中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(4):54 60 拟南芥 AtCAO 和 AtHEMA1 基因共表达载体 的构建及转烟草研究 李翠萍潘宇白小宁褚福堂苏承刚张兴国 ( 西南大学园艺园林学院南方山地园艺学教育部重点实验室重庆 400715) 摘要增加作物的叶绿素含量, 尤其是叶绿素 b 的含量, 是增强作物耐弱光性的可能途径 将拟南芥叶绿素合成的关键酶 谷氨酰 trna 还原酶 (glutamyl trnareductase,hema1) 的基因和促进叶绿素 b 合成的关键酶 叶绿素酸酯 a 加氧酶 (chlorophylideaoxygenase,cao) 的基因, 构建于同一个植物双元表达载体, 经农杆菌介导整合进烟草基因组 结果显示, 弱光下转基因烟草比野生烟草的叶绿素总量增加不显著, 但叶绿素 b 含量增加 16% ~17% 叶绿素 a/b 比值降低 9% ~12% 光合作用增强 42% ~65%, 均达到显著水平, 而且生长发育比野生烟草快 为今后改良作物的耐弱光性奠定了基础 关键词烟草 AtHEMA1 基因 AtCAO 基因叶绿素耐弱光中图分类号 Q786 弱光是作物设施栽培的主要障碍之一 [1 3] 通过常规育种方法, 可培育出耐弱光的新品种, 但存在资源匮乏 改良困难和周期长等局限性, 而转基因技术将是改良作物耐弱光性的重要途径 增强作物耐弱光性的一个策略是增加其光合色素 叶绿素, 尤其是叶绿素 b 的含量 在叶绿素合成途径中,5 氨基乙酰丙酸 (ALA) 是所有卟啉化合物的共同前体, 与光合作用和呼吸作用相关 [4 5] 提高植物中的 ALA 含量可提高叶绿素含量, 进而增强耐弱光性 [6 7] 由谷氨酸合成 ALA 是叶绿素生物合成途径的限速步骤, 其中谷氨酰 trna 还原酶 (glutamyl trna reductase,hema1) 是此途径的关键酶 拟南芥中有 3 个基因编码谷氨酰 trna 还原酶, 即 AtHEMA1 AtHEMA2 和 AtHEMA3 [8 10] 其中,AtHEMA1 受光诱导, 在光合组织中表达, 而 AtHEMA2 AtHEMA3 主要在根中表达 此外, 许多阴生植物的叶绿素 b 含量较高, 叶绿素 a/b 比值较低, 有利于吸收弱光环境中的散射光, 而叶绿素酸酯 a 加氧酶 (chlorophylideaoxygenase,cao) 收稿日期 :2013 01 18 修回日期 :2013 02 15 重庆市重大攻关项目资助项目 (CSTC2010AA1019) 通讯作者, 电子信箱 :zhangxg63@163.com 催化叶绿素 a 氧化形成叶绿素 b, 是叶绿素 b 形成的唯一途径 [11 12] 本实验克隆了拟南芥 CAO 基因 (AtCAO), 并与拟南芥 AtHEMA1 基因相连接, 构建了含有双价目的基因的双元表达载体, 经农杆菌介导整合进烟草基因组, 分析这两个基因共表达对叶绿素总量 叶绿素 a 含量 叶绿素 b 含量和光合性能等方面的影响, 以期增强转基因烟草对弱光的捕获能力, 提高其耐弱光性, 为今后用于其它作物的耐弱光改良奠定基础 1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 植物材料 拟南芥 (ArabidopsisthalianaL. EcotypeColumbia) 和烟草 (Nicotianatabacum L.cv. Wisconsin38) 由本实验室繁殖和保存 1.1.2 菌株 质粒 大肠杆菌菌株 XL 1 blue 农杆菌菌 株 EHA105( Agrobacterium tumefaciens) 双元载体 pcambia1302 由实验室保存 ; 含 AtHEMA1 基因的表达 载体 pvct2298 由实验室构建 [13] 1.1.3 试 剂 pmd18 T 载体 限制性内切酶 PrimStarHSDNA 聚合酶 TaqDNA 聚合酶 DNAmarker
