Real-time PCR專刊-1.pub

Real-Time PCR 專 刊 創 世 紀 生 物 有 限 公 司 網 址 : www.biogenesis.com.tw 服 務 信 箱 : service@biogenesis.com.tw 台 北 02-26558877 台 中 04-22602466 高 雄 07-3422370 花 蓮 03-8463953 竹 南 037-687493

每 個 人 都 值 得 擁 有 一 台 Eco TM Real-Time PCR System 體 積 僅 有 31x35x31cm, 完 全 不 佔 實 驗 室 空 間 48 well 設 計, 符 合 所 有 客 戶 需 求 升 降 溫 速 率 高 達 5.5 o C/sec Block 均 溫 度 業 界 最 佳 (± 0.1 o C at 95 o C) 偵 測 時 間 最 短 Standard Mode:80min; Fast Mode: 40min 內 建 4 channels, 可 偵 測 4 種 不 同 波 長 螢 光 能 進 行 絕 對 定 量 相 對 定 量 SNP Genotyping, 更 內 建 HRM 分 析 模 式 圖 形 化 操 作 介 面, 直 覺 易 上 手 符 合 MIQE 規 範 無 法 比 擬 的 CP 值

新 一 代 溫 控 系 統 Illumina Eco Real-Time PCR System 使 用 真 空 銀 質 block, 內 含 導 熱 性 流 體, 經 流 體 攪 拌 器 帶 動 均 勻 導 熱, 除 了 升 降 溫 速 度 高 達 5.5 o C/sec 外, 更 有 效 的 將 well 均 溫 度 降 低 至 0.1 o C 新 一 代 的 溫 控 系 統 能 使 實 驗 再 現 性 高, 在 HRM 分 析 時 分 辨 SNP Class IV (A/T,Tm<0.2 o C) 的 效 能 更 好 高 速 且 靈 敏 的 光 學 系 統 Channel Excitation Emission Example Fluorescents Detected 1 505-545 nm SYBR Green, FAM LED 1 2 (452-486 604-644 nm ROX, Texas Red, nm) TAMRA LED 2 3 562-596 nm HEX, JOE, TET, (542-582 VIC nm) 4 665-705nm Cy5, Quasar 670 Illumina Eco Real-Time PCR System 使 用 2 組 LED array 作 為 激 發 光 源, 螢 光 訊 號 經 過 4 組 不 同 的 光 學 濾 鏡, 以 高 速 CCD Camera 接 收 並 轉 換 為 螢 光 訊 號, 支 援 SYBR Green FAM VIC HEX ROX Cy5 及 其 他 相 同 波 長 的 螢 光 Eco 的 螢 光 偵 測 速 率 高 達 每 分 鐘 40 detections, 因 此 Melting Curve 只 需 要 3min 即 可 完 成 Sealing tape tool 48 well plate Plate adapter Base with LED backlight Eco Real-Time PCR System 內 附 Eco Dock,Dock 具 有 LED 背 光, 能 讓 sample loading 更 加 便 利 Plate adapter 與 96 well plate 尺 寸 相 同,sample loading 後 可 直 接 移 至 96well plate 離 心 機 排 除 氣 泡 每 個 well 容 量 為 20uL, 建 議 反 應 體 積 為 10~20uL( 最 少 反 應 體 積 為 5uL) 附 sealing tape tool, 封 膜 更 容 易

絕 對 定 量 相 對 定 量 SNP Genotyping HRM Illumina Eco Real-Time PCR System 能 進 行 絕 對 定 量 相 對 定 量 SNP Genotyping 及 HRM, 能 一 次 滿 足 你 所 有 的 需 求 Real-Time PCR 儀 器 性 能 大 車 拼 Idaho LS32 Roche LC Nano Bio-Rad MiniOpticon ABI StepOne / StepOne Plus Thermo PikoReal Illumina Eco ABI 7500 Fast Bio-Rad CFX96 Touch Qiagen RotorGene Q Roche LC480 均 溫 性 ± 0.1 o C ± 0.4 o C ± 0.5 o C ± 0.3 o C ± 0.1 o C ± 1 o C ± 0.4 o C ± 0.02 o C ± 0.4 o C 反 應 時 間 30min <50min ~ 120min <120min <60min 40min <120min ~ 90min 45min ~ 90min chennals 4 2 2 3 / 4 5 4 5 6 6 6 樣 本 數 32 32 48 48 / 96 24 / 96 48 96 96 72 / 100 96/384 HRM include include upgrade include include upgrade include include include Size (Cuft) 1.8 0.53 0.68 1.9 / 2.29 0.76 1.2 2.65 5.05 1.5 7.17 另 有 EcoReal-Time PCR System 體 驗 計 畫, 請 聯 絡 各 區 業 務 代 表

