南京农业大学学报,! "!" # 吴志明 董文琦 党志红 等 - 半夏凝集素基因克隆及其对桃蚜的抗性研究 - 南京农业大学学报, 半夏凝集素基因克隆及其对桃蚜的抗性研究 吴志明 董文琦 党志红 潘文亮 谢晓亮 温春秀 陈劲枫 - 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 园艺学院 江苏南京 $ - 河北省农林科学院经济作物研究所 河北石家庄 - 河北省农林科学院植物保护研究所 河北保定 摘要 研究了半夏凝集素 * )) +/ 基因对桃蚜 :"1!! 的抗性 从半夏幼叶中提取总 @ / 采用 @+ 2@ 法分离克隆出 * ( 基因 # / 片段 该基因在.! & = 中登录号为 0$, 序列分析表明 该 # / 片段全长为 编码 %$ 个氨基酸组成的蛋白 具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征 含有 个由, 个氨基酸 0 9 组成的甘露糖专一结合位点 与报道的天南星科凝集素基因氨基酸序列的同源性在 4 5 $$4 构建了 6 启动子控制下的 * ( 基因的植物表达载体 & * ( 该载体含有抗卡那霉素的选择标记基因 利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株 2@ 和半定量 @+ 2@ 分析表明 * ( 基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达 抗蚜虫鉴定表明 转基因植株有效地抑制了蚜虫的群体增长率 平均抑制率达 4 表明该基因对同翅目害虫的抗虫基因工程有重要的应用价值 关键词 半夏凝集素 基因克隆 转基因烟草 抗性 桃蚜中图分类号 6%, 文献标志码 / 文章编号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收稿日期 $ 基金项目 河北省农林科学院青年基金项目 /% 河北省自然科学基金项目 2$ 国家转基因重大专项资助项目 $ & 作者简介 吴志明 博士研究生 副研究员 通讯作者 陈劲枫 教授 博导 从事蔬菜遗传育种和生物技术研究 #! *!" #
,% 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 随着人们生活水平的不断提高 人们对无公害蔬菜的要求也越来越高 而同翅目害虫严重危害蔬菜 作物 且这些害虫也是植物病毒的传播介体 常给蔬菜生产带来重大经济损失 化学农药的施用在 减少虫害的同时引起一系列副作用 如农药残留 环境污染 诱导害虫产生抗药性和引起次要害虫的大 发生等 利用基因工程技术导入抗虫基因创造抗虫蔬菜作物 是持续控制虫害的根本措施 已有研 究表明 植物凝集素基因能有效控制同翅目昆虫 转植物凝集素基因的作物对蚜虫 褐飞虱等同翅 目昆虫具有良好的抗性 显示了其在抗虫基因工程研究中的潜力 % 天南星科植物半夏凝集素对棉蚜有强致死作用 9 ( 等首次从半夏中克隆了 个 * 基因 转基因植株对蚜虫具有显著抑制作用 $ 由于凝集素抗虫活性与其和糖类可逆性结合的能力密切相关 如果结合位点突变使凝集素丧失与昆虫消化道糖的结合能力 那么它就丧失了抗虫活性 笔者从半 夏中克隆了 个 * ( 基因 与 9 ( 等报道的序列在糖结合位点具有明显差异 为了评价该基因的 抗蚜虫活性 笔者利用植物双元载体 & 构建了该基因的植物表达载体 并进行了转基因烟草抗蚜 虫活性研究 以期为利用该基因进行蔬菜作物抗蚜虫基因工程奠定基础 () 材料与方法 (*() 材料 半夏 * 采自河北省农林科学院药用植物研究中心中药材种质资源圃 植物双元质 粒载体 & 和农杆菌菌株 / 由中国农业科学院作物研究所赵开军研究员惠赠 + ( @ / 提取试剂盒 3 31E 反转录酶 / 聚合酶 +, / 连接酶. 3 + : 载体试 剂盒 限制性内切酶购自 (!) 