标题

906 论著 11β-HSD2 重组真核表达载体构建及对 A549 细胞 IL-6 的影响 陈晓琳江红王兴友王丽娜宋何煜金帮明 摘要 目的本文旨在构建 11β- 羟基类固醇脱氢酶 2(11β-HSD2) 基因的重组真核表达载体, 并检测其转染入哺乳动物细胞后对白介素 6 (interleukiṉ6,il-6) 表达水平的影响 方法用 PCR 方法扩增 11β-HSD2 基因的全长 cdna, 先亚克隆至 pgmt 载体, 测序正确后再亚克隆至 pcdna3.1myc-hisc 以构建其重组真核表达载体 将重组的真核表达载体瞬时转染人肺腺癌细胞系 A549, 用 Westernblot 方法鉴定表达情况, 并用 ELISA 方法检测 IL-6 表达水平 结果测序表明 11β-HSD2 的重组真核表达载体构建成功,Westernblot 显示真核表达载体能够在 A549 细胞中成功表达, 并可使 IL-6 表达水平升高 结论成功构建了 11β-HSD2 基因的重组真核表达载体, 初步验证了该基因的促炎效应 关键词 11β- 羟基类固醇脱氢酶 2; 基因表达 ;A549 细胞 ; 白介素 6 Constructionof11β-HSD2recombinanteukaryoticvectoranditsefectonIL-6inA549cels CHENXiaolin *,JIANG Hong,WANG Xinḡyou,WANGLi-na,SONG He-yu,JINBanḡ ming. * Departmentof Respiratory Medicine,GeneralHospitalofBeijing MilitaryRegion,Beijing100700,China Correspondingauthor:WANG Xinḡyou,Email:18910909576@163.com Abstract Objective To establish recombinant eukaryotic vector of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase2genein mammaliancelandtodetecttheexpressionofinterleukiṉ6afterthevector transfection.methods ThecDNAof11β-hydroxysteroiddehydrogenase2genewasamplifiedbyPCR. Aftersubcloned withpgmt vectorandsequenced,thegene wasinsertedintotheeukaryoticvector pcdna3.1myc-hisc.theexpressionvectorwastransientlytransfectedinhumanlungadenocarcinoma cellinea549cels,andthentheproteinwasdetectedusing Westernblot,interleukiṉ6wasmeasuredby ELISA.Results Sequencing revealed 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2 recombinant eukaryotic expressionvector wasconstructedsuccessfuly,and Westernblotindicatedthateukaryoticexpression vectorexpressedsuccessfulyin A549cels.Transfection withrecombinanteukaryoticvectorof11βhydroxysteroiddehydrogenase2genesignificantlyincreasedinterleukiṉ6expression.conclusions The recombinanteukaryoticvectorof11β-hydroxysteroiddehydrogenase2geneisestablishedsuccessfulyand