Illumina Eco TM Real-Time PCR System 規 格 儀 器 規 格 加 熱 系 統 單 一 制 冷 片 系 統 ( 液 態 介 質 循 環 控 溫 ) 加 熱 模 組 型 式 搭 配 耗 材 反 應 體 積 加 熱 模 組 溫 控 區 間 溫 度 均 一 性 光 學 系 統 激 發 光 源 螢 光 通 道 (channal) 數 據 收 集 反 應 時 間 (40 cycles) 48 孔 加 熱 模 組 48 孔 反 應 盤 及 光 學 膜 5-20μl 平 均 升 降 溫 速 率 5.5 C/ 秒 35-100 C ± 0.1 C at 95 o C ;± 0.06 C at 60 o C 電 荷 耦 合 元 件 照 相 機 (CCD camera) 2 組 發 光 二 極 體 陣 列 (LED array) 激 發 光 波 長 452-486 nm 及 542-582 nm 四 個 通 道, 發 射 光 濾 鏡 波 長 範 圍 分 別 為 505-545 nm 562-596 nm 604-644 nm 及 665-705 nm, 可 支 援 SYBR Green FAM VIC HEX ROX Cy5 其 他 激 發 光 及 發 射 光 波 長 在 範 圍 內 的 螢 光 染 劑 無 需 設 定 即 可 收 集 整 個 反 應 盤 的 數 據 ( 四 個 濾 鏡 數 據 皆 可 收 集 ) 可 在 反 應 結 束 後 依 數 據 分 析 需 要 更 改 反 應 盤 設 定 Standard Mode: 80min; Fast Mode: 40min 電 力 需 求 電 壓 : 120-240VAC = 10% 頻 率 : 50/60Hz = 1% 最 大 電 流 : 8A 最 大 功 率 需 求 : 500W 一 般 功 率 需 求 : 180W 尺 寸 規 格 關 閉 (W x D x H): 34.5cm x 31cm x 32cm 開 啟 (W x D x H): 34.5cm x 31cm x 36.8cm 重 量 : 13.6kg 軟 體 Eco TM 系 統 軟 體 支 援 絕 對 定 量 相 對 定 量 等 位 基 因 辨 別 (SNP Genotyping) 高 解 析 度 解 離 曲 線 分 析 (HRM) 檔 案 可 輸 出 為 CSV EXCEL PDF 及 PowerPoint 格 式 圖 檔 可 直 接 存 為 BMP JPG 及 PNG 產 品 內 容 物 Eco Instrument NetBook Eco Dock Plate Sealing film

Real-Time PCR 基 本 原 理 及 應 用 介 紹 What is Real-time PCR Real-time PCR, 顧 名 思 義, 可 以 將 之 視 為 兩 個 部 份, 及 Real-time" 和 PCR 藉 由 PCR 擴 增 的 原 理, 使 極 微 量 的 DNA 放 大, 並 經 由 光 學 系 統, 達 到 即 時 偵 測 (Real-time) 的 目 的 ; 經 由 每 一 次 PCR 擴 增 循 環, 將 其 生 成 反 應 產 物 之 螢 光 數 值 記 錄 下 來, 待 反 應 全 部 完 成 之 後, 將 每 個 檢 體 的 cycle number 與 PCR 產 物 的 螢 光 數 值 相 關 位 置 做 圖, 可 得 到 一 反 應 曲 線 圖 形, 完 整 的 呈 現 PCR 反 應 中 每 一 個 cycle 中 PCR 產 物 的 生 成 情 形 PCR vs. Real-time PCR 一 般 的 PCR 反 應, 利 用 熱 循 環 (thermal cycle) 步 驟, 以 熱 穩 定 性 核 酸 聚 合 酶 (ex: Taq) 擴 增 DNA 特 定 片 段, 理 論 上 經 過 30 cycles 的 擴 增 PCR 產 物 為 原 始 量 的 2 30 倍 (>10 9 倍 ), 再 利 用 洋 菜 膠 電 泳 (agarose gel electrophoresis) 進 行 結 果 分 析 我 們 可 以 經 由 產 物 的 片 段 大 小 擴 增 後 產 物 生 成 量 等 等 條 件 來 判 斷 實 驗 結 果 是 否 成 功 又 因 為 我 們 是 分 析 反 應 終 了 後 的 產 物, 對 於 反 應 過 程 並 沒 有 做 任 何 分 析 記 錄, 故 一 般 PCR 反 應 又 可 稱 為 End-point PCR 一 般 的 PCR 反 應 雖 然 可 藉 由 洋 菜 膠 電 泳 分 析, 並 經 由 膠 體 影 像 擷 取 系 統 進 行 分 析, 但 是 電 泳 影 像 常 因 為 DNA 染 劑 的 染 色 效 果 電 泳 膠 體 的 螢 光 背 景 值 影 像 系 統 曝 光 值 設 定 等 因 素, 造 成 每 次 拍 照 條 件 呈 現 的 結 果 無 法 完 全 一 致, 並 使 得 後 續 對 核 酸 定 量 有 相 當 的 誤 差 Real-time PCR 和 End-point PCR 一 樣 是 利 用 熱 循 環 步 驟 使 微 量 DNA 樣 本 進 行 擴 增 達 到 放 大 的 目 的, 但 是 最 後 並 不 是 以 洋 菜 膠 電 泳 進 行 結 果 判 讀, 而 是 在 反 應 中 加 入 DNA Binding Dye 或 是 螢 光 探 針 (Fluorescent Probe), 並 針 對 每 個 cycle 所 產 生 的 螢 光 量 進 行 偵 測 理 論 上 PCR 產 物 隨 著 cycle 增 加, 而 螢 光 數 值 也 伴 隨 著 PCR 產 物 一 起 增 加 ; Real-time PCR 會 紀 錄 每 一 個 PCR cycle 中 螢 光 數 值 的 情 形, 藉 由 分 析 PCR cycle 與 螢 光 數 值 這 兩 個 因 素 之 間 的 相 對 關 係, 來 進 行 實 驗 結 果 的 判 讀 所 以 相 較 於 End-point PCR,Real-time PCR 較 重 視 DNA 樣 本 的 增 幅 過 程, 而 非 擴 增 反 應 最 終 的 產 物 量 a. b. Fig 1. 使 用 175bp amplicon 分 別 進 行 (a)realtime PCR detection ;(b) end-poingt PCR detection (by Agarose gel) 使 用 Agarose gel 分 析 雖 然 可 觀 察 各 組 間 的 差 異, 但 是 只 能 告 知 其 大 約 " 的 差 異 量, 無 法 做 確 實 的 數 據 化 ; 而 real-time PCR 可 經 由 螢 光 偵 測, 及 時 觀 察 PCR amplicon 的 增 幅 情 況, 並 藉 由 Ct value 的 計 算 不 同 sample 間 的 差 異 量

