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博 士 专 业 学 位 论 文 论 文 题 目 促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 研 究 生 姓 名 指 导 教 师 姓 名 专 业 名 称 研 究 方 向 论 文 提 交 日 期 葛 许 华 刘 春 风 神 经 病 学 帕 金 森 病 2015 年 9 月

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促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 中 文 摘 要 促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 中 文 摘 要 第 一 部 分 6- 羟 基 多 巴 胺 (6-OHDA) 诱 导 PC12 细 胞 凋 亡 及 其 可 能 机 制 目 的 采 用 6- 羟 基 多 巴 胺 (6-hydroxydopamine,6-OHDA) 诱 导 PC12 细 胞 损 伤 建 立 帕 金 森 病 的 体 外 模 型, 探 讨 GSK3β 在 6-OHDA 诱 导 的 凋 亡 途 径 中 的 具 体 作 用 及 6-OHDA 对 PC12 凋 亡 的 可 能 作 用 机 制 方 法 采 用 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 PC12 细 胞 损 伤 建 立 帕 金 森 病 的 体 外 模 型, 通 过 MTT 检 测 以 及 台 盼 蓝 染 料 排 除 试 验 检 测 不 同 浓 度 的 6-OHDA 处 理 后 的 PC12 细 胞 活 性 和 生 存 率 利 用 免 疫 印 迹 法 测 定 :1 总 GSK3β 和 p-gsk3β 水 平 ;2 Bax 和 β- 肌 动 蛋 白 水 平,β- 肌 动 蛋 白 用 作 细 胞 质 内 蛋 白 的 内 参 对 照 ;3 Bax 和 prohibition 蛋 白 水 平,prohibition 蛋 白 用 作 线 粒 体 内 蛋 白 的 内 参 对 照 结 果 1 6-OHDA 刺 激 24 后 呈 剂 量 依 赖 性 (10 20 50 100 200µm) 地 抑 制 PC12 细 胞 的 细 胞 活 性 及 细 胞 存 活 率 6-OHDA 在 100μM 时 显 著 抑 制 PC12 的 活 性 和 存 活 率 2 Western blot 检 测 结 果 显 示,6-OHDA 处 理 呈 时 间 依 赖 性 地 减 少 了 GSK3β 磷 酸 化 通 过 提 取 细 胞 线 粒 体 和 细 胞 质 来 检 查 Bax 在 细 胞 线 粒 体 中 存 在 的 情 况, 结 果 显 示 6-OHDA 处 理 后 细 胞 质 中 Bax 含 量 减 少 了, 线 粒 体 中 Bax 含 量 增 加 了, 提 示 6-OHDA 诱 发 了 Bax 的 线 粒 体 转 位 结 论 6-OHDA 显 著 降 低 了 PC12 细 胞 的 活 性, 促 进 了 PC12 细 胞 凋 亡,GSK3β 在 6-OHDA 诱 导 的 凋 亡 中 起 到 一 定 作 用,6-OHDA 处 理 呈 时 间 依 赖 性 地 减 少 GSK3β 磷 酸 化, 诱 发 了 Bax 的 线 粒 体 转 位,Bax 可 从 细 胞 溶 质 转 位 至 线 粒 体 中, 引 起 线 粒 体 I

