Real-time PCR 原理

Real-time PCR Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology

Real-time PCR 原 理 数 学 原 理 化 学 原 理 Real-time PCR 应 用 绝 对 定 量 相 对 定 量 等 位 基 因 分 型 阴 阳 性 判 定 microrna

荧 光 定 量 PCR 数 学 原 理 基 线 阈 值 Ct 值 [DNA] 0

同 时 扩 增 96 的 相 同 样 品 的 结 果 由 于 PCR 扩 增 效 率 的 差 异 使 得 相 同 的 样 品 扩 增 结 果 存 在 很 大 的 差 异

扩 增 曲 线 : 四 个 阶 段 线 性 图 谱 对 数 图 谱 平 台 期 线 性 增 长 期 指 数 增 长 期 基 线 期 平 台 期 线 性 增 长 期 指 数 增 长 期 基 线 期

基 线 阈 值 Ct 值 [DNA] 0 什 么 是 基 线? 基 线 就 是 扩 增 曲 线 中 的 水 平 部 分 线 性 图 谱 对 数 图 谱

基 线 阈 值 Ct 值 [DNA] 0 什 么 是 阈 值? 1. 基 线 ( 空 白 ) 信 号 的 产 生 是 由 于 测 量 的 偶 然 误 差 引 起 的 2. 偶 然 误 差 的 结 果 满 足 对 数 分 布 3. 阈 值 = 基 线 ( 背 景 ) 信 号 标 准 偏 差 x 10 4. 由 于 测 量 的 偶 然 误 差 而 导 致 测 得 的 荧 光 信 号 大 于 阈 值 的 概 率 小 于 10-5 5. 当 荧 光 信 号 大 于 阈 值 时, 可 以 肯 定 是 由 于 PCR 的 扩 增 使 得 荧 光 强 度 得 以 测 量

什 么 是 C T 值? 基 线 阈 值 Ct 值 [DNA] 0 从 基 线 到 指 数 增 长 的 拐 点 所 对 应 的 循 环 次 数 线 性 图 谱 对 数 图 谱 C T 值 C T 值

为 什 么 C T 值 [DNA] 0? N = N 0 x (1+e) n N: 产 物 分 子 数 ;N 0 : 起 始 分 子 数 e: 扩 增 效 率 ; n: 循 环 次 数 PCR 理 论 方 程 只 在 指 数 期 成 立 线 性 期 lg [DNA] 指 数 期 y = x(1+e) n 循 环 数

为 什 么 C T 值 [DNA] 0? R n = R B + X 0 (1+ e) n R s 第 n 次 PCR 循 环 时 的 荧 光 信 号 强 度 (R n ) 等 于 背 景 信 号 强 度 (R B ) 加 上 每 个 分 子 的 荧 光 强 度 ( 即 单 位 荧 光 强 度,R S ) 与 分 子 数 目 的 乘 积 设 n=c T, 则 : R CT = R B + X 0 (1+ e) CT R s lg (R CT -R B ) = lg X 0 + C T lg (1+ e) + lg R s C T lg (1+ e) = - lg X 0 + lg (R CT -R B ) lgr s C T = log X O log(1 + E X ) + log( R T R B log(1 + E ) log R X ) S 即 C T = - k lg X 0 + b ( 线 性 方 程 )

标 准 曲 线 :C T 值 对 [DNA] 0 作 图 C T 值 C T = - k lgx 0 + b lg [ 起 始 DNA]

成 功 的 定 量 PCR

荧 光 定 量 PCR 化 学 原 理

SYBR Green I 作 用 机 理

数 量 关 系 1. 每 形 成 一 个 DNA 双 链, 就 有 一 定 数 量 的 染 料 结 合 上 去 2. 染 料 一 结 合, 就 产 生 荧 光 信 号 3. 信 号 强 度 与 DNA 分 子 总 数 目 成 正 比