could be highly overexpressed in A549 cels. The increase level of interleukiṉ6 suggests the proinflammatoryefectof11β-hydroxysteroiddehydrogenase2. Keywords 11β-hydroxysteroiddehydrogenase2;Geneexpression;A549cels;Interleukiṉ6 急性肺损伤 (ALI)/ 急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 是指由心源性以外的肺内外各种致病因素, 如严重感染 创伤 休克 弥漫性血管内凝血 误 [1] 吸等导致的急性进行性缺氧性呼吸衰竭 目前, DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-436X.2013.012.007 基金项目 : 军队医药卫生 十一五 科技攻关项目 (08G006) 作者单位 :100700 北京军区总医院呼吸内科 ( 陈晓琳 王兴友 王丽娜 );100044 北京交通大学理学院生命科学与生物工程研究院 ( 江红 宋何煜 );400715 重庆, 西南大学 ( 金帮明 ) 通信作者 : 王兴友,Email:18910909576@163.com 国内外学者已做了大量有关 ALI/ARDS 发病机制的广泛研究, 主要着重于在早期炎症反应方面 ALI/ARDS 发病的关键是致病因子激活多种炎症细胞, 释放一系列炎症介质, 这些炎症介质可再度激活炎症细胞, 以自分泌或旁分泌的方式释放更多的炎症介质或细胞因子, 导致瀑布式的炎症反应, 形成肺过度损伤 抗炎治疗是降低 ALI/ARDS 发病率和病死率的重要措施, 糖皮质激素是重要的抗炎药物, 但在临床治疗过程中, 部分患者表现出糖皮质激素治疗不敏感甚至无效 这可能是 ARDS 的病死率至今没

907 有明显下降的一个主要原因 已有研究表明, 局部器官或组织中有活性的糖皮质激素浓度才是抗炎效应是否有效的一个重要指标 机体对糖皮质激素的不敏感是影响糖皮质激素功能的重要因素, 局部有活性的糖皮质激素浓度下降可使机体的抗炎效应减退, 炎性因子分泌量增加 以往的研究主要集中在对于糖皮质激素受体的研究, 近年, 其受体前调节成为了一个新的研究热点 11β- 羟基类固醇脱氢酶 (11β-hydroxysteroid dehydrogenase,11β-hsd) 是参与糖皮质激素受体 [1] 前调节的重要代谢酶 它是一种微粒酶复合体, 催化糖皮质激素 C11 位的酮基 ( 无活性 ) 与羟基 ( 有活性 ) 之间的氧化还原反应, 至少有 2 种同工酶 : 11β-HSD1 和 11β-HSD2 11β-HSD2 主要以 NAD 为辅酶, 是催化单向反应的氧化酶,11β-HSD2 可能在局部增强有活性的糖皮质激素转化为无活性的糖皮质激素的穿梭运动, 降低局部有活性的糖皮质激素的浓度, 而有活性的糖皮质激素可以抑制炎性因子的产生, 所以增加 11β-HSD2 的表达水平可以促进炎性因子的表达, 具体机制现在还不清楚 可以将有活性的糖皮质激素转化为无活性的糖皮质激 [2] 素, 降低局部有活性糖皮质激素的浓度, 调节机体炎性因子的水平, 从而在机体的局部炎症反应中起重要作用 本实验通过干预细胞中 11β-HSD2 水平, 观察炎性因子白介素 6(IL-6) 的变化, 反映了 11β-HSD2 在抗炎中的作用 1 材料与方法 1.1 材料商品化 11β-HSD2 的 cdna 购自 Origene 公司 ;pgmt 试剂盒 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 高纯度质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司 ; 限制性内切酶 T4DNA 连接酶购自 Takara 公司 ; 真核表达载体 pcdna3.1mycẖisc 和脂质体 Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司 ; DMEM 高糖培养基购自 Gibco 公司 ; 胎牛血清购自 HyClone 公司 ;His 抗体 (CW0285) 购自北京康为世纪生物科技有限公司 ;Tubulin 抗体为第四军医大学陈志南院士实验室制备和惠赠 ;IL-6 的 ELISA 试剂盒 (555220) 购自美国 BD 公司 1.2 方法 1.2.1 真核表达载体的构建根据 GenBank 中的 11β-HSD2 序列合成上 下游引物, 序列分别为 : 上游引物 :5 -CCCAAGCTTGCCATGGAGCGCTGG- CCTTGG-3, 下游引物 :5 -GGGGTACCATCC- GAGCCACTGCTGGGGA-3, 在上 下游的引物中 分别引入 HindⅢ 和 KpnⅠ 内切酶序列, 由北京博迈 德科技发展有限公司合成 以 cdna 为模板, 通过 聚合酶链反应对 11β-HSD2 进行扩增 扩增条件 : 预变性 94,5 min; 变性 94,25s; 复性 55, 25s; 延伸 72,30s;30 个循环后 72 延伸 20min, 最后 10 min 时加入普通 Taq 酶, 以加上 polya 尾 用 T4DNA 连接酶将回收的 PCR 产物与克隆载体 pgmt 连接, 用测序鉴定双酶切阳性的 质粒 将 11β-HSD2 从重组的 T 载体中亚克隆至 pcdna3.1mycẖisc, 同样通过测序鉴定重组的真核表达载体 1.2.2 转染细胞将 4 10 5 个 A549 细胞铺于 T25 培养瓶中, 置于 37,5%CO2 孵箱中培养 24h 后按照脂质体 Lipofectamine2000 的说明书的要求 进行转染, 脂质体和重组质粒的用量分别为 6μl 和 3μg, 用不含血清和抗生素的培养液进行转染, 转染 后 5h 换为有血清和抗生素的培养液 1.2.3 Westernblot 方法检测蛋白表达水平转 染 48h 后用裂解液 RIPA (10 mmol/l Tris-HCl, ph7.5,150 mmol/l NaCl,1% NP-40,0.5% 去氧胆酸钠, 蛋白酶抑制剂 ) 收集转染后 48h 的 A549 细 胞, 用 Bradford 方法作蛋白定量后, 按每个样本 30μg 总蛋白上样, 进行 15%SDS-PAGE;220mA 恒流转膜 40 min (0.2μmol/L 硝酸纤维素膜 ); 用 封闭液 ( 含 5% 脱脂奶粉的 TBST) 室温振荡封闭 1h; 分别与封闭液稀释 His 抗体 (1 1000) 和 Tubulin 抗体 (1 50),4 过夜,TBST 洗膜 ; 加入 封闭液 1 2000 稀释的 HRP 标记的二抗, 室温振 荡反应 1h; 洗膜后用 ECL 显色检测目的蛋白 1.2.4 ELISA 检测细胞上清中 IL-6 的含量将 转染后 48h 收取的细胞上清按照 ELISA 试剂盒说 明书用双抗体夹心法测定 IL-6 含量 用标准品获 得标准曲线后, 将一抗 (1 250) 加于酶标板中 4 过夜, 每孔 100 μl PBST 洗 3 遍, 加封闭液 ( 含 10% 胎牛血清的 PBS, 每孔 >200 μl) 室温 1h, PBST 洗 3 遍, 加样品 ( 用细胞培养液稀释 80 倍, 每 孔 100μl) 室温 2h PBST 洗 5 遍, 加 HRP 标记的 二抗 (1 250, 每孔 100μl)1h PBST 洗 7 遍, 加显 色液 ( 每孔 100μl) 避光显色 30 min, 加 50μl 终止 液, 在波长 450nm 处测 OD 值 1.3 统计分析使用 SPSS11.0 软件包进行, 全部 数据以 x - ±s 表示, 组内差异比较采用 t 检验 P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 重组 11β-HSD2 真核表达载体的鉴定以购

