3 海外检验医学 447 年 月第 卷第 期 ; ' *( ( ;/%* 447 <( =( 战 有文献报道 年龄和性别是影响变异的主要因素 而种族和运动类型则并不重要 8 通过分析个体内和分析过程中变异 人们建立了, 模型 以增加这种基于标记物测定的兴奋剂检测方法的可靠性 5 直接法为亚型分析法

9 论著 高灵敏度化学发光免疫分析法用于体育运动中生长激素的兴奋剂检测!" " #!$ %!!#&$!'!$!%!!$ ; ;!" ;# $. ; % & '" ". ; " ;; 背景 ; 体育赛事中存在重组人生长激素 + 的滥用现象 但目前缺乏相应的兴奋剂检测方法 已有文献表明 血清生长激素亚型组分的分析是检测 + 兴奋剂的有效手段 本研究建立和验证了生长激素亚型 也称同功体 的选择性免疫分析方法 有望在兴奋剂的监测和鉴定方面发挥潜在作用 方法 ; 本研究使用可优先识别垂体源性生长激素 + 或 + 的单克隆抗体建立了 对夹心型化学发光分析方法 以差异性地识别 + 法和, 法 及 + 法和, 法 我们对使用 + 前后的志愿者样本进行分析 并分别计算了各样本 法和 法测定结果的比值 结果 ; 方法的功能灵敏度 4 48 # 批内和批间的不精密度分别为 3 和. 9 在两个独立的健康受试者的队列研究中 的比值 中位数范围 分别为 4 3 4 47. 4 3 4 9 和 4 53 4 43 4 4 34 4 8.5,, 不存在性别差异 4 名业余运动员经单次注射 + 后 和基线相比 的比值 / 的中位数 分别增加到.84 9. 和 44 7.,, 摄入低剂量 4 4.. %# # 的 + 和,, 各平均值明显增加 对男性和女性的持续作用时间分别长达 3 和 5 高剂量 4 43. %# # 的 + 可使男性 的均值增加 持续时间长达. 和.,, 而女性则超过.5 结论 ; 本研究建立的灵敏的化学发光分析法可优先识别 + 或 + 可在 + 单次注射.5 内检测出阳性标本 ;; 在体育界人生长激素 + 被滥用 尽管其对于健康成年人运动能力增强的效应尚不清楚. 8 + 在世界反兴奋剂机构 / 的违禁药物名单中赫然在目 5 经垂体提取的生长激素 + 和重组生长激素 + 均可在黑市上购!"# $% &'! % #() %*+,( #( - %. /'( (- 0 1( ( (# / %(- 0%! 0 &' %, % +( -( 0 ( &' (- # % ( ( (! (!% &' 2% / 34..5 % 6$ 7 37 854 89 1 % % * #% :%!%! 得 + 也已在运动员 教练和理疗医师身上找到 9 3 然而 至今尚未有反兴奋剂控制机构认可的常规检测方法 + 具有特定的生理和物理化学性质 如脉冲式释放 正常人的浓度差异 + 和 + 的氨基酸和理化性质相似 循环中半衰期短等 9 4 这些特性使得 + 滥用的检测几乎变得不可能 目前 + 的检测主要采用两种策略 即间接法和直接法 以克服上述困难 间接法通常测定与 + 相关的蛋白浓度 并使用特定的判别函数计算蛋白标记物浓度的系数 当摄入 + 后此系数就会增加并超出生理学变异和运动后出现波动的范围. 目前获得特定人群中各标记物方法特异的参考区间仍然面临挑