中 文 摘 要 促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 功 能 障 碍, 进 而 导 致 细 胞 凋 亡 关 键 词 帕 金 森 病 6- 羟 基 多 巴 胺 PC12 细 胞 糖 原 合 成 酶 激 酶 3β Bax 第 二 部 分 促 红 细 胞 生 成 素 (EPO) 对 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 PC12 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用 及 其 机 制 目 的 通 过 研 究 促 红 细 胞 生 成 素 对 6-OHDA 处 理 的 PC12 细 胞 的 糖 原 合 成 酶 激 酶 3β 的 磷 酸 化 Bax 的 线 粒 体 转 位 Bcl-2 表 达 水 平 半 胱 天 冬 酶 3 活 性, 探 讨 促 红 细 胞 生 成 素 (EPO) 抑 制 6- 羟 基 多 巴 胺 (6-OHDA) 诱 导 的 凋 亡 的 机 制 方 法 PC12 细 胞 用 TDZD-8 (25μM) 或 用 不 同 浓 度 的 EPO (0-10U/mL) 预 处 理, 随 后 用 100μM 6-OHDA 孵 育 采 用 MTT 检 测 和 台 盼 蓝 排 除 试 验 测 定 不 同 处 理 后 的 细 胞 活 性 ; 免 疫 印 迹 法 观 察 GSK3β 磷 酸 化 水 平 总 GSK3β 水 平 Bax 在 细 胞 内 分 布 情 况 抗 增 殖 蛋 白 水 平 Bcl-2 以 及 β- 肌 动 蛋 白 水 平 ;Hoechst 33258 染 色 法 来 估 算 凋 亡 PC12 细 胞 的 比 例, 使 用 半 胱 天 冬 酶 3 比 色 测 定 试 剂 盒 系 统 估 算 半 胱 天 冬 酶 3 活 性 结 果 1 EPO 呈 浓 度 依 赖 性 地 ( 浓 度 从 1 至 10U/mL 不 等 ) 降 低 6-OHDA 诱 导 的 生 长 抑 制,GSK3β 抑 制 剂 4- 苯 基 -2- 甲 基 -1,2,4- 噻 二 唑 3,5- 二 酮 (TDZD8) 显 著 逆 转 6-OHDA 诱 导 的 生 长 抑 制 2 EPO 和 TDZD-8 显 著 逆 转 6-OHDA 对 GSK3β 磷 酸 化 的 抑 制, 也 显 著 抑 制 6-OHDA 诱 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 3 6-OHDA 不 改 变 细 胞 质 内 的 Bcl-2 表 达 水 平, 而 EPO 和 TDZD-8 两 者 也 不 影 响 Bcl-2 的 细 胞 质 内 表 达 水 平 但 6-OHDA 显 著 降 低 了 Bcl-2 的 线 粒 体 内 表 达 水 平, 而 加 入 EPO 和 TDZD-8 后 可 逆 转 6-OHDA 诱 导 的 Bcl-2 的 线 粒 体 内 表 达 降 低 4 EPO 和 TDZD-8 抑 制 6-OHDA 诱 导 的 细 胞 凋 亡,6-OHDA 显 著 增 加 半 胱 天 冬 酶 3 活 性, 而 EPO 和 TDZD 则 显 著 抑 制 半 胱 天 冬 酶 3 活 性 升 高 结 论 EPO 通 过 促 进 6-OHDA 处 理 的 PC12 细 胞 的 GSK3β 的 磷 酸 化 从 而 减 少 Bax 的 线 粒 体 转 位 以 及 阻 止 线 粒 体 内 Bcl-2 水 平 的 降 低 降 低 Caspase 3 活 性, 来 抑 制 6-OHDA 诱 导 的 凋 亡, 进 而 发 挥 神 经 保 护 作 用, 提 示 EPO 是 一 个 很 有 潜 力 的 神 经 II

促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 中 文 摘 要 保 护 药 物 关 键 词 帕 金 森 病 促 红 细 胞 生 成 素 糖 原 合 成 酶 激 酶 3β Bcl-2/Bax 半 胱 天 冬 酶 3 作 者 : 葛 许 华 指 导 老 师 : 刘 春 风 III

英 文 摘 要 促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 Erythropoietin attenuates 6-hydroxydopamine-induced apoptosis via Glycogen Synthase Kinase 3β mediated mitochondrial translocation of Bax in PC12 cells Abstract Part 1 6- hydroxydopamine (6-OHDA) -induced PC12 cell apoptosis and its possible mechanism Objective To explore the specific role of GSK3β in the 6-OHDA-induced apoptosis pathway and the possible mechanism of 6-OHDA inducing PC12 cell apoptosis using an in-vitro model of Parkinson s disease established by PC12 cell damages induced by 6-OHDA. Methods A in-vitro model of Parkinson s disease was established by PC12 cell damages induced by 6-OHDA. The viability and survival rate of PC12 cells following treatment with different concentration of 6-OHDA was determined by MTT assay and trypan blue dye exclusion test. Western blotting was used to detect: 1. total GSK3β and p-gsk3β levels; 2. Bax and β-actin levels (β-actin being the internal reference of intracytoplasmic protein); and 3. Bax and prohibitin levels (prohibitin being the internal reference of intramitochondrial protein). Results Treatment with 6-OHDA for 24h provided dose-dependent (10, 20, 50, 100 and 200µm) inhibition of the viability and survival rate of PC12 cells. Viability and survival rate of PC12 cells was significantly inhibited at the 6-OHDA concentration 100μM. Western blotting showed that treatment with 6-OHDA reduced GSK3β phosphorylation in a time-dependent manner. When examining the presence of Bax in mitochondria by extracting mitochondria and cytoplasm, it was shown that treatment with 6-OHDA reduced Bax in the cytoplasm while increased Bax in the mitochondria, indicating mitochondrial translocation of Bax induced by 6-OHDA. Conclusions 6-OHDA significantly reduced PC12 cell viability and promoted IV