2013,33(4) 李翠萍等 : 拟南芥 AtCAO 和 AtHEMA1 基因共表达载体的构建及转烟草研究 55 (λdna/ecorⅠ +HindⅢ DL2000) 购自 TaKaRa 公司 ; Ligationhigh 连接酶购自 TOYOBO 公司 ;SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒 柱式质粒小抽提量试剂盒购自上 表 1 引物序列 Table1 Primersequences 编号序列 (5 3 ) 位置 海生工生物工程有限公司, 并委托该公司合成引物和测定序列 文中所用引物序列见表 1 P1 GAGCTCATGAGATAGGGCAGACGTAG AtCAO 基因启动子上游, 划线部分为 SacI 位点 P2 GGTTCTTAGAAGACATTAGTTTAGTGG AtCAO 基因终止子下游 P3 GTAACGCCAGGGTTTTCCCA 位于 pmd18 T 载体 LacZ 的下游 P4 CCATGGCGTCACCGGAAAGAGAGTG AtCAO 基因启动子下游 P5 GCACCTATACTTCCTTCTTTACAG AtCAO 基因编码区内 P6 CCGAGAAATGTTGGATCTTGTGTTG AtHEMA1 基因编码区内 P7 TTCCGCTTCCTCGCTCACTGA ColE1 复制子下游 P8 CCAATACGCAAACCGCCTCT pmd18 T 载体 LacZ 的上游 P9 CCCGGCAGCTTAGTTGCCGT T DNA 的左边界外侧 P10 ATGACGCACAATCCCACTATCC CaMV35S 启动子内 P11 CATGAGCGAAACCCTATAGGAACC Tnos 终止子内 P12 GGATGTATGAGTGAATGGGGCATGAG AtCAO 基因编码区内 P13 GGAGACGTGACAGCAAAATGATG AtHEMA1 基因终止子下游 表 1 中除引物 P3 外, 其它引物的位置见图 3a 1.2 方法 1.2.1 AtCAO 基因的克隆根据 GenBank 公布的 AtCAO 基因序列, 在其启动子上游和终止子下游分别设计 PCR 引物 P1 和 P2( 表 1) 采用改良的 CTAB 法从拟南芥花蕾中提取基因组 DNA 用 PrimStarHSDNA 聚合酶 (TaKaRa) 进行 PCR 扩增, 反应条件为 :98 预变性 1min;98 10s,60 30s,72 4min, 循环 3 次 ; 98 10s,61 30s,72 4min, 循环 28 次 ; 最后 72 延伸 10min PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后回收,TaqDNA 聚合酶加 A 尾后 TA 克隆进 pmd18 T 载体, 转化大肠杆菌 XL 1 Blue 感受态细胞 用引物 P3/ P4 对菌落进行 PCR 筛选, 阳性克隆再经测序验证 所克隆的载体命名为 pvct1263, 其中的 AtCAO 基因具有原始的启动子和终止子, 以便保持其在拟南芥中的表达模式 1.2.2 含 AtCAO 和 AtHEMA1 双价基因的植物双元表达载体构建用 EcoR I 和 SalI 对载体 pvct1263 pvct2298 进行双酶切, 回收目的片段后经 Ligationhigh (TOYOBO 公司 ) 连接 2~3h, 转化至 XL 1 Blue 大肠杆菌感受态细胞 重组子分别用引物对 P5/P6 P4/P7 进行 PCR 检测 ;SmalI 和 SacI 进行酶切鉴定 经鉴定的载体命名为 pvct2299 1.2.3 烟草的遗传转化及再生植株的检测采用冻融法将载体 pvct2299 转入根癌农杆菌 EHA105 (Agrobacteriumtumefaciens) 感受态细胞, 叶盘法转化烟草 [14] 不定芽诱导和选择培养基为 MS 附加 2.5mg/L 的 6 BA 0.2mg/L 的 NAA 150mg/L 的卡那霉素 300 mg/l 的羧苄青霉素 3% 蔗糖和 0.65% 琼脂 生根培养基为 MS 附加 150mg/L 的卡那霉素 300mg/L 的羧苄青霉素 3% 蔗糖和 0.65% 琼脂 采用改良 CTAB 法提取野生型及抗卡那霉素烟草叶片的基因组 DNA 用引物对 P8/P9 P10/P11 P1/ P12 P6/P13 分别检测有无农杆菌污染 卡那霉素抗性基因 AtCAO 基因和 AtHEMA1 基因 1.2.4 转基因烟草的耐弱光性鉴定 (1) 弱光处理方法将转基因与野生型烟草组培苗同期繁殖, 采用随机排列的方式栽种于人工气候室 盆栽土壤为腐殖质土 粘土 沙土按 1 1 1 比例混匀 挑取形态正常 生长良好和整齐一致的转基因烟草株系和野生烟草进行弱光处理 每类材料各 3 株, 重复 3 次 用 T5 植物生长灯提供光照, 每天 14h 光照 /10h 黑暗, 环境温度为 25 将烟草苗修剪为三叶一心, 以免叶片数不同导致光合能力和生长的差异 分别于 25 ~30μmol m 2 s 1 ( 比烟草的光补偿点稍高 ) 弱光照处理 50d,50~60μmol m 2 s 1 弱光照继续处理 50d 后, 测定叶绿素 a b 含量, 光合速率和株高 (2) 光合能力测定选取野生烟草与转基因烟草自上而下的第 5 片功能叶, 于 9 00~11 00 使用 LI