TaqMan 探 针 的 FRET TaqMan Probe E R E Q E E R Q

TaqMan 作 用 机 理

数 量 关 系 3 上 游 引 物 R TaqMan 探 针 Q 5 5 3 下 游 引 物 R 3 5 Q 5 3 1. 每 产 生 一 条 DNA 链, 就 切 断 一 条 探 针 2. 每 切 断 一 条 探 针, 就 产 生 一 个 单 位 信 号 3. 信 号 强 度 与 结 合 探 针 的 DNA 分 子 数 成 正 比

Real-time PCR 应 用

绝 对 定 量 (Absolute Quantification,AQ) 病 原 体 检 测 转 基 因 食 品 检 测 基 因 表 达 研 究 相 对 定 量 (Relative Quantification,RQ) 基 因 在 不 同 组 织 中 的 表 达 差 异 药 物 疗 效 考 核 耐 药 性 研 究 等 位 基 因 分 型 (Allelic Discrimination,AD) 基 因 突 变 分 析 SNP 研 究 物 种 鉴 定 菌 株 鉴 定 阴 性 阳 性 鉴 定 (Plus/Minus with IPC,+/-)

实 时 PCR 分 析 绝 对 定 量 相 对 定 量 根 据 标 准 曲 线 提 供 数 量 测 量 提 供 精 确 的 起 始 材 料 相 对 数 量 差 异

绝 对 定 量 与 相 对 定 量 的 定 义 绝 对 定 量 分 析 用 于 确 定 未 知 样 本 中 某 个 核 酸 序 列 的 绝 对 量 值, 即 通 常 所 说 的 拷 贝 数 相 对 定 量 用 于 测 定 一 个 测 试 样 本 中 目 标 核 酸 序 列 与 校 正 样 本 中 同 一 序 列 表 达 的 相 对 变 化 校 正 样 本 可 以 是 一 个 未 经 处 理 的 对 照 或 者 是 在 一 个 时 程 研 究 中 处 于 零 时 的 样 本

绝 对 定 量 : 从 荧 光 到 拷 贝 数 The well contains 400 target copies Y= mx+b Ct s Ct values 0 1 2 3 4 5 6 7 Log copy number

相 对 定 量 : 参 照 因 子 Calibrator 用 以 比 较 结 果 的 基 准 t =0 t=12 t=24 t=48 time total RNA total RNA total RNA total RNA cdna cdna cdna cdna

相 对 定 量 : 内 对 照 Endogenous Control 用 以 标 准 化 样 品 操 作 t =0 t=12 t=24 t=48 time total RNA total RNA total RNA total RNA cdna cdna cdna cdna

IL-2 18S ΔC t ΔΔC t 2 -ΔΔCt T=0 (calibrator) 24 9 15 0 1.0 T=1hr 24 10 14-1 2.0 T=6hr 23 11 12-3 8.0 T=24hr 28 10 18 3 0.1 Relative Quantity of Expression 10 8 6 4 2 1 2.0 8.0 0.1 t = 0 t = 1 h t = 6 h t = 24 h 0

相 对 定 量 研 究 软 件 同 时 分 析 多 达 10 块 反 应 板 的 基 因 表 达 数 据 多 至 960 个 数 据 点 的 单 击 分 析 数 据 直 观 通 过 ΔΔC T ( 比 较 Ct) 法 完 全 自 动 分 析 数 据 无 须 将 数 据 导 出 至 电 子 数 据 表 或 多 次 数 据 导 出

终 点 检 测 等 位 基 因 分 型 阴 性 阳 性 鉴 定 突 变 的 存 在 形 式 目 标 序 列 的 有 无

等 位 基 因 分 型 定 义 : 等 位 基 因 分 型 (AD) 分 析 是 一 种 多 重 ( 每 个 反 应 包 括 一 个 以 上 的 引 物 和 探 针 对 ) 终 点 ( 在 PCR 过 程 的 终 点 收 集 数 据 ) 分 析 实 验, 用 于 检 测 某 个 核 酸 序 列 的 变 异 每 个 反 应 中 包 括 两 个 引 物 和 探 针 对, 允 许 在 一 个 目 标 模 板 序 列 的 单 核 苷 酸 多 态 性 (SNP) 位 点 上 出 现 两 个 可 能 的 变 异 基 因 型 目 标 序 列 的 实 际 量 不 确 定