公司 " + 凝胶回收试剂盒等购自 + @ 公司 卡那霉素 氯 霉素 利福平 头孢霉素等购自北京鼎国生物技术公司 2@ 引物由北京赛百盛公司合成 (*+) 方法 (*+*() ( 基因的克隆 ) 以半夏幼叶为材料 按照 (!) 公司的 + ( @ / 提取试剂盒说明书提 取 @ / 根据.! & = 上的 * 基因序列 登录号为 /9$ 设计合成引物 上游引物 F /./.+2+/.//+..22+22//.2+22+22+2 F 下游引物 F /./+...222...//++//++2/22+ +2+22.+2/2/2+ F 为了随后亚克隆方便 分别在引物的 F 端加上了酶切位点 9# 和 3 以提 取的总 @ / 为模板 按照 3 31E 试剂说明书合成 # / 第 链 取 1# / 进行常规 2@ 扩增 反应条件 $,, $, 个循环 最后 延伸 2@ 产物按照常规方法克隆到质粒. 3 + 载体上 随机挑取 个克隆进行测序 并将序列提交.! & = 记为 * ( 利用 /3/ 分析软件与.! & = 上的单子叶甘露糖结合凝集素基因比 对分析 (*+*+) 植物表达载体的构建及转化 ) 利用克隆测序的 * ( 基因序列 经 9# 和 3 双酶切后将 * ( 基因亚克隆到植物载体 & 的相应位点上 转化到农杆菌菌株 / 中 按照王关林等 的方法采用叶盘法转化烟草获得抗卡那霉素 标记的转化再生植株 (*+*) 转基因植株的鉴定 ) 2@ 检测 剪取转基因植株和非转基因植株的幼叶 采用 2+/& 法提取 基因组 / 提取的 / 模板量调整为 ) 1 取 1 作为模板进行 2@ 扩增 反应条件 同 半定量 @+ 2@ 鉴定 对用 2@ 检测呈阳性的植株提取总 @ / 进行半定量 @+ 2@ 参照马 恢等的方法利用双重 @+ 2@ 技术进行内标基因和 * ( 基因的双重 @+ 2@ 检测 内标为马铃薯 的线粒体 / 脱氢酶基因 抗蚜虫鉴定 将 2@ 分子检测呈阳性的 个不同的转基因单株进行接种鉴定 桃蚜采自河北省 农林科学院植物保护研究所温室内烟草上自然发生的种群 于温室内饲养稳定一段时间后 选取健康活 泼 生理状态一致的无翅成蚜进行试验 将室内饲养的桃蚜分别接种到 5 " 叶龄的转基因烟草和非 转基因烟草植株中层叶片上 每株苗接无翅成蚜约 头 置于同一条件下 5 饲养 隔日调, 查记载各处理烟苗上蚜虫数量 直至 " 按照袁正强等的方法以转基因烟草对蚜虫的种群抑制率 作为指标 来评价各转基因烟草对蚜虫的毒力效果 种群抑制率 B 对照株活蚜数 处理株活蚜数 对照株活蚜数 A4
第 期 吴志明 等 半夏凝集素基因克隆及其对桃蚜的抗性研究, +) 结果与分析 +*() ( 基因!93 序列比较分析采用 @+ 2@ 技术扩增出 条 的 # / 片段 经克隆测序后记为 * ( 该序列在.! & = 登录号为 0$, 利用 /3/ 分析软件将该基因与.! & = 上的凝集素基因进行序列比对 并在氨基酸水平上进行了同源性分析 图 结果表明 该基因编码一个具有信号肽的前体蛋白 根据预 图 () ( 与单子叶植物甘露糖结合凝集素氨基酸序列比对结果 *()& # $/ $! %! $# / )( $ % & /! # % /$ " % $" # / / 异叶天南星凝集素! 3 "3 )) /9$$% /1/ 华南星凝集素! 3 # 3 )) /9 % /3/ 海芋凝集素! 3 1! )) 0,%, +/ 半夏凝集素 * )) /9$ / 3/ 疆南星凝集素 33 3 )) $ 序列在该点具有相同的氨基酸 +!!!! ( # " 序列在该点存在氨基酸差异 +!! "!! ( # " 甘露糖凝集素的保守位点比较 +!#(!!"!# ( # "!?! #!#( ( 表示在该序列位点无法比较 +!!?! #!!# (!#(!"-
