复旦学报 医学版 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜的 1 1 及其受体 131 表达的作用 何爱明 林 董 林世明 福建师范大学福清分校生物与化学工程系 福清 福建省福清卫生学校药理教研组 福清 摘要 目的 探讨溃结灵对溃疡性结肠炎 # # 大鼠结肠黏膜的中性粒细胞趋化因子 & #& #!$$ '# ##& -. & 及其受体 2 趋化因子受体 2$ '!# 2 表达的作用 方法 只雄性, 大鼠随机分为正常组 模型组 艾迪莎组 溃结灵高剂量组 溃结灵中剂量组和溃结灵低剂量组 共 组 每组 只 用 0 & 三硝基苯璜酸 &##( 6 +./ 灌肠建立大鼠溃疡性结肠炎模型 造模成功后 除正常组外 各组分别给予生理盐水 ' 艾迪莎 "" 溃结灵高 "" 中 "" 低 "" 剂量处理 后处死动物 肉眼观察结合显微镜观察对结肠组织形态学评分 运用荧光定量 法及免疫组化染色法分别检测各组大鼠 -. & 及 2'.) 及其蛋白表达 结果 溃结灵具有明确改善大鼠 的效应 与艾迪莎组相比 溃结灵高剂量组的疗效差异无统计学意义 中 低剂量组的疗效差异有统计学意义 与正常组相比 模型组 -. & 及 2'.) 及蛋白质表达呈明显上升趋势 与炎症呈正相关 经过溃结灵和艾迪莎干预后 随着炎症改善 -. & 及 2'.) 及其蛋白表达呈下降趋势 结论 溃结灵可能通过干预 -. & 及 2 的表达来抑制中性粒细胞趋化 从而达到缓解./ 诱导溃疡性结肠炎的效应 关键词 溃结灵 溃疡性结肠炎 中性粒细胞趋化因子 & 2 趋化因子受体 中图分类号 文献标志码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
何爱明 等 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜的 -. & 及其受体 2 表达的作用 '## #$#7, $4# * ## #' # +##$ #'+ 4$ $4! ( $ ( "#$*! + -. & 2$(#"+ ##+!'!$#!$ +' & 7 " # # ##& #!$$ '# ##& 2$ '!# 溃疡性结肠炎 # # 又称为非特异性溃疡性结肠炎 是一类慢性反复发作的肠道非特异性炎症 病理组织学改变以大量炎性细胞 包括中性粒细胞 淋巴细胞 浸润 隐窝结构扭曲 隐窝脓肿为特点 有研究报道中性粒细胞!'!$ #!$. 通过微血管循环进入结肠黏膜内 并持续存在于活动性 的全过程 固有膜中的. 被认为是病理学炎症反应的可靠的标志性物质 中性粒细胞趋化因子 & #& #!$$ '# ##& -. & 及其受体 2 趋化因子受体 2$ '!# 2 的表达在中性粒细胞向炎症区域的趋化过程中起着关键的作用 若能干预上述相应趋化因子及其受体的表达 从而影响中性粒细胞向炎症区域的趋化 无疑对 的炎症消除和疾病愈合是非常有利的 中药复方溃结灵主要由水蛭 救必应 白芍 炙甘草等组成 以清热 健脾 活血为治则 临床和实 验研究发现 溃结灵对 有较好的治疗效果 对于溃结灵治疗 的作用机制 广州中医药大学脾胃研究所等研究单位已经开展了一系列研究工作并取得一定的进展 但目前仍然未彻底揭示其作用的机理 本研究通过运用荧光定量 法 免疫组化染色检测大鼠 -. & 及 2'.) 及其蛋白的表达 观察溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠的治疗效应及对上述指标的影响 以进一步揭示溃结灵的治疗机制和 的发病机制 材料和方法 实验动物, 大鼠 只 级 雄性 体重 " 由福建医科大学实验动物中心提供 合格证号 闽实动质准第 号 试剂与仪器 溃结灵药材 采芝林连锁药店 经广州中医药大学中药学院中药标本中心张秋镇老师鉴定 药材均符合中华人民共和国药典标准 按组方比例称取药材 常规方法制备水煎液 低 中 高剂量按成人用量的 