正 常 与 突 变 探 针 在 同 一 管 里 反 应 的 点 突 变 检 测

基 因 分 型 检 测 FAM VIC Homozygote for FAM-specific allele VIC FAM Homozygote for VIC-specific allele FAM VIC Heterozygote for both alleles

等 位 基 因 自 动 识 别 软 件 加 速 数 据 分 析 等 位 基 因 分 组 识 别 每 一 个 孔 的 质 量 评 分 用 户 自 定 义 的 质 量 评 分 标 准 基 于 每 一 个 标 记 的 识 别 限 制 用 户 的 主 观 干 扰

阴 性 阳 性 鉴 定 定 义 : 阳 性 / 阴 性 实 验 是 一 种 终 点 分 析, 它 可 以 确 定 某 个 样 本 中 是 ( 阳 性, 用 加 号 表 示 ) 否 ( 阴 性, 用 减 号 表 示 ) 存 在 一 个 特 异 性 目 标 序 列 在 终 点 分 析 中, 数 据 是 在 PCR 过 程 结 束 时 获 得 的 什 么 是 IPC?IPC 是 一 种 阳 性 内 对 照, 它 被 用 在 阳 性 / 阴 性 实 验 中, 用 于 监 测 PCR 过 程 并 确 定 阴 性 结 果 不 是 因 为 PCR 失 败 而 造 成,IPC 包 括 一 个 模 板 一 组 引 物 和 一 个 荧 光 标 记 (VIC) 的 探 针, 被 加 到 反 应 板 的 每 一 个 孔 中

阴 性 结 果 示 例

阳 性 结 果 示 例

microrna MicroRNA(miRNA) 是 一 种 22 个 碱 基 左 右 的 内 源 性 单 链 小 分 子 RNA 由 带 茎 环 结 构 的 双 链 RNA 前 体 剪 切 而 成 具 有 高 度 保 守 性 时 序 性 和 组 织 特 异 性 通 过 与 特 异 mrna 结 合, 抑 制 目 标 基 因 表 达 或 降 解 mrna

mirna Expression 1. Transcription 2. Hairpin release in the nucleus 3. Export to cytoplasm 4. Dicer processing 5. Strand selection by RISC 6. Translational repression *mature active strand

Mechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation

为 何 研 究 mirna? mirna 已 被 确 认 为 一 类 新 的 基 因 调 控 因 子, 参 与 了 细 胞 的 发 育 分 化 和 联 络 对 mirna 功 能 的 研 究 将 有 助 于 设 计 sirna 干 扰 实 验 mirna 有 可 能 成 为 新 的 生 物 分 子 标 记 有 重 要 的 临 床 应 用 价 值

mirna 分 析 的 技 术 挑 战 Northern Blot ( 杂 交 法 ) Homegrown technology and easy to access ( 易 于 操 作 ) Large sample amount requirement (ug scale) ( 需 大 量 样 品 ) Low dynamic range (two orders of magnitude) ( 可 测 范 围 低 ) Mismatch hybridization often cannot distinguish well between mirnas that only have small sequence differences ( 错 配 杂 交 问 题 ) Precursor mirna Mature mirna Microarrays ( 芯 片 法 ) High throughput ( 高 产 出 ) Improved dynamic range ( 可 测 范 围 较 宽 ) Large sample RNA requirement, approximately 5 µg per array ( 需 大 量 样 品 ) Difficult or impossible to distinguish between the Pre-miRNA and mirna ( 很 难 区 分 前 体 mirna and 成 熟 mirna) Do not distinguish well between mirnas that have only small differences in sequence. ( 对 类 似 结 构 的 mirna 分 辨 率 差 ) Quantitative Real-Time PCR ( 实 时 定 量 PCR) Dramatically less sample requirement ( 只 需 微 量 样 品 ) Significantly wide dynamic range (7 logs) ( 非 常 宽 的 可 测 范 围 ) High sensitivity and specificity ( 高 灵 敏 度, 高 特 异 性 ) However, how to design a TaqMan real-time PCR assay on a ~22 base polynucleotide fragment? ( 但 是, 如 何 设 计 这 样 一 个 靶 物 只 有 22 个 碱 基 TaqMan real-time PCR?) Solution: TaqMan MicroRNA PCR Assays