Ct value 在 進 行 Real-time PCR 結 果 分 析 時, 一 定 常 聽 到 Ct value (threshold cycle, 或 稱 為 Cq value Cp value) 這 個 名 詞, 這 是 指 PCR 反 應 樣 本 擴 增 之 生 成 量 能 夠 通 過 閾 值 (threshold) 之 相 對 應 cycle number 由 上 述 的 定 義, 我 們 可 以 發 現, 要 先 定 義 閾 值, 才 可 以 得 到 Ct value 在 一 Real-time PCR 擴 增 曲 線 中, 我 們 在 選 取 閾 值 之 前, 我 們 必 須 要 先 了 解 整 個 PCR 反 應 過 程 中 產 物 生 成 量 的 變 化, 才 能 選 取 適 合 的 閾 值 (threshold value) 來 當 做 我 們 的 定 義 值 Fig.2 Ct value 的 計 算 方 式 一 般 Real-time PCR 的 Ct value 需 要 經 過 數 個 步 驟 計 算 :(a) 決 定 Base-line region ;(b) 計 算 Δ Rn, 也 就 是 將 各 個 cycle 扣 除 base-line 後 的 螢 光 值 ;(c) 決 定 Threshold 經 軟 體 計 算 後,Threshold 與 螢 光 值 交 叉 位 置 所 相 對 應 的 理 論 上,PCR 反 應 是 以 最 佳 效 能 2 n 進 行 擴 PCR cycle 數 值, 即 為 Ct value 增, 若 是 以 擴 增 30 cycles 為 例, 產 物 會 以 2 1 2 2 2 3 2 4 2 30 進 行 對 數 增 加 但 是 實 際 上, 初 期 的 反 應 因 為 DNA 樣 本 數 過 少, 故 無 法 達 到 此 理 論 值 而 後 期 的 反 應, 因 為 酵 素 活 性 降 低 primer 耗 盡 等 種 種 因 素, 導 致 整 個 PCR 反 應 無 法 達 到 最 佳 效 能, 而 無 法 以 對 數 進 行 擴 增 所 以, 整 個 PCR 反 應 只 有 中 段 的 部 分 是 以 理 論 值 進 行 反 應 當 PCR 以 理 論 值 進 行 對 數 擴 增 時, 其 具 有 高 精 確 度 與 高 再 現 性 等 特 徵, 最 能 夠 代 表 PCR cycle 與 生 成 產 物 的 相 對 關 係. 實 務 上, 由 軟 體 紀 錄 而 繪 製 的 曲 線 圖 形 中, 該 如 何 判 斷 哪 個 部 分 為 理 想 中 的 PCR 擴 增 區 段 呢? 我 們 可 以 在 分 析 軟 體 中 以 cycle number 對 fluorescence log value 進 行 做 圖 整 個 圖 形 中 呈 現 直 線 關 係 的 區 段, 卽 表 示 反 應 產 物 以 理 論 值 進 行 對 數 增 加, 我 們 就 可 以 將 " 閾 值 (threshold value)" 定 義 在 此 區 段 即 可 當 產 物 的 生 成 量 達 到 此 threshold value 時, 其 相 對 應 的 cycle number 即 為 Ct value 除 了 利 用 PCR 的 原 理 來 判 斷 Ct value, 目 前 市 面 上 所 販 售 的 Real-time PCR 儀 器, 其 分 析 軟 體 皆 有 auto Ct 之 功 能 以 2nd derivative maximum method 為 例, 軟 體 將 曲 線 圖 形 轉 換 為 數 學 方 程 式 後, 再 利 用 二 次 導 數 過 後 的 結 果 產 生 一 極 大 值, 此 極 大 值 所 對 應 的 cycle number 即 為 Ct value 不 論 是 利 用 PCR 的 原 理 做 為 基 礎 或 是 使 用 auto Ct 來 計 算 Ct value, 均 各 自 有 優 點 及 缺 點, 各 位 可 以 參 考 reference 或 是 實 驗 室 傳 承 下 來 的 經 驗, 來 決 定 最 符 合 實 驗 需 求 的 分 析 方 法 Ct value 與 data 分 析 Real-time PCR 又 稱 做 quantitative PCR(qPCR), 故 實 驗 結 果 主 要 用 來 分 析 同 一 基 因 在 不 同 樣 本 中 之 含 量 試 想, 在 兩 個 不 同 的 樣 本 中 偵 測 同 一 個 基 因, 一 個 所 含 的 copy 數 較 多, 另 一 個 較 少, 在 相 同 擴 增 條 件 下, 那 一 個 樣 本 會 先 進 入 我 們 所 設 定 之 threshold value 呢? 換 句 話 說, 那 一 個 樣 本 擴 增 較 少 的 次 數 之 後 就 可 以 達 到 設 定 之 threshold value 呢? 沒 錯, 樣 本 中 起 始 copy 數 較 多 時, 會 較 快 達 到 threshold value, 故 Ct 值 較 小 ; 換 句 話 說,Ct 值 較 小 的 樣 本, 其 起 始 之 copy 數 越 多 所 以,Ct value 越 小, 起 始 copy 數 越 多,Ct value 越 大, 起 始 copy 數 越 少 要 注 意 的 是, 即 使 Ct value 與 copy 數 是 呈 高 度 負 相 關, 但 是 每 次 的 Real-time PCR Ct value 皆 視 為 一 獨 立 數 據, 並 不 適 合 將 分 屬 兩 次 實 驗 的 Ct Value 進 行 比 較, 最 主 要 原 因 是 每 次 實 驗 的 閾 值 (threshold) 可 依 據 當 時 實 驗 需 求 或 軟 體 判 斷 進 行 調 整, 即 使 放 入 相 同 copy 的 待 測 基 因, 在 兩 次 不 同 的 real-time 實 驗 中 也 會 得 到 不 同 的 Ct value ; 因 此 每 次 real-time PCR 實 驗 都 應 該 視 為 獨 立 數 據, 放 入 相 對 應 的 standard 或 control, 才 能 夠 避 免 被 閾 值 左 右 實 驗 結 果 造 成 誤 判