倍给药 即 ""./ "' 公司 艾迪莎 美沙拉秦缓释颗粒剂 批号 1 博福 益普生 天津 制药有限公司 -. & 抗大鼠抗体 美国, 公司 2 抗大鼠抗体 武汉博士德生物工程有 限公司 大鼠 -. & 2 ),1 基因引物 上海生工生物技术有限公司 / 试剂盒 广州达晖生物公司 其余试剂均为分析纯 造模方法 动物适应性饲养一周后 按体重随机分为 组 每组 只 动物禁食不禁水 $ 留取正常组 只 其余 只给予 0 乌拉坦 '" 腹腔麻醉 参照文献报道的./ 造模最佳剂量 '" " 计算 用 ' 注射器抽吸./ 原液 '" 与 0 乙醇 ' 混合后 用聚丙烯管插入肛门上段 ' 处注入混合试剂 $ 后观察造模动物 约 0 出现稀便和血便 后随机处死 只动物 距肛门约 ' 处肉眼可见大小约 ' ' 的溃疡面 表明造模成功 将其余 只大鼠随机分成模型组 艾迪莎组 溃结灵低 中 高剂量组 个组别 其中模型组 只 其余各组均 只 给药及标本处理 造模成功后 正常组 模型组给予 ' 生理盐水灌胃 艾迪莎组给予艾迪莎 "" 灌胃 溃结灵低 中 高剂量组分别按设计剂量给药 每天 次 均连续给药 各组治疗结束后禁食 $ 处死动物 迅速剖取距肛门 ' 处的长度为 ' 结肠组织 块 分别置于 0 中性甲醛液和液氮中备用 组织形态学评分标准及方法 取全段结肠 剪开 生理盐水洗净 平铺于白板上置于放大镜下肉眼观察结肠大体形态 结肠黏膜损伤情况 表 将固定的结肠组织进行常规石蜡包埋 切片 苏木精 伊红染色 显微镜下观察结肠组织形态学变化 表 表 肉眼观察结肠形态和黏膜损伤评分标准 "#'!&"! '$%' '!#%'* ' '! %'&#!/! #& #!&*%"#'! )$ -+ ''#!$ " #+ *4#$# 4#$#$!'#$(4 4#$+ ''# #$#4 4#$+ ''# #$#4 4#$#$ ' # + + ''# ' $ ' # ++ ''#' #$ (
复旦学报 医学版 年 月 表 光镜下观察组织学损伤评分标准 "#'!&"! '$ #&"' ' #%#!/!#"#%'&%'*#%'& "#'! 1# " ''' /" '' -+ ''# ' # -!#$ (' ' # ( 结肠黏膜 1 1 及 131 表达检测 采用链酶亲合素生物素复合物 #!#&(# '!* )/ 法加微波修复 具体步骤按试剂盒说明进行操作 用已知阳性标本作阳性对照 以 / 代替一抗作阴性对照 在光镜下观察免疫组织化学染色结果 染色阳性表达为胞质或胞膜呈棕褐色颗粒 每张切片随机选取 个高倍视野 计数 个细胞 计算阳性细胞百分比 1 1 及 131 的表达检测 采用荧光定量 法检测 # -. & 引物序列 上游引物 :& )))) ))))&: 下游引物 :&))) )) )) ) ))) &: # 2 引物序列 上游引物 :&) )& ))&: 下游引物 :& & )&: # ),1 上游引物 :&))) ) & ) )) ) ))) &: 下游引物 :&& ) ) )))&: 组织总.) 提取后做逆转录 然后用 #' & 反应体系扩增 采用相对定量 比较管家基因 "$&&!$!$# $ " ),1 与目的基因的 # 值 得出所 测标本目的基因的相对表达量 相对 '.) 表达 # 0# 值 靶基因 # 值 ),1 # 值 结果由 仪配套的软件自动计算 统计学分析 实验数据应用 统计软件进行处理 计量资料采用 表示 组间差异采用单因素方差分析 &4 ). 8) 方差齐时用 $ + 法 方差不齐时用 ' &14 法 时 认为差异有统计学意义 时 认为差异有显著统计学意义 结 果 肉眼及光镜观察结肠黏膜损伤情况和损伤评分 表 2 模型组黏膜糜烂重 溃疡多而大 黏膜严重充血 水肿 艾迪莎组黏膜糜烂程度减轻 溃疡数量少 黏膜充血 水肿程度较模型组轻浅 溃结灵高剂量组黏膜糜烂不严重 溃疡小 黏膜充血 水肿程度轻 溃结灵低剂量组黏膜糜烂较严重 溃疡较明显 黏膜充血 水肿程度无明显减轻 溃结灵中剂量组的组织损伤介于高剂量组和低剂量组之间 正常组大鼠未见及黏膜充血 水肿和糜烂 黏膜光滑平整 表 2 大鼠结肠黏膜损伤评分 2, #! "#'!