56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.42013 6400 便携式光合仪 (LI COR, 美国 ) 在实际生长条件下测定净光合速率 测定过程中使用开放气路, 光照强度为 60μmol m 2 s 1, 温度为 28 测定前, 应多次匹配, 当数据的读数稳定时, 进行记录, 求 3 次测定的平均值 (3) 叶绿素含量的测定用 6mm 的打孔器在烟草第 5 叶位主脉两侧中部位置对称取 15 个叶圆片, 浸泡在 15ml80% 的丙酮溶液中, 封口 避光放置于摇床上, 于 25 125r/min 振荡至叶片变白 以 UV 1800 型分光光度计测定 470nm 646nm 和 663nm 处的 OD 值, 然后计算单位面积叶绿素 a b 含量及叶绿素总量 (4) 株高测定株高按烟草农艺性状调查标准方法 (YC/T42 1998) 测定 [15] (5) 数据处理方法用 Excel 进行数据处理, 计算平均值和作图 采用 SPSS19.0 软件进行方差分析 2.2 构建成了含 AtCAO 和 AtHEMA1 双价基因的双元表达载体用 EcoR I 和 SalI 双酶切载体 pvct1263 和 pvct2298, 分别回收 4049bp 11886bp 目的条带, 连接 转化后获得卡那霉素抗性菌落, 分别用引物对 P5/ P6 P4/P7 扩增出 2195bp 2123bp 目的片段, 表明 PCR 鉴定正确 ( 结果略 ) 质粒 DNA 经 SmaI 酶切出 3296bp 5272bp 和 7367bp 片段, 经 SalI 酶切出 1586bp 2184bp 4787bp 和 7347bp 片段 ( 图 2), 表明酶切鉴定正确, 构成了双元载体 pvct2299, 其 T DNA 结构见图 3a 2 结果与分析 2.1 AtCAO 基因的克隆以拟南芥基因组 DNA 为模板,P1/P2 为引物扩增到 4008bp 片段 ( 图 1a) 将该片段 TA 克隆到 pmd18 T 载体, 用引物 P3/P4 对菌斑进行 PCR 筛选, 扩增出 1304bp 的目的片段 ( 图 1b) 阳性菌落经测序显示与 GenBank 中公布的序列相一致, 包含了该基因的启动子 编码区和终止子, 表明该基因得到克隆, 且获得了重组质粒 pvct1263 图 1 AtCAO 基因的克隆 Fig. CloningofAtCAOgene (a)amplificationofatcaogene (b)pcrscreeningofpositive colonies Mb:λDNA/EcoRI+HindⅢ marker;ms:dl2000dna marker 图 2 AtCAO AtHEMA1 基因双元表达载体的酶切验证 Fig.2 Identificationofthebinaryvectorcontaining AtCAOandAtHEMA1genes 1:pVCT2299plasmid;2:SmaIdigestionofpVCT2299;3:SalI digestionofpvct2299;m:λdna/ecori+hindⅢ marker 2.3 获得了整合有 AtCAO 和 AtHEMA1 双价基因的烟草植株将含有 AtCAO AtHEMA1 基因的植物双元表达载体 ( 图 3a) 转化进根癌农杆菌 EHA105, 转化烟草后筛选获得了具有卡那霉素抗性的芽和植株 ( 图 3b 图 3c) 提取 gdna 后经引物对 P8/P9 进行 PCR 扩增, 证实 DNA 样本均无农杆菌污染 ( 图 3d); 经引物对 P10/ P11 P1/P12 和 P6/P13 进行 PCR 扩增后, 分别得到 1470bp 的卡那霉素标记基因 ( 图 3e) 1179bp 的 AtCAO 基因片段 ( 图 3f) 1002bp 的 AtHEMA1 基因片段 ( 图 3g), 而且 PCR 产物测序结果与预期的完全一致 ( 图 3h), 表明目的基因已整合进烟草基因组 待苗长高至 3cm 以上时在生根培养基上得到 100% 生根 共获得 11 株转基因烟草植株 选取长势和大小一致的转基因株系 TL1 和 TL2 用于后续试验