Real-time PCR 偵 測 模 式 要 如 何 即 時 偵 測 產 物 變 化 量 呢? 當 然 是 偵 測 每 個 cycle 的 螢 光 量 並 進 行 記 錄, 目 前 常 用 的 方 法 可 大 致 分 為 兩 大 類 : DNA binding dye 及 fluorescent probe 分 述 如 下 : DNA binding dye : DNA binding dye 是 利 用 螢 光 物 質 嵌 入 雙 股 DNA, 並 經 由 激 發 偵 測 其 螢 光 量 ; 理 論 上 隨 著 cycle 數 增 加 PCR 產 物 越 多, 嵌 入 PCR 產 物 的 DNA binding dye 也 越 多, 每 個 cycle 能 偵 測 的 螢 光 量 也 會 隨 之 增 加 目 前 市 面 上 最 常 用 於 real-time PCR 的 DNA binding dye 包 括 SYBR Green I 及 EvaGreen, 其 激 發 (excitation) 波 長 為 488~500nm, 散 發 (emission) 波 長 為 517~530 nm, 藉 由 與 雙 股 DNA 結 合 後, 其 螢 光 訊 號 能 增 加 800 倍 以 上 在 PCR 反 應 的 過 程 中, 隨 著 雙 股 DNA 含 量 的 增 加, 與 DNA 結 合 的 DNA binding dye 亦 增 加, 螢 光 訊 號 即 隨 之 增 加 但 是, 需 要 特 別 注 意 一 點,DNA binding dye 與 DNA 的 結 合 為 非 專 一 性, 因 此 只 要 是 primer dimer 或 是 非 專 一 性 產 生 的 PCR 產 物 都 可 能 與 dye 結 合, 因 此 實 驗 前 必 須 先 確 定 primer 對 PCR 產 物 的 專 一 性, 或 是 在 real-time PCR 中 搭 配 melting curve analysis 確 認 是 否 有 2 個 以 上 的 PCR 產 物, 否 則 很 容 易 造 成 real-time data 的 誤 判 Fig.3 DNA binding dye 偵 測 模 式 以 SYBR Green I 為 例, 游 離 的 SYBR Green I 螢 光 訊 號 相 當 微 弱, 但 是 SYBR Green I 嵌 入 雙 股 DNA 後 會 增 加 其 螢 光 訊 號 儀 器 在 每 個 PCR cycle 結 束 時 偵 測 螢 光 值, 隨 著 PCR amplicon 增 加, 能 嵌 入 雙 股 DNA Green I 也 隨 之 增 加, 故 螢 光 訊 號 也 隨 著 PCR amplicon 增 加 而 增 強 常 見 的 DNA binding dye 包 括 SYBR Green I 與 EvaGreen, 兩 者 所 使 用 的 激 發 光 與 散 發 光 波 長 相 近 ( 皆 屬 於 綠 光 ), 在 real-time PCR 儀 器 設 定 上 可 使 用 同 一 個 channel SYBR Green I 與 EvaGreen 都 有 低 背 景 值 的 優 點, 皆 適 用 於 real-time PCR 的 偵 測 ; 但 是 SYBR Green I 具 有 抑 制 PCR 作 用 的 缺 點, 因 此 一 般 的 master mix 中 的 SYBR Green I 含 量 相 當 低, 在 melting curve 分 析 中 只 能 觀 察 是 否 有 primer dimer 或 non-specific PCR product 產 生 EvaGreen 屬 於 最 新 一 代 的 DNA binding dye, 與 SYBR Green I 的 比 較 如 下 : 沒 有 PCR 抑 制 效 果, 與 SYBR Green I 相 比 更 適 用 於 fast real-time PCR, 大 幅 縮 短 反 應 時 間 應 用 於 real-time PCR 的 濃 度 比 SYBR Green I 高, 在 相 同 的 條 件 下 能 獲 得 更 亮 的 螢 光 訊 號 可 用 於 HRM 分 析, 進 行 SNP 分 型 或 其 他 應 用 Fig.4 EvaGreen 未 與 DNA 結 合 前 是 形 成 dimer 不 發 光 的 狀 態 ; 只 有 與 DNA 結 合 才 會 形 成 active form 被 激 發 螢 光