, 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 测信号肽规则 其 端有一个, 个氨基酸组成 的信号肽 信号肽位于 /, E 之间 切除信号肽 后成为具有杀虫活性的成熟蛋白 该基因推测的氨 基酸序列包含 个由, 个氨基酸组成的甘露糖专一 结合点 这与天南星科其他植物如异叶天南星凝集 素! 3 "3 )) / / 疆南 星凝集素 3 3 3 )) / 3/ 等 很相似 % 氨基酸序列同源性分析 图 表 明 甘露糖凝集素是一类同源性很高的凝集素 其 中天南星科的凝集素归类为一组 其同源性在 4 5$$4 之间 它们之间的糖结合位点序列 非常保守 其中 * ( 基因的前两个结合位点为 0 9 第 个保守结合位点 * ( 基因与天南星 科植物 / / 华南星凝集素! 3 # 3 ) 图 +) 不同单子叶植物甘露糖结合凝集素氨基酸序列同源聚类分析 *+)& & / # $ $# & % %! %$/ $! %! /! # % /$ " %" $# / % $1!. / 雪花莲凝集素.!! )) />,. /, 3 % ) /1/ 和海芋凝集素! 3 1! )) /3/ 一样 均为 0 >9 而与 9 ( 等报道的 * 基因结合位点 0 99 明显不同 如图 下划线所示 因此有必要对 * ( 基因抗 蚜功能进行研究 +*+) ( 基因植物表达载体的构建 将经 9# 和 3 双酶切的 * ( 基因片段亚克隆到植物双元表达载体 & 的相应位点上 构建成 6 启动子 * ( ;. ;6 终止子结构的植物表达载体 & * ( 图 提取质 粒经 9# 和 3 双酶切验证 表明 * ( 基因以正确的阅读框架插入到 & 载体中 图, 并 将该载体转化到农杆菌菌株 / 中用于随后的烟草转化 获得转基因植株 图 ) 植物转化载体 1,-(+( ( 表征示意图 *)!& /$! 1 $ $ /$ 1#$/ %1,-(+(" )( +*) 转 ( 基因烟草植株分子鉴定 对经卡那霉素筛选获得的抗性烟草再生植株进 行 2@ 检测 其中 个不同的单株检测结果如图 所示 结果表明 * ( 基因特异引物在非转基 因烟草上只扩增出 条 的非特异带 通过 提高 2@ 反应的退火温度和热启动进行扩增 这 条带仍然得以扩增 而转基因烟草除了扩增出 特异带外 也扩增出了 的带 这可能是 烟草中含有与 * ( 基因高度同源的植物凝集素 基因组 / 引起的 这条带不影响转基因植株检 测结果的准确性 但可用作内标记区分转基因阴性 图 ) 表达载体 1,-(+( ( 的酶切验证 植株和阳性植株 对上述经过 2@ 检测的 株阳性植株进行了半定量 @+ 2@ 检测 验证转基因植株 * ( 基因在转录水平的表达 图 % 以马铃薯的线粒体 *)& / % %!$ & 1#$ 1! 1,-(+(" )( - / =! 5-9# 和 3 双酶切验证 +!" " )! ( < ( 9# " 3,-3 =! 1 / 脱氢酶基因为内标 非转基因烟草扩增出大小约为 $ 的内标特异带 转基因烟草在扩增出