908 买的 PMV-11β-HSD2 质粒为模板, 进行 PCR 扩增, 其产物在 1% 琼脂糖凝胶电泳上可见一条大小约 1200bp 的特异性条带, 与目的片段大小相符, 见图 1 将目的片段回收连入 PGMT 载体, 蓝白筛选后, 转化大肠杆菌 Top10, 摇菌提质粒, 酶切后琼脂糖电泳, 切胶回收后连入 pcdna3.1myc/his, 提质粒后用 HindⅢ KpnⅠ 双酶切后琼脂糖电泳, 可见约 1200bp 处清晰条带, 见图 2, 并送北京博迈德科技发展有限公司测序, 测序结果与 GenBank 所提供的序列相一致, 表明 11β-HSD2 的重组真核表达载体构建成功 测重组质粒 pcdna3.1myc/his-11β-hsd2 瞬时转染 A549 细胞 48h 后, 用 Westernblot 鉴定表达情况 从图 3 可知,His 抗体在转染 pcdna3.1 myc/his-11β-hsd2 细胞中可检测到目的蛋白 11β-HSD2 的表达, 转染空载体 pcdna3.1myc/his 的细胞中没有目的蛋白, 见图 3 注 :A: 转染重组质粒的细胞裂解液 ;B: 转染空载体 pcdna3.1myc/his 的细胞裂解液图 3 Westernblot 鉴定重组质粒 pcdna3.1 myc/his-11β-hsd2 的表达 2.3 转染细胞上清中 IL-6 的测定图 4 为 IL-6 ELISA 试剂盒的标准曲线, 显示 OD 值和样品浓度 在一定范围内呈线性相关 图 5 中转染空载体 pcdna3.1myc/his 的细胞上清与未处理的细胞上清相比 IL-6 水平差异无统计学意义 (P >0.05); 转 染空载体的细胞上清的 IL-6 水平低于转染重组质 粒的细胞上清 (P <0.05) 注 :A:DNA marker:dl2000bp;b:pcr 产物 ;C: 阴性对照图 1 对 PMV-11β-HSD2 质粒进行扩增的 PCR 结果 图 4 标准品的标准曲线 注 :A:DNA marker:dl2000bp;b: 重组质粒 pcdna 3.1 myc/his-11β-hsd2 经 Hind Ⅲ KpnⅠ 双酶切 ;C: 质粒 pcdna3.1myc/his- 11β-HSD2;D:DNA marker:dl15000bp 图 2 重组载体 pcdna3.1myc/his-11β-hsd2 的双酶切鉴定结果 2.2 11β-HSD2 重组质粒在 A549 细胞中表达的检 注 :IL-6: 白介素 6;A: 未处理的细胞上清 ;B: 转染空载体 pcdna3.1myc/his 的细胞上清 ;C: 转染重组质粒的细胞上清 ; 与 B 比较, a P < 0.05 图 5 ELISA 测定细胞上清中 IL-6 的表达水平

909 3 讨论严重感染 创伤 休克 弥漫性血管内凝血 误吸等可诱发机体全身炎症反应 过度的失控的炎症会引起机体组织和器官的严重损害, 炎症因子在全身炎症反应发生 发展过程中起着重要作用 细胞因子不仅具有多种生物学功能, 而且相互刺激 诱导和调节, 构成一个细胞因子网络, 参与机体免疫 炎症 感染和移植排斥反应等, 其中 IL-6 在炎症的发生 发展过程中发挥着重要作用,IL-6 等因其加重和促进炎症反应的作用被看作促炎症因子 如何及早阻断或及早降低过强的炎症反应是目前研究热点之一 [3] IL-6 与肿瘤的发生 发展有密切关系,A549 细胞为人肺腺癌细胞系, 其作为肿瘤细胞使得 IL-6 具有一定的分泌基础量, 为干预其分泌量提供了前提 同时 A549 细胞为人肺 Ⅱ 型上皮细胞来源, 肺泡 Ⅱ 型上皮细胞在合成和分泌肺泡表面活性物质 促进肺泡电解质的跨上皮运输及补充和分化为肺泡 [4] Ⅰ 型上皮细胞等方面起重要作用 而且, 肺泡 Ⅱ 型上皮细胞分泌大量细胞因子, 可调控中性粒细胞 [5] 向肺周边部移行, 中性粒细胞又进一步促进炎症反应, 加重肺组织损伤 这就说明肺泡 Ⅱ 型上皮细胞自身分泌的炎症细胞因子在 ALI 发生 发展中起重要作用 因此, 减少肺泡 Ⅱ 型上皮细胞炎症因子分泌, 有助于减轻 ALI A549 细胞具有生长速度快 易培养及无限传代的肿瘤细胞特点, 其转染条件的获得较有限传代细胞容易, 同时我们检测到 A549 细胞能够正常表达 11β-HSD2, 所以我们应用 A549 细胞对后续试验有重要的参考价值 真核表达载体的表达为日后转染与炎症密切相关的肺血管内皮细胞提供了成功的转染条件, 