3 海外检验医学 447 年 月第 卷第 期 ; ' *( ( ;/%* 447 <( =( 战 有文献报道 年龄和性别是影响变异的主要因素 而种族和运动类型则并不重要 8 通过分析个体内和分析过程中变异 人们建立了, 模型 以增加这种基于标记物测定的兴奋剂检测方法的可靠性 5 直接法为亚型分析法 即测定摄入 + 后机体循环中 + 亚型组分的改变 9 血循环中的 + 包含了数种亚型 相对分子质量为 444 的 + 含量最多 其次是相对分子质量为 4 444 的 + 3 4 不同的 + 亚型还可组成二聚体和多聚体 而 + 只有相对分子质量为 444 一种单体 机体摄入 + 后 垂体分泌 + 的功能受到抑制 从而使得相对分子质量为 444 的单体成为 + 的主要形式 已有研究建立了免疫分析法 此方法制备 种单克隆抗体 % * 一种可优先识别 + 另一种可识别垂体分泌的 + 即对同一份血浆样品分别进行 种免疫检测 一种优先识别相对分子质量为 444 的亚型 法 另一种识别与之不同的 + 亚型 法 以 与 的比值表示相对分子质量为 444 的 + 单体的相对丰度 使用 + 后此比值就会增加 79 这可能有助于生长激素药代动力学研究和体育比赛中服用 + 的兴奋剂检测 / 的世界反兴奋剂条例和实验室国际标 准要求对检测结果阳性的样本进行第二次 独立试验 以排除假阳性 对于免疫分析法 独立试验 意味着抗体识别独立的抗原表位 因此 使用特殊研究试剂的两套 和 内部测定方法被开发出来 9 并通过 44 年雅典和 445 年都灵奥运会的评估. 亚型分析的方法是对 + 的直接测定 检测的时间窗由 + 较短的半衰期决定 方法的定量检测限是一个至关重要的参数 在兴奋剂分析中广泛应用的方法应该具有经过验证且有效的性能参数 本研究建立的方法使用化学发光和包被管技术 对上文所述的两套 和 方法的定量检测限和重现性进行了优化 其中一套方法用作筛查 另一套对结果进行认证 此外 我们将改进的方法用来检测之前使用过 + 的残留样本 进行方法适用性研究 材料与方法一 抗体的选择与特性我们用重组的或垂体源性的 + 免疫老鼠 并根据与相对分子质量为 444 的 +33 5 标准 英国国家生物制品检定所 =, 0 或 + 34 848=, 0 亲和力的高低选择单克隆抗体 % * 我们筛选出 个对相对分子质量为 444 的 + 亲和力高的单克隆抗体 853 和 855 和 个对 + 亲和力高但对 + 亲和力低的单克隆抗体 859 和 858 本研究分别用以上 个单克隆抗体作为 个免疫分析方法的捕获抗体 我们还筛选出一种单克隆抗体 857 其对 + 和 + 的亲和力相似 因此可以和以上 个捕获抗体同时作为检测抗体使用 所有单克隆抗体的抗原表位通过竞争性结合实验确定 此实验涉及大量 + 变体和碎片的光谱 详见本文在线版的补充文本 补充表 补充图 1 网址 """ % ( # ( '( 88!. 二 分析方法提取纯化的 857 用 = 羟基琥珀酰亚胺吖啶酯!% =+ 1 '/#( %*+ 诊断试剂公司 标记 并在所有的分析测定中用作示踪抗体 将 853 和 859 或 855, 和 858, 包被聚苯乙烯管 公司 校准物为羊血清 #% 公司 稀释的垂体源性 + 34 848 =, 0 质控物包括阴性对照品和阳性对照品 其中前者为添加

7 + 的人血清 后者为添加 + 和 + 混合物的人血清 向含有 84 孵育缓冲液的各包被管 和,, 中加入 84 的校准物或质控物或样品 室温下反应 用 % 洗液 3 %%( ) 4 45 %( =0 4 4 )" 4 4 444 消泡剂 洗涤 8 次后 向管内加入 44 示踪剂 857 孵育 接着再用 % 洗液洗涤孵化管 加入酸性过氧化氢和氢氧化钠溶液, 试剂 和,> + 公司 用光度计,!$ 84 分析仪或!(!%?!,78., ( 公司 测定吸光度值 我们还用 %%! 444 的 + 方法 /?0 西门子医用溶液 测定了一批样本 以提供商业化方法的比较数据 测定结果显示当浓度为 4 和 9 # 时 批内 ' 分别为.. 和. 批间 ' 分别为. 4 9 和. 