荧 光 定 量 PCR 技 术 的 原 理 与 应 用 张 晓 辉 张 晓 辉 PCR 产 品 经 理 北 京 元 业 伯 乐 科 技 发 展 有 限 公 司
提 纲 荧 光 定 量 PCR 技 术 原 理 荧 光 化 学 物 质 简 介 定 量 PCR 技 术 延 伸 基 因 分 型 (SNP) 检 测 熔 解 曲 线 分 析 荧 光 定 量 PCR 技 术 应 用
常 规 PCR 技 术 : 常 规 PCR PCR 后 借 助 电 泳 对 扩 增 反 应 的 终 产 物 进 行 定 量 及 定 性 分 析 S1 S2 M
常 规 PCR 常 规 PCR 结 合 电 泳 分 析 方 法 的 缺 点 只 能 对 终 产 物 进 行 分 析, 无 法 对 起 始 模 板 准 确 定 量 必 须 在 扩 增 反 应 结 束 后 借 助 电 泳 方 法 分 析, 费 时 费 事 无 法 对 扩 增 反 应 实 时 检 测 EB 有 毒
定 量 PCR 技 术 : 定 量 PCR 利 用 荧 光 信 号 的 变 化 实 时 检 测 PCR 扩 增 反 应 中 每 一 个 循 环 扩 增 产 物 量 的 变 化, 通 过 Ct 值 和 标 准 曲 线 实 现 对 起 始 模 板 的 定 量 分 析 IQ5 Real-time PCR 仪
PCR 反 应 混 合 物 荧 光 物 质 Mg 2+ Mn 2+ dctp dgtp dutp datp 或 Taq DNA 多 聚 酶 模 板 DNA 引 物 缓 冲 液
荧 光 曲 线 随 着 PCR 反 应 的 进 行, 扩 增 产 物 不 断 累 积, 荧 光 信 号 强 度 不 断 增 加 每 经 过 一 个 循 环, 收 集 一 次 荧 光 强 度 信 号, 得 到 一 条 荧 光 扩 增 曲 线 图
定 量 原 理 如 何 对 起 始 模 板 定 量? 通 过 Ct 值 和 标 准 曲 线 实 现 对 起 始 模 板 的 定 量 分 析 引 入 两 个 概 念 : 荧 光 阈 值 Ct 值
荧 光 阈 值 定 量 原 理 在 荧 光 扩 增 曲 线 指 数 增 长 期 设 定 一 个 荧 光 强 度 标 准 ( 即 PCR 扩 增 产 物 量 的 标 准 ) 阈 值 线
定 量 原 理 Ct 值 的 概 念 Ct 值 的 定 义 是 PCR 扩 增 过 程 中, 扩 增 产 物 ( 荧 光 信 号 ) 到 达 阈 值 时 所 经 过 的 扩 增 循 环 次 数 阈 值 线 C(t) 值 C(t) 值 18.12 +/ - 0.04
定 量 原 理 确 定 初 始 模 板 的 浓 度 Log 浓 度 与 循 环 数 呈 线 性 关 系 初 始 模 板 量 越 多, 扩 增 产 物 达 到 某 一 值 ( 域 值 ) 时 所 需 要 的 循 环 数 越 少
定 量 原 理 理 想 的 PCR 反 应 : X=X 0 *2 n 非 理 想 的 PCR 反 应 : X=X 0 (1+Ex) n n: 扩 增 反 应 的 循 环 次 数 X: 第 n 次 循 环 后 的 产 物 量 X 0 : 初 始 模 板 量 Ex: 扩 增 效 率
在 扩 增 产 物 达 到 阈 值 线 时 : X E) Ct =X 0 (1+Ex) Ct =N (1) X Ct : 荧 光 扩 增 信 号 达 到 阈 值 强 度 时 扩 增 产 物 的 量. 在 阈 值 线 设 定 以 后, 它 是 一 个 常 数, 我 们 设 为 N. 方 程 式 (1) 两 边 同 时 取 对 数 得 : log N=log X 0 (1+Ex) Ct (2) 整 理 方 程 式 (2) 得 : log X 0 = - log(1+ex) *Ct+ log N (3) 定 量 原 理 Log 浓 度 与 循 环 数 呈 线 性 关 系, 根 据 样 品 扩 增 达 到 域 值 的 循 环 数 就 可 计 算 出 样 品 中 所 含 的 模 板 量
10 8 Real time PCR
10 8 10 6 Real time PCR
10 8 10 6 10 4 Real time PCR
Real time PCR 10 8 10 6 10 4 10 2
Real time PCR 10 8 10 6 10 4 10 2 T 11.1 17.7 24.6 31.9
Real time PCR
Real time PCR 10 8 10 6 10 4 10 2 T
Real time PCR 10 5 copies/well