Probe system : 依 據 不 同 的 系 統,probe 又 可 以 分 為 數 種 不 同 的 模 式, 但 是 基 本 的 原 理 為 利 用 PCR 產 物 的 序 列 來 設 計 一 段 互 補 的 核 酸 探 針, 並 在 探 針 上 進 行 螢 光 修 飾, 利 用 FRET (Fluorescence resonance energy transfer, 螢 光 能 量 轉 換 ) 原 理 使 探 針 在 與 PCR 產 物 結 合 後, 造 成 散 發 光 (emission light) 波 長 的 改 變, 隨 著 產 物 的 增 加, 改 變 後 的 散 發 光 強 度 也 隨 之 增 強, 進 而 達 到 及 時 針 測 的 目 的 使 用 探 針 系 統 的 優 勢 是 具 有 較 好 的 專 一 性, 不 用 擔 心 non-specific binding 的 問 題, 且 可 以 藉 由 不 同 的 螢 光 波 長 及 探 針 的 配 合, 對 於 同 一 樣 本 同 時 進 行 多 目 標 偵 測 (multiplex detection); 其 缺 點 為 實 驗 成 本 較 高, 且 需 要 花 費 較 多 的 心 力 對 於 探 針 的 效 能 進 行 確 認 Fig.5 Hydrolysis Probe 偵 測 模 式 Hydrolysis Probe( 或 稱 為 Taqman-style Probe) 是 目 前 最 常 使 用 的 probe detection system 使 用 hydrolysis probe detection 需 要 設 計 forward primer reverse primer 及 probe, 其 中 probe 分 別 在 5`-end & 3'-end 分 別 接 上 reporter dye 及 quencher 依 據 FRET 原 理, 當 reporter dye 與 quencher 距 離 相 近 時,reporter dye 散 發 的 螢 光 會 被 quencher 吸 收 而 無 法 偵 測 如 果 hydrolysis probe 能 夠 正 確 附 著 在 target gene 上,Taq polymerase 上 的 5` 3' exonuclease activity 會 將 此 段 probe 水 解, 使 得 reporter dye 與 quencher 分 離, 並 在 每 個 PCR cycle 結 束 後 偵 測 其 螢 光 值 如 果 target gene 的 PCR amplicon 增 加, 被 水 解 的 probe 也 隨 之 增 加, 相 對 的 偵 測 的 螢 光 值 也 隨 著 cycle 數 增 加 Real-time PCR 分 析 模 式 常 見 的 real-time PCR 分 析 模 式 包 括 : 絕 對 定 量 ( Absolute quantification ) SNP Genotyping Melting Curve HRM(High Resolution Melting) 相 對 定 量 (Relative quantification) 以 下 我 們 將 針 對 這 些 分 析 方 式 進 行 介 紹 : 絕 對 定 量 (Absolute quantification) 絕 對 定 量, 即 針 對 樣 本 作 絕 對 的 量 化 先 利 用 標 準 品 作 標 準 曲 線, 再 比 較 樣 本 與 標 準 品 的 相 對 關 係, 所 呈 現 的 實 驗 結 果, 依 據 使 用 標 準 品 的 不 同, 通 常 以 濃 度 ng/ml mg/ml 或 是 計 量 單 位 ng pg copy number 等 作 為 表 示 一 般 進 行 絕 對 定 量 時 要 注 意 的 是 標 準 曲 線 的 斜 率 與 相 關 係 數 (R 2 ), 一 般 能 接 受 的 斜 率 範 圍 為 -3.0 ~ -3.6 ( 相 對 應 的 PCR efficiency 為 90%~110%), 而 相 關 係 數 (R 2 ) 則 是 越 接 近 1 越 好 如 果 初 期 的 標 準 曲 線 斜 率 與 相 關 係 數 不 如 預 期, 是 可 以 藉 由 刪 減 不 適 合 的 標 準 品 或 是 調 整 閾 值 使 得 方 程 式 修 正 至 可 使 用 的 範 圍 ; 若 方 程 式 無 法 修 正, 只 能 重 新 設 計 primer 或 是 更 改 標 準 品 來 改 進 絕 對 定 量 常 用 於 臨 床 診 斷, 如 HBV HCV 的 檢 測 Fig.6 以 standard curve 進 行 絕 對 定 量 上 圖 是 偵 測 PX gene, 標 準 品 分 別 為 20000 copies 10000 copies 5000 copies 2500 copies 及 1250 copies, 每 一 個 標 準 品 做 4 重 複, 並 計 算 其 standard curve 方 程 式 PCR efficiency 為 100.11%, 相 關 係 數 為 0.995 待 測 品 可 根 據 其 Ct value 計 算 出 copies 數

Melting curve 分 析 在 進 行 Real-time PCR 實 驗 時, 我 們 該 如 何 確 認 PCR 產 物 的 專 一 性? 此 時, 我 們 可 以 利 用 DNA 半 解 離 溫 度 (Tm value) 的 特 性 判 斷, 若 是 只 有 單 一 的 產 物, 理 論 上 半 解 離 溫 度 均 相 同 但 是 當 有 第 二 組 半 解 離 溫 度 出 現, 不 論 是 PCR 產 物 的 不 專 一 或 是 primer dimer 的 形 成, 均 會 造 成 Ct value 的 誤 判 Melting curve 只 能 使 用 在 在 使 用 DNA binding dye 的 系 統 時, 只 要 是 使 用 DNA binding dye 進 行 real-time PCR 偵 測, 或 是 設 計 新 的 probe 實 驗 前, 皆 需 要 進 行 melting curve 的 分 析 Melting curve 分 析 都 放 在 real-time PCR 的 cycle 結 束 後, 由 55~60 o C 加 熱 至 95 o C, 偵 測 每 一 個 溫 度 的 螢 光 量, 並 將 其 數 值 轉 換 為 每 個 溫 度 的 螢 光 變 化 量 (df/dt), 而 螢 光 變 化 量 最 高 的 位 置 即 為 此 PCR 產 物 的 Tm 值 a b Fig. 7 Melting Curve :(a) 為 melting curve 分 析 的 raw data ;(b) 為 經 過 轉 換 的 df/dt, 在 df/dt 的 圖 中 可 以 清 楚 看 到 此 組 primer set 只 有 一 個 Tm 值 (single peak) 相 對 定 量 (Relative quantification) 相 對 定 量 實 驗 不 需 要 標 準 曲 線 的 存 在, 所 以 實 驗 結 果 通 常 以 " 倍 數 "(n-fold) 表 示 實 驗 的 設 計 上 通 常 會 包 含 三 個 數 值, 基 準 點 (calibrator) 實 驗 點 及 內 部 校 正 點 (internal control), 一 般 的 計 算 方 式 如 下 : 1. Ct of Target gene Ct of reference gene = Δ Ct 先 以 reference gene 做 為 內 部 校 正 點, 分 別 將 基 準 點 Ct 與 實 驗 點 Ct 消 去 各 樣 品 中 的 reference gene 的 Ct 值 其 目 的 為 消 除 各 sample 之 間 非 實 驗 所 產 生 的 差 異, 如 樣 本 細 胞 數 不 同 pipetting error 等 等, 再 將 實 驗 點 與 基 準 點 作 比 較 2. Δ Ct of Sample - Δ Ct of Calibrator = ΔΔ Ct 以 加 藥 試 驗 為 例, 可 以 將 未 加 藥 當 作 Calibrator, 加 藥 後 2 4 8 16 小 時 設 為 不 同 實 驗 點 進 行 比 較, 此 時 將 各 時 間 點 的 Δ C 消 去 Δ Ct of Calibrator 即 可 得 到 與 基 準 點 相 對 應 的 ΔΔ Ct 3. 帶 入 公 式 2 (-ΔΔ Ct), 計 算 相 對 倍 率 將 ΔΔ Ct 帶 入 公 式 後, 得 到 的 數 據 即 為 實 驗 點 與 基 準 點 間 基 因 的 相 對 倍 率 在 進 行 相 對 定 量 實 驗 前, 必 須 先 確 定 reference gene 與 target gene 兩 者 之 PCR efficiency 相 差 不 遠, 才 可 進 行 後 續 的 分 析