2013,33(4) 李翠萍等 : 拟南芥 AtCAO 和 AtHEMA1 基因共表达载体的构建及转烟草研究 57 图 3 转基因烟草鉴定 Fig.3 Identificationoftransgenictobaccoplants (a)thestructureoft DNAinbinaryvectorpVCT2299containingAtCAO,AtHEMA1genes (b)kanamycinresistantbuds (c)therooted transgenictobacco (d)~(g)detectionthetransgenictobaccowithorwithoutcontaminationofagrobacteriumgdna,nptigene,atcaogene, AtHEMA1gene (h)partialsequenceofthepcrproductwithp1/p12primerpair M:DL2000DNA marker; :WildtobaccogDNA asa negativecontrol;+:pvct2299plasmidasapositivecontrol 2.4 AtCAO 和 AtHEMA1 基因提高了弱光下烟草的光合能力 ( 表 2) 25~30μmol m 2 s 1 弱光照处理 50d 后, 转基因烟草株系 TL1 和 TL2 与野生烟草相比, 叶绿素总量无显著差异, 但叶绿素 b 含量分别比野生烟草增加 14% 和 6%; 转基因烟草叶绿素 b 含量增加造成叶绿素 a/b 比值分别比野生烟草低 5.8% 和 6.1%; 光合作用比野生烟草分别增强 32% 和 12%; 但均未达到显著水平 50~60μmol m 2 s 1 弱光照继续处理 50d 后, 转基因烟草株系 TL1 和 TL2 的叶绿素总量分别比野生烟草增加 5% 和 8%; 叶绿素 b 含量分别比野生烟草增加 17% 和 16%, 叶绿素 a/b 比值分别比野生烟草约低 12% 和 9%, 且两者均达到极显著性水平 (P<0.01); 光合作用比野生烟草分别增加 65% 和 42%, 达到显著性水平 P<0.05) 表 2 弱光对转 AtCAO AtHEMA1 基因烟草叶绿素合成和光合性能的影响 Table2 EfectsoflowlightonchlorophylandphotosynthesisoftransgenictobaccowithAtCAOandAtHEMA1 弱光处理强度 (μmol m 2 s 1 ) 25~30 50~60 株系 叶绿素 a 含量 (μg/cm 2 ) 叶绿素 b 含量 (μg/cm 2 ) 叶绿素总量 (μg/cm 2 ) 叶绿素 a/b 光合作用强度 (μmolco 2 m 2 s 1 ) WT 22.54±0.61 6.24±0.17 28.78±0.78 3.61±0.10 1.56±0.25 TL1 24.08±1.83 7.09±0.48 31.17±2.28 3.40±0.10 2.05±0.53 TL2 22.48±1.62 6.62±0.57 29.10±2.18 3.39±0.11 1.75±0.39 WT 29.12±0.80 7.50±0.22 36.63±0.99 3.88±0.05 1.21±0.21 TL1 29.69±0.89 8.77±0.47 38.46±1.36 3.40±0.77 2.00±0.44 TL2 30.94±1.13 8.70±0.54 39.64±1.95 3.55±0.94 1.72±0.34 WT:wildtobacco;TL1andTL2:diferentlinesoftransgenictobacco;Valuesaremeans±SD(n=3); and :1% and5% significant levelrespectively