如 何 定 量 定 量 原 理 : 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数 的 标 准 样 品 作 出 标 准 曲 线, 通 过 未 知 样 品 的 Ct 值, 从 标 准 曲 线 上 计 算 出 该 样 品 的 起 始 浓 度 未 知 10 6 10 5.104 10 3 10 2 10 荧 光 强 度 --- 循 环 数 曲 线 初 始 模 板 量 对 数 ---C(T) 循 环 数 标 准 曲 线
如 何 定 量 首 先 确 定 未 知 样 品 的 C(t) 值 借 助 标 准 曲 线 由 未 知 样 品 的 C(t) 值 反 推 出 其 初 始 量 unknown 10 4 10 3 Unknown contains 3108 copies
与 传 统 PCR 的 比 较 实 现 了 初 始 模 板 的 绝 对 定 量 检 测 灵 敏 度 高 可 以 检 测 到 低 拷 贝 的 目 的 基 因 可 以 区 分 微 小 的 拷 贝 数 差 异 可 以 对 初 始 模 板 含 量 差 异 较 大 的 样 品 同 时 定 量 省 时 省 力 检 测 设 计 灵 活
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荧 光 化 学 染 料 - SYBR Green I - EvaGreen 探 针 - Molecular Beacons - TaqMan
SYBR Green 1 SYBR Green I
SYBR Green I 工 作 原 理 SYBR Green 1 结 合 到 双 链 DNA 的 小 沟 部 位 G C G A C T G C A T T T G G C C C C C C C A A A G G G T G A T A G C A T C G T A SYBR Green 1 染 料 结 合 状 态 时 荧 光 强 度 是 非 染 料 结 合 状 态 时 荧 光 强 度 是 非 结 合 状 态 的 800-1000 倍
SYBR Green I 工 作 原 理
SYBR Green I 工 作 原 理
SYBR Green I 工 作 原 理
SYBR Green I 工 作 原 理
SYBR Green I 优 点 使 用 方 便 --- 不 必 设 计 复 杂 的 荧 光 探 针 没 有 序 列 特 异 性 --- 可 以 用 于 不 同 的 模 板 便 宜 灵 敏
与 非 特 异 性 产 物 结 合 SYBR Green I 缺 点
TaqMan TaqMan 探 针 荧 光 素 淬 灭 剂 水 解 型 杂 交 探 针
TaqMan 目 标 特 异 性 探 针 5 为 荧 光 素, 3 为 淬 灭 剂 5 荧 光 素 3 淬 灭 剂 与 目 标 序 列 互 补
TaqMan
TaqMan
TaqMan
TaqMan
TaqMan 优 点 对 目 标 序 列 有 很 高 的 特 异 性 --- 特 别 适 合 于 SNP 检 测 与 Molecular Beacons 相 比 设 计 相 对 简 单
TaqMan 缺 点 价 格 较 高 只 适 合 于 一 个 特 定 的 目 标 不 能 进 行 融 解 曲 线 分 析 背 景 高
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SYBR Green I 融 解 曲 线 分 析 Fluorescence decreases Tm Temperature increases Graph fluorescence intensity vs. temperature Decreasing fluorescence recorded - Due to increasing temperature - Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curve
SYBR Green I 融 解 曲 线 分 析 -di dt T m 荧 光 强 度 的 倒 数 取 负 数 后 对 温 度 作 图 (-di/dt)
产 物 特 异 性 分 析 10,000 copies 目 的 产 物 非 特 异 性 产 物 10 copies 目 的 产 物
溶 解 曲 线 的 作 用 溶 解 曲 线 分 析 的 主 要 作 用 预 实 验 中 用 于 判 定 产 物 的 纯 度 是 否 存 在 引 物 二 聚 体 和 非 特 异 性 产 物 预 实 验 中 结 合 温 度 梯 度 功 能 用 于 判 定 最 佳 退 火 温 度 基 因 分 型 或 SNP