Table. 1 相 對 定 量 範 例 下 表 針 對 不 同 組 織 內 的 TRa gene 進 行 相 對 定 量 偵 測 實 驗 中 使 用 B2M 作 為 reference gene pooled cdna 做 為 calibrator 進 行 相 對 定 量 ΔΔ Ct 經 過 轉 換 得 到 的 ratio 值 即 為 各 組 織 相 對 於 pooled cdna 內 TRa 的 相 對 比 例 TRa Ct Mean (Target gene) B2M Ct Mean (Reference gene) Δ Ct (Target - Endo) ΔΔ Ct ( Sample - Reference) Ratio Pooled cdna (Calibrator) 28.11 23.23 4.88 1 Heart 28.59 24.16 4.43-0.45 1.37 Kidney 27.82 22.51 5.31 0.43 0.75 Liver 31.44 23.35 8.09 3.21 0.11 Lung 29.24 22.46 6.78 1.9 0.27 SNP Genotyping SNP genotyping 是 針 對 SNP 位 置 設 計 2 組 probe, 這 兩 組 probe 除 了 SNP 序 列 差 異 外, 也 分 別 在 這 2 組 Probe 上 標 定 不 同 螢 光 (Ex: FAM & VIC) 若 待 測 物 為 Homozygous Wild Type or Homozygous Mutant, 則 只 有 其 中 1 組 probe 能 偵 測 的 到 ; 如 果 是 Heterozygous, 則 2 組 probe 可 同 時 偵 測 得 到 target gene SNP genotyping 常 應 用 於 遺 傳 疾 病 偵 測 或 是 族 群 研 究 Fig.7 使 用 probe 進 行 SNP genotyping 其 中 偵 測 A" 的 probe label VIC ; 偵 測 T 的 probe label FAM 經 過 real-time PCR 偵 測, 軟 體 自 動 將 待 測 物 分 群 為 A/A T/T 及 A/T (heterozygous)

HRM 分 析 High Resolution Melting Analysis( 高 解 析 度 融 點 分 析,HRM) 是 新 一 代 的 real-time PCR 偵 測 技 術, 其 特 點 是 可 快 速 大 量 的 分 析 基 因 序 列 的 突 變 或 變 異, 讓 研 究 人 員 能 夠 快 速 的 針 對 基 因 變 化 的 部 分 做 篩 選 或 分 類 ( 例 如 SNPs) 發 現 基 因 變 異 (gene scanning) 或 是 確 認 族 群 內 的 基 因 變 異 進 行 HRM 的 第 一 個 步 驟 是 使 用 PCR 方 式 將 待 測 基 因 區 段 放 大, 並 使 用 特 定 的 dsdna Binding Dye 染 色, 這 時 候 可 偵 測 到 高 度 的 螢 光 數 值 ; 待 PCR 放 大 至 足 夠 的 螢 光 量 時, 開 始 對 這 個 PCR 反 應 進 行 融 點 曲 線 分 析 (Melting Curve) 事 實 上,HRM 就 是 高 解 析 度 的 Melting Curve, 可 以 分 辨 Tm=0.1 o C 的 差 異, 因 此 即 使 是 SNP Class IV A/T (Tm<0.2 o C) 也 可 以 區 分 ; 以 實 驗 成 本 來 說,dsDNA binding dye 比 起 Probe 相 對 便 宜, 而 且 在 前 製 作 業 上 不 需 要 完 整 的 核 酸 序 列 即 可 進 行, 故 非 常 適 合 作 為 大 量 檢 體 篩 選 之 用 選 擇 適 合 HRM 的 DNA Binding Dye 一 般 最 常 使 用 的 DNA Binding Dye - SYBR Green I 並 不 適 合 用 於 HRM 的 實 驗, 原 因 是 SYBR Green I 在 高 濃 度 下 會 抑 制 PCR 反 應, 而 在 低 濃 度 時 是 屬 於 nonsaturated dye Non-saturated dye 在 DNA melting 的 過 程 中 雖 然 會 釋 出, 但 是 很 快 的 又 會 嵌 入 沒 有 dye binding 的 位 置, 因 此 在 進 行 HRM 時 使 用 non-saturated dye 是 無 法 觀 察 螢 光 值 相 對 於 溫 度 的 細 微 變 化 適 用 於 HRM 的 為 saturated dye (ex: SYTO9) 或 是 release-on-demand dye (EvaGreen) Saturated dye 不 會 抑 制 PCR polymerase 活 性, 因 此 可 放 入 master mix 的 濃 度 較 SYBR Green I 高, 以 確 保 DNA binding dye 能 嵌 入 dsdna 中 所 有 的 位 置 ; 由 於 所 有 DNA binding dye 已 飽 和, 隨 溫 度 增 加 而 釋 出 的 dye 不 會 再 嵌 回 dsdna, 在 進 行 HRM 分 析 時 可 觀 察 到 細 微 的 Tm 變 化 release-on-demand dye (EvaGreen) 是 新 一 代 的 DNA binding dye, 其 使 用 濃 度 與 non-saturated dye 相 近, 因 此 不 會 抑 制 PCR polymerase 活 性, 且 背 景 值 也 與 SYBR Green I 一 樣 低 ; 而 進 行 melting 時, 游 離 的 EvaGreen 也 不 會 再 回 到 dsdna binding, 非 常 適 合 HRM 分 析 使 用