功能 灵敏度为 4 # 三 方法认证生长激素的变体和片段的来源 其他肽类激素 缓冲盐的组成和详细的测定程序见在线版补充文本 分析灵敏度的计算方法是零标准 4 次测定值的均值加上 个标准差 " 功能灵敏度通常定义为当批间 ' 4 时的最低检测浓度 然而所有分析结果的批间 ' 包括背景分析在内 均未大于 4 因此 我们以零标准 4 次独立测定结果平均值的 倍作为功能灵敏度 用 法测定 4 个样本 + 浓度范围 4 4 到 4 # 每个样本测定 4 次 计算批内 ' 用 法测定 4 个样本 + 浓度范围 4 4 48 # 各 4 次独立分析的结果计算批间 ' 分析由. 个操作者在 8 内完成 将 8 个样本 + 浓度范围. 7 5 # 用羊血清按 @ @5 进行系列稀释 由各稀释样

4 海外检验医学 447 年 月第 卷第 期 ; ' *( ( ;/%* 447 <( =( 品 法测定结果评价方法的线性 将以上 8 个样品各分为多份 向每份中分别加入不同浓度的 + 终浓度为 4. 3 # 法测定 或 +4 4 4 # 法测定 由测定值计算回收率 除了为每个抗体的抗原表位绘图外 我们还研究了夹心法中与抗体结合的相关蛋白的交叉反应 潜在的交叉反应蛋白通过蛋白质序列数据库的, ) 软件进行鉴定 经软件分析 以下蛋白具有高度同源性 胎盘生长激素 + <93 7 氨基酸 相对分子质量为 4 444 的 + 95 7 胎盘泌乳素?5. 37 相对分子质量为 9 444 的 + 7 3 7 泌乳素?> 8 7 和 +.. 7 向羊血清中添加蛋白至终浓度为 844 # 相对分子质量为 4 444 的 + 相对分子质量为 9 444 的 + + <?> 或 8 444 # +.? 用以上 种分析方法进行检测 四 受试者和样品我们从 7 个健康受试者身上抽取血液 得到血 清 1/) 血浆 肝素化的血浆和柠檬酸化的血浆 研究抗凝剂的影响 4 名健康志愿者提供的血液经分离得到血清 各血清样本分为多等份 用以研究待测组分在分析前不同条件下的稳定性 储存条件分别为室温 5 和 3 A5 3 和 9 B8 A 9.4 和 34 将新鲜血液凝血后离心并立即分析 得到参比血清值 另外有一批样品在分析前经 度冰冻 解冻过程 我们从 个独立的健康供血者队列中收集样本 研究正常人 值的分布范围 这 个人群分别来自柏林和巴伐利亚红十字会 使用带分离胶的血清管 ((' 公司 收集血液 我们还分析了单次注射过不同剂量 中等剂量组 4 4.. %# # 高剂量组 4 43. %# # 的 + 的业余运动员 男女各 4 名 的样本 这些样本为另一项研究的遗留样本 详细的程序和参与者信息见发表的文献 这项研究的 份样本经 和, 法测得的 + 浓度均小于功能灵敏度 为方便统计分析 这些样本浓度随意设定为 4 48 #

本研究方案符合现行版的赫尔辛基宣言并经过当地伦理委员会的批准 德国慕尼黑!"# $% 大学医学院和莱比锡大学 且经过所有受试者的知情同意 五 统计学分析我们将样本的测定信号同标准曲线的信号相比较 并通过! 软件 样条平滑算法.4! 免疫分析程序 版本 9? 1 % 公司 计算待测样本中 + 的浓度! 软件同, 软件,,, ( 公司 的测定结果相同 测定结果以均值 " 或中位数 78 可信区间 表示 我们利用 /%# 回归分析法 0 *( ( < 59 公司 对本研究的测定值和 %%! 法测定值进行比较 并用 '"8 4 软件 研究所 做进一步的统计分析 用非参数秩和检验 的 检验进行性别和剂量组的组间比较 用 ($( 配对符号秩检验对摄入 + 前后的数据进行比较 以 4 48 作为有统计学意义的检验标准 结果一 抗体的抗原表位鉴定 + 不同变体和片段和各单克隆抗体的交叉 反应见网上补充表 抗体 855 和 853 的抗原表位与 + 受体的结合位点 部分重叠 因为它们与生长激素结合蛋白 +,? 