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SNP 单 点 核 苷 酸 多 态 性 Single Nucleotide Polymorphisms: : 由 DNA 序 列 中 同 一 个 位 置 上 的 碱 基 对 的 插 入 缺 失 转 换 及 颠 换 等 造 成 的 个 体 DNA 序 列 差 异 AACCTGCATAATGCCAG AACCTGCAGAATGCCAG AGAA A
SNP 检 测 - 基 因 型 分 析 用 TaqMan 探 针 进 行 基 因 型 分 析 SNP G/A Forward primer F F G C Q V T Q Reverse primer F G Q Allele-specific probe R V T Q Allele-specific probe
多 色 双 通 道 技 术 应 用 - 基 因 型 分 析 Q Match for Allele 1 Mismatch for Allele 1 Hybridization of TaqMan Probe Reduced Efficiency of Probe Hybridization 5 3 G F Q 3 V 5 C C Digestion of probe - fluorescence NO digestion of probe - NO fluorescence F 5 G C Q 5 3 F V G T Q Q Polymerase
多 色 双 通 道 技 术 应 用 - 基 因 型 分 析 从 病 人 血 液 样 品 中 提 取 DNA 基 因 型 分 类 : A/A (Allele 1) V T Q G/G (Allele 2) F C Q G/A (Heterozygote)
多 色 双 通 道 技 术 应 用 - 基 因 型 分 析 Allele 1 control VIC FAM
多 色 双 通 道 技 术 应 用 - 基 因 型 分 析 Allele 2 control FAM VIC
多 色 双 通 道 技 术 应 用 - 基 因 型 分 析 Heterozygote control FAM VIC
HRM 与 SNP 检 测
HRM 荧 光 染 料 高 浓 度 饱 和 型 的 专 用 DNA 染 料, 对 于 同 源 和 异 源 的 DNA 双 链 核 酸 分 子 可 以 达 到 同 样 均 一 的 染 色 效 果, 而 不 会 抑 制 PCR 扩 增 反 应 的 进 行 Eva Green
SNP Genotyping SNP Class Base Change Typical Tm Shift Rarity y( (in human genome) 1 C/T and G/A Large (>0.5 o C) 64% 2 C/A and G/T 20% 3 C/G 9% 4 A/T Very Small (<0.2 o C) 7% SNP 是 指 基 因 组 水 平 上 由 单 个 核 苷 酸 的 变 异 所 引 起 的 DNA 序 列 多 态 性, 在 群 体 中 的 发 生 频 率 不 小 于 1 % 包 括 单 个 碱 基 的 转 换 颠 换 插 入 和 缺 失 等 所 谓 转 换 是 指 同 型 碱 基 之 间 的 转 换, 如 嘌 呤 与 嘌 呤 ( G2A) 嘧 啶 与 嘧 啶 ( T2C) 间 的 替 换 ; 所 谓 颠 换 是 指 发 生 在 嘌 呤 与 嘧 啶 (A2T A2C C2G G2T) 之 间 的 替 换 依 据 排 列 组 合 原 理,SNP 一 共 可 以 有 6 种 替 换 情 况, 即 A/ G A/ T A/ C C/ G C/ T 和 G/ T, 但 事 实 上, 转 换 的 发 生 频 率 占 多 数, 而 且 是 C2T 转 换 为 主, 其 原 因 是 Cp G 的 C 是 甲 基 化 的, 容 易 自 发 脱 氨 基 形 成 胸 腺 嘧 啶 T, Cp G 也 因 此 变 为 突 变 热 点
Melt Curve Analysis Double D Stranded d DNA Single Stranded Tm
Melt Curve Analysis
信 号 的 归 一 化 处 理 所 有 样 本 熔 解 前 信 号 ( 初 始 荧 光 信 号 ) 和 熔 解 后 信 号 ( 最 终 荧 光 型 号 ) 被 设 置 成 统 一 的, 从 100% 到 0% 间 的 相 对 值
Difference Plot 通 过 扣 除 参 考 峰, 熔 解 曲 线 峰 型 间 的 差 异 被 进 一 步 的 分 析
