嗜 鹽 菌 Haloferax mediterranei 的 類 胡 蘿 蔔 素 之 抗 氧 化 及 細 胞 毒 性 評 估 EVALUATION FOR ANTIOXIDATIVE ACTIVITIES AND CYTOTOXICITIES OF CAROTENOIDS FROM HALOPHILIC Haloferax mediterranei 研 究 生 : 張 舒 婷 (Shu-Ting Chang) 指 導 教 授 : 林 銘 澤 (Prof. Ming-Tse Lin) 大 同 大 學 生 物 工 程 研 究 所 碩 士 論 文 Thesis for Master of Science Department of Bioengineering Tatung University 中 華 民 國 九 十 七 年 六 月 June 2008
謝 誌 研 究 所 的 兩 年 時 光 是 我 從 目 前 人 生 中 最 重 要 的 時 光 之 ㄧ, 讓 我 學 習 如 何 自 我 的 提 昇 及 成 長, 面 對 自 己 內 心 的 恐 懼 以 及 遇 到 挫 折 與 失 敗 時 如 何 重 新 勇 敢 及 堅 強 這 紙 畢 業 證 書 不 只 是 張 碩 士 文 憑 而 已, 更 是 我 戰 勝 自 己 的 證 明 我 曾 想, 如 果 有 天 回 憶 起 我 的 碩 士 論 文, 我 一 定 會 說 是 我 用 淚 水 寫 成 的 兩 年 的 光 陰 讓 我 明 白, 原 來 我 不 再 是 從 前 的 自 己, 我 應 該 更 有 智 慧 且 更 加 勇 敢 及 堅 強, 我 應 該 以 自 己 為 榮 首 先 感 謝 指 導 教 授 林 銘 澤 老 師 的 悉 心 指 導 及 修 正, 使 得 本 論 文 得 以 順 利 完 成, 感 謝 老 師 兩 年 來 在 做 研 究 上 及 處 事 態 度 耐 心 的 指 正 及 教 導, 使 我 每 每 遭 遇 瓶 頸 時 總 能 迎 刃 而 解, 並 能 在 失 敗 中 得 到 更 多 的 收 穫 並 感 謝 大 同 大 學 陳 志 成 老 師 及 台 灣 大 學 蘇 南 維 老 師 在 百 忙 之 中 撥 冗 指 教, 使 得 本 論 文 更 臻 完 備 同 時 也 感 謝 所 有 大 同 大 學 的 老 師 們 在 這 兩 年 內 給 予 到 幫 助 及 指 導, 使 得 我 在 自 己 的 人 生 中 上 能 更 上 一 層 樓 再 來 要 感 謝 所 有 實 驗 室 的 學 長 姐 同 學 及 學 弟 妹 感 謝 你 們 這 兩 年 的 陪 伴 及 在 學 業 上 互 相 切 磋 學 習 因 為 有 你 們 讓 我 的 研 究 所 生 涯 更 多 彩 多 姿 充 滿 歡 樂 最 後, 感 謝 父 母 與 家 人 對 我 的 栽 培 及 無 怨 無 悔 的 付 出, 在 我 最 失 意 的 時 候 因 為 有 你 們 我 才 能 勇 敢 的 面 對 挑 戰, 也 期 許 將 來 我 也 能 成 為 你 們 的 支 柱 與 榮 耀, 謹 以 此 論 文 獻 給 我 摯 愛 的 家 人
中 文 摘 要 由 嗜 鹽 菌 Haloferax mediterranei 所 萃 取 得 的 紅 色 素 (hmerp), 含 有 三 種 C50 類 胡 蘿 蔔 素 此 三 種 C50 類 胡 蘿 蔔 素 可 分 別 藉 由 矽 膠 管 柱 色 層 分 析 法 以 含 40% 乙 酸 乙 酯 的 己 烷 乙 酸 乙 酯 及 甲 醇 流 洗 而 被 分 離 出 來, 以 流 洗 出 來 的 順 序, 將 純 化 後 的 類 胡 蘿 蔔 素 分 別 命 名 為 hmc1 hmc2 及 hmc3 比 較 50 μm 的 hmc3 trolox butylated hydroxyanisole (BHA) 及 β-carotene 的 DPPH 自 由 基 清 除 的 能 力 總 抗 氧 化 力 (ABTS, radical cation decolorization assay) 及 還 原 能 力,hmC3 分 別 為 trolox 的 0.8 1.7 倍 及 4.0 倍, 且 為 β-carotene 的 1.7 倍 4.1 倍 及 7.5 倍, 而 hmc3 的 效 力 相 似 或 更 優 於 BHA 此 外, 在 比 較 螯 合 亞 鐵 離 子 的 能 力 上, 僅 有 50 μm hmc3 具 有 螯 合 的 亞 鐵 離 子 的 能 力, 其 螯 合 能 力 可 達 42%, 為 相 同 濃 度 EDTA 之 螯 合 能 力 的 77% 在 評 估 清 除 超 氧 自 由 基 能 力 方 面,hmC3 trolox 及 BHA 的 IC 50 分 別 為 0.275 mm 8.69 mm 及 25.70 mm; 而 β-carotene 在 此 方 面 的 能 力 則 過 弱 以 致 無 法 偵 測 由 抗 氧 化 活 性 分 析 的 結 果 顯 示, hmc3 在 抗 氧 化 的 能 力 上 有 優 異 的 表 現, 且 在 各 種 抗 氧 化 能 力 的 表 現 皆 遠 優 於 β-carotene 將 hmerp 及 經 純 化 後 的 三 種 類 胡 蘿 蔔 素 分 別 處 理 HepG2 和 Hep3B 等 人 類 肝 癌 細 胞 以 及 CCD-966SK 人 類 纖 維 母 細 胞, 之 後 再 以 MTT assay i
分 析 細 胞 存 活 率 結 果 發 現, 經 0-0.5 ppm hmerp 及 0-1000 nm hmc3 處 理 6 h 後, 二 者 對 細 胞 並 沒 有 明 顯 的 毒 殺 作 用 ; 但 是 處 理 24 h 後, 隨 著 處 理 的 劑 量 增 加, 細 胞 的 死 亡 率 也 隨 之 提 升 hmc3 對 於 CCD-966SK Hep3B 及 HepG2 等 細 胞 的 LD 50 分 別 為 334 nm 165 nm 及 122 nm; 然 而 當 濃 度 低 於 200 nm 時, 人 類 纖 維 母 細 胞 之 存 活 率 可 達 80% 以 上 當 以 100 nm 的 另 外 兩 種 類 胡 蘿 蔔 素 (hmc1 及 hmc2) 處 理 24h, 其 對 於 HepG2 及 Hep3B 細 胞 皆 沒 有 明 顯 的 毒 性 此 外,B16-F0 老 鼠 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 以 hmc3 處 理 24 h, 其 細 胞 存 活 率 的 LD 50 約 為 8.5 nm, 同 時, 經 hmc3 處 理 24 及 48 h,b16-f0 細 胞 內 的 黑 色 素 含 量 並 沒 有 隨 之 減 少 ii
ABSTRACT An extracted red pigment from Haloferax mediterranei (hmerp) contains three kinds of C50 carotenoids. These three kinds of C50 carotenoids can be isolated by eluting of 40% ethyl acetate in hexane, ethyl acetate, and methanol from silica gel column chromatography. The purified carotenoids were named hmc1, hmc2, and hmc3 according to the order of elution from silica gel column chromatography. Adding 50 μm hmc3 and the same concentrations of trolox, butylated hydroxyanisole (BHA), or β-carotene, the DPPH radical scavenging ability, total antioxidative activity, and reducing power of hmc1 were 80%, 1.7 folds, and 4.0 folds of trolox as well as 1.7 folds, 4.1 folds, and 7.5 folds of β-carotene, respectively. These abilities of hmc3 were similar or better than BHA. Additionally, the chelating effect on ferrous ions was measured as 42%, and was 77% of 50 μm EDTA. However, trolox, BHA, and β-carotene were few or no ferrous ions chelating ability. For the assessment of the superoxide-scavenging ability, the IC 50 of hmc3, trolox, and BHA were 0.275 mm, 8.69 mm, and 25.70 mm, respectively; the ability of β-carotene was too weak to be detected. It s obvious that the hmc3 has excellent antioxidant activity and its ability is better than β-carotene. iii
Incubation of the hepatocellular carcinoma HepG2 and Hep3B cells and human skin fibroblast CCD-966SK cell with hmerp and these 3 kinds of purified carotenoids, the cell viabilities by MTT assay were determined. No apparently toxicity to cells treated with the 0-0.5 ppm hmerp and 0-1000 nm hmc3 within 6 h was observed, but it was toxic for these cells treated with in 24 h and was in a dose dependent manner. The LD 50 of CCD-966SK, Hep3B, and HepG2 cells were 334 nm, 165 nm, and 122 nm, respectively. However, the viability of CCD-966SK cells is above 80% when the treatment concentration was lower than 200 nm. One hundred nm of the other two carotenoids (hmc1 and hmc2) had no or few toxicity to the HepG2 and Hep3B cells. In addition, the LD 50 of B16-F0 melanoma cell was 8.5 nm when it was treated with hmc3 for 24 h. Meanwhile, the melanin contents of B16-F0 cells treated with hmc3 for 24 h and 48 h did not decrease. iv
目 錄 中 文 摘 要...i 英 文 摘 要...iii 目 錄... v 圖 目 錄... x 表 目 錄...xi 第 一 章 前 言... 1 第 二 章 文 獻 回 顧... 4 2.1. 古 生 菌... 4 2.2. 嗜 鹽 菌 的 介 紹... 5 2.2.1. 嗜 鹽 菌 的 分 類... 5 2.2.2. 嗜 鹽 菌 的 生 理 特 性... 5 2.2.3. 嗜 鹽 菌 的 能 量 生 產... 6 2.3. 嗜 鹽 菌 Haloferax mediterranei 介 紹... 7 2.4. 類 胡 蘿 蔔 素 的 介 紹... 8 2.4.1. β- 胡 蘿 蔔 素... 8 2.4.2. 茄 紅 素... 9 2.4.3. 菌 紅 素... 10 2.5. 自 由 基 與 抗 氧 化... 11 v
2.5.1. 自 由 基... 11 2.5.2. 自 由 基 對 生 物 體 之 影 響... 14 2.5.3. 生 物 體 的 抗 氧 化 反 應... 15 2.5.4. 抗 氧 化 的 測 定 法... 16 2.6. 肝 癌... 20 2.6.1 肝 癌 的 生 成... 21 2.6.2 肝 癌 與 類 胡 蘿 蔔 素... 23 2.7. 黑 色 素 及 美 白 作 用... 24 2.7.1. 黑 色 素 細 胞... 24 2.7.2. 黑 色 素 形 成 和 酪 胺 酸 酶 活 性 作 用 的 關 係... 25 2.7.3. 一 般 常 用 美 白 劑 的 機 轉... 25 第 三 章 材 料 與 方 法... 27 3.1. 色 素 的 來 源 與 定 量... 27 3.1.1. 實 驗 儀 器... 27 3.1.2. 實 驗 藥 品... 27 3.1.3. 色 素 的 來 源... 27 3.1.4. 色 素 的 定 量... 27 3.2. 抗 氧 化 能 力 分 析... 29 3.2.1. 實 驗 儀 器... 29 vi
3.2.2. 實 驗 藥 品... 29 3.2.3. 清 除 DPPH 自 由 基 能 力 的 測 定... 30 3.2.4. 總 抗 氧 化 力 之 測 定... 30 3.2.5. 還 原 力 的 測 定... 31 3.2.6. 螯 合 亞 鐵 離 子 之 能 力 測 定... 32 3.3. 細 胞 毒 性 測 試... 35 3.3.1. 實 驗 儀 器... 35 3.3.2. 實 驗 細 胞 株 及 藥 品... 35 3.3.3. 細 胞 培 養... 36 3.3.4. 繼 代 培 養... 37 3.3.5. 細 胞 之 保 存 與 解 凍... 38 3.3.6. 細 胞 計 數... 38 3.3.7. 細 胞 存 活 率 之 測 定... 39 3.4. 對 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 之 作 用... 41 3.4.1. 實 驗 儀 器... 41 3.4.2. 實 驗 細 胞 株 及 藥 品... 41 3.4.3. 細 胞 培 養... 42 3.4.4. 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 存 活 率 分 析... 42 3.4.5. 細 胞 黑 色 素 分 析... 42 vii