$'%' '!#% %' &!'$ "! " ""$# '!!.' 7,"" 7, "" 7, "" %# # &'"! &'"! & # # 1 1 及 131 蛋白表达免疫组化图像分析结果 表 与正常组相比 模型组 -. & 及 2 蛋白表达呈明显上升趋势 经过溃结灵和艾迪莎干预后 随着炎症改善 -. & 及 2 蛋白呈下降趋势 表 1 1 及 131 蛋白表达阳性总面积和阳性表达所占比值 &"$'*'&#"#"'"! *%!" "#''$*'"#!)*&#'!#!1 1! 131! #+ -. & ' #+ -. & 0 #+ 2 ' #+ 2 0.' 7,"" 7, "" 7, "" %# # &'"! &'"! &' "! &' "!
何爱明 等 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜的 -. & 及其受体 2 表达的作用 1 1 及 131 定量检测分析结果 表 5 与正常组相比 模型组 -. & 及 2 '.) 表达呈明显上升趋势 经过溃结灵和艾迪莎干预后 随着炎症改善 -. & 及 2'.) 表达呈下降趋势 表 51 1131 基因相对 表达量 5&"$' "#)*&#'!#!"!'$ 1 1! 131 0! -. & 2.' 7,"" 7, "" 7, "" %# # &'"! &'"! &' "! &' "! 讨 论 溃疡性结肠炎是炎症性肠病 + ''# (4-/, 的一种 -/, 已被公认为是胃肠道中除恶变外最严重的疾病之一 的病因和发病机制目前尚不明确 流行病学实验表明 结肠癌的发生 发展与结肠炎症的反复发作密切相关 从中医的角度看 属泄泻 痢疾 便血 肠风等范畴 多因素体脾胃虚弱 饮食不节 忧思恼怒等致脾胃损伤 湿热内生 蕴结于肠腑 而致反复发作 其病位在脾 肾 大肠 病初多为湿热内蕴 肠道气机阻滞 病久入络 入脏 而出现脾肾阳虚挟瘀及寒热虚 实挟杂之证 以清热 健脾 活血为治则的溃结灵由救必应 白术 白芍 水蛭 炙甘草组成 临床治 疗 有较好的疗效 且无明显不良反应 本研究的实验结果显示 中 高剂量的溃结灵能明显减轻 大鼠的组织损害 改善病理损伤 表明溃结灵对实验鼠有明显的治疗作用 初步验证了该药的临床治疗效果 随着免疫学 分子生物学等学科的迅速发展 以及动物模型制作方法的日趋成熟 的发病机制正逐步得以揭示 近来研究集中在 样受体 &!# 核转录因子 &/ #!# + #&/.&/ 通路上 尤其是.&/ 认为它调控着细胞因子和黏附分子的释放 从而参与了 肠道的 炎症和免疫反应 研究指出 溃结灵使./ 法诱导的 大鼠模型结肠黏膜 -/& 蛋白阳性细胞率明显降低 和 蛋白表达水平明显下降.& /! 蛋白表达及血清.& 降低 说明溃结灵可能 通过调控.&/ 通路的细胞因子和蛋白表达而发挥抗炎症的作用 这也验证了.&/ 通路在 发病机制中发挥一定的作用 - & 和.& 被公认为是介导 的细胞因子.&/ 的激活有待于依 赖性细胞因子 - & - &.& 的产生 - &.& 在 发病机制中的重要性已被确认 - & 是一种很强的中性粒细胞趋化因子 它能促进中性粒细胞的溶酶及超氧阴离子 白三烯及 & 羟色胺的释放.& - &- & 等诱发的 肠道炎症反应在很大程度上是通过诱导产生以 - & 为代表的趋化因子所介导的 因此 - & 在 炎症反应的持续与放大中起重要作 用 -' 等研究发现 患者 - & 表达水平明显高于正常对照组 - &'.) 阳性细胞与正常对照组相比有明显增高 且 - &'.) 阳性细胞主要位于勃膜层 隐窝脓肿等区域的巨噬细胞内 上述研究均表明 - & 与 发病有密切的联系 中性粒细胞趋化因子 -. & 是一种和人 - & 很相似的鼠源性趋化性细胞因子 被看作是 - & 家 族的一员 对嗜中性粒细胞有很强的趋化作用 趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的 蛋白偶联的跨膜受体!