HRM 實 驗 設 計 注 意 要 點 DNA Sample 建 議 所 有 的 DNA sample 都 應 該 使 用 同 一 套 extraction kit 進 行 純 化, 避 免 不 同 kit 造 成 HRM 分 析 結 果 差 異 進 行 HRM 分 析 時, 建 議 的 gdna 起 使 量 為 10ng~20ng, 如 果 是 plasmid DNA 起 使 量 可 低 於 1ng DNA sample 經 過 PCR 增 幅 後 可 達 到 足 夠 進 行 HRM 分 析 的 螢 光 量, 螢 光 量 越 多, 解 離 的 區 間 越 大, 其 解 析 度 也 越 好 進 行 HRM 時 一 定 要 放 入 positive control, 包 括 homozygous wild type homozygous mutant 及 heterozygous,positive control 在 HRM 反 應 中 可 做 為 基 準 線, 作 為 圖 形 分 析 判 斷 標 準 Primer 設 計 與 合 成 HRM primer 設 計 原 則 與 一 般 real-time PCR 原 則 相 似, 除 了 要 針 對 基 因 片 段 進 行 設 計, 更 要 盡 可 能 避 免 primer dimer 的 產 生 委 託 合 成 primer 一 定 要 進 行 HPLC-purification, 只 有 HPLC 才 能 將 primer 合 成 時 殘 留 的 鹽 類 完 全 移 除, 避 免 干 擾 HRM 分 析 Amplicon 片 段 長 度 進 行 HRM 實 驗 設 計 時 必 須 先 考 慮 amplicon 長 度, 一 般 來 說 如 果 是 一 個 nucleotide (SNP) 的 變 化, 在 50~250bp 的 區 間 內 是 可 以 HRM 偵 測 其 Tm 的 差 異, 雖 然 amplicon 的 片 段 越 短 越 容 易 偵 測 其 Tm 變 化, 最 後 的 螢 光 值 也 相 對 於 長 片 段 amplicon 來 的 低, 操 作 者 必 須 依 實 驗 需 求 決 定 amplicon 的 長 短 在 進 行 族 群 研 究 時, 常 有 多 個 核 酸 變 異 點 座 落 於 同 一 段 基 因 中, 此 時 可 適 當 延 長 amplicon 長 度 (>400bp), 減 少 primer set 設 計 的 需 求 HRM 分 析 流 程 PCR 增 幅 此 步 驟 與 一 般 PCR 步 驟 相 同, 其 目 的 是 將 待 測 基 因 增 幅 至 適 合 進 行 HRM 分 析 的 螢 光 量 在 PCR 增 幅 步 驟 中, 可 以 用 一 般 end-point PCR 方 式 進 行 增 幅 再 加 入 DNA binding dye, 或 者 是 直 接 使 用 real-time PCR 進 行 增 幅 以 real-time PCR 增 幅 的 好 處 是 可 即 時 監 控 每 個 cycle 所 產 生 的 螢 光 量, 做 為 未 來 調 整 實 驗 的 依 據 Raw Melting Curve Data 在 PCR 增 幅 待 測 基 因 後, 緊 接 著 就 是 進 行 melting curve 偵 測, 在 HRM 的 分 析 中 建 議 先 進 行 95 o C denature 及 55 o C annealing 以 產 生 heterozygous miss-match, 再 由 55 o C 升 溫 至 95 o C 進 行 HRM 偵 測 ( 每 0.1 o C 偵 測 一 次 螢 光 訊 號 ) 在 進 行 HRM 偵 測 時 可 以 觀 察 到 由 55 o C 至 接 近 Tm 值 前 (pre -melt) 會 有 一 段 等 量 的 螢 光 衰 減, 而 通 過 Tm 後 螢 光 值 會 呈 現 背 景 值 至 95 o C (post-melt) 由 於 pre -melt 及 post-melt 的 螢 光 值 都 會 干 擾 HRM 的 分 析, 因 此 在 軟 體 分 析 時 在 pre-melt 及 post-melt 各 設 定 一 段 normalization region 作 為 HRM 分 析 的 起 點 (pre-melt normalization region) 與 終 點 (post-melt normalization region)