第 四 章 結 果... 44 4.1. hmc3 的 抗 氧 化 能 力 探 討... 44 4.1.1. 清 除 DPPH 自 由 基 之 能 力... 44 4.1.2. hmc3 總 抗 氧 化 力 分 析... 46 4.1.3. hmc3 還 原 力 的 分 析... 48 4.1.4. hmc3 亞 鐵 離 子 螯 合 力 分 析... 50 4.1.5. hmc3 之 超 氧 自 由 基 IC 50 清 除 能 力 分 析... 52 4.2. H. mediterranei 的 C50 類 胡 蘿 蔔 素 之 細 胞 毒 性 探 討... 54 4.2.1. H. mediterranei 的 C50 類 胡 蘿 蔔 素 對 肝 癌 細 胞 的 細 胞 毒 性... 54 4.2.2. H. mediterranei 所 產 三 種 C50 類 胡 蘿 蔔 素 對 肝 癌 細 胞 的 毒 性... 57 4.2.3 hmc3 對 纖 維 母 細 胞 與 肝 癌 細 胞 的 毒 性 比 較... 61 4.3. H. mediterranei 之 C50 類 胡 蘿 蔔 素 對 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 的 影 響.. 63 4.3.1. H. mediterranei 之 C50 類 胡 蘿 蔔 素 對 B16-F0 細 胞 的 細 胞 毒 性... 63 4.3.2. hmc3 對 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 的 黑 色 素 影 響 分 析... 65 第 五 章 討 論... 68 5.1. hmc3 之 抗 氧 化 能 力 討 論... 68 viii
5.2. H. mediterranei 所 產 C50 類 胡 蘿 蔔 素 的 細 胞 毒 性... 69 5.3. hmc3 對 B16-F0 黑 色 素 細 胞 的 作 用... 72 第 六 章 結 論... 75 參 考 文 獻... 76 ix
圖 目 錄 圖 4.1 不 同 抗 氧 化 劑 對 DPPH 自 由 基 的 清 除 能 力 之 比 較... 45 圖 4.2 不 同 抗 氧 化 劑 對 ABTS 陽 離 子 自 由 基 清 除 率 能 力 之 比 較... 47 圖 4.3 不 同 抗 氧 化 劑 的 還 原 能 力 之 比 較 分 析... 49 圖 4.4 不 同 抗 氧 化 劑 的 的 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 之 比 較... 51 圖 4.5 以 微 弱 化 學 發 光 儀 分 析 不 同 抗 氧 化 劑 的 超 氧 自 由 基 之 清 除 能 力 53 圖 4.6 以 hmerp 處 理 肝 癌 細 胞 6 小 時 之 存 活 率... 55 圖 4.7 肝 癌 細 胞 經 hmerp 處 理 24 小 時 後 的 存 活 率... 56 圖 4.8 以 hmc3 處 理 肝 癌 細 胞 6 小 時 之 存 活 率... 58 圖 4.9 Hep3B 肝 癌 細 胞 經 C50 類 胡 蘿 蔔 素 處 理 24 小 時 之 存 活 率... 59 圖 4.10 HepG2 肝 癌 細 胞 經 C50 類 胡 蘿 蔔 素 處 理 24 小 時 之 存 活 率.. 60 圖 4.11 以 hmc3 處 理 CCD966SK HepG2 及 Hep3B 細 胞 24 小 時 存 活 率 之 比 較... 62 圖 4.12 以 MTT 分 析 C50 類 活 蘿 蔔 素 對 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 的 細 胞 毒 性... 64 圖 4.13 hmc3 處 理 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 24 小 時 的 黑 色 素 量 及 細 胞 存 活 率... 66 圖 4.14 hmc3 處 理 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 48 小 時 的 黑 色 素 量 及 細 胞 存 活 率... 67 x
表 目 錄 表 5.1 hmc3 與 trolox 的 抗 氧 化 能 力 相 關 百 分 比... 71 表 5.2. 以 H. mediterranei 所 產 C50 類 胡 蘿 蔔 素 對 各 細 胞 株 的 LD 50... 74 xi
第 一 章 前 言 許 多 研 究 指 出 人 體 內 的 自 由 基 主 要 是 由 氧 分 子 在 新 陳 代 謝 過 程 中 轉 變 形 成 活 性 氧 族 (reactive oxygen species, ROS), 如 單 旋 氧 (single oxygen) 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide) 羥 自 由 基 (hydroxyl radical) 超 氧 陰 離 子 自 由 基 (superoxide anion radical) 過 氧 化 脂 質 (lipid hydroperoxide) 等 (Halliwell, 1994) 產 生 的 自 由 基 (free radical) 會 攻 擊 細 胞 膜 上 的 多 聚 不 飽 和 脂 肪 酸 (polyunsaturated fatty acid, PUFA), 因 而 引 起 脂 質 過 氧 化 作 用, 造 成 正 常 細 胞 的 氧 化 傷 害 此 外, 活 性 氧 或 活 性 氮 也 會 對 各 種 胺 基 酸 造 成 氧 化 傷 害, 使 雙 股 DNA 股 突 變 受 傷, 導 致 蛋 白 質 的 立 體 結 構 與 酵 素 活 性 的 改 變, 進 而 導 致 相 關 疾 病 的 發 生, 例 如 癌 症 (cancer) 氣 腫 (emphysema) 糖 尿 病 (diabetes) 動 脈 粥 狀 硬 化 (atherosclerosis) 腦 血 管 病 變 巴 金 森 氏 症 (Parkinson s disease) 等 ( 蔡 坤 志,2002; 吳 伯 宏,2004;Temple, 2000) 肝 癌 在 亞 洲 地 區 是 一 種 非 常 普 遍 的 惡 性 腫 瘤, 以 台 灣 地 區 而 言 則 是 常 見 的 惡 性 腫 瘤 之 一, 有 研 究 報 告 指 出 人 類 肝 細 胞 癌 本 身 是 一 種 多 元 誘 因 的 疾 病, 可 能 與 ( 一 ) 黃 麴 毒 素 (aflatoxin,af) ( 二 ) 抽 煙 和 喝 酒 及 ( 三 ) 肝 炎 病 毒 (HBV HCV) 相 關 流 行 病 學 研 究 顯 示 類 胡 蘿 蔔 素 的 攝 取 可 以 減 少 肝 癌 的 生 成 (Okuno et al., 2002), 動 物 實 驗 顯 示 攝 取 類 胡 蘿 蔔 素 中 的 茄 紅 素 可 有 效 減 少 大 鼠 罹 患 肝 癌 的 風 險 (Rao and 1
Agarwal, 2000), 且 經 細 胞 實 驗 證 實 茄 紅 素 可 以 減 少 肝 細 胞 DNA 的 氧 化 傷 害 且 抑 制 肝 癌 細 胞 的 生 長 (Park et al., 2005) 類 胡 蘿 蔔 素 廣 泛 存 在 於 植 物 動 物 及 微 生 物 當 中, 為 一 種 脂 溶 性 的 多 烯 類 色 素, 是 目 前 所 有 色 素 當 中 研 究 且 應 用 最 廣 的 一 種 天 然 色 素 類 胡 蘿 蔔 素 是 由 重 覆 的 共 軛 雙 鍵 所 結 合 的 長 鏈 多 烯 構 造, 具 有 吸 光 性 質 及 光 保 護 (photo-protection) 功 能 此 外, 具 有 清 除 單 旋 氧 的 能 力, 它 可 以 直 接 與 單 旋 氧 反 應, 形 成 較 穩 定 的 三 重 態 氧 (3O2), 防 止 其 他 破 壞 反 應 的 發 生 類 胡 蘿 蔔 素 可 與 苯 氧 自 由 基 作 用 形 成 較 安 定 的 類 胡 蘿 蔔 素 自 由 基, 停 止 自 由 基 的 連 鎖 反 應 ( 鄭 永 祥 等 人,2000; 錢 明 賽,1998; Handelman, 2001;Stahl and Sies, 2003) 類 胡 蘿 蔔 素 中 又 以 茄 紅 素 的 抗 氧 化 能 力 為 最 佳, 其 清 除 單 態 氧 的 速 率 常 數 是 目 前 常 用 抗 氧 化 劑 維 生 素 E 的 100 倍, 也 是 β- 胡 蘿 蔔 素 的 兩 倍 多 (Di Mascio et al., 1991) 近 期 的 研 究 也 指 出 茄 紅 素 可 以 防 止 LDL (low density lipoprotein) 膽 固 醇 的 氧 化, 降 低 動 脈 粥 狀 的 形 成, 可 降 低 輻 射 線 和 紫 外 線 所 造 成 的 傷 害, 且 可 以 預 防 攝 護 腺 癌 肺 癌 及 肝 癌 等 (Kaur and Kapoor, 2001; Tapiero et al.., 2004) 菌 紅 素 (Bacterioruberin) 為 一 種 紅 色 的 類 胡 蘿 蔔 素, 是 由 50 個 碳 原 子 (C 50 ) 所 構 成 的 長 鏈 結 構, 屬 於 高 碳 類 胡 蘿 蔔 素, 其 碳 鏈 比 一 般 常 見 的 類 胡 蘿 蔔 素 長 ( 陳 炳 輝,2000) 菌 紅 素 的 與 茄 紅 素 (lycopene) 2
主 體 結 構 類 似, 都 有 兩 端 開 環 的 結 構, 但 菌 紅 素 的 碳 鏈 (C 50 ) 比 茄 紅 素 碳 鏈 (C 40 ) 長, 因 此 也 比 茄 紅 素 多 兩 個 共 軛 雙 鍵, 且 兩 端 各 有 兩 個 hydroxyl group, 是 屬 於 葉 黃 素 類 (xanthophy) 的 類 胡 蘿 蔔 素 (Oren et al., 2001) 菌 紅 素 可 由 一 種 生 長 在 高 鹽 環 境 下 的 古 生 極 端 嗜 鹽 菌 Haloferax mediterranei 所 生 產, 其 喜 好 在 20-25% 的 鹽 濃 度 下 生 長, 但 是 當 環 境 中 的 鹽 濃 度 低 於 10% 時, 嗜 鹽 菌 體 內 會 生 產 大 量 的 紅 色 菌 紅 素, 可 用 來 抵 抗 低 鹽 環 境 所 造 成 的 滲 透 壓 改 變 (D Souza et al., 1997) 菌 紅 素 與 其 他 類 胡 蘿 蔔 素 一 樣, 具 備 光 保 護 (photo-protective) 的 能 力, 可 以 藉 由 吸 收 過 多 的 光 能 (light harvesting) 用 來 保 護 細 胞, 使 細 胞 免 於 受 到 紫 外 線 的 傷 害 (Saito et al., 1997; Shahmohammadi et al., 1998) 由 於 菌 紅 素 在 化 學 結 構 上 類 似 類 胡 蘿 蔔 素 中 的 茄 紅 素, 因 此 本 論 文 將 研 究 菌 紅 素 在 抗 氧 化 及 對 癌 細 胞 的 毒 性 上 是 否 也 有 優 異 的 表 現 3
第 二 章 文 獻 回 顧 2.1. 古 生 菌 Woese 等 人 (1990) 依 16S rrna 的 序 列 分 析 提 出 了 Three domain 學 說, 將 地 球 的 生 物 由 原 先 的 原 核 及 真 核 重 新 分 類 為 真 細 菌 (Eubateria) 真 核 生 物 (Eukarya) 及 古 生 菌 (Archaea) 早 期 發 現 的 古 生 菌 皆 分 離 自 極 端 的 環 境, 其 中 包 括 高 溫 高 鹽 及 極 端 酸 鹼 的 環 境 中, 近 年 來, 一 般 的 中 低 溫 環 境 中 也 發 現 有 古 生 菌 的 存 在 (DeLong, 1992 ; Eckburg et al., 2003) 古 生 菌 兼 具 了 原 核 和 真 核 生 物 的 特 性, 例 如 和 細 菌 一 樣 具 有 環 狀 的 染 色 體, 新 陳 代 謝 的 過 程 也 很 類 似 ; 但 細 胞 功 能 和 處 理 基 因 的 遺 傳 訊 息 則 與 真 核 細 胞 較 相 似 部 分 古 生 菌 可 以 生 活 在 沸 水 或 鹽 度 極 高 的 環 境 中, 是 一 種 非 常 古 老 的 生 命 型 態 依 伯 杰 氏 系 統 性 細 菌 學 手 冊 (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology) 將 古 生 物 分 類 成 五 個 主 要 群 組, 分 別 是 methanogenic archaeobacteria sulfate reducers extremely halophilic cell wall-less archaeobacteria 及 extremely thermophilic S 0 -metabolizers 等 (Holt et al., 2000) 4
2.2. 嗜 鹽 菌 的 介 紹 2.2.1. 嗜 鹽 菌 的 分 類 根 據 16S rrna 寡 核 苷 酸 序 列 測 定 分 析, 古 生 菌 中 的 嗜 鹽 菌 於 2004 年 已 增 加 到 19 屬, 其 中 包 括 Halobacterium Haloarcula Halobaculum Halobiforma Halococcus Haloferax Halogeometricum Halomicrobium Halorhabdus Halorubrum Halosimplex Haloterrigena Natrialba Natronococcus Natronomonas Natronorubrum 及 Haloakalophilium 等 (Goo et al.. 2004) 2.2.2. 嗜 鹽 菌 的 生 理 特 性 古 生 菌 中 的 嗜 鹽 菌 對 氯 化 鈉 的 適 應 性 極 為 特 殊 嗜 鹽 菌 普 遍 存 在 於 高 鹽 的 環 境 之 中, 例 如 海 鹽 湖 鹽 池 等 天 然 的 環 境 及 曬 鹽 場 等 人 工 的 環 境 中 海 水 中 約 含 3.5% 的 鹽 濃 度, 其 中 主 要 成 分 為 氯 化 鈉, 一 般 而 言, 嗜 鹽 菌 需 生 長 在 12% 的 高 鹽 環 境 中, 最 好 的 生 長 環 境 是 當 鹽 濃 度 為 20-25%( 約 海 水 鹽 濃 度 的 6-7 倍 之 高 )(Juez et al., 1990) 在 高 鹽 的 環 境 下 可 維 持 嗜 鹽 菌 中 halobacterial ATPase 此 嗜 鹽 蛋 白 質 的 穩 定 度 (Bickel-Sandkotts et al.., 1998) 嗜 鹽 菌 除 halococci 為 革 蘭 氏 陽 性 菌 外 其 餘 皆 屬 於 革 蘭 氏 陰 性 菌, 大 部 分 嗜 鹽 菌 會 產 生 黃 色 橘 色 或 是 紅 色 的 類 胡 蘿 蔔 素, 可 用 來 保 護 菌 體 以 避 免 光 線 的 輻 射 傷 害 嗜 鹽 菌 具 有 surface-layer 或 稱 為 S-layer 的 堅 硬 5