竞争性结合 + 而 857 859 和 858 的抗原表位与这个位点相距较远 857 不与相对分子质量为 4 444 的 + 结合 这提示我们 857 的抗原表位包含氨基酸位点为. 5 的残基 而这些残基在相对分子质量为 4 444 的 + 亚型中被剪切掉 858 与相对分子质量为 9 444 的 + 变体结合 不含 位的氨基酸 因此 此抗原表位不在螺旋链 上 859 和 858 对变体 4 的亲和力降低 分别降低 8 和.9 8 表明抗原表位接近氨基酸 4 从这些实验推导出单克隆抗体的抗原表位 并绘制成 + 的结构模型 见网上补充图 1 二 灵敏度 精密度 线性 回收率和交叉反应性 种免疫分析方法的性能参数总结在表 研究发现相对分子质量为 4 444 的 + +.? 和 ( 没有交叉反应 当浓度为 44 # 时 相对分子质量为 9 444 的 + 在不同的方法下分别出现交叉反应 3 4 4 9, 和 4, 而 + < 存在 3 4 5, 和 9 5, 的交叉反应性 + < 浓度为

海外检验医学 447 年 月第 卷第 期 ; ' *( ( ;/%* 447 <( =( 4 # 的羊血清的 值为 4 8 和 4 54,, 三 干扰在所有的分析中 血红蛋白 8 # 胆红素 53 %( 三酰甘油.7 7 %%( 或人血清白蛋白 4 # 都不会对测定结果带来干扰 向 3 个血清样本中添加不同量的重组 +,? 浓度为 4. 8 4 %( 血清样本 + 测定浓度均随 +,? 添加量的增加而降低 当 +,? 在最高浓度时 + 测定浓度分别降低到 3 7 法 5. 7 8 8 法 88.., 法 和 54 5 7, 法 > 值仍不受影响 变异 4 同 7 个健康人血清样品 + 浓度范围 4 4. 8 83 # 分析 相比 加入抗凝剂 1/) 肝素和柠檬酸的血浆样本在不同方法下的测定值稍有增高 法 43 5 9 47. 8 7 和. 5 5 法 7 7 3 49 3 7 7 和 5 7, 法. 5 5 5 5 和 5. 8 9, 法 3 9 9. 7 8 和 9 5 与血清测定值相比 各抗凝剂下 值分别为 74 3 9 4 4 3 3 和 4 9 3,, 值分别为 75. 7 4. 3 和 4 7 5 四 方法稳定性在室温或 3 A 储存的 内 无论是 + 的绝对浓度还是相应的 值都无变化 在 3 A 储存 3 或 9 以后, 法测定的绝对浓度呈下降趋势,, 的均值则分别上升至 43 8 8 3 和 4 8 4 而其他所有分析的 + 绝对浓度和 值都保持不变 经过 B8 A 储存 34 后 和, 法测定的 + 浓度比基线降低 4 值和,, 值上升至 8 4 9 7 和 43 3 3 见在线补充图 0 但所有这些改变均没有统计学意义 冰冻和解冻过程引起的浓度和比值的变化也没有显著性差异 见在线补充图 / 五 人血清样品的分析 健康志愿者 献血者 我们用 法和 法各测定了 44 名献血者血清标本中的 + 浓度 其中 个标本的 + 浓度小于 法的功能灵敏度 其余 95 个样本 3 名男性 3 名女性 经 法测定的 + 浓度介于 4 45 # 至 9 74 # 之间 中位数 4 8. # 由于样品量有限 只有 84 个样品同时进行了, 和, 测定 计算得到的各 值见表 值的均值没有性别差异 C4 34, C4 35 我们先用 %%! 方法测定了一组独立队列研究中的血清样本 选择其中 44 个能测出 + 浓度 4 # 中位数 4 34 # 浓度范围 4 4 5 34 # 的样本作为研究对象 这 44 名献血者中男. 