使日后建立炎症模型, 深入探讨 11β-HSD2 在炎症方面的作用成为可能, 同时 11β-HSD2 具有促增殖的特性, 在后续试验中可进一步探讨其对 A549 细胞等肿瘤细胞特性的影响 在诸多炎性疾病中,11β-HSD2 表达下降 在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者的病理样本中, [6] 11β-HSD2mRNA 表达下降, 而在局部皮质酮的代谢水平也相应下降, 是由于克罗恩病和溃疡性结肠炎均以前炎性因子增加为特征, 内源性皮质醇通常被看作对抗炎症的生理性复合物, 而 11β-HSD2 在介导内源性糖皮质激素活性过程中有重要作用, 在前炎性因子的刺激下,11β-HSD2 的负调节已经被体内 ( 肿瘤坏死因子 α 过度表达的转基因小鼠 ) 和体外 ( 培养的结肠细胞 ) 的实验数据证实 在 ALI [7] 中, 内毒素激活可以下调 11β-HSD2 的表达, 意味着放慢了糖皮质激素失活的速度, 增加了其在炎性组织细胞内浓度, 增强了天然的和 ( 或 ) 合成的糖皮质激素的抗炎效应, 可以作为机体的抗炎反应之一 上述研究均为 11β-HSD2 减少时的效应, 本实验通过构建真核表达载体实现 11β-HSD2 在细胞中的特异性过表达研究其增加时对炎症因子的影响, 从另一个角度探讨了 11β-HSD2 的功能, 使对 11β-HSD2 的认识更加全面 本实验结果表明, 上调 11β-HSD2 的表达可以引起 IL-6 水平升高, 说明 11β-HSD2 对 IL-6 有正调节作用 IL-6 来源于单核 / 巨噬细胞, 是多种细胞产生的多功能细胞因子, 在细菌感染时炎性介质刺激单核细胞 淋巴细胞等释放 IL-6, 使 IL-6 明显增高 IL-6 可加重和促进炎症反应, 为促炎症因子 除对血管内皮细胞及炎细胞具有直接的激活和毒性作用外, 更主要在炎症急性期诱导蛋白的合成, 催化和放大炎性反应和毒性作用, 参与全身炎性反应和脏器的早期损害 同时, 由于外源性糖皮质激素可使 11β-HSD2 表达增多, 导致局部有活性的糖皮质激素浓度下降, 促炎因子 IL-6 表达升高, 减弱了机体的抗炎效应, 导致机体对糖皮质激素的治疗反应不敏感 从类风湿关节炎患者关节置换术滑膜中 [8] 获取的外周血细胞中发现,11β-HSD2 表达增加, 再次验证了 11β-HSD2 在类风湿关节炎症状中表现的对糖皮质激素抗炎治疗不敏感的现象中的重要作用 本实验以真核质粒 pcdna3.1myc/his 作为表达载体, 将 11β-HSD2 基因插入其中, 成功构建了真核表达载体 pcdna3.1myc/his-11β-hsd2, 并通过脂质体介导在 A549 中表达和分泌后上调炎性因子 IL-6 的浓度, 提示了 11β-HSD2 在炎症中的重要作用 同时, 由于实验中没有直接测定糖皮质激素的水平变化, 不能确定 11β-HSD2 是否通过调节糖皮质激素以外的途径作用, 需要在以后的实验中深入探讨 参考文献 [1] Alikhani-KoopaeiR,FouladkouF,FreyFJ,etal.Epigenetic regulationof11 beta-hydroxysteroiddehydrogenasetype2 expression.jclininvest,2004,114:1146-1157. [2] Holmes MC, Sangra M, French KL,et al.11beta- Hydroxysteroiddehydrogenasetype2protectstheneonatal cerebelum from deleterious efects of glucocorticoids. Neuroscience,2006,137:865-873. [3] ChengYW,LeeH,Shiau MY,etal.Humanpapilomavirus