細 胞 壁 是 一 層 由 醣 蛋 白 所 組 成 的 細 胞 壁, 藉 由 二 價 的 陽 離 子 ( 例 :Mg 2+ ) 使 細 胞 壁 密 實 的 連 在 一 起 嗜 鹽 菌 的 細 胞 外 型 多 變, 然 而 大 部 分 為 桿 狀 型 (Rodriguez-Valera et al., 1981) 通 常 嗜 鹽 菌 生 長 的 鹽 濃 度 範 圍 在 15-25% 之 間, 但 最 適 合 的 鹽 濃 度 約 在 23% 的 環 境 之 中 嗜 鹽 菌 的 生 長 溫 度 在 30-55 範 圍 之 間, 然 而 最 佳 的 生 長 溫 度 一 般 而 言 是 在 37 嗜 鹽 菌 可 生 長 於 ph 5-8 此 範 圍 之 間, 最 好 的 生 長 酸 鹼 度 為 ph 7 當 培 養 環 境 的 溫 度 升 高 時, 在 高 鹽 的 培 養 環 境 下, 氧 氣 的 供 應 是 極 為 重 要 的 (Bickel-Sandkotts et al.., 1998) 2.2.3. 嗜 鹽 菌 的 能 量 生 產 嗜 鹽 菌 的 細 胞 膜 分 成 兩 部 份, 分 別 為 紅 色 膜 及 紫 色 膜, 配 合 嗜 鹽 菌 兩 種 不 同 獲 得 能 量 的 系 統 : 一 種 是 處 於 光 線 照 射 下 類 似 光 磷 酸 化 的 反 應, 其 發 生 於 紫 色 膜, 而 另 一 種 為 有 氧 氣 時 所 產 生 的 氧 化 磷 酸 化 反 應 則 發 生 於 含 有 細 胞 色 素 及 黃 素 蛋 白 (flavoprotein) 的 紅 色 膜 上 紫 色 膜 在 細 胞 膜 上 呈 現 斑 點 狀 的 分 布, 做 為 進 行 光 合 作 用 的 特 殊 地 點, 較 為 特 殊, 所 佔 的 面 積 也 占 了 細 胞 膜 面 積 的 一 半 紫 膜 中 脂 質 的 含 量 佔 了 約 25%, 而 剩 餘 的 75% 為 蛋 白 質 是 一 種 細 菌 視 紫 質 (bacteriorhodopsin) 細 菌 視 紫 質 普 遍 被 認 為 與 葉 綠 素 作 用 相 似, 在 光 量 子 的 驅 動 下 有 質 子 幫 浦 (proton motive force 稱 PMF) 的 功 能, 使 質 子 產 生 跨 膜 運 輸 進 而 形 成 腺 嘌 呤 核 苷 三 磷 酸 (ATP) 以 產 生 生 物 體 所 需 能 量 除 了 紫 膜 所 提 供 的 6
光 轉 化 促 使 質 子 濃 度 梯 度 促 使 ATP 合 成 產 生 能 量 以 外, 也 可 以 替 嗜 鹽 菌 於 高 鹽 的 環 境 下 建 立 跨 膜 的 鈉 離 子 電 化 學 梯 度 細 菌 視 紫 質 與 人 體 中 視 網 膜 上 的 柱 狀 細 胞 所 含 有 的 視 紫 質 (rhodopsin) 此 類 蛋 白 類 似, 皆 由 呈 紫 色 的 視 黃 醛 (retinal) 做 為 基 質 一 般 當 嗜 鹽 菌 存 在 的 環 境 惡 劣 ( 例 : 氧 氣 濃 度 過 低 ) 及 具 有 光 線 照 射 的 綜 合 條 件 下, 因 無 法 藉 由 氧 化 磷 酸 化 產 生 提 供 足 夠 能 量, 需 要 藉 由 紫 膜 製 造 光 合 磷 酸 化 來 提 供 能 量 時 才 會 產 生 紫 膜 的 合 成 ( 沈,2003) 2.3. 嗜 鹽 菌 Haloferax mediterranei 介 紹 Haloferax mediterranei 是 一 株 由 地 中 海 所 分 離 得 到 的 極 端 嗜 鹽 菌, 其 最 佳 的 生 長 環 境 為 鹽 濃 度 20-25% H. mediterranei 菌 體 內 會 累 積 一 種 名 為 聚 羥 基 丁 酸 (poly-β-hydroxybutyrate, PHB) 的 高 分 子 顆 粒, 聚 羥 基 丁 酸 為 廣 泛 應 用 於 生 物 可 分 解 性 塑 膠 (biodegradable plastics) 的 天 然 原 料, 廢 棄 掩 埋 後 可 被 微 生 物 完 全 分 解 (Fernandez-Castillo et al., 1986) 由 於 H. mediterranei 的 最 佳 生 長 鹽 濃 度 為 20-25%, 因 此 當 鹽 濃 度 低 於 10% 時, 菌 體 中 會 因 內 外 滲 透 壓 不 平 衡 而 致 使 細 胞 破 裂 因 此 當 環 境 中 的 鹽 濃 度 快 速 下 降 時, 嗜 鹽 菌 會 產 生 一 種 紅 色 的 菌 紅 素 (bacterioruberin), 來 抵 抗 低 鹽 環 境 所 造 成 的 滲 透 壓 失 衡 (D Souza et al., 1997) 7
2.4. 類 胡 蘿 蔔 素 的 介 紹 類 胡 蘿 蔔 素 (carotenoid) 為 一 種 色 彩 鮮 豔 的 黃 紅 色 系 脂 溶 性 色 素, 具 有 良 好 的 抗 氧 化 性, 廣 泛 存 在 植 物 動 物 及 微 生 物 中 根 據 化 學 結 構, 可 將 類 胡 蘿 蔔 素 分 為 二 類 : 一 類 為 碳 氫 ( 羥 ) 類 胡 蘿 蔔 素 (hydrocarbon carotenoids), 分 子 中 不 含 氧, 例 如 :β-carotene 及 lycopene; 另 一 類 是 帶 氧 類 胡 蘿 蔔 素 (oxycarotenoids) 或 是 葉 黃 素 (xanthophylls), 是 類 胡 蘿 蔔 素 衍 生 物 中 含 氧 者, 在 其 分 子 的 兩 端 具 有 hydroxyl group 或 carbonyl group, 或 兩 者 皆 有, 例 如 :astaxanthin β-cryptoxanthin canthaxanthin capsanthin lutein 和 zeaxanthin(el-agamey et al., 2004) 近 期 的 研 究 指 出, 類 胡 蘿 蔔 素 因 有 長 碳 鏈 的 共 軛 雙 鍵 (conjugated double bonds), 經 由 打 斷 共 軛 雙 鍵 吸 收 單 氧 (singlet oxygen) 及 自 由 基 (free radicals), 減 少 對 體 內 的 傷 害, 因 而 具 有 良 好 的 抗 氧 化 能 力 (Cantrell et al., 2003) 2.4.1. β- 胡 蘿 蔔 素 β- 胡 蘿 蔔 素 分 子 式 C 40 H 56, 是 一 直 鏈 型, 兩 尾 環 化 成 六 圓 環 的 碳 氫 化 合 物, 內 含 11 個 共 軛 雙 鍵 及 2 個 非 共 軛 的 雙 鍵, 此 特 有 的 結 構 使 其 能 吸 收 在 420-550 nm 的 可 見 光 區, 最 大 的 吸 收 波 長 為 448-551 nm β- 胡 蘿 蔔 素 易 受 到 光 熱 和 空 氣 的 破 壞, 退 化 及 異 構 化 成 cis 型 態 (Marty and Berset, 1990) β- 胡 蘿 蔔 素 屬 脂 溶 性, 可 溶 於 甲 苯 二 氯 化 碳 及 石 8
油 醚 等, 微 溶 於 乙 醇 和 甲 醇 β- 胡 蘿 蔔 素 是 種 具 抗 氧 化 活 性 的 類 胡 蘿 蔔 素, 其 抗 氧 化 力 可 以 藉 由 吸 收 活 性 氧 的 能 量 以 阻 止 其 產 生 破 壞 性 反 應, 且 可 以 與 脂 質 過 氧 化 自 由 基 結 合 而 中 斷 脂 質 過 氧 化 的 連 鎖 反 應 β- 胡 蘿 蔔 素 亦 可 與 引 起 連 鎖 反 應 之 脂 質 過 氧 基 (COO ) 作 用 而 減 少 油 脂 的 氧 化, 即 其 可 保 護 細 胞 膜 不 受 自 由 基 的 破 壞 (Rouseff and Nagy, 1994) 2.4.2. 茄 紅 素 茄 紅 素 (lycopene) 屬 於 類 胡 蘿 蔔 素 (carotenoids) 的 一 種, 呈 紅 色, 創 造 出 蕃 茄 的 紅 顏 色 其 雖 不 具 有 維 生 素 A 的 效 價 (Stahl and Sies, 1996; Gerster, 1997), 卻 有 很 強 之 抗 氧 化 活 性, 而 且 大 量 存 在 於 蕃 茄 及 其 加 工 產 品 中 (Tonucci et al., 1995) 茄 紅 素 的 分 子 式 為 C40H56, 非 環 化 直 鏈 排 列 的 碳 氫 化 合 物, 具 有 11 個 共 軛 雙 鍵 和 2 個 非 共 軛 雙 鍵, 親 油 性, 最 大 的 吸 收 波 長 為 472 nm 外 觀 是 暗 紅 色 針 狀 或 柱 狀 的 結 晶, 熔 點 175, 易 溶 於 氯 仿 及 苯 中, 在 乙 醚 中 的 溶 解 度 是 0.33 g/l, 在 己 烷 中 的 溶 解 度 是 0.07g/L, 微 溶 於 乙 醇 甲 醇, 完 全 不 溶 於 水 在 大 多 食 物 中, 茄 紅 素 及 其 他 類 胡 蘿 蔔 素 皆 是 以 all - trans 的 結 構 存 在, 這 是 最 安 定 的 型 態 (Clinton, 1998), 但 如 果 遭 受 到 光 熱 能 或 化 學 反 應, 則 會 發 生 異 構 化 (isomerization), 將 trans 型 態 轉 換 成 cis 型 態 9
(Schierle et al., 1997) 蕃 茄 在 加 工 中, 會 有 cis 異 構 物 的 形 成, 含 量 約 5 10 %; 在 人 的 血 液 及 組 織 中,cis 異 構 物 的 含 量 則 更 高, 約 有 50 % 以 上, 攝 護 腺 組 織 中 高 達 80 % 的 含 量 茄 紅 素 可 作 為 抗 氧 化 劑, 其 功 效 與 β- 胡 蘿 蔔 素 維 生 素 E 一 樣, 主 要 是 清 除 體 內 脂 溶 性 部 分 的 自 由 基, 研 究 發 現, 茄 紅 素 是 抗 氧 化 性 最 強 的 類 胡 蘿 蔔 素, 其 清 除 單 態 氧 的 速 率 常 數 是 目 前 常 用 抗 氧 化 劑 維 生 素 E 的 100 倍, 是 β- 胡 蘿 蔔 素 的 兩 倍 多 (Ribaya-Mercado et al., 1995;Di Mascio et al., 1991) 2.4.3. 菌 紅 素 菌 紅 素 (bacterioruberin) 為 一 種 紅 色 的 類 胡 蘿 蔔 素, 是 由 50 個 碳 原 子 (C 50 ) 所 構 成 的 長 鏈 結 構, 屬 於 高 碳 類 胡 蘿 蔔 素, 其 碳 鏈 比 一 般 常 見 的 類 胡 蘿 蔔 素 長 ( 陳 炳 輝,2000) 菌 紅 素 的 與 茄 紅 素 (Lycopene) 主 體 結 構 類 似, 都 有 兩 端 開 環 的 結 構, 但 菌 紅 素 的 碳 鏈 (C 50 ) 比 茄 紅 素 碳 鏈 (C 40 ) 長, 因 此 也 比 茄 紅 素 多 兩 個 共 軛 雙 鍵, 且 兩 端 各 有 兩 個 hydroxy group, 是 屬 於 葉 黃 素 類 (xanthophy) 的 類 胡 蘿 蔔 素 (Oren et al., 2001) 菌 紅 素 是 由 一 種 生 長 在 高 鹽 環 境 下 的 古 生 物 - 極 端 嗜 鹽 菌 Haloferax mediterranei 所 生 產, 其 喜 好 在 鹽 濃 度 20-25% 下 生 長, 但 是 當 環 境 中 的 鹽 濃 度 低 於 10% 時, 嗜 鹽 菌 體 內 會 生 產 大 量 的 紅 色 菌 紅 素, 可 用 來 抵 抗 低 鹽 環 境 所 造 成 的 滲 透 壓 (D Souza et al., 1997) 菌 紅 素 與 其 10
他 類 胡 蘿 蔔 素 一 樣, 具 備 光 保 護 (photo-protective) 的 能 力, 可 以 藉 由 吸 收 過 多 的 光 能 (light harvesting) 用 來 保 護 細 胞, 使 細 胞 免 於 受 到 紫 外 線 的 傷 害 (Saito et al., 1997 ; Shahmohammadi et al., 1998) 2.5. 自 由 基 與 抗 氧 化 2.5.1. 自 由 基 生 物 在 演 化 過 程 中 受 到 自 由 基 的 威 脅 因 此, 生 物 在 演 化 過 程 中 本 身 也 發 展 出 抗 氧 化 物 質 (antioxidants) 以 及 抗 氧 化 酵 素 (antioxidant enzymes) 以 對 抗 自 由 基 所 帶 來 的 危 害 ( 呂 鋒 洲,1993) 一 般 而 言, 生 物 的 抗 氧 化 系 統 與 自 由 基 引 起 的 氧 化 傷 害 會 維 持 平 衡 的 狀 態 但 當 生 物 體 因 外 在 環 境 因 素 或 內 在 生 理 障 礙 時, 造 成 自 由 基 過 多 增 加 氧 化 逆 境, 導 致 氧 化 逆 境 與 抗 氧 化 系 統 失 衡, 而 引 起 各 種 疾 病 及 老 化 的 發 生 (Foyer and Fletcher, 2001) 自 由 基 有 非 常 多 的 種 類, 大 部 分 是 瞬 間 產 生, 其 半 衰 期 極 短, 對 人 體 有 重 大 影 響 的 可 歸 納 為 以 下 五 種 : 2.5.1.1. 超 氧 自 由 基 (superoxide anion radical; O 2 -) - O 2 是 所 有 有 氧 生 物 都 會 產 生 的 形 式 也 是 最 初 且 最 常 產 生 的 一 種 ROS 當 吞 噬 細 胞 (phagocytic cells) 與 外 來 物 或 免 疫 複 合 體 (immune complex) 接 觸 時, 以 及 粒 線 體 的 電 子 傳 遞 過 程 中 可 能 會 產 生 O - - 2 O 2 11