Workflow mirvana mirna Isolation Kit TaqMan MicroRNA RT kit TaqMan MicroRNA Assays TaqMan Universal Master Mix,No UNG

Five Fully Integrated Systems for Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System

mirvana mirna Isolation Kit 专 业 高 效 回 收 小 分 子 RNA 富 集 小 于 200 nt RNA, 提 高 下 游 试 验 灵 敏 度 方 便 快 捷,30 分 钟 完 成 整 个 过 程 理 想 的 mirna, sirna, shrna, and snrna 分 析 试 剂 盒 适 合 各 种 组 织 和 细 胞 材 料

mirna cdna Forward primer RT primer Step 1: Stem-loop RT Step 2: Real-time PCR TaqMan MicroRNA Assays Four oligos per mirna 1. RT primer 2. Forward primer 3. Reverse primer 4. TaqMan probe Two enzymes required 1. Reverse transcriptase 2. AmpliTaq Gold DNA Polymerase Q F TaqMan probe Reverse primer

发 夹 状 引 物 的 反 转 录 mirna 分 析 高 度 的 重 现 性 mir-16 let-7a mir-20 mir-324-5 4 mirnas 个 样 本,16 个 重 复, 2 名 操 作 者 的 实 验 中 平 均 标 准 方 差 : 0.1 定 量 结 果 偏 差 : 0.6%

TaqMan Universal Master Mix 实 验 证 明 可 以 达 到 7 个 数 量 级 的 线 性 范 围

TaqMan Array Human MicroRNA Panel New release 快 速, 高 效 的 mirna 分 析 方 法 同 时 检 测 多 达 365 个 mirna

mirna 定 量 PCR 相 关 应 用 转 录 后 基 因 调 控 研 究 细 胞 分 化 及 神 经 信 号 传 导 临 床 应 用 : 疾 病 诊 断 及 治 疗 耐 药 性 研 究 基 因 疾 病 治 疗 新 生 物 标 志 的 发 现

Primer Express 目 前 世 界 上 唯 一 专 业 用 于 设 计 定 量 引 物 和 探 针 的 软 件 随 机 配 送

TaqMan Gene Expression Assays Over 700,000 assays designed to Human Arabidopsis Mouse Drosophila Rat C. elegans Canine Rhesus Macaque A single tube contains Forward Primer Reverse Primer TaqMan probe Optimized at a 20x concentration

代 客 设 计 合 成 TaqMan 基 因 表 达 试 剂 盒 对 于 任 何 物 种 或 生 物 体 适 用 用 户 确 定 目 标 序 列 以 方 便 的 单 管 形 式 供 货

SNP 基 因 分 型 分 析 试 剂 盒 超 过 4,500,000 个 预 先 设 计 好 的 人 和 小 鼠 的 全 基 因 组 试 剂 盒, 代 客 合 成 MicroRNA 分 析 试 剂 盒 人 小 鼠 大 鼠 拟 南 芥 果 蝇 和 线 虫 药 物 代 谢 分 析 试 剂 盒 2,400 个 药 物 代 谢 相 关 的 高 多 态 性 位 点, 涵 盖 220 个 药 物 代 谢 酶 转 运 蛋 白 基 因

病 原 体 检 测 试 剂 盒 沙 门 氏 杆 菌 单 核 细 胞 增 多 性 李 斯 特 菌 李 斯 特 杆 菌 大 肠 杆 菌 流 感 病 毒 检 测 试 剂 盒 流 感 病 毒 A 型 /H5 亚 型 检 测 试 剂 盒 转 基 因 检 测 试 剂 盒 大 豆 和 玉 米 的 转 基 因 检 测 试 剂 盒

谢 谢! ABI Real-time PCR