910 type16/18upṟegulatestheexpressionofinterleukiṉ6and antiapoptoticmcḻ1innoṉsmalcellungcancer.clincancer Res,2008,14:4705-4712. [4] Perl M,Lomas-NeiraJ,Chung CS,etal.Epithelialcel apoptosisandneutrophilrecruitmentinacutelunginjury-a unifying hypothesis? What we have learned from smal interferingrnas.molmed,2008,14:465-475. [5] WitherdenIR,VandenBonEJ,Goldstraw P,etal.Primary humanalveolartype Ⅱ epithelialcelchemokinerelease: efectsofcigaretesmoke and neutrophilelastase.am J RespirCelMolBiol,2004,30:500-509. [6] Ergang P, Leden P, Bryndová J,et al.glucocorticoid availabilityincolonicinflammationofrat.digdissci,2008, 53:2160-2167. [7] ThompsonBT.Glucocorticoidsandacutelunginjury.Crit CareMed,2003,31(4Suppl):S253-S257. [8] StegkJP,EbertB,Martin HJ,etal.Expressionprofilesof human 11beta-hydroxysteroid dehydrogenases type 1 and type2ininflammatoryboweldiseases.molcelendocrinol, 2009,301:104-108. ( 收稿日期 :2013-01-26 ) 实用无创机械通气技术进修班招生简介 北京朝阳医院呼吸与危重症医学科 ( 西区 ) 简讯 无创正压机械通气的临床应用日趋广泛, 从早期用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 (OSAS) 逐步扩展至治疗多种急性呼吸衰竭, 在慢性呼吸衰竭的机械通气治疗中无创通气已居于主导地位 目前, 国内多数医院在呼吸科 ICU 急诊科 心脏科等开展了无创通气治疗, 取得一定疗效, 但长期以来关于无创通气的一些基本问题仍困扰着临床, 如 : 何种呼吸机可用于无创通气 为何上机后患者的血 CO2 反而更高 患者无法耐受无创通气怎么办, 成为制约无创通气进一步规范 普及应用的重要因素 北京朝阳医院呼吸与危重症医学科 - 北京呼吸疾病研究所在国内较早开展无创通气, 是国内无创通气多中心研究的牵头单位 ( 中华结核和呼吸杂志,2005,28:680-684; 中华结核和呼吸杂志,2006,29:13-17), 对无创通气的教学具有丰富经验 现以北京朝阳医院呼吸与危重症医学科 ( 西区 ) 为教学基地, 举办无创机械通气专项进修班, 时间安排为 4 个月的短期进修, 教学安排为前半程在 ICU 进行理论学习和临床见习 后半程在呼吸病房由带教老师指导完整管理无创机械通气患者, 通过理论与实践相结合的强化培训使进修生在短期内初步规范掌握无创通气的临床应用 招生范围 : 临床工作中需开展无创机械通气, 具有一定呼吸衰竭治疗经验的医生 招生时间 : 每年招收 3 期, 每期 4 个月, 分别于 6 月 10 月 2 月开学 报名方式 :1 在朝阳医院网站 (htp://www.bjcyh.com.cn/) 首页左下方 最新下载 或在潮阳呼吸支持技术学院网站 (htp://www.cycrst.com/index.asp) 培训专区 下载 进修申请表 2 填写 进修申请表, 封面进修科目栏填写 呼吸与危重症医学科 ( 西区 ), 第三页进修科目要求栏填写 无创机械通气的临床应用 3 将 进修申请表 邮寄至 : 北京市石景山区京原路 5 号北京朝阳医院 ( 西区 )ICU 朱剑收 100043, 请在信封上注明 无创通气进修 我们会及时与您联系, 我们的联系电话 010-51718872