的 半 衰 期 極 短, 所 以 很 少 直 接 對 生 物 體 造 成 傷 害, 但 其 所 造 成 的 連 鎖 反 應 會 產 生 二 級 或 三 級 產 物, 將 會 對 生 物 體 產 生 更 嚴 重 的 傷 害 (Barotosz, 2003) 人 體 類 內 含 有 Mn-SOD CuZn-SOD 等 可 以 有 效 的 將 這 些 超 氧 化 物 自 由 基 轉 化 成 為 H 2 O 2, 再 經 由 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (glutathione perxidase,gsh-px) 或 觸 酶 (catalase) 等 可 將 其 轉 化 為 無 害 的 H 2 O (Halliwell, 1995) O 2 + e - O 2 - SOD 2 O - 2 + 2H + H 2 O 2 +O 2 catalase 2H 2 O 2 2H 2 O+O 2 GSH-Px 2.5.1.2. 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide;h 2 O 2 ) H 2 O 2 是 由 O 2 接 受 兩 個 氫 離 子 再 經 超 氧 歧 化 酶 (superoxide dismutase,sod) 催 化 產 生, 或 經 由 吞 噬 細 胞 的 吞 噬 作 用 及 其 他 酵 素 或 非 酵 素 的 反 應 生 成 SOD 2O 2 + 2H + 3 O 2 + H 2 O 2 2O 2 + 2H + 1 O 2 + H 2 O 2 O 2 - + 2H + H 2 O 2 H 2 O 2 是 一 種 很 穩 定 的 活 性 氧, 分 子 結 構 與 水 相 似, 能 通 過 細 胞 膜 進 入 細 胞 內, 並 和 細 胞 內 的 金 屬 離 子 (Fe 2+ Cu + ) 交 互 作 用 形 成 芬 頓 反 12
應 (fenton reaction), 產 生 高 活 性 的 羥 自 由 基 (Ahsan et al.., 2003) 2.5.1.3. 羥 自 由 基 (hydroxyl radical; OH) OH 可 經 由 芬 頓 反 應 及 哈 伯 - 魏 氏 反 應 (Haber-Weiss reaction) 產 生 另 外, 照 射 X-ray 或 過 多 的 紫 外 線 也 都 會 大 量 產 生 OH O 2 + Fe 3+ Fe 2+ + O 2 Fe 2+ + H 2 O 2 H 2 O 2 + O 2 + H + Fe 3+ + OH + OH OH+ 1 O 2 + H 2 O OH 是 一 種 活 性 極 強 的 自 由 基, 它 會 造 成 體 內 脂 質 過 氧 化 作 用, 進 而 傷 害 細 胞, 亦 可 以 與 任 何 生 物 體 內 的 物 質 反 應, 包 括 醣 類 蛋 白 質 磷 脂 質 核 醣 體 等, 特 別 是 使 細 胞 凋 亡 (apoptosis) 或 DNA 突 變 (Bartosz, 2003;Ahsan et al.., 2003) 2.5.1.4. 單 旋 氧 (singlet oxygen; 1 O 2 ) 當 體 內 穩 定 的 氧 受 到 紫 外 線 照 射, 會 產 生 大 量 不 穩 定 的 氧 分 子, 因 電 子 逆 向 旋 轉, 造 成 氧 分 子 處 於 不 穩 定 的 激 發 狀 態, 極 容 易 和 氫 反 應, 造 成 脂 質 氧 化 及 形 成 另 一 個 自 由 基 (Halliwell, 1994) 2.5.1.5. 過 氧 化 脂 質 (lipid hydroperoxide;looh) 脂 質 和 脂 蛋 白 中 的 不 飽 和 脂 肪 酸 對 因 自 由 基 引 起 的 氧 化 特 別 敏 感 當 不 飽 和 脂 肪 酸 被 自 由 基 氧 化 後 會 造 成 連 鎖 反 應, 所 以 會 產 生 LOOH 脂 質 過 氧 化 不 僅 會 破 壞 脂 質 導 致 細 胞 膜 的 損 傷, 脂 質 氧 化 會 產 生 一 些 二 13
級 產 物, 特 別 是 丙 二 醛 (malondialdehyde;mda) 會 與 生 物 體 組 成 如 蛋 白 質 氨 基 酸 和 DNA 反 應, 引 起 相 關 的 疾 病 發 生 (Fang et al., 2002; Halliwell, 1994;Urso and Clarkson, 2003) LOOH+Fe 2+ (Cu + ) LOOH+Fe 2+ LOO +Fe 2+ +H + LO +Fe 3+ (Cu 2+ )+ OH 2.5.2. 自 由 基 對 生 物 體 之 影 響 自 由 基 於 生 物 體 內 多 種 生 理 及 生 化 反 應 過 程 中 扮 演 訊 息 傳 遞 的 角 色 氧 自 由 基 在 生 物 體 內 是 重 要 的 訊 息 傳 遞 者 並 參 與 基 因 轉 錄 的 過 程 ; 一 氧 化 氮 (NO) 是 一 種 廣 泛 存 在 的 訊 息 分 子, 人 體 的 組 織 或 細 胞 內 的 生 理 反 應 中 都 可 以 發 現 NO 的 參 與 藉 由 內 皮 細 胞 產 生 NO 調 控 血 管 平 滑 肌 細 胞 的 老 化 與 增 生 白 血 球 的 黏 附 血 小 板 的 聚 集 血 管 強 化 (vascular tone) 血 栓 形 成 和 血 液 流 動 等 此 外 NO 也 是 免 疫 反 應 過 程 中 的 重 要 中 間 產 物 另 外, 氧 含 鐵 硫 的 氧 化 酵 素 自 由 基 和 其 他 活 性 分 子 皆 會 造 成 氨 基 酸 蛋 白 質 和 脂 質 的 傷 害, 藉 此 導 致 細 胞 的 受 傷 或 死 亡 例 如, 輻 射 誘 導 ROS 產 生 進 而 改 變 超 氧 歧 化 酶 (SOD) 的 生 理 化 學 和 免 疫 的 特 性, 導 致 細 胞 內 氧 化 傷 害 加 重 此 外, 自 由 基 所 產 生 的 細 胞 毒 素 會 對 哺 乳 動 物 的 細 胞 有 害 並 間 接 引 發 許 多 慢 性 疾 病 的 發 生, 所 以 自 由 基 在 生 物 體 內 所 扮 演 的 角 色 是 一 體 兩 面 的 (Fang et al.. 2002) 14
2.5.3. 生 物 體 的 抗 氧 化 反 應 原 始 的 無 氧 呼 吸 生 命 型 態 由 於 演 化 出 利 用 氧 氣 進 行 代 謝 的 機 轉, 因 而 進 化 為 具 有 複 雜 機 能 的 高 等 生 物 ( 包 括 人 類 在 內 ) 在 這 過 程 中, 為 了 避 免 氧 的 毒 性 所 造 成 的 傷 害, 大 部 分 的 生 物 體 都 演 化 出 精 密 的 抗 氧 化 系 統 來 對 抗 自 由 基 與 活 性 氧 引 起 的 氧 化 逆 境 ( 蔡 坤 志, 2002) 生 物 體 的 抗 氧 化 系 統 分 為 酵 素 系 統 與 非 酵 素 系 統 兩 類, 其 都 具 有 移 除 或 抑 制 自 由 基 與 活 性 氧 的 能 力, 並 可 修 補 因 自 由 基 所 引 起 的 傷 害 生 物 體 的 抗 氧 化 酵 素 系 統 包 括 超 氧 歧 化 酶 (superoxide dismutase; SOD) 觸 酶 (catalase ;CAT) 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (glutathione peroxidase;gshpx) 抗 壞 血 酸 過 氧 化 酶 (ascorbate peroxidase;apx) 等 基 本 上 這 些 酵 素 必 須 結 合 一 些 微 量 元 素 如 鋅 銅 鎂 鐵 砷 等, 作 為 功 能 性 的 氧 化 還 原 中 心 SOD 可 以 兩 個 超 氧 自 由 基 與 兩 個 氫 離 子 生 成 氧 和 過 氧 化 氫, 在 粒 線 體 中 含 有 以 錳 為 反 應 中 心 的 SOD, 細 胞 質 的 SOD 則 是 以 銅 和 鋅 為 反 應 中 心 GSHPx 是 以 砷 為 反 應 中 心, 其 藉 由 將 還 原 態 的 麩 胱 甘 肽 (glutathione;gsh) 氧 化 為 氧 化 態 的 麩 胱 甘 肽 硫 化 物 (glutathione disulfide; GSSG) 進 而 清 除 H 2 O 2 而 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 (glutathione reductase;gsh-r) 則 以 NADPH 為 還 原 力 將 GSSG 再 生 成 GSH 觸 酶 則 具 有 過 氧 化 酶 的 活 性, 可 迅 速 清 除 H 2 O 2 ( 吳 伯 宏,2004; Halliwell, 1994;Wickens, 2001) 15
生 物 體 的 抗 氧 化 非 酵 素 系 統 包 括 抗 壞 血 酸 (ascorbic acid) 維 生 素 E(tocopherol) β- 胡 蘿 蔔 素 (β-carotene) 麩 胱 甘 肽 (glutathione, GSH) 等 抗 壞 血 酸 可 作 為 APX 的 電 子 提 供 者, 抑 制 細 胞 內 H 2 O 2 的 累 積 GSH 可 作 為 的 H 2 O 2 還 原 劑, 在 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 催 化 的 反 應 中 可 將 過 氧 化 物 還 原 維 生 素 E 則 利 用 苯 環 上 的 羥 基, 使 羥 基 的 氫 原 子 容 易 被 自 由 基 奪 走, 而 成 為 安 定 的 α- tocopherol radical, 而 不 會 再 攻 擊 其 他 分 子, 而 氧 化 型 的 維 生 素 E 可 以 被 抗 壞 血 酸 和 麩 胱 甘 肽 還 原 (Kaur and Kapoor, 2001;Temple, 2000) 2.5.4. 抗 氧 化 的 測 定 法 由 於 過 去 許 多 研 究 都 指 出 活 性 氧 (ROS) 及 活 性 氮 (RNS) 會 致 使 養 化 產 生 造 成 許 多 疾 病 發 生 近 年 來 許 多 發 表 致 力 於 抗 氧 化 及 抗 氧 化 物 相 關 的 研 究 因 此 有 許 多 方 便 簡 單 且 可 快 速 偵 測 的 體 外 抗 氧 化 分 析 法 被 開 發 出 來 目 前 的 抗 氧 化 偵 測 法 主 要 可 以 分 為 兩 大 類 : (1) 直 接 清 除 ROS 或 RNS 自 由 基 法 大 多 以 生 物 酵 素 法 或 是 以 微 弱 化 學 發 光 法 偵 測, 包 括 : 過 氧 化 物 (ROO ) 清 除 能 力 分 析 超 氧 化 物 (O 2 ) 清 除 能 力 分 析 過 氧 化 氫 (H 2 O 2 ) 清 除 能 力 分 析 羥 自 由 基 (HO ) 清 除 能 力 分 析 16
單 旋 氧 ( 1 O 2 ) 清 除 能 力 分 析 過 氧 化 氮 (ONOO ) 清 除 能 力 分 析 (2) 清 除 物 穩 定 的 化 學 法 大 多 以 非 生 物 法 之 化 學 法 偵 測, 包 括 : 清 除 2,2 -azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate) 自 由 基 陽 離 子 (ABTS +) 分 析 法 或 Trolox 當 量 抗 氧 化 力 分 析 (TEAC) 清 除 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH ) 分 析 法 鐵 離 子 還 原 力 法 (FRAP assay) Folin Ciocalteu 還 原 力 分 析 法 (FC assay) 以 下 介 紹 幾 種 常 用 的 抗 氧 化 分 析 法 的 測 定 原 理 : 1. α,α-diphenyl-βpicrylhydrazyl(dpph) 自 由 基 之 清 除 能 力 測 定 抑 制 油 脂 氧 化 的 抗 氧 化 劑, 通 常 是 藉 由 提 供 氫 來 捕 捉 油 脂 的 過 氧 化 自 由 基, 故 使 用 DPPH (C 18 H 12 N 6 O 5 ) 來 檢 測 抗 氧 化 劑 提 供 氫 離 子 的 能 力 油 脂 在 自 氧 化 作 用 的 初 期 (Shimada et al., 1992) 在 油 脂 自 氧 化 作 用 初 期 (induction period) 會 產 生 alkyl 自 由 基, 在 連 鎖 引 發 期 間 (propagation period) 會 產 生 氫 過 氧 化 物 及 氧 自 由 基, 當 兩 個 自 由 基 互 相 結 合 時, 連 鎖 反 應 則 會 被 終 止 (Thamas, 1995) DPPH 為 一 種 很 穩 定 的 自 由 基, 其 經 濟 而 且 容 易 取 得, 其 甲 醇 溶 液 在 517 nm 下 有 強 吸 光, 當 DPPH 與 抗 氧 化 劑 反 應 時 其 吸 光 值 會 消 失, 因 此 在 517 nm 的 吸 光 值 越 低 即 表 示 抗 氧 17
化 劑 的 供 氫 能 力 越 強 (Shimada et al., 1992) DPPH + AH DPPH 2 + A (violet) (decolorized) DPPH 的 甲 醇 溶 液 會 隨 著 ph 值 及 時 間 而 有 所 變 化, 期 會 隨 著 時 間 增 長 而 逐 漸 劣 化, 但 在 ph 5.0~6.5 比 較 穩 定 且 有 適 當 的 吸 收, 在 鹼 性 時 則 不 穩 定 此 外,DPPH 的 甲 醇 溶 液 會 隨 時 間 的 增 長 而 逐 漸 劣 化, 固 實 驗 時 需 新 先 配 置 (Blosi, 1958) 2. 總 抗 氧 化 力 (ABTS radical cation decolorization assay) 測 定 原 理 為 利 用 化 學 氧 化 劑 使 ABTS ( 2,2 -azinobis- 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 產 生 具 有 長 活 性 的 自 由 基 陽 離 子 (ABTS + ), ABTS + 與 抗 氧 化 物 反 應 後 成 為 無 色 的 ABTS 2-, 利 用 波 長 734nm 觀 察 其 反 應 程 度, 吸 光 值 改 變 越 大 則 表 示 樣 品 抗 氧 化 能 力 越 好 此 法 的 優 點 在 於 反 應 的 ph 值 接 近 細 胞 生 理 環 境 的 ph 值, 且 可 適 用 於 測 定 脂 溶 性 與 水 溶 性 物 質, 方 法 簡 便 迅 速, 適 用 多 種 測 定 樣 品 (Aruoma, 2003; Proteggente et al., 2002) (Huang et al., 2005) 18