58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.42013 2.5 转 AtCAO AtHEMA1 基因促进弱光下烟草的生长发育弱光下, 转 AtCAO AtHEMA1 基因烟草株系 TL1 和 TL2 的株高分别比野生烟草增加 23% 和 58%, 达到了差异显著水平 ( 图 4a 图 4b) 另外, 转基因烟草株系 TL1 TL2 的现蕾期, 分别比野生烟草提前 20d 和 10d 可见, 弱光处理后, 转基因烟草的生长与发育均较野生型烟草快, 显示出耐弱光的特性 图 4 弱光对转基因烟草生长的影响 Fig.4 Efectsoflowlightonthegrowth oftransgenictobacco (a) Theheightoftransgenictobaccounderlow light (b) TransgenictobaccoTL1underlow light (c)transgenictobacco TL2underlowlight 3 讨论 叶绿素是植物体内参与光合作用的重要色素, 其合成主要包括 4 个阶段 :(1)ALA 的合成 ;(2)Mg 2+ 螯合 ;(3) 原叶绿素酸酯演化成叶绿素酸酯 ;(4) 叶绿素合成 其中,ALA 的合成是叶绿素形成途径中的限速步骤, 而叶绿素酸酯 a 既可在叶绿素合成酶作用下形成叶绿素 a, 也可在叶绿素酸酯 a 氧化酶 (CAO) 作用下形成叶绿素酸酯 b, 再经过叶绿素合成酶作用形成叶绿素 b [16], 表明这两个酶在叶绿素 a 和 b 合成中起着重要作 [17] 用 Hota 等用低浓度外源 ALA 可提高绿萝试管苗叶片光合速率, 而且类似结果在菠菜 甜瓜 白菜 草莓 西瓜 烟草等植物上也得到证实 [7 8] 弱光处理后, 烟草利用 ALA 合成亚铁血红素, 提高 POD 和 CAT 酶的活性, 从而增强植株对弱光的耐受性 [18 21] Tanaka [22] 等发现拟南芥叶绿素 a/b 比值与 AtCAO 的 mrna 表达水平相关, 超表达该基因证实可促进叶绿素 b 合 [23] 成 Gopal 等将该基因导入烟草基因组, 经弱光处理后, 发现转基因烟草株系 S2 的叶绿素 b 含量比野生烟草增加 16%, 叶绿素 a/b 比值下降 20%, 株系 S1 只有叶绿素 b 含量稍微增加, 叶绿素 a/b 比值却明显增加 本研究将 AtHEMA1 和 AtCAO 基因同时导入烟草后发现, 转基因株系 TL1 和 TL2 的叶绿素 b 含量增加, 叶绿素 a/b 比值降低, 尤其是 50~60μmol m 2 s 1 弱光照处理后, 叶绿素 b 含量比野生烟草增加 16% ~17%, 叶绿素 a/b 比值比野生烟草降低 9% ~12%, 两者均达到差异极显著水平 (P<0.01)( 表 2), 表明 AtCAO 转基因得到了表达并发挥了促进叶绿素 b 合成的功能, 但叶绿素总量与野生型相比, 差异不显著, 推测或因 AtHEMA1 基因的作用不明显, 或因叶绿素合成的中间阶段中还存在其他限速酶 我们目前正在分析 AtHEMA1 和 AtCAO 在转基因烟草中的表达水平以及导入其他基因来证实这一问题 本研究的转基因烟草株系 TL1 和 TL2 经 25~30 μmol m 2 s 1 弱光照处理 50d 后, 在叶绿素和光合指标上与野生烟草的差异不显著, 而且均不及 50~60 μmol m 2 s 1 弱光光照处理 50d 后的结果 ( 表 2), 表明两个外源基因可能只在较强弱光下发挥作用, 而在接近光补偿点的弱光下, 其功能有限, 不能有效地提升光合性能 这也表明, 如果要有效地增强转基因烟草的耐弱光性, 有必要导入更多增强叶绿素合成的基因 本研究转基因烟草株系 TL1 和 TL2 的光合作用在 25~30μmol m 2 s 1 耐光照处理 50d 后比野生烟草增加 12% ~32%,50~60μmol m 2 s 1 耐光照处理 50 d 后比野生烟草增加 42% ~65%, 且后者达到显著水平 ( 表 2); 转基因烟草比野生烟草株高显著增加 ( 图 4), 更早开花进入生殖生长 ; 表明转基因烟草的光合作用得到增强后, 净光合产物积累较多, 促进了生长发育, 因而推测 AtHEMA1 和 AtCAO 基因在用于其它作物的耐弱光改良上可能会发挥作用 参考文献 [1] 陈青君, 张福墁, 王永健, 等. 黄瓜对低温弱光反应的生理特征