第 期 吴志明 等 半夏凝集素基因克隆及其对桃蚜的抗性研究,$ 内标带的同时也不同程度地扩增出 条 的特异条带 且不同植株在 @ / 水平上的转录水平不一 致 有的甚至无法检测到转录 如 号转基因植株 图 ) 转 ( 基因烟草的 72 检测结果 * )& 72 %! # $! $!! 图 ) 转基因烟草的半定量 "72 检测 * )& / " $ $ "72 # $ " 1#$ & )(! $!! 1#$ -3 =! 1 - 空白对照 8! #( ( - 质粒 -3 =! 1 - 空白对照 8! #( ( - 阴性 对照 " #( (,- 阴性烟草对照 ( )! #( ##( 烟草对照 ( )! #( ##(, 5- 转基因烟草植株 5- 转基因烟草植株 5 号 + )! #( ##( 5 号 + )! #( ##( ( ( +*) 转基因烟草的抗虫鉴定对经 2@ 检测的 株转基因植株进行了抗蚜虫接种鉴定研究 从接虫后第 天结果来看 不同的转基因植株抗虫性差异很大 其中表现抗性的转基因烟草对烟蚜的种群抑制力由大到小依次为, 和 % 抑制率在 4 54 之间 平均抑制率为 4 其中 号转基因植株接种 " 后蚜虫全部死亡 抑制率达到 4 图 而 号和 号转基因植株几乎没有抗性 尤其是 号转基因烟草接种 " 后群体增长是对照植株的 倍 半定量 @+ 2@ 结果显示 号转基因植株在 @ / 水平上几乎没有表达 说明转基因植株的抗性水平与转基因表达量密切相关 表达水平高的植株其抗性水平也较高 图 ) 转基因烟草对蚜虫虫口密度增长的抑制作用 * )- &! $! $!! 1#$ & 1 1#$ % # 1/ %$ ) 讨论 转 * ( 基因烟草植株的抗蚜试验结果表明 转基因烟草能有效地抑制桃蚜的繁殖和发育 影响 桃蚜群体的形成 表现出明显的抗虫作用 说明该基因是一个有潜在应用前景的抗蚜虫基因 凝集素的 抗虫活性与它和糖类可逆性结合能力密切相关 有人通过定点突变技术 使豆科植物的凝集素./6 丧失与糖结合的能力 结果该凝集素丧失了抗虫活性 笔者分离的 * ( 基因转化获得抗蚜虫转基 $ 因植株对蚜虫的平均抑制率为 4 有的单株接种 " 后抑制率高达 4 这比 9 ( 等报道的 * 基因抗蚜虫活性高 这可能是两者在氨基酸水平上同源性差异引起的 它们的同源性为 $$4 尤其是在与抗蚜虫活性密切相关的甘露糖结合位点上 它们的第 个保守位点明显不同 9 ( 等报道 * 基因在该处的位点为 0 99 而笔者分离的 * ( 基因的保守位点为 0 >9 由于凝集素结合位 点与抗虫性差异密切相关 因此推测分离的 * ( 基因抗虫活性高可能是 0 >9 与蚜虫消化道上糖结 合能力更强有关 本研究中不同的 * ( 转基因烟草植株的抗性水平差异很大 大部分植株的抑制率在 4 5 4 之间 这与转基因在叶片中的表达水平有关 高抗水平的植株叶片外源凝集素基因表达的水平也 高 而抗性极低甚至不表现抗性的转基因植株中凝集素表达水平很低甚至不表达 这种表达差异可能是
南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 由转基因植株体内转基因沉默引起的 如转基因的拷贝数和构型 在基因组上的整合位点及整合方式 转基因的转录水平等都与沉默有关 也可能是由转基因植株的生理差异所致 不同转化植株的抗虫性不同 表明通过获得一定数量的转基因植株结合抗蚜虫鉴定试验筛选才能获得抗性良好的转基因株系 然后应用于植物育种实践中 也可通过选择所转入的植物的偏爱密码子优化 * ( 基因以提高其在该植物中的表达水平 另外蚜虫是刺吸式昆虫 主要吸食植物韧皮部汁液 因此在蚜虫主要取食部位 即韧皮部 