3. 還 原 能 力 測 定 還 原 作 用 主 要 是 從 物 質 中 捕 捉 氧 分 子 供 給 電 子 或 氫, 使 得 被 氧 化 的 過 氧 化 物 還 原, 進 而 抑 制 過 氧 化 物 的 生 成 (Shimada et al., 1992) 還 原 力 以 測 定 普 魯 士 藍 (prussian blue, Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 ) 生 成 量 為 指 標, 藉 由 赤 血 鹽 (pottassium ferricyanide, K 3 Fe(CN) 6 ) 還 原 成 黃 血 鹽 (K 4 Fe(CN) 6 ) 之 後, 再 與 三 價 鐵 離 子 作 用 生 成 普 魯 士 藍, 並 以 分 光 光 度 計 在 最 大 吸 收 波 長 700 nm 下 測 定 普 魯 士 藍 含 量, 用 以 檢 測 樣 品 的 還 原 力 (Oyaizu, 1986) 樣 品 若 將 鐵 離 子 還 原 成 亞 鐵 離 子, 再 與 三 價 鐵 生 成 普 魯 士 藍 而 吸 光 值 上 升, 則 表 示 樣 品 還 原 力 越 強 K 3 Fe(CN) 6 + sample K 4 Fe(CN) 6 + sample-oxide 3 K 4 Fe(CN) 6 + 4Fe 3+ Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 + 12K + 4. 螯 合 亞 鐵 離 子 能 力 測 定 脂 質 氧 化 一 般 因 自 由 基 作 為 引 發 者 (initiator), 但 反 應 需 有 金 屬 離 子 催 化 下 產 生 大 量 自 由 基, 而 加 速 對 人 體 傷 害 (Halliwell et al., 1995) 在 多 種 金 屬 離 子 中,Fe 2+ 為 最 具 有 影 響 力 的 助 氧 化 劑, 會 促 使 脂 質 氧 化 作 用 的 進 行 (Yamaguchi et al., 1988), 此 實 驗 法 是 利 用 Fe 2+ 與 ferrozine 的 複 合 物 在 562 nm 之 呈 色 反 應, 可 測 得 樣 品 對 Fe 2+ 離 子 之 螯 合 能 力 (Dinis et al., 1994) 當 樣 品 螯 合 Fe 2+ 離 子 時, 會 降 低 562 nm 的 吸 光 值 Fe 2+ + ferrozine ferrozine- Fe 2+ complex (violet) 19
5. 超 微 弱 化 學 發 光 測 定 超 氧 自 由 基 實 驗 原 理 是 利 用 螯 合 劑 lucigenin 補 捉 超 氧 自 由 基 (O2- ) 並 在 結 合 後 以 此 儀 器 紀 錄 其 所 發 出 之 冷 光 (chemiluminescence), 以 累 積 之 光 子 數 (CPS,Countsper second) 來 定 量 超 氧 自 由 基 (Belch et al., 1995; Liu et al., 2000;Tsai et al., 2003) 以 丙 酮 醛 (methylglyoxal) 及 精 氨 酸 (arginine) 啟 動, 產 生 兩 種 自 由 基 型 態 (a, b), 當 (b) 與 氧 反 應 時 即 可 產 生 超 氧 陰 離 子, 加 入 探 針 後 再 以 超 微 弱 化 學 發 光 儀 檢 測 2.6. 肝 癌 先 前 有 許 多 文 獻 顯 示 自 由 基 中 的 活 性 氧 及 活 性 氮 會 對 各 種 胺 基 酸 造 成 氧 化 傷 害, 使 雙 股 DNA 股 突 變 受 傷, 導 致 蛋 白 質 的 立 體 結 構 與 酵 素 活 性 的 變 化, 進 而 導 致 相 關 疾 病 的 發 生, 例 如 造 成 癌 症 的 發 生 ( 蔡 坤 志, 2002) 而 肝 癌 在 亞 洲 地 區 是 一 種 非 常 普 遍 的 惡 性 腫 瘤, 以 台 灣 地 區 而 言 則 20
是 常 見 的 惡 性 腫 瘤 之 一, 原 發 性 肝 癌 (hepatocellularcarcinoma;hcc) 分 為 三 種 類 型 : 肝 細 胞 癌 (hepatocellular carcinoma;hcc), 膽 管 癌 ( cholangiocarcinoma ), 及 肝 細 胞 膽 管 癌 (mixedhepatocholangiocarcinoma) 這 三 種 原 發 性 肝 癌 中, 以 HCC 的 患 者 數 最 多, 約 佔 80%, 而 其 中 60%-80% 是 由 肝 硬 化 轉 變 而 來, 根 據 統 計 數 據 來 看, 發 現 台 灣 95% 以 上 的 肝 癌 患 者 都 有 B 形 肝 炎 表 面 抗 原 (HBsAg) 另 外 有 研 究 報 告 指 出 男 性 罹 患 肝 癌 的 機 率 比 女 性 還 要 高, 比 例 約 6:1, 這 種 比 例 其 中 一 定 許 多 未 知 的 因 素, 至 今 原 因 不 明 (Trevisani et al., 1993; Ng et al., 1995) 2.6.1 肝 癌 的 生 成 有 學 者 的 研 究 報 告 指 出 人 類 肝 細 胞 癌 本 身 是 一 種 多 元 誘 因 的 疾 病, 可 能 與 以 下 幾 點 因 素 有 關 : (1) 黃 麴 毒 素 (Aflatoxin,AF): 黃 麴 毒 素 是 由 黃 麴 菌 和 寄 生 麴 黴 菌 代 謝 後 所 產 生 的 毒 素, 流 行 病 學 家 研 究 指 出, 攝 取 含 黃 麴 毒 素 的 食 物 與 肝 癌 發 生 有 極 密 切 的 關 係 另 外 有 動 物 實 驗 指 出, 以 受 感 染 的 食 物 或 純 黃 麴 毒 素 來 為 餵 食 實 驗 動 物 也 會 引 起 動 物 產 生 肝 癌 (2) 抽 煙 和 喝 酒 : 抽 煙 對 身 體 百 害 而 無 一 利, 由 於 香 煙 中 的 尼 古 丁 在 肝 臟 分 解, 並 會 21
造 成 肝 臟 的 負 擔 一 旦 患 者 又 喝 酒 過 量, 就 會 造 成 肝 臟 的 負 擔 增 加, 經 過 日 積 月 累 的 結 果, 勢 必 會 影 響 肝 功 能, 導 致 脂 肪 肝 酒 精 性 肝 炎, 甚 至 肝 硬 化 進 而 導 致 肝 癌 的 形 成 (3) 肝 炎 病 毒 (HBV HCV): B 型 肝 炎 病 毒 屬 於 環 狀 DNA 病 毒 (Mason et al., 1982) 1970-1980 年 間, 許 多 流 行 病 學 家 及 病 毒 分 子 學 家 提 出 強 烈 的 證 據 認 為 HBV 的 感 染 與 肝 癌 的 形 成 有 密 切 關 係 (Beasley, 1988) 但 是 整 個 感 染 的 機 制 還 尚 不 清 楚, 直 到 最 近 的 研 究 報 告 指 出 插 入 到 宿 主 細 胞 中 的 HBV DNA 可 能 會 引 起 細 胞 內 致 癌 基 因 的 活 化 (Koshy and Hofschneider, 1989) 因 而 導 致 肝 癌 的 形 成 而 且 B 型 肝 炎 可 以 寄 生 在 人 類 及 屬 於 靈 長 類 的 猩 猩 個 體 上, 以 體 液 及 排 泄 物 為 主 要 感 染 媒 介, 其 中 包 括 血 液 唾 液 及 精 液 為 主 要 因 素 ; 而 打 針 注 射 破 損 的 黏 膜 皮 膚 周 產 期 感 染 及 經 由 性 行 為 接 觸 感 染 為 另 一 種 主 要 的 傳 染 途 徑 另 外,C 型 肝 炎 也 是 主 要 導 致 肝 癌 形 成 的 原 因 之 一,HCV 是 一 種 RNA 病 毒, 主 要 以 人 類 為 宿 主 臨 床 上 的 證 據 顯 示 C 型 肝 炎 導 致 肝 癌 的 因 素 主 要 是 打 針 注 射 或 者 被 污 染 的 血 液 製 劑 傳 染, 並 且 發 現 日 本 人 形 成 肝 癌 的 主 要 因 素 來 自 於 C 型 肝 炎 病 毒 的 感 染, 所 以 至 今 的 文 獻 中 是 導 致 日 本 人 肝 癌 的 主 要 原 因 所 以 綜 合 以 上 幾 點 原 因 可 以 得 知 整 個 肝 癌 的 形 成 可 能 包 含 不 同 的 致 癌 物 ( 抽 煙 喝 酒 ) 的 產 生 肝 炎 病 毒 (HBV HCV) 的 侵 襲 及 肝 硬 化 22
的 因 素, 都 可 能 會 造 成 肝 癌 的 形 成 但 至 今 沒 有 文 獻 指 出 何 種 病 毒 或 致 癌 物 會 直 接 誘 導 肝 癌 的 證 據 (Ochiya et al., 1986; Robinson, 1994) 2.6.2 肝 癌 與 類 胡 蘿 蔔 素 許 多 天 然 的 類 胡 蘿 蔔 素 都 被 證 實 具 有 抗 癌 的 活 性 流 行 病 學 的 研 究 發 現 癌 症 的 危 險 因 子 與 黃 綠 色 的 蔬 菜 水 果 消 耗 量 有 反 比 的 關 係 自 從 β-carotene 從 蔬 果 中 被 發 現 後 就 被 許 多 研 究 發 表 認 為 有 抗 癌 的 功 能 研 究 指 出 多 種 食 物 中 的 類 胡 蘿 蔔 素 具 有 抗 癌 的 能 力 :lutein, lycopene, zeaxanthin 以 及 β-cryptoxanthin 分 析 這 些 天 然 類 胡 蘿 蔔 素 的 抗 癌 能 力 的 機 轉 目 前 正 在 進 行 中, 如 :β-cryptoxanthin 被 發 現 可 刺 激 RB gene 以 及 p73 gene 的 表 現 目 前 多 種 混 合 的 天 然 類 胡 蘿 蔔 素 被 認 為 具 有 預 防 癌 症 的 功 能 並 被 廣 泛 的 研 究 (Nishino et al., 2000) 流 行 病 學 研 究 指 出 高 量 lycopene 的 攝 取 與 降 低 多 種 癌 症 的 罹 患 風 險 有 關 近 期 的 研 究 指 出 血 清 中 含 有 高 量 的 lycopene 或 是 規 律 的 攝 食 lycopene 及 番 茄 與 降 低 肝 癌 及 攝 護 腺 癌 有 關 體 外 測 試 中, 當 lycopene 的 劑 量 達 到 5 μmol/l 時 能 有 效 的 抑 制 大 鼠 肝 癌 細 胞 AH109A, 且 lycopene 於 體 外 測 試 可 抑 制 人 類 肝 癌 細 胞 SK-Hep-1 細 胞 轉 移 近 期 有 動 物 實 驗 發 現, 每 週 餵 食 大 鼠 兩 次 lycopene(20 mg/kg body weight) 持 續 12 週 後 可 有 效 的 減 少 肝 癌 細 胞 的 轉 移 增 加 且 可 抑 制 血 管 增 生 (Huang et al., 2008) 23
2.7. 黑 色 素 及 美 白 作 用 2.7.1. 黑 色 素 細 胞 黑 色 素 細 胞 為 樹 突 狀 的 單 細 胞 分 泌 細 胞, 佔 表 皮 細 胞 的 5-10%, 位 於 表 皮 中 的 基 底 層 與 有 棘 層 之 間, 黑 色 素 細 胞 亦 存 在 於 毛 囊 之 中, 它 們 是 黑 色 素 的 製 造 者 這 種 細 胞 的 細 胞 體 呈 圓 形, 並 且 有 長 而 不 規 則 的 突 起, 分 枝 進 入 表 皮, 走 在 基 底 層 與 有 棘 層 之 間 ( 許 元 昱 等,1992; 徐 莉 萍,1991) Fitzpatrick 和 Breathnach 於 1963 年 發 表, 在 黑 色 素 細 胞 與 角 質 細 胞 間 有 很 特 別 的 功 能 與 構 造, 此 特 別 的 功 能 與 構 造 為 每 個 表 皮 黑 色 素 細 胞 會 分 泌 黑 色 素 顆 粒 注 射 進 入 限 量 的 鄰 近 角 質 細 胞, 此 過 程 稱 之 為 細 胞 分 泌 (cytocrine secretion)( 許 元 昱 等,1992; 徐 莉 萍,1991) 色 素 細 胞 與 鄰 近 一 群 角 質 細 胞 ( 約 36 個 ) 的 配 對 關 係 稱 為 表 皮 黑 色 素 單 位 (epidermalmelanin unit), 而 後 Breathnach 於 1980 年 將 此 親 近 的 關 係 稱 為 表 皮 共 生 ( 許 元 昱 等,1992) 當 所 形 成 的 黑 色 素 經 隨 同 角 質 層 的 代 謝 作 用 而 到 達 角 質 細 胞 時, 這 些 顆 粒 會 被 一 層 薄 膜 包 圍 而 聚 集 在 一 起 此 構 造 稱 之 為 黑 色 素 顆 粒 化 合 物 黑 色 素 在 表 皮 的 深 層 內 形 成, 並 向 皮 膚 表 面 移 動, 以 扮 演 其 保 護 的 角 色 其 實 在 往 上 移 動 的 過 程 中, 黑 色 素 細 胞 是 不 動 的, 而 是 由 角 質 細 胞 負 責 轉 移 的 工 作, 角 質 細 胞 將 這 些 黑 色 素 運 至 皮 膚 表 面, 以 形 成 保 護 24
的 屏 障, 雖 然 黑 色 素 是 由 黑 色 素 細 胞 所 生 成 的, 上 皮 細 胞 確 是 黑 色 素 的 倉 庫, 較 黑 色 素 細 胞 含 有 更 多 的 黑 色 素 ( 徐 莉 萍,1991) 無 論 肌 膚 較 白 或 較 黑, 都 擁 有 幾 乎 等 量 的 黑 色 素 細 胞, 而 其 中 的 差 異 在 於 : 膚 色 黑 者 之 ( 許 元 昱 等,1992) 黑 色 素 細 胞 較 為 活 躍, 可 生 產 較 多 的 黑 色 素 顆 粒 ( 徐 莉 萍,1991) 黑 色 素 無 法 被 肌 膚 內 的 酵 素 分 解 黑 色 素 細 胞 在 人 體 上 分 佈 的 密 度 因 部 位 的 不 同 而 有 差 異, 尤 其 是 在 紫 外 線 照 射 得 到 的 部 位, 黑 色 素 細 胞 的 密 度 會 增 加 一 個 人 約 有 20 億 個 黑 色 素 細 胞, 平 均 每 平 方 公 厘 有 1500 個, 通 常 於 皮 膚 基 底 層 頭 髮 毛 囊 軟 腦 膜 和 眼 睛 脈 絡 膜 中 部 有 黑 色 素 細 胞 的 存 在 2.7.2. 黑 色 素 形 成 和 酪 胺 酸 酶 活 性 作 用 的 關 係 黑 色 素 的 形 成 是 酪 胺 酸 (tyrosine) 在 黑 色 素 細 胞 (melanocytes) 中, 藉 著 酪 胺 酸 酶 (tyrosinase) 的 催 化 而 轉 變 成 多 巴 (dopa), 多 巴 再 轉 變 成 多 巴 醌 (dopaquinone) 等 一 連 串 的 氧 化 作 用 而 形 成, 酪 胺 酸 酶 是 此 反 應 過 程 的 唯 一 決 定 酵 素 (Prota, 1996) 因 此, 所 採 用 的 原 料 是 否 具 有 降 低 黑 色 素 形 成 和 有 美 白 效 果, 通 常 是 以 酪 胺 酸 酶 活 性 的 阻 滯 作 用 大 小 ( 阻 滯 率 %)(Bernard and Berthon, 2000) 來 評 定 的 2.7.3. 一 般 常 用 美 白 劑 的 機 轉 面 對 色 素 沉 澱 問 題 治 療 的 市 售 美 白 保 養 品 及 藥 品 成 分, 其 作 用 機 轉 不 外 乎 以 下 幾 類 : 25