Normalization data 在 HRM 分 析 軟 體 中 設 定 normalization region 後, 軟 體 會 自 動 將 分 析 區 間 的 螢 光 值 由 100~0 做 重 新 分 配, 此 時 amplicon 螢 光 的 強 弱 會 決 定 HRM 的 解 析 度, 當 螢 光 值 極 高, normalization 後 的 解 析 度 也 會 跟 著 提 高, 也 更 能 夠 辨 識 其 螢 光 曲 線 的 差 異 Difference data 雖 然 normalization data 可 以 分 辨 homozygous 與 heterozygous 的 螢 光 差 異, 但 是 homozygous wild type 與 homozygous mutant 在 SNP Class IV (A/T) 仍 無 法 準 確 辨 識, 此 時 可 使 用 difference data 增 加 其 辨 識 度 Difference data 是 先 設 定 一 個 sample 做 為 基 準 點 (reference), 將 所 有 sample 的 每 個 溫 度 點 螢 光 數 據 扣 除 基 準 點 後 所 產 生 的 螢 光 曲 線 變 化 以 SNP Class IV (A/T) 為 例, 若 我 們 將 homozygous A 設 為 基 準 點, 此 時 homozygous A 在 每 一 溫 度 點 的 螢 光 變 化 值 為 0, 故 所 有 homozygous A sample 所 產 生 的 螢 光 變 化 也 會 趨 近 於 0 ; 但 是 homozygous T 的 Tm 值 較 homozygous A 高, 故 進 行 difference 時, 每 個 溫 度 點 homozygous T 螢 光 扣 除 homozygous A 後 會 形 成 正 螢 光 值 曲 線, 根 據 其 曲 線 分 佈 即 可 分 辨 homozygous A 與 homozygous T A. Raw Melting Curve Data B. Normalization Data C. Difference Data Blue: T/T Red: A/A Green: A/T Blue: T/T Red: A/A Green: A/T Blue: T/T Red: A/A Green: A/T 結 語 上 述 的 幾 個 主 題, 為 Real-time PCR 常 見 的 項 目, 在 此 為 各 位 讀 者 做 基 礎 的 介 紹 更 深 入 的 實 驗 技 術, 如 probe 的 設 計 data 的 分 析 實 驗 條 件 最 佳 化 及 儀 器 的 基 礎 原 理 試 劑 耗 材 的 選 擇 等, 若 是 各 位 讀 者 有 興 趣, 歡 迎 您 隨 時 來 信 或 來 電, 我 們 將 盡 全 力 提 供 您 所 需 要 的 資 訊 創 世 紀 生 技 公 司 同 時 提 供 最 專 業 的 real-time PCR instrument master mix pathogen detection kit 以 及 HRM 相 關 試 劑, 我 們 將 竭 誠 的 為 您 服 務

創 世 紀 生 技 公 司 全 新 鉅 獻 IQ 2 Fast qpcr System 產 品 特 色 : 只 要 2min 就 能 完 成 hotstart, 省 時 間 搭 配 Fast qpcr instrument, 只 要 40min 就 可 完 成 實 驗 ( 不 同 qpcr 儀 器 執 行 Fast qpcr 時 間 不 同 ) 內 含 EvaGreen, 能 進 行 一 般 qpcr 及 HRM 背 景 值 超 低 螢 光 值 更 亮, 更 能 分 辨 細 微 的 差 異 靈 敏 度 超 高, 即 使 1 copy 也 可 偵 測 適 用 於 各 式 real-time PCR 儀 器 Template: Lambda (10 7 copies ~ 1 copy) Sloop:-3.524; Efficiency:92.22% R 2 =0.992 Only 1 copy detectable Blue: A/A Red: G/G Green: A/G 以 Lambda DNA 進 行 10 7 ~1 copy 序 列 稀 釋, 並 以 IQ2 Fast qpcr system 偵 測, 即 使 只 有 1 copy 也 能 被 偵 測!!! IQ2 Fast qpcr System 內 含 EvaGreen, 可 進 行 HRM 分 析 產 品 名 稱 適 用 機 型 產 品 型 號 IQ 2 Fast qpcr System IQ 2 Fast qpcr System with Low ROX BioRad: icycler, MyiQ, MiQ 2, iq 5, CFX-96, CFX-384, MJ Opticon, Option2, Chromo4, MiniOpticon Qiagen: Roto-Gene Q, Roto-Gene3000, Roto- Gene 6000 Eppendorf: Mastercycler realplex Illumina: Eco RealTime PCR System Cepheid: SmartCyler Roche: LIghtCycler 480, LightCycloer 2.0 ABI: 7500, 7500 Fast Stratagene: MX4000P, MX3000P, MX3005P DBU-001-1mL DBU-001-5mL DBU-002-1mL DBU-002-5mL IQ 2 Fast qpcr System with ROX ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne, StepOne plus DBU-003-1mL DBU-003-5mL

Primer Design Inc. 來 自 英 國, 專 業 的 real time PCR 供 應 商 http://www.primerdesign.co.uk/ ~ RT & qpcr 一 次 到 位 ~ Precision OneStep qrt-pcr MasterMix One Step qrt-pcr, 好 處 多 更 多 : 1. RT step 反 應 只 需 10 分 鐘, 可 耐 55 o C 高 溫 2. Q-PCR step - 不 到 1 hr 3. One Step 減 少 你 set up 實 驗 所 需 要 的 時 間 A. 只 需 要 加 primers / probe / RNA template B. 降 低 實 驗 的 風 險 C. 更 節 省 經 費 D. 包 裝 內 附 RNAse inhibitor E. 更 靈 敏, > 10 9 copies ; < 10 copies. - 更 精 準, 更 方 便, 更 省 時 - 從 HeLa 中 萃 取 RNA, 以 25 ng 以 做 10x 稀 釋, 執 行 one step qrt-pcr, 分 析 ACTB 的 表 現 量 產 品 名 稱 適 用 機 種 產 品 編 號 Precision OneStep qrt-pcr Master Mix Precision OneStep qrt-pcr Master Mix with Low ROX Illumina Eco, MJ Chromo4, Roche 480, RotorGene (all models), Eppendorf Mastercycler, Fluidigm BioMark and Cepheid SmartCycler ABI 7500, 7500 Fast OneStep OneStep-SY* OneStep-LR OneStep-LR-SY* Precision OneStep qrt-pcr Master Mix with ROX ABI 7000, 7300, 7700, 7900, and One Step platform OneStep-R OneStep-R-SY* Precision OneStep qrt-pcr Master Mix for BioRad icycler Precision OneStep qrt-pcr Master Mix for Stratagene hardware Precision OneStep qrt-pcr Master Mix for capillary lightcyclers BioRad icycler, IQ4 and IQ5 Stratagene MX OneStep-MX Roche Lightcycler 1.0, 1.5, and 2.0 OneStep-CL OneStep-iC OneStep-iC-SY* OneStep-MX-SY* OneStep-CL-SY* * 註 : 編 號 -SY 表 示 內 含 SYBR Green I