促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 英 文 摘 要 PC12 cell apoptosis. GSK3β plays a certain role in 6-OHDA-induced apoptosis. Treatment with 6-OHDA resulted in time-dependent reduction of GSK3β phosphorylation, and induced Bax translocation from cytoplasm to mitochondria, causing mitochondrial dysfunction which further led to cell apoptosis. kinase 3β Key words Bax Parkinson s disease; 6-OHDA; PC12 cell; Glycogen synthatase Part 2: Protective Effects of Erythropoietin (EPO) against 6-OHDA-induced PC12 Cell Apoptosis and its Mechanism Objective To explore the mechanism of EPO inhibiting 6-OHDA-induced apoptosis by investigating the effects of EPO on GSK3β phosphorylation, mitochondrial translocation of Bax, Bcl-2 expression level and Caspase 3 activity in 6-OHDA-treated PC12 cells. Methods PC12 cells were pre-treated with TDZD-8(25μM) or different concentrations of EPO (0-10U/mL) before incubation with 100μM 6-OHDA. Cell viability following different treatments was determined by MTT assay and trypan blue exclusion test; Western blotting was used to detect the GSK3β phosphorylation level, total GSK3β level, intracellular distribution of Bax, prohibition level, and Bcl-2 and β-actin levels; the proportion of apoptotic PC12 cells was estimated by Hoechst 33258 staining; and Caspase 3 activity was determined using Caspase 3 colorimetric assay kit. Results EPO reduced 6-OHDA-induced growth inhibition in a dose-dependent manner (over the concentrations ranging from 1 to 10U/mL), and the GSK3β inhibitor 4-benzyl-2-methyl-1, 2, 4-thiadiazolidine-3, 5-dione (TDZD8) markedly reversed 6-OHDA-induced growth inhibition. EPO and TDZD-8 markedly reversed inhibition of GSK3β phosphorylation in the presence of 6-OHDA, and markedly suppressed 6-OHDA-induced mitochondrial translocation of Bax. 6-OHDA did not alter the Bcl-2 expression level in cytoplasm, nor did EPO or TDZD-8 exhibit any effect on Bcl-2 expression level in cytoplasm. In contrast, 6-OHDA V

英 文 摘 要 促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 significantly suppressed Bcl-2 expression in mitochondira, which however could be reversed by addition of EPO and TDZD-8. EPO and TDZD-8 inhibited 6-OHDA-induced cell apoptosis. 6-OHDA markedly enhanced Caspase 3 activity, while EPO and TDZD markedly inhibited the enhanced Caspase 3 activity. Conclusions EPO inhibits 6-OHDA-induced apoptosis by promoting GSK3β phosphorylation in 6-OHDA-treated PC12 cells, reducing mitochondrial translocation of Bax, reserving suppressed Bcl-2 level in mitochondria, and suppressing Caspase 3 activity, which contribute to its neuroprotective effect. These indicate EPO s good potential to be a neuroprotective agent. Key words Parkinson s disease; Erythropoietin; Glycogen synthase kinase 3β; Bcl-2/Bax; Caspase 3 Written by Xu-Hua Ge Supervised by Professor Chun-Feng Liu VI

目 录 第 一 部 分 6- 羟 基 多 巴 胺 (6-OHDA) 诱 导 PC12 细 胞 凋 亡 及 其 可 能 机 制...1 引 言...1 1 材 料 与 方 法...3 2 结 果...10 3 讨 论...12 参 考 文 献...15 第 二 部 分 促 红 细 胞 生 成 素 (EPO) 对 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 PC12 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用 及 其 机 制...19 引 言...19 1 材 料 与 方 法...21 2 结 果...29 3 讨 论...33 参 考 文 献...36 结 论...38 综 述...39 参 考 文 献...52 攻 读 学 位 期 间 本 人 出 版 或 公 开 论 著 论 文...61 中 英 文 对 照 缩 略 词 表...62 致 谢...63