(1) 酪 氨 酸 酵 素 的 直 接 或 間 接 的 抑 制 (Tyrosinase inhibitor) (2) 抗 氧 化 及 抗 自 由 基 作 用 (Anti-oxidation and anti-free radical) (3) 加 速 皮 膚 黑 色 素 的 移 除 (Enhance melanin elimination) (4) 黑 色 素 細 胞 的 毒 殺 作 用 (Melanocytotxic effect) (5) 防 曬 (Sunscreen) 雖 然 整 個 黑 色 素 形 成 的 生 理 機 轉 並 不 全 然 由 上 述 幾 種 作 用 來 得 以 減 少 黑 色 素 的 形 成 或 加 速 其 代 謝 移 除, 像 是 有 些 植 物 的 萃 取 物, 如 洋 甘 菊 的 萃 取 物, 亦 於 文 獻 中 被 提 及 能 針 對 表 皮 細 胞 所 分 泌 之 細 胞 激 素 (endothelin-1) 對 黑 色 素 細 胞 產 生 抑 制 的 作 用, 以 達 到 減 少 黑 色 素 形 成 的 目 的 (Hachiya et al., 2001); 或 像 是 具 有 抗 自 由 基 作 用 的 綠 茶 萃 取 物, 亦 被 提 及 具 有 藉 由 抑 制 黑 色 素 顆 粒 自 黑 色 素 細 胞 的 傳 遞 與 分 佈, 以 造 成 皮 膚 外 觀 色 澤 的 淡 化, 其 並 可 與 L-tyrosine 競 爭 性 地 與 酪 氨 酸 酵 素 的 活 性 位 置 結 合, 進 而 抑 制 黑 色 素 的 形 成 (No et al.,1999), 而 類 胡 蘿 蔔 素 也 有 具 有 良 好 的 抗 氧 化 功 能, 此 外, 類 胡 蘿 蔔 素 為 維 生 素 A 的 前 驅 物, 而 維 生 素 A 被 發 表 可 以 阻 斷 黑 色 素 的 生 成, 且 維 生 素 A 作 為 美 白 劑 可 以 誘 導 角 質 細 胞 中 色 素 微 粒 的 分 散 達 到 美 白 的 效 果 (Solano et al.,2006) 這 些 亦 皆 是 天 然 萃 取 物 應 用 於 美 白 的 例 子 但 這 其 中, 仍 是 以 藉 由 抑 制 酪 氨 酸 酵 素 (tyrosinase) 來 達 到 減 少 皮 膚 色 素 的 形 成 與 淡 化 斑 點 之 類 的 美 白 材 料 為 主 流 26
第 三 章 材 料 與 方 法 3.1. 色 素 的 來 源 與 定 量 3.1.1. 實 驗 儀 器 1. 高 速 離 心 機 (Beckman Model J2-21M/E,U.S.A) 2. 紫 外 光 - 可 見 光 分 光 光 度 計 (Jasco Model V-550,Japan) 3. 減 壓 濃 縮 機 組 (Eyela, N-N series; water bath SB-650; aspirator A-3S, low temperature circulator 631D, Tokyo, Japan) 3.1.2. 實 驗 藥 品 購 自 台 灣 景 明 化 工 : 甲 醇 丙 酮 購 自 日 本 和 光 純 藥 工 業 株 式 會 社 (Wako): 乙 酸 乙 酯 己 烷 庚 烷 3.1.3. 色 素 的 來 源 本 實 驗 中 所 有 使 用 的 H. mediterranei 類 胡 蘿 蔔 素 丙 酮 粗 萃 物 及 分 別 以 含 40% 乙 酸 乙 酯 之 己 烷 乙 酸 乙 酯 和 甲 醇, 自 silica gel 管 柱 層 析 分 離 所 得 之 三 種 類 胡 蘿 蔔 素, 分 別 命 名 為 hmerp 及 hmc1 hmc2 和 hmc3, 皆 取 自 同 實 驗 室 的 張 雅 琪 同 學 3.1.4. 色 素 的 定 量 將 放 入 褐 色 樣 品 瓶 已 純 化 並 以 氮 氣 吹 乾 的 色 素 加 入 100 μl 的 丙 酮 完 全 回 溶 ( 注 意 將 瓶 壁 上 的 色 素 收 下 ), 取 5 μl 的 丙 酮 色 素 液 加 入 995 μl 的 丙 酮 於 1.5 ml 微 量 離 心 管 中 混 合 均 勻 ( 稀 釋 兩 百 倍 ), 於 分 光 光 度 計 27
測 495 nm 波 長 的 吸 光 值, 計 算 菌 紅 素 的 濃 度 採 用 Ronnekleiv 及 Liaaen-Jensen 於 1995 所 提 出 菌 紅 素 的 消 光 係 數 (extinction coefficient, 1% E1 cm )2500 計 算 菌 紅 素 濃 度 的 計 算 式 如 下 : 菌 紅 素 濃 度 (ppm)= A 1% E1 cm D 10000 A: 吸 光 值 D: 稀 釋 倍 率 1% E1 cm : 消 光 係 數 (2500) 28
3.2. 抗 氧 化 能 力 分 析 本 實 驗 分 別 分 析 hmc3 清 除 α,α-diphenyl-βpicrylhydrazyl (DPPH) 自 由 基 能 力 總 抗 氧 化 力 (ABTS radical cation decolorization assay) 還 原 力 抑 制 共 軛 雙 烯 生 成 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 以 及 使 用 微 弱 化 學 發 光 儀 測 超 氧 自 由 基 (O - 2 ) 清 除 能 力 等 3.2.1. 實 驗 儀 器 1. 紫 外 光 - 可 見 光 分 光 光 度 計 (Jasco,Model V-550,Japan) 2. 自 動 酵 素 免 疫 分 析 儀 (Thermo,Multiskan,IMSA-0039,USA) 3. 高 速 微 量 離 心 機 (Hermel,Model Z233MZ,Germany) 4. BPCL 超 微 化 學 發 光 偵 測 儀 ( 中 國 科 學 院 生 物 物 理 所,Model BPCL-A-KIC,China) 3.2.2. 實 驗 藥 品 購 自 日 本 和 光 純 藥 工 業 株 式 會 社 (Wako): ethylene diamine tetraacetic acid(edta) trichloroacetic acid 購 自 美 國 Sigma 公 司 : FeCl 3.6H 2 O K 3 Fe(CN) 6 butylated hydroxyanisole(bha) trolox β-carotene 2,2-diphenyl-1-picryhydrazy ( DPPH ) cis-9,cis-12-octadecadienoic acid potassium ferricyanide 2,2 azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid]diammonium salt 29
(ABT) potassium persulfate Bis-N-methylacridinium (lucigenin) arginine methylglyoxal 購 自 台 灣 景 明 化 工 : 甲 醇 丙 酮 3.2.3. 清 除 DPPH 自 由 基 能 力 的 測 定 清 除 α,α-diphenyl-βpicrylhydrazyl(dpph) 自 由 基 能 能 力 測 定 為 參 考 Shimada 等 人 (1992) 所 述 的 方 法 加 以 修 改 取 80 μl 的 濃 度 為 50 μm hmc3 及 β-carotene 甲 醇 溶 液, 加 入 20 μl 以 甲 醇 新 鮮 配 製 的 1 mm DPPH 的 反 應 液 (DPPH 甲 醇 反 應 液 需 在 配 置 好 3 小 時 內 使 用 完 畢 ), 兩 者 均 勻 混 合 避 光 靜 置 30 分 鐘 後, 使 用 分 光 光 度 計 檢 測 517 nm 的 吸 光 値 以 甲 醇 取 代 樣 品 作 為 控 制 組, 若 樣 品 吸 光 値 越 低 則 表 示 樣 品 清 除 DPPH 自 由 基 的 能 力 越 強 以 BHA 及 trolox 作 為 positive control DPPH 自 由 基 清 除 率 (Scavenging of DPPH)% = (1- 樣 品 於 517 nm 吸 光 値 / 控 制 組 於 517 nm 之 吸 光 値 ) 100% 3.2.4. 總 抗 氧 化 力 之 測 定 參 考 Re 等 人 (1999) 所 述 的 方 法 加 以 修 飾 方 法 為 先 配 製 7 mm 的 ABTS ( 2,2 azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid]- diammonium salt) 溶 液, 再 加 入 過 硫 酸 鉀 (potassium persulfate, 最 終 濃 度 為 2.45 mm) 混 合 均 勻, 放 置 在 黑 暗 環 境 中 6-12 小 時 使 其 產 生 藍 綠 30
色 的 ABTS. + 自 由 基 水 溶 液 ABTS 反 應 液 使 用 前 先 以 去 離 子 水 稀 釋, 調 整 在 734 nm 的 吸 光 値 為 0.70±0.02 後, 方 可 使 用 取 10 μl 濃 度 50 μm hmc3 或 β-carotene 與 1 ml 的 ABTS. + 反 應 液 混 合, 在 30 分 鐘 後 測 定 734 nm 的 吸 光 值, 觀 察 藍 綠 色 脫 色 程 度 BHA 及 trolox 則 做 為 positive control 以 原 始 濃 度 ABTS. + 為 控 制 組 的 吸 光 值 ABTS. + 清 除 力 (%)= [( 控 制 組 於 734 nm 吸 光 值 - 樣 品 於 734 nm 吸 光 值 )/ 控 制 組 於 734 nm 吸 光 值 ] 100% 3.2.5. 還 原 力 的 測 定 參 考 Oyaizu (1986) 所 述 的 方 法 加 以 修 飾 取 0.1 ml 50 μm hmc3 甲 醇 溶 液, 加 入 0.1 ml 0.2 M phosphate buffer (ph 6.6) 及 0.1 ml 1% 赤 血 鹽 (potassium ferricyanide, PFC), 於 50 水 浴 20 分 鐘 後 快 速 冷 卻, 加 入 0.1 ml 10% trichloroacetic acid (TCA) 溶 液, 混 合 後 以 3000 rpm 離 心 10 min, 取 出 0.1 ml 上 清 液, 再 加 入 0.1 ml 去 離 子 水 及 0.1 ml 0.1 % ferric chloride 溶 液 混 勻, 於 50 水 浴 10 分 鐘 後 以 分 光 光 度 計 測 定 700 nm 吸 光 值 以 0.1 ml 甲 醇 溶 液 取 代 樣 品 作 為 控 制 組 以 相 同 濃 度 (50μM)β-carotene 取 代 樣 品 測 定 700 nm 吸 光 值 與 hmc3 之 吸 光 值 比 較 以 BHA 及 Trolox 作 為 possitive control 吸 光 值 變 化 率 越 高 則 表 示 還 原 力 越 強 還 原 力 = ( 樣 品 反 應 後 於 700 nm 之 吸 光 值 31
- 未 加 樣 品 之 控 制 組 於 700 nm 之 吸 光 值 ) 3.2.6. 螯 合 亞 鐵 離 子 之 能 力 測 定 本 實 驗 參 考 Dinis et al..(1994) 所 述 方 法 加 以 修 飾 取 50 μl 50 μm hmc3 或 β-carotene 的 甲 醇 溶 液, 加 入 180 μl 甲 醇 及 10 μl 1 mm FeCl 2 溶 液, 經 過 30 秒 作 用 後 再 加 入 10 μl 5 μm ferrozine(c 16 H 8 N 4 Na 2 O 8 S 2 ), 在 室 溫 下 反 應 10 分 鐘 後 立 即 以 分 光 光 度 計 測 其 在 562 nm 的 吸 光 值 以 50 μl 甲 醇 溶 液 取 代 樣 品 作 為 控 制 組 吸 光 值 越 低 則 表 示 螯 合 金 屬 離 子 的 能 力 越 強 以 相 同 濃 度 50 μm EDTA 取 代 樣 品 做 為 possitive control 螯 合 亞 鐵 離 子 能 力 (chelating effects)% =100% [1-( 樣 品 於 562 nm 之 吸 光 值 / 未 加 樣 品 之 控 制 組 於 562 nm 之 吸 光 值 )] 3.2.7. 超 微 弱 化 學 發 光 檢 測 法 化 學 發 光 (chemiluminescence) 之 測 定 是 採 用 超 微 弱 化 學 發 光 測 量 儀 系 統, 利 用 如 lucigenin 等 高 特 異 性 的 探 針 與 待 測 的 自 由 基 ( 如 : 超 氧 自 由 基 ) 結 合, 產 生 超 微 弱 冷 光, 以 此 儀 器 紀 錄 其 所 發 出 之 冷 光 (chemiluminescence), 再 計 算 所 累 積 之 光 子 數 (photon count) 來 定 量 自 由 基 可 以 在 實 驗 中 加 入 抗 氧 化 劑, 若 能 抑 制 自 由 基 的 生 成 即 表 示 該 抗 氧 化 物 質, 具 有 清 除 該 項 自 由 基 的 能 力 3.2.7.1. 超 氧 陰 離 子 IC 50 清 除 能 力 檢 測 利 用 螯 合 劑 lucigenin 補 捉 超 氧 自 由 基 (O - 2 ) 並 在 結 合 後 以 此 儀 器 32