名 女 55 名 年龄 7 57 岁 平均年龄 为 7 岁. 7 岁 法测定这些样本 + 的浓度范围为 4 4 # 中位数为 4 89 # 其他方法的 + 测定值和 值见表 其中 值无性别差异 C4 3, C4 5 并独立于样本的年龄或 + 测定的绝对浓度 4 48 %%! 法检测结果均显著高于本研究建立的免疫测定法 4 444 各免疫法测定结果和 %%! 法测定值经 /%# 回归分析的结果为 法 斜率 C4 85 C4 7.. 法 斜率 C 4 5 C4 73, 法 斜率 C4 54C4 77, 法 斜率 C4 53C4 73 业余运动员的药物摄入试验 4 名受试者 男 4 名 女 4 名 单次注射 + 剂量为 4 4.. 或 4 43. %# # 值在 内显著增加 与基线相比 值的峰值达到.84 9. 性别 C4.93 或剂量组 C4 538 无统计学差异 药物注射后 在.4 对样品进行监测 发现峰值出现的平均时间为 4 9 9 且高剂量组比低剂量组达到峰值的平均时间增加 分别为 3 4 和 7 7 9 4 C 4 435 峰值亦趋于增加 与基线相比,, 值的峰值在注射后. 4 9 7 达到 44 7. 没有明显的性别差异 同样 高剂量组比低剂量组达到峰值的平均时间 分别为 8. 3 3 和 4 9 5 C4 45 和,, 值趋于增加 不同剂量组的样品分别经 和, 法测定 值和 + 浓度随时间变化的关系如图 / 所示 低剂量组 4 4.. %# # 男性组在摄入 + 后 均值比基线值增加的持续时间为 3 C4 4 3 而相应时间下,, 值仍显著增加 C4 43 女性组在 5 内 均值大于基线值 C4 44 而相应时间下,, 仍

. 显著增加 C4 44. 高剂量组 4 43. %# # 男性组在摄入 + 的. 内 均值始终高于基线值 C4 4 3 而,, 值大于基线值的持续时间为. C4 43 女性组在.5 内 均值大于基线值 C4 44 而,, 值在.5 后仍显著增加 C4 4 5 与基线值相比 各样本的 值增加的幅度和持续时间不尽相同 例如 双剂量组下 个样本各测定值如图 / 所示 讨 本研究采用分析灵敏度高的免疫发光技术结合选择性单克隆抗体和包被管技术建立了一套差示免疫分析法 用本方法测定了之前摄入过 + 的残留样本 差示免疫分析法的测定原理已另有文献描述 79 原始方法作为内部使用方法还通过了 44 年雅典奥运会和 445 年都灵奥运会的评估. 事实证明 至今没有任何分析报告质疑阳性结果的运动员们可能没有使用 + 或 + 是在训练中使用而不是比赛时 但是显而易见的是 原始方法使用特殊的研究试剂和微孔板包被位点 显示出较差的性能 若反兴奋剂控制实验室将原始方法中的试剂和操作说明进行常规转换后 将无法实现原法 4 # 的初始灵敏度 8 因此我们旨在开发一个标准化的 可靠和极其灵敏的方法 所建立的 个免疫分析法功能敏感度都小于 4 48 # 且重复性好 计算得出的 值的变异小于 即使是不同操作者在不同时间内进行分析 结果也是如此 正如所料 优先选择性识别垂体源性 + 的 法 测定 + 的回收率大大降低 而所有 个方法分析 + 的回收率相当 这不仅验证了差示免疫分析法的原理 而且和正在进行的 + 测定标 5 准化的争议有关 校准物和抗体抗原表位的特异性均对免疫测定结果有较大影响 这就给临床常规诊断带来很大问题 如测定结果的可比性和已公布的 + 相关疾病动态试验的临界值! (- 值 9 的应用 相反 本研究正是根据抗体对不同 + 亚型的亲和力不同的原理建立了循环中 + 的测定方法 本研究中交叉反应惟一明显的 + 相关分子是胎盘的生长激素变体 + < 3 7 且反应发生的条件是浓度大于 4 # 在单胎妊娠期的头几个 论 月里 个体内的 + < 一般不会超过 8 # 因此 在对早孕的女运动员进行兴奋剂检测时一般不会发生交叉反应 双胎妊娠的终末期 + < 可能会超过 44 # 但并不影响对正常条件下的女运动员进行兴奋剂检测 据报道 +,? 