Cluster Analysis C/C C/T T/T
结 果 分 析 野 生 型 :24 例 杂 合 体 :18 例 突 变 型 :6 例
甲 基 化 研 究 与 HRM
5-methylcytosine 基 因 组 中 2-5% 胞 嘧 啶 被 甲 基 化 碱 基 5 th 对 碱 基 配 对 无 影 响 SAM Mtase SAH Mtase=methyltransferase S-Adenosyl Methionine 腺 苷 甲 硫 氨 酸
Methylation Sites 只 有 CpG 中 G 之 前 的 C 被 甲 基 化 CpG- dinucleotides 在 基 因 组 中 分 布 并 不 均 匀 CpG-islands 中 富 含 CpG CpG-islands 多 位 于 结 构 基 因 启 动 子 的 核 心 序 列 和 转 录 起 始 点
Methylation and PCR Taq 酶 不 区 分 胞 嘧 啶 和 5- 甲 基 化 胞 嘧 啶 PCR 循 环 完 成 之 后, 几 乎 所 有 的 5- 甲 基 化 胞 嘧 啶 将 被 非 甲 基 化 胞 嘧 啶 替 代 未 处 理 的 甲 基 化 的 DNA 在 PCR 后 将 失 去 表 观 遗 传 信 息
重 亚 硫 酸 盐 处 理 经 过 重 (chong) 亚 硫 酸 盐 处 理 未 甲 基 化 的 C 将 变 为 U 甲 基 化 的 C 不 受 影 响 PCR 过 程 中 U 会 被 T 替 代 未 甲 基 化 的 GC 碱 基 对 会 变 为 AT 对, 可 能 会 导 致 扩 增 子 Tm 值 的 变 化 G:C vs A:T
Methylation Assay CDH1 (Cadherin E), 113bp amplicon iq SYBR Green Supermix Methylated gdna diluted with unmethylated gdna
提 纲 荧 光 定 量 PCR 技 术 原 理 荧 光 化 学 物 质 简 介 定 量 PCR 技 术 延 伸 基 因 分 型 (SNP) 检 测 熔 解 曲 线 分 析 荧 光 定 量 PCR 技 术 应 用
实 时 荧 光 定 量 PCR 应 用 总 结 定 量 : 定 性 : DNA 定 量 RNA 定 量 SNP 分 析 基 因 型 分 析
定 量 PCR 应 用 I- 实 时 定 量 DNA 定 量 拷 贝 数 研 究 ( 替 代 Southern Blot) 病 原 体 定 量 检 测 转 基 因 拷 贝 数 的 检 测 RNA 定 量 基 因 表 达 差 异 ( 替 代 Northern Blot) 单 个 或 多 个 基 因 地 表 达 谱 分 析 不 同 组 织 器 官 不 同 时 期 不 同 处 理
基 因 突 变 分 析 单 基 因 遗 传 病 诊 断, 如 血 友 病 地 贫 SNP 扫 描 疾 病 相 关 基 因 鉴 定, 如 牛 皮 癣 哮 喘 相 关 基 因 SNP 的 鉴 定 SNP 检 测 与 临 床 表 现 的 相 关 性, 如 抗 高 血 压 药 物 疗 效 的 个 体 差 异 药 物 副 反 应 的 预 防, 如 麻 醉 意 外 物 种 鉴 定 菌 株 鉴 定 各 种 病 毒, 细 菌, 病 毒 病 原 体 检 测, 如 炭 疽 菌,E coli. O157
建 立 诊 断 标 准 或 利 用 已 有 标 准 诊 断 病 原 微 生 物 的 检 测 ( 替 代 ELISA) 病 原 微 生 物 耐 药 株 的 检 测 医 学 领 域 的 应 用 肿 瘤 标 记 物 的 检 测 ( 包 括 癌 基 因 抗 癌 基 因 肿 瘤 转 移 基 因 及 转 移 抑 制 基 因 癌 胚 抗 原 同 功 酶 抗 体 激 素 细 胞 因 子 受 体 等 ) 肿 瘤 耐 药 基 因 (MDR) 借 助 SNP 检 测, 遗 传 病 诊 断
医 学 领 域 的 应 用 核 酸 水 平 的 病 理 毒 理 研 究 研 究 各 种 处 理 对 细 胞 mrna 含 量 变 化 的 影 响 比 较 染 病 组 织 与 正 常 组 织 中 各 种 mrna 含 量 差 异 DNA 或 RNA 的 转 染 量 与 疾 病 的 研 究 疾 病 进 程 的 研 究
医 学 领 域 的 应 用 药 物 不 同 药 物 处 理 的 比 较 同 一 药 物 不 同 剂 量 的 比 较 同 一 药 物 同 剂 量 不 同 处 理 时 间 疗 效 评 估 愈 后 指 标
感 谢 各 位 光 临!