紀 錄 其 所 發 出 之 冷 光 (chemiluminescence), 以 累 積 之 光 子 數 (CPS, counts per second) 來 定 量 超 氧 自 由 基 (Belch et al.., 1995;Liu et al.., 2000;Tsai et al.., 2003) 試 劑 配 置 1. 2.0 mm 亮 光 素 (lucigenin, Bis-N-methylacridinium) 秤 取 0.025 g lucigenin, 以 1 PBS 定 量 至 25 ml, 置 入 褐 色 瓶 中 於 4 冰 箱 儲 存 備 用 lucigenin 溶 解 緩 慢, 建 議 以 vortex mixer 震 盪 直 到 lucigenin 溶 解 ; 另 外, 超 氧 陰 離 子 測 定,lucigenin 用 量 為 1 ml, 建 議 可 以 以 1.5 ml 褐 色 ependoff 分 裝 於 4 冰 箱 儲 存 備 用 2. 10% 精 氨 酸 (arginine) 秤 取 1.0 g arginine, 以 二 次 水 定 量 到 10 ml, 於 室 溫 下 使 用 ( 不 可 冰 浴 ) 儲 存 勿 超 過 一 週, 以 免 影 響 超 氧 陰 離 子 產 生 3. 6.5 10-2 mm 丙 酮 醛 ( 甲 基 乙 二 醛,methylglyoxal) 取 0.1 ml 6.5 mm ( 1.17 密 度 (g/ml ) /72.06 分 子 量 *40% ) methylglyoxal, 以 二 次 水 定 量 到 10 ml, 並 以 1.5 ml 褐 色 ependoff tube 分 裝 備 用, 因 在 超 氧 陰 離 子 測 定,methylglyoxal 用 量 不 多, 建 議 置 於 -20 保 存 4. 1 PBS(pH7.4) 依 phosphate buffered saline tablets(sigma) 說 明 配 置 1 L 之 1 PBS, 33
於 4 冰 箱 儲 存 備 用 方 法 於 石 英 杯 中 依 序 加 入 1.0 ml 的 2.0 mm lucigenin;1.0 ml 磷 酸 鈉 緩 衝 液 (ph7.4);18μl 的 10% arginine;18μl 的 6.5 10-2 mm methylglyoxal, 搖 晃 混 合 後 待 其 反 應 曲 線 平 衡 ( 約 800 seconds) 後, 快 速 仔 細 地 加 入 10 μl 的 樣 品 後 搖 晃 均 勻, 放 入 儀 器 中 測 量, 反 覆 加 入 樣 品 數 次, 以 便 換 算 出 當 抑 制 百 分 之 五 十 所 需 的 樣 品 濃 度 超 氧 陰 離 子 清 除 能 力 百 分 比 (%)=[ CPS(Blank) -CPS(sample)/ CPS(Blank) ] 100% 劃 出 濃 度 與 清 除 百 分 比 (Inhibition%) 相 關 曲 線, 即 可 求 得 抑 制 百 分 之 五 十 所 需 的 樣 品 濃 度 34
3.3. 細 胞 毒 性 測 試 3.3.1. 實 驗 儀 器 1. 自 動 酵 素 免 疫 分 析 儀 (Thermo,Multiskan,IMSA-0039,USA) 2. 倒 立 顯 微 鏡 (OLYMPUS Co.,TOPCON: IX70,Japan) 3. 細 胞 培 養 箱 (Sanyo,MCO-20AIC,Japan) 3.3.2. 實 驗 細 胞 株 及 藥 品 細 胞 株 : 購 自 台 灣 財 團 法 人 食 品 工 業 研 究 所 生 物 資 源 保 存 及 研 究 中 心 : 1. HepG2 (BCRC 60025):Human hepatocellular carcinoma 2. Hep3B/T2 (BCRC 60434):Human hepatocellular carcinoma 3. CCD-966SK (BCRC 60153):Human skin fibroblast 細 胞 培 養 實 驗 藥 品 : 購 自 美 國 GIBCO BRL 公 司 : Dulbecco s Modified eagle medium (DMEM) MEM non-essential amino acids solution (NEAA) Penicillin Streptomycin L-glutamine 購 自 美 國 HyClone 公 司 : Trypsin-EDTA Fetal bovine serum(fbs) 35
購 自 美 國 Sigma 公 司 : Dimethyl sulfoxide (DMSO) Minimum essential medium Eagle (MEM) 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) Trypan blue stain(0.4%) Sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) 購 自 日 本 和 光 純 藥 工 業 株 式 會 社 (Wako): Sodium hydroxide (NaOH) Sodium chloride (NaCl) Disodium hydrogen phosphate 12-Water ( Na 2 HPO 4 12H 2 O ) Potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ) 3.3.3. 細 胞 培 養 此 實 驗 所 選 用 的 細 胞 株 分 別 為 :HepG2 Hep3B/T2 人 類 肝 癌 細 胞 與 CCD-966SK 人 類 皮 膚 纖 維 母 細 胞 株 人 類 肝 癌 細 胞 株 Hep G2( 含 有 Rb 和 p53) 培 養 於 含 10 ml 90 % Complete DMEM (Complete Dulbecco's modified Eagle's medium:dmem with 100 μm non- essential amino acid 2mM L-glutamine 100 U/mL penicillin 和 100 μg/ml streptomycin 與 2.2 g/l NaHCO 3 ) 以 及 10 % FBS 之 100 mm tissue culture dish 中, 置 於 37 5 % CO 2 之 培 養 箱 中 生 長, 每 週 更 換 培 養 基 2~3 次 人 類 肝 癌 細 胞 株 Hep3B/T2( 不 含 Rb 和 p53) 培 養 於 含 10 ml 90 % 36
Complete DMEM (Complete Dulbecco's modified Eagle's medium:dmem with 100 μm non-essential amino acid 2mM L-glutamine 100 U/mL penicillin 和 100 μg/ml streptomycin 與 3.7 g/l NaHCO 3 ) 以 及 10 % FBS 之 100 mm tissue culture dish 中, 置 於 37 5 % CO 2 之 培 養 箱 中 生 長, 每 週 更 換 培 養 基 2~3 次 人 類 皮 膚 纖 維 母 細 胞 株 (Human skin fibroblast)ccd-966sk 培 養 於 含 10 ml 90 % MEM (Complete Minimum essential medium (Eagle): MEM with 100 μm non- essential amino acid 2mM L-glutamine 100 U/mL penicillin 和 100 μg/ml streptomycin 與 2.2 g/l NaHCO 3 ) 以 及 10 % FBS 之 100 mm tissue culture dish 中, 置 於 37 5 % CO 2 之 培 養 箱 中 生 長, 每 週 更 換 培 養 基 2~3 次 3.3.4. 繼 代 培 養 待 細 胞 生 長 達 90 分 滿, 此 時 移 去 培 養 液, 以 適 量 PBS (9.00 g/l NaCl, 0.9707 g/l Na 2 HPO 4 12H 2 O, 0.21 g/l KH 2 PO 4, ph 7.2) 清 洗 培 養 皿 中 貼 附 的 細 胞, 接 著 加 入 約 2 ml trypsin-edta (T/E, 0.05 %, 1 ) 溶 液, 置 於 37 5 % CO 2 培 養 箱 作 用 5 分 鐘 後, 於 倒 立 顯 微 鏡 下 觀 察 細 胞 是 否 全 數 懸 浮,HepG2 細 胞 貼 的 較 緊 且 易 成 團 生 長, 所 以 需 要 較 長 的 時 間 才 可 完 全 切 下 細 胞, 此 外, 可 以 無 菌 drop 協 助 沖 下 未 脫 落 之 細 胞, 並 立 即 加 入 兩 倍 體 積 ( 約 4 ml) 培 養 液, 中 和 T/E 反 應 經 1000 rpm 離 37
心 5 分 鐘 後 移 除 上 清 液, 加 入 新 鮮 培 養 液 均 勻 沖 散 細 胞, 再 取 適 當 的 細 胞 數 移 至 新 的 培 養 皿 (100 mm tissue culture dish) 培 養 3.3.5. 細 胞 之 保 存 與 解 凍 同 細 胞 繼 代 培 養, 但 將 離 心 後 之 兩 倍 濃 度 500 μl 細 胞 液 加 入 含 500 μl 冷 凍 液 ( 含 20% DMSO 之 Complete DMEM) 的 冷 凍 管 中 其 細 胞 之 保 存 濃 度 分 別 為 HepG2:5~8 10 6 cells/ml;hep3b /T2 及 CCD-966SK 為 2~4 10 6 cells/ml, 然 後 進 行 程 式 降 溫 冷 凍 (4,10 min -20, 30 min -80,16-18 hrs 或 隔 夜 ), 最 後 儲 存 於 液 態 氮 桶 解 凍 細 胞 時, 首 先 從 液 態 氮 桶 將 細 胞 冷 凍 管 迅 速 移 置 37 水 槽 內, 使 其 在 60 秒 內 急 速 解 凍, 回 溫 後 將 含 有 細 胞 之 冷 凍 液 (10% FBS,10% DMSO, Culture medium) 稍 微 沖 散 並 吸 至 含 10 ml 新 鮮 培 養 液 之 新 的 培 養 皿 (100 mm tissue culture dish) 中 生 長, 此 外, 解 凍 後 的 細 胞 至 少 經 過 兩 次 繼 代 培 養 穩 定 後 才 進 行 細 胞 活 性 實 驗 3.3.6. 細 胞 計 數 將 培 養 皿 中 的 細 胞 培 養 液 移 除, 以 PBS 清 洗 次, 再 加 入 適 量 的 trypsin-edta 待 細 胞 剝 落 後, 離 心 去 除 上 清 液 然 後 加 入 培 養 液, 將 細 胞 均 勻 沖 散 取 50 μl 稀 釋 10 倍 之 細 胞 懸 浮 液 至 微 量 離 心 管, 並 加 入 等 體 積 的 trypan blue 均 勻 混 合 於 1.5 ml eppendorf 中, 最 後 將 混 合 液 ( 約 10 μl) 吸 至 血 球 計 數 盤 於 倒 立 顯 微 鏡 下 觀 察 並 計 數 當 中 死 細 胞 38
會 因 trypan blue 滲 入 而 呈 現 藍 色, 活 細 胞 則 因 細 胞 膜 完 整, 染 料 無 法 滲 入 而 不 呈 色 有 關 細 胞 存 活 率 之 測 定, 大 於 92 % 者 方 可 進 行 隨 後 之 試 驗 細 胞 計 數 方 式 如 下 : (1) 計 數 四 大 方 格 之 細 胞 總 數 ( 活 細 胞 數 ) (2) 4 ( 平 均 細 胞 數 / 方 格 ) (3) 2 ( 稀 釋 倍 數 ; 至 少 2, 因 為 與 trypan blue 等 體 積 混 合 ) (4) 10 4 ( 細 胞 數 /ml): 每 一 大 格 體 積 =0.1cm 0.1cm 0.01cm=10-4 ml (5) 總 細 胞 數 :( 活 細 胞 數 4) 2 10 4 media 毫 升 數 (6) 存 活 率 (%): 活 細 胞 數 / 總 細 胞 數 ( 活 細 胞 數 + 死 細 胞 數 ) 3.3.7. 細 胞 存 活 率 之 測 定 MTT 是 一 種 tetrazolium salt, 全 名 為 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide, 為 一 種 黃 色 染 劑, 可 被 活 細 胞 吸 收 並 被 粒 腺 體 (mitochondria) 中 的 succinate tetrazolium reductase (succinate dehydrogenase) 還 原 成 一 種 藍 紫 色 的 formazan 結 晶 體, 故 測 量 吸 光 值 OD 550~570 之 大 小, 可 測 得 活 細 胞 數 目 的 多 寡, 常 用 於 檢 測 藥 物 對 細 胞 的 生 長 及 存 活 之 影 響 進 行 增 生 測 定 時, 當 吸 光 值 愈 大 表 示 活 細 胞 數 愈 多, 即 樣 品 的 細 胞 毒 性 愈 低 (Hansen et al.., 1989) 39
MTT 分 析 的 測 法 主 要 參 照 Song 等 人 於 2003 年 發 表 之 文 章 (Song and Yen, 2003), 其 實 驗 步 驟 如 下 : 同 細 胞 計 數 方 法, 將 培 養 之 細 胞 株 以 1000 rpm, 離 心 5 分 鐘, 收 集 並 計 算 其 數 目 後, 分 別 將 HepG2 Hep3B/T2 與 CCD-966SK 細 胞 以 2~3 10 4 cells / 100 µl 的 細 胞 密 度 接 種 於 96-well microplate (100 μl of culture medium / well) 中, 於 37 5 % CO 2 細 胞 培 養 箱 中 培 養 24 小 時, 使 細 胞 貼 壁 每 個 well 再 分 別 加 入 100 μl 不 同 濃 度 的 純 化 的 菌 紅 素 及 色 素 粗 萃 物 (0-1000nM) 培 養 基 分 別 處 理 6 及 24 小 時 其 後 換 入 新 鮮 培 養 基 後 每 個 well 加 入 20 μl MTT solution (5 mg/ml), 於 37 5% CO 2 細 胞 培 養 箱 中 培 養 3 小 時, 移 除 培 養 基, 每 個 well 再 加 入 200 μl DMSO 反 應 5 分 鐘 後, 以 自 動 酵 素 免 疫 分 析 儀 (Multiskan Spectrum Microplate Spectrophotometer) 測 定 550 nm 下 之 吸 光 值 細 胞 存 活 率 之 計 算 如 下 : Cell viability (%) = (A sample / A control ) 100 (%) 40