2013,33(4) 李翠萍等 : 拟南芥 AtCAO 和 AtHEMA1 基因共表达载体的构建及转烟草研究 59 研究. 中国农业科学,2003,36(1):77 81. ChenQJ,ZhangFM,WangYJ,etal.Studiesofphysiologic characteristicsofreactionofcucumbertolowtemperatureandpoor light.scientiaagriculturasinica,2003,36(1):77 81. [2] 艾希珍, 郭延奎, 马兴庄, 等. 弱光条件下日光温室黄瓜需光特性及叶绿体超微结构. 中国农业科学,2004,37(2):268 273. AiXZ,GuoYK,MaXZ,etal.Photosyntheticcharacteristics andultrastructureofchloroplastofcucumberunderlow light intensityinsolargreenhouse.scientiaagriculturasinica,2004, 37(2):268 273. [3]BarkeyKO,WelsR.Responseofsoybeanphotosynthesisand chloroplastmembranefunctiontocanopydevelopmentandmutual shading.plantphysiology,1991,97:245 252. [4] Von Wetstein D,Gough S, Kananagara C G.Chlorophyl biosynthesis.plantcel,1995,7:1039 1057. [5] 孙永平, 张治平, 徐呈祥, 等.5 氨基乙酰丙酸处理对低温下西瓜叶片快速叶绿素荧光诱导曲线的影响. 园艺学报,2009,36 (5):671 678. SunYP,ZhangZP,XuCX,etal.EfectofALA onfast chlorophylfluorescenceinductiondynamicsofwatermelonleaves underchilingstres.actahorticulturasesinica,2009,36(5): 671 678. [6] TanakaR, YeshidaK, NakayashikiT, eta1. Diferential expresion oftwo hema mrnas encoding glutamyl trna reductase proteins in greening cucumber seedlings. Plant Physiology,1996,110:1223 1230. [7] 汪良驹, 姜卫兵, 章镇, 等.5 氨基乙酰丙酸的生物合成及生理活性及其在农业中的潜在应用. 植物生理学通讯,2003,39 (3):185 192. WangL J, Jiang W B, Zhang Z, etal.biosynthesisand physiologicalactivitiesof5 aminolevulinic acid(ala)and its potentialapplicationinagriculture.plantphysiology,2003,39 (3):185 192. [8]LlangLL,KumarA M,SolD.Lightregulationofchlorophyl biosynthesis at the level of5 aminolevulinate formation in Arabidopsis.PlantCel,1994,6(2):265 275. [9] KumarA M, CsanlankovszkiG, Sold D. A second and diferentialy expresed glutamyl trna reductase gene from Arabidopsisthaliana.PlantMo1ecularBio1ogy,1996,30(3): 4l9 426. [10]MccormacA C,FischerA,KumarA M,etal.Regulationof HEMA1expresionbyhytochromeandaplastidsignalduringde etiolationinarabidopsisthaliana.plantjournal,2001,25:549 561. [11] EckhardtU,Grimm B,HortensteinerS.Recentadvancesin chlorophylbiosynthesisandbreakdowninhigherplants.plant Mo1Bio1,2004,56:1 14. [12] UlrikeOster, RyouichiK, AyumiK, eta1. Cloningand functionalexpresionofthegeneencodingthekeyenzymefor chlorophylbbiosynthesis(cao) from Arabidopsisthaliana. PlantJ,2000,21(3):305 310. [13] 李潇, 李翠萍, 陈吉裕, 等. 