$&&/4/.!/. $"!3"&")..!&/8&.!"** *(7& $.&3! 6!!8& "("&$".&3!&!":$)&.$"/!/$..&!/!7/2"!(!.)!"&4 * ("!1..&/2-2/.0.= 832!!8&" &/&.!"/$)$"$.!7&&&!3/!! : %!!4!:8(&(!.)!" ** 1/"!-0!./7-5&!&&.& "$!" &4"$!.:&!/!/!7/.&!&"&!/!/.!/. 6"-! -**** "#:7&=(7!!1&"-$).&! 4"4!&%&/!4&./!//! 4!.$"&/.!! 6"8(& ( 21/&4 9..:2.&"!
中国防痨杂志 年 月第 * 卷第 期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收稿日期 本文编辑 薛爱华 通知 年全国结核病防治科普学术会议征文通知 为了促进我国结核病防治科普宣传工作的发展 及时交流相关学术动态 中国防痨协会科普工作委员会将于 年 月在黑龙江省漠河市召开全国结核病防治科普学术会议 现开始征集学术论文 征文具体要求如下 征文内容 本次学术会议交流内容包括结核病科普宣传 健康教育等相关学科新进展 结核病控制 临床 基础研究 耐药结核病的预防 治疗和管理 结核病新诊断工具 新疫苗 新药的研究和使用等相关内容 征文要求 未曾公开发表 通过!" 发送论文全文 征文收稿邮箱 )4!3 论文书写格式及要求参见中国防痨杂志! 年第 期稿约! 或登录中国防痨杂志! 网站 73###="== 阅读投稿指南 发送征文时注明作者姓名 工作单位 通讯地址 邮政编码 联系电话 手机 * 每篇征文要附单位推荐信 注明未公开发表 作者署名无争议 内容真实可靠 无一稿二投等内容 在发送征文的电子邮件主题中注明 年结核病防治科普学术会议征文 征文截止日期 年 * 月 日 征文费用 每篇征文付审稿费 元 含第一作者论 文证书费及汇编一本 被挑选在中国防痨杂志! 上发表的论文需另付版面费 * 汇款账户 户名 广东省防痨协会 账号 上海浦发银行广州环市东支行 征文发表形式 会议录用论文将纳入大会论文汇编 经中国防痨杂志编委会审稿合格的论文将在中国防痨杂志! 上刊发 其他 参会者可获国家级继续医学教育学分 分 参加会议的各省 自治区 直辖市 新疆生产建设兵团 计划单列市防痨协会负责科普宣教的同志可提前报名 并填写报名表回执 回执内容包括 姓名 职务 职称 学历 单位全称及邮政编码 联系电话 于 年 月 日前传真至广东省防痨协会 同时发送电子版本 会议正式通知及会议具体时间 将由中国防痨协会科普工作委员会另行通知 联系方式 联系人 何金苗 尹建军 电话 * 传真 *!")4!3 中国防痨协会科普工作委员会