的存在使一些商用 + 检测方法产生负偏差.4. 这个问题同样存在于差示免疫分析法 +,? 存在下 个方法测定的 + 信号均会下降 但 值不受影响 相对分子质量为 4 444 的 + 亚型可以和所有的单克隆捕获抗体发生交叉反应 但不会干扰 个夹心分析方法的测定 因为标记的 857 抗体识别的抗原表位包括相对分子质量为 4 444 亚型中丢失的氨基酸 即 857 不识别相对分子质量为 4 444 的亚型 由于机体摄入 + 后会抑制相对分子质量为 4 444 的 + 亚型分泌. 因此特异地检测相对分子质量为 4 444 的 + 的免疫方法可作为单独的方法用于 + 分析 有望在未来兴奋检测方法的开发中发挥作用 本研究方法的分析灵敏度和功能灵敏度低于大多数市面上的常规方法 灵敏度的提高和重复性的改善使得 的计算值更加可信 即使在低 + 浓度下也是如此 值与 + 的绝对浓度无交互作用 无性别差异 在 个独立的正常人队列研究中 值没有差异 + 单次注射 内 值显著增加 与基线相比两对方法的 峰值均可达到.44 44 + 的摄入试验表明 不同个体间的检测时间窗不同 从 4 到大于.5 不等 剂量越大时间窗更长 且女性高于男性 值的增加主要取决于两个因素 循环中存在的 + 和 + 经初始抑制后垂体的再分泌 + 从皮下位点释放的动力学和在机体循环中的代谢因人而异.. 因此检测时间窗具有可变性 本研究未涉及 + 重复用药的影响 但我们应进行此项研究 以制定更加有效的策略用于兴奋剂检测 在反兴奋剂控制实验室应用差示免疫分析法需要定义一个合理的! (- 值 以便我们有足够的信心确认测定值在此值之上样本为阳性样本! (- 值的定义应该是政府和反兴奋剂控制组织的工作 超出了我们研究的范围 此值的建立须基于一个合适的参考人群 人群中样本应具有代表性 同反兴奋剂控制工作中的样本相当 此外 虽然结果显示分析前任何条件变化均不影响 + 浓度和 值 但这些条件可能不同于反兴奋剂检测的实际工

海外检验医学 447 年 月第 卷第 期 ; ' *( ( ;/%* 447 <( =( 作条件 所以我们应该进一步研究该方法在现实工作中的稳定性 总之 本研究建立了 个可靠 灵敏的化学发光免疫法 各方法可差异性地识别不同的 + 亚型 以鉴别样本个体是否使用过 + 方法不仅可用于 + 的药代动力学研究或监测患者的服药依从性 而且可用于体育运动中滥用 + 的检测 虽然某些人 + 亚型组成变化的检测时间可超过.5 但由于 + 半衰期较短 因此检测机体是否摄入 + 的最佳时机应是最初的 作者贡献 " () "** ) +., " " " * "," ("" * )" ** ) * " 作者潜在利益冲突声明 * " *" " " * -" " " '. " " " 雇佣关系 * / 0 1 * / 0 1!" * / 0 1 顾问与咨询 股票所有权 # $ ' " " " '# "(0 1 " "" ""( " " * / 0 1 ) * 01" "(" " " 酬劳 研究基金 $ - ' " $ - 专家意见 赞助商参与的工作 / "*( " "( * " ) + * * * ** ) " * 志谢 / " " ) * "+ "** ( $ - * ($ - ' $ " 1 * / 0 1 " " " &. " + % " ) "( % "" ( + "**! & 1 "* ' " " * " "( 翻译 周伟燕 ; 陈文祥 卫生部临床检验中心 审校 史红 中华医学会杂志社 参考文献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