拟南芥 AtHEMA1 基因的克隆与其表达载体的构建. 南方农业,2011,5(5):10 14. LiX,LiCP,ChenJY,eta1.CloningofAtHEMA1geneand construction of its plant expresion vector, South China Agriculture,2011,5(5):10 14. [14]HorschRB,FryJE,HofmanNL,eta1.Asimpleandgeneral methodoftransferinggenesintoplants,science,1985,227: 1229 1231. [15] 国家烟草专卖局. 烟草农艺性状调查方法 (YC/T142). 北京 : 中国标准出版社,1998. StateTobaccoMonopolyAdministration.InvestigationMethodsof AgronomicalCharacterofTobacco(YC/T142).Beijing:China StandardPres,1998. [16] 吴自明, 张欣, 万建民. 叶绿素生物合成的分子调控. 植物生理学通报,2008,44(6):1064 1070. WuZM,ZhangX,WanJM.Molecularregulationofchlorophyl biosynthesis.plantphysiologycommunications,2008,44(6): 1064 1070. [17]HotaY,TanakaT,Takaoka,H,etal.Newphysiologicalefects of 5 aminolevulinic acid in plants: The increase of photosynthesis, chlorophyl content, and plant growth. Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,1997,61:2025 2028. [18] 康琅, 程云, 汪良驹, 等.5 氨基乙酰丙酸对秋冬季大棚西瓜叶片光合作用及抗氧化酶活性的影响. 西北植物学报,2006,26 (11):2297 2301. KangL,ChengY,WangLJ,eta1.Efectsof5 aminolevulinic acid(ala) onthephotosynthesisandanti oxidativeenzymes activitiesoftheleavesofgreenhousewatermeloninsummerand winter.actabotboreal occidentsin,2006,26:2297 2301. [19] 汪良驹, 姜卫兵, 黄保健.5 氨基乙酰丙酸对弱光下甜瓜幼苗光合作用和抗冷性的促进效应. 园艺学报,2004,31(3):321 326. WangLJ,JiangW B,HuangBJ.Promotionofphotosynthesis by5 aminolevulinicacid(ala)duringandafterchilingstresin melon seedlings grown under low light condition. Acta HorticulturaeSin,2004,31(3):321 326. [20] 汪良驹, 石伟, 刘晖, 等. 外源 5 氨基乙酰丙酸处理对小白菜叶片的光合作用效应. 南京农业大学学报,2004,27(2):34 38. WangL J,ShiW, Liu H, etal. Efectsofexogenous5 aminolevulinicacidtreatmentonleafphotosynthesisofpak choi. JournalofNanjingAgriculturalUniversity,2004,27(2):34 38.
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