表达 * ( 能更好地抑制蚜虫的生长 单子叶植物甘露糖结合凝集素是一类同源性很高的凝集素 有大的基因家族编码 $ 本研究在进行转基因植株的 2@ 检测时 以烟草的基因组 / 为模板 并以 * ( 基因特异引物进行扩增时得到了一条和目标片段不同的大小约为 的非特异带 提高引物的退火温度仍然能扩增到该片段 这说明烟草中具有与单子叶甘露糖结合凝集素基因高度同源的序列 但是半定量 @+ 2@ 时并未检测到该片段 说明其并没有发生转录 推测该片段可能是植物凝集素基因家族中的不活跃成员 对该片段产物测序也许对进一步研究烟草凝集素基因具有一定的意义 在本研究中 该片段可作为内标记来区分转基因烟草和非转基因烟草 弥补了 2@ 检测容易带来假阳性的不足 迅速准确地筛选阳性转基因植株 参考文献 ) 2! : 1-+ ( (! : "!#( -3( (, 2! ( 8 =!. (" ( /! -+! " 3 "!# # "!! (#! )( (!!<! " -2 ( (!# ( $,, 9 9 ) 8! )- #!!" (! :<( " "! #! )! #<! :!! )!!! &! "(( " * )) +/ - 2! + ; ) 2 $,,,, 孙小芬 唐克轩 万丙良 等 - 表达雪花莲凝集素. / 的转基因水稻纯系抗褐飞虱 - 科学通报,% 周永刚 田颖川 莽克强 - 苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究 - 生物工程学报, $ % 黄大窻 潘映红 张淑香 等 - 从掌叶半夏和半夏中发现对几种蚜虫有致死活性的蛋白 - 中国农业科学 $$ $, $% 潘映红 张淑香 曹景萍 等 - 掌叶半夏凝集素的分离纯化及抗蚜活性研究 - 自然科学进展 $$, 9 ( ( ) 6 (! + )! -3(!# # ( )(!# )!! ( * - 复旦学报 自然科学版,,,%,%, $ 9 ( ( ) )9( )! 0 ( )! -+ )! #( ##(!! )* )) #(!! #!"! #!( " -+ )! #@!! # 6 6 "!@ ( <! -2 (:"! " ) "! #!( (!( : #( (!# # " # :(.! 32!# - (# /# " 6# 6/ $$ $ 王关林 方宏筠 - 植物基因工程 3- 版 - 北京 科学出版社 + + + =!:6 -/ "!!!!(" ( ( ( ( ( / ( "!:"!"! - 3(!# & ( () # @! ( $$, $ 马恢 谢晓亮 尹江 等 - 以马铃薯 @ / 为内对照双重 @+ 2@ 法检测马铃薯纺锤块茎类病毒 - 园艺学报, %, 袁正强 赵存友 周岩 等 - 雪花莲凝集素基因. / 的改造及其抗蚜性 - 植物学报,% $ $ (!!.-/!<!(" (!" # ) )!?! #!#! )!! - # /# " @! $%,,%,%$ % 1 ( <!. (6! -# /# ( ) "!! ( : ( (! " )!# ( *! - & ( #,,$ 3 =!3 / / 8 (+! - ( ( (): "!! "! )!!! # ) " ( "!!! -/".!!,% 2 = ( 6 = / 3( " /! -2! :! ("!! (!!#! =!!! )! #( ##( #(! )! #! ) #= )( (!!# - 2! @! % % $ 1 ( 1. ( 6 ( (3! -1!# )!!!?! #! "!#!! ( ( )#!"!)! -.!! #@! ( #! " 2 ( ( ( % % % 责任编辑 范雪梅