3.4. 對 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 之 作 用 3.4.1. 實 驗 儀 器 1. 自 動 酵 素 免 疫 分 析 儀 (Thermo,Multiskan,IMSA-0039,USA) 2. 倒 立 顯 微 鏡 (Olympus Co.,Topcon: IX70,Japan) 3. 細 胞 培 養 箱 (Sanyo,MCO-20AIC,Japan) 3.4.2. 實 驗 細 胞 株 及 藥 品 細 胞 株 : 購 自 台 灣 財 團 法 人 食 品 工 業 研 究 所 生 物 資 源 保 存 及 研 究 中 心 : B16-F0 (BCRC 60029):mouse melanoma cell 細 胞 培 養 實 驗 藥 品 : 購 自 美 國 Gibco BRL 公 司 : penicillin streptomycin L-glutamine 購 自 美 國 HyClone 公 司 : trypsin-edta fetal bovine serum (FBS) 購 自 美 國 Sigma 公 司 : DMSO MEM MTT Trypan blue stain (0.4%) NaHCO 3 購 自 日 本 和 光 純 藥 工 業 株 式 會 社 (Wako): NaOH NaCl Na 2 HPO 4 12H 2 O KH 2 PO 4 41
3.4.3. 細 胞 培 養 老 鼠 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 株 B16-F0 細 胞 培 養 於 含 10 ml 90 % MEM (Complete Minimum essential medium,eagle):mem with 100 μm nonessential amino acid 2mM L-glutamine 100 U/mL penicillin 和 100 μg/ml streptomycin 與 2.2 g/l NaHCO 3 ) 以 及 10 % FBS 之 100 mm tissue culture dish 中, 置 於 37 5 % CO 2 之 培 養 箱 中 生 長, 每 週 更 換 培 養 基 2~3 次 3.4.4. 黑 色 素 腫 瘤 細 胞 存 活 率 分 析 將 培 養 之 細 胞 株 以 1000 rpm, 離 心 5 分 鐘, 收 集 並 計 算 其 數 目 後, 將 B16-F0 細 胞 以 2~3 10 4 cells/100 µl 的 細 胞 密 度 接 種 於 96-well microplate (100 μl of culture medium / well) 中, 於 37 5 % CO 2 細 胞 培 養 箱 中 培 養 24 小 時, 使 細 胞 貼 壁 每 個 well 再 分 別 加 入 100 μl 不 同 濃 度 的 hmc1 hmc2 及 hmc3 及 hmerp (0-50nM 0-2000nM) 培 養 基 分 別 處 理 6 及 24 小 時 其 後 換 入 新 鮮 培 養 基 後 以 MTT assay 分 析 細 胞 存 活 率 細 胞 存 活 率 之 計 算 如 下 : Cell viability (%) = (A sample / A control ) 100 (%) 3.4.5. 細 胞 黑 色 素 分 析 此 分 析 方 法 參 考 Liu 等 人 於 2007 年 所 發 表 的 文 章 修 改 而 成 於 24 孔 培 養 盤 植 入 黑 色 素 細 胞 ( 密 度 為 2x105 細 胞 / 孔 ),37,5% CO2 培 養 24 hr, 使 之 貼 壁 分 別 加 入 不 同 濃 度 (0-50nM) 菌 紅 素 處 理 42
24h 及 48h 後, 移 除 培 養 基 再 以 PBS 清 洗 後 將 細 胞 以 Trypsin-EDTA 收 下 移 放 至 1.5mL 離 心 管 將 細 胞 離 心 (10000rpm,10min) 後 移 除 上 清 液, 再 加 入 1N NaOH 200μl 溶 解 細 胞 中 的 黑 色 素, 測 OD405nm 吸 光 值 黑 色 素 抑 制 率 (%) = (A sample / A control ) 100 (%) 取 相 同 細 胞 數 ( 密 度 為 2x10 5 細 胞 / 孔 ) 種 於 24 well 中, 以 不 同 濃 度 的 菌 紅 素 及 色 素 粗 萃 物 處 理 24h 及 48h, 之 後 以 MTT 法 分 析 細 胞 量 對 照 單 位 細 胞 中 黑 色 素 量 的 生 成 43
第 四 章 結 果 4.1. hmc3 的 抗 氧 化 能 力 探 討 類 胡 蘿 蔔 素 在 抗 氧 化 能 力 上 一 般 而 言 都 有 良 好 的 表 現, 而 H. mediterranei 會 產 生 一 種 C50 紅 橘 色 的 類 胡 蘿 蔔 素, 本 實 驗 分 別 以 清 除 α,α-diphenyl-βpicrylhydrazyl(dpph) 自 由 基 能 力 總 抗 氧 化 力 (ABTS radical cation decolorization assay) 還 原 力 抑 制 共 軛 雙 烯 生 成 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 以 及 使 用 微 弱 化 學 發 光 儀 測 定 超 氧 自 由 基 (O - 2 ) 清 除 能 力 等 方 法 分 析 hmc3 的 抗 氧 化 能 力 4.1.1. 清 除 DPPH 自 由 基 之 能 力 抑 制 油 脂 氧 化 的 抗 氧 化 劑, 通 常 是 藉 由 提 供 氫 來 捕 捉 油 脂 的 過 氧 化 自 由 基, 故 使 用 DPPH (C 18 H 12 N 6 O 5 ) 來 檢 測 抗 氧 化 劑 提 供 氫 離 子 的 能 力 油 脂 在 自 氧 化 作 用 的 初 期 (Shimada et al.., 1992) 比 較 相 同 50 μm 的 BHA trolox β-carotene 以 及 hmc3( 內 含 50 μm bacterioruberin) 對 DPPH 自 由 基 的 清 除 能 力 ( 圖 4.1), 發 現 hmc3 對 於 DPPH 自 由 基 的 清 除 能 力 可 達 60.3%, 遠 高 於 相 同 濃 度 β-carotene 的 清 除 率 34.8% 而 相 對 於 positive control 中 BHA 清 除 率 66.8% 及 Trolox 的 75.2%,hmC3 對 於 DPPH 自 由 基 的 清 除 能 力 可 謂 十 分 優 異 44
100 DPPH scavenging efficiency (%) 80 60 40 20 a a, b c b 0 Trolox BHA β -carotene hmc3 圖 4.1 不 同 抗 氧 化 劑 對 DPPH 自 由 基 的 清 除 能 力 之 比 較 於 含 有 50 μm sample 之 80 μl 甲 醇 溶 液 中 加 入 20 μl DPPH 的 反 應 液, 反 應 30 分 鐘 後, 測 OD 517 nm 以 甲 醇 取 代 樣 品 作 為 控 制 組 每 個 數 據 皆 為 三 重 複, 以 mean ± SD 表 示, 相 同 字 母 表 示 無 顯 著 差 異 (P<0.05) DPPH 自 由 基 清 除 率 % = [1 -( 樣 品 OD 517 nm / 控 制 組 OD 517 nm ) ] 100% 45
因 抗 氧 化 劑 捕 捉 DPPH 自 由 基 是 以 提 供 氫 的 形 式, 所 以 可 以 推 知 hmc3 可 提 供 氫 進 而 阻 止 油 脂 自 氧 化 的 連 鎖 反 應, 其 良 好 的 抗 氧 化 性 也 可 能 是 來 自 於 對 自 由 基 的 捕 捉 能 力 4.1.2. hmc3 總 抗 氧 化 力 分 析 總 抗 氧 化 力 (ABTS radical cation decolorization assay) 分 析 的 原 理 為 利 用 化 學 氧 化 劑 使 ABTS ( 2,2 -azinobis-(3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid)) 產 生 具 有 長 活 性 的 自 由 基 陽 離 子 (ABTS +),ABTS + 與 抗 氧 化 物 反 應 後 成 為 無 色 的 ABTS 2-, 利 用 波 長 734nm 觀 察 其 反 應 程 度, 吸 光 值 改 變 越 大 則 表 示 樣 品 抗 氧 化 能 力 越 好 從 50 μm 的 BHA trolox β-carotene 與 hmc3( 內 含 50 μm bacterioruberin) 以 及 添 加 1000 μm 高 濃 度 的 BHA 與 trolox 對 ABTS 陽 離 子 自 由 基 清 除 率 能 力 的 比 較 ( 圖 4.2) 結 果, 顯 示 50 μm 的 trolox BHA 及 hmc3 對 ABTS 陽 離 子 自 由 基 清 除 率 能 力 分 別 是 2.7% 2.2% 及 4.7% 可 以 看 出 在 低 濃 度 時 hmc3 清 除 率 為 trolox 的 170% 且 為 BHA 的 214%, 相 對 而 言,β-carotene 則 對 ABTS 自 由 基 清 除 率 效 果 十 分 不 明 顯 此 外,1000 μm trolox 及 BHA, 其 對 ABTS 自 由 基 清 除 率 為 39% 及 59% 因 此,hmC3 對 ABTS 自 由 基 清 除 率 效 果 十 分 良 好 46
50 ABTS + scavenging effect(%) 40 30 5 b c d a 0 Trolox BHA Trolox BHA β -carotene hmc3 1000 μm 50 μm 圖 4.2 不 同 抗 氧 化 劑 對 ABTS 陽 離 子 自 由 基 清 除 率 能 力 之 比 較 10 μl 的 50 μm sample 與 1 ml 的 ABTS + 反 應 液 混 合 反 應 30 分 鐘 後, 測 OD 734 nm 每 個 數 據 皆 為 三 重 複, 以 mean ± SD 表 示, 相 同 字 母 表 示 無 顯 著 差 異 (P<0.05) ABTS + 清 除 力 (%)= [( 控 制 組 OD 734 nm - 樣 品 OD 734 nm )/ 控 制 組 OD 734 nm ] 100% 47
4.1.3. hmc3 還 原 力 的 分 析 還 原 力 以 測 定 普 魯 士 藍 (prussian blue, Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 ) 生 成 量 為 指 標, 藉 由 赤 血 鹽 (pottassium ferricyanide, K 3 Fe(CN) 6 ) 還 原 成 黃 血 鹽 (K 4 Fe(CN) 6 ) 之 後, 再 與 三 價 鐵 離 子 作 用 生 成 普 魯 士 藍, 並 以 分 光 光 度 計 在 最 大 吸 收 波 長 700 nm 下 測 定 普 魯 士 藍 含 量, 用 以 檢 測 樣 品 的 還 原 力 (Oyaizu, 1986) 圖 4.3 為 50 μm BHA trolox β-carotene 以 及 hmc3( 內 含 50 μm bacterioruberin) 的 還 原 能 力 比 較 分 析 結 果 發 現, 相 較 於 BHA Trolox 及 β-carotene,hmc3 的 還 原 力 表 現 最 好, 分 別 是 trolox 與 BHA 的 4 倍, 且 hmc3 的 還 原 力 是 同 屬 類 胡 蘿 蔔 素 的 β-carotene 的 八 倍 綜 合 以 上, 顯 示 hmc3 在 還 原 能 力 的 表 現 上 十 分 優 異 48
0.7 a 0.6 0.5 0.4 Δ A 0.3 0.2 0.1 b b c 0.0 Trolox BHA β -carotene hmc3 圖 4.3 不 同 抗 氧 化 劑 的 還 原 能 力 之 比 較 分 析 取 0.1 ml 含 50 μm 樣 本 的 甲 醇 溶 液 進 行 鐵 離 子 還 原 能 力 分 析, 以 甲 醇 溶 液 取 代 樣 品 作 為 控 制 組 每 個 數 據 皆 為 三 重 複, 以 mean ± SD 表 示, 相 同 字 母 表 示 無 顯 著 差 異 (P<0.05) 還 原 力 (ΔA)=( 樣 品 OD 700nm - 控 制 組 OD 700nm ) 49
4.1.4. hmc3 亞 鐵 離 子 螯 合 力 分 析 實 驗 是 利 用 Fe 2+ 與 ferrozine 的 複 合 物 在 562 nm 之 呈 色 反 應, 可 測 得 樣 品 對 Fe 2+ 離 子 之 螯 合 能 力 (Dinis et al.., 1994) 當 樣 品 螯 合 Fe 2+ 離 子 時, 會 造 成 562 nm 吸 光 值 的 降 低 圖 4.4 為 比 較 50 μm EDTA BHA trolox β-carotene 以 及 hmc3( 內 含 50 μm bacterioruberin) 對 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 的 分 析 結 果 顯 示 在 相 同 濃 度 下,hmC3 對 於 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 為 42%, 而 相 同 濃 度 的 EDTA 螯 合 能 力 為 55%, 而 BHA trolox 及 β-carotene 在 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 上 都 沒 有 顯 著 的 功 效, 特 別 是 BHA 及 trolox 的 濃 度 達 到 1000 μm 時 對 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 也 沒 有 提 昇 綜 合 以 上 結 果 顯 示 hmc3 在 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 上 有 很 好 的 表 現 50