#!!# 通常表达于免疫细胞 内皮细胞 上皮细胞等细胞膜上 按趋化因子分类 将与 类趋化因子结合的受体称为 类受体 同 2 类趋化因子结合的受体称为 2 类受体 2 本研究发现 在炎症诱导下 活动性 结肠组织中 -. & 蛋白及 '.) 增高 结肠浸润的中性粒细胞及肠上皮细胞膜上 2 的表达明显增高 -. & 通过与中性粒细胞膜上相应的 2 结合 激活胞膜上的钙泵 细胞向前方伸出片足 使细胞移向产生趋化因子的部位定向迁移 进入结肠组织间隙 在细胞因子及某些因素作用下活化 释放胞质内的颗粒 对局部组织产生破坏作用 本研究亦发现 在不同剂量的溃结灵治疗下 结肠组织的 -. & 及其受体 2 的水平随炎症缓解而下降的趋势 这与 -. & 及其受体 2 的水平与肠道炎症程度呈正相关的报道相一致 本研究证实溃结灵具有明确改善大鼠溃疡性结肠炎的效应 其高剂量组与艾迪莎组的疗效差异无统计学意义 而中低剂量组与艾迪莎组的疗效差异有显著统计学意义 我们推测溃结灵可能通过抑制 -. & 及其受体 2 的表达 从而影响中性粒细胞向炎症区域的趋化 达到缓解./ 诱导大鼠溃疡性结肠炎的效应 综上所述 溃结灵治疗 的机制通过两种途径来实现
复旦学报 医学版 年 月 调控.&/ 通路细胞因子的水平 调节 -. & 及其受体 2 表达的水平 两途径均与 - & 有关联 对于两调节途径之间的相互联系及作用方式有待进一步研究 参 考 文 献 '! ( ' ))' 7 %!$ " # ## " #$ '!$ + # # 黄志新 劳绍贤 崔琦珍 等 溃结灵颗粒治疗活动性溃疡性结肠炎的临床和实验研究 中西医结合消化杂志 杜群 李红 王建华 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠治疗作用的病理学观察 中药新药与临床药理 杜群 李红 王建华 等 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜.&/! 蛋白表达及血清.& 含量的影响 广州中医药大学学报 李红 杜群 王文君 等 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜 样受体 基因表达的影响 中药材 李红 杜群 王汝俊 等 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜.&/& 蛋白表达的作用 辽宁中医杂志 / 1 " 1!# & '+ $ + ''# ##$ # 王皓 欧阳钦 胡仁伟 三硝基苯磺酸结肠炎动物模型的建立 胃肠病学 /#6, ' / /# # '#$! #' # '! *! ' # # #$ # 欧阳钦 我国炎性病研究的概况及展望 中华消化杂志 杜群 王汝俊 李燕舞 等 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜 蛋白水平的作用 世界华人消化杂志 7 ''# " $ -77.&!! / # '## +"!' # 0 & " + & -' )88 "' 8 #! # #&! #"'# '! 4#$ +''# (4 / ( -')-7 $'#! " #+ &"4#$&# "! #&!$!# #$ ' ++ ''# (4 '+$( $-+ ''# (4 4 "$# # '$' + + ''# " #'6!! $ # " #$!," 7 )/ 4 ).&!!/ ##! '.)"&!#!+ ''# # $ ' *# +# '&# # " " '+" '#$,/$#.!!# (#! " # $ ' $ '!# *!!' '#!$ /(! "! " $#!$ 7 1' $ ' " # + '!#$ " ''! ' 收稿日期 编辑 段佳