促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 第 一 部 分 第 一 部 分 6- 羟 基 多 巴 胺 (6-OHDA) 诱 导 PC12 细 胞 凋 亡 及 其 可 能 机 制 引 言 帕 金 森 病 (Parkinson disease,pd) 是 中 老 年 常 见 的 神 经 系 统 变 性 疾 病, 严 重 危 害 患 者 身 体 健 康 和 降 低 患 者 的 生 活 质 量 [1], 在 60 岁 以 上 人 群 中 患 病 率 高 达 1%, 其 特 征 性 病 理 变 化 为 中 脑 黑 质 多 巴 胺 (DA) 能 神 经 元 进 行 性 变 性 丢 失, 胶 质 增 生, 胞 浆 内 出 现 特 征 性 嗜 酸 性 包 涵 体 即 路 易 体 [2], 从 而 导 致 基 底 节 神 经 调 节 功 能 的 紊 乱, 其 临 床 症 状 包 括 运 动 迟 缓 静 止 性 震 颤 肌 肉 强 直 及 屈 曲 姿 势 DA 能 神 经 元 死 亡 机 制 迄 今 尚 未 明 了, 许 多 研 究 资 料 表 明 内 源 性 及 外 源 性 神 经 毒 素 在 帕 金 森 病 发 病 机 制 中 可 能 起 重 要 作 用 [3] 多 巴 胺 代 谢 的 中 间 产 物 6- 羟 基 多 巴 胺 (6-hydroxydopamine,6-OHDA) 属 于 羟 基 化 DA 类 似 物, 是 多 巴 胺 的 毒 性 氧 化 代 谢 产 物 之 一, 可 对 部 分 脑 部 区 域 的 儿 茶 酚 胺 神 经 递 质 神 经 元 起 到 选 择 性 的 破 坏 作 用, 是 帕 金 森 病 的 病 因 之 一 目 前 已 有 研 究 报 道 在 人 脑 尾 状 核 及 尿 液 内 均 可 检 测 到 6-OHDA 体 内 实 验 发 现, 纹 状 体 内 注 射 6-OHDA 后, 黑 质 多 巴 胺 能 细 胞 出 现 凋 亡 的 形 态 学 改 变, 提 示 6-OHDA 可 能 直 接 参 与 PD 的 发 病 机 制 [4] 大 量 研 究 证 明 6-OHDA 可 被 多 巴 胺 神 经 元 的 多 巴 胺 转 运 体 选 择 性 摄 取, 聚 集 于 线 粒 体 内, 抑 制 线 粒 体 复 合 物 I 和 IV, 促 进 细 胞 内 氧 自 由 基 和 过 氧 化 氢 生 成, 导 致 多 巴 胺 神 经 元 凋 亡 [5] 因 此 6-OHDA 被 广 泛 用 于 建 立 帕 金 森 病 实 验 模 型 [6-8] 目 前 比 较 肯 定 的 用 于 研 究 帕 金 森 病 的 体 外 模 型 除 了 原 代 培 养 的 中 脑 / 纹 状 体 神 经 原 外, 多 为 一 些 传 代 细 胞 系, 其 中 PC12 细 胞 是 最 常 用 的 传 代 细 胞 株, 被 用 于 研 究 多 种 神 经 变 性 疾 病 PC12 细 胞 ( 大 鼠 肾 上 腺 嗜 铬 细 胞 克 隆 ) 在 许 多 方 面 与 多 巴 胺 神 经 元 相 似, 都 对 多 巴 胺 和 左 旋 多 巴 降 解 产 生 的 自 由 基 敏 感 并 引 起 细 胞 凋 亡 [9,10] 低 剂 量 的 神 经 毒 素 MPTP,(1-methy-4-phenvl-1,2,3,6-tetrohydropyridine) 和 6- 羟 多 巴 胺 (6-OHDA) 就 能 引 起 明 显 的 细 胞 毒 性 因 而,PC12 细 胞 近 年 来 常 被 用 作 研 究 帕 金 森 病 的 离 体 细 胞 模 型 [11,12] 目 前 帕 金 森 病 病 因 和 发 病 机 制 尚 未 明 确, 也 缺 乏 理 想 的 特 异 性 神 经 保 护 治 疗 方 1

第 一 部 分 促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 法, 以 阻 止 神 经 元 退 行 性 变, 修 复 已 损 伤 的 神 经 元, 临 床 上 只 能 针 对 症 状 进 行 对 症 治 疗, 因 此 对 帕 金 森 病 发 病 机 制 的 研 究 依 然 非 常 重 要 帕 金 森 病 可 能 的 病 因 除 遗 传 易 感 性 外, 尚 包 括 线 粒 体 膜 电 位 的 改 变 钙 的 细 胞 毒 性 作 用 环 境 因 素 兴 奋 性 毒 性 氧 化 应 激 以 及 免 疫 学 异 常 等 [13-15] 这 些 因 素 导 致 了 PD 特 征 性 的 病 理 改 变 : 黑 质 致 密 部 多 巴 胺 (DA) 能 神 经 元 退 行 性 改 变 以 及 其 胞 质 内 出 现 路 易 小 体 (LB), 最 终 发 生 细 胞 凋 亡 或 死 亡 糖 原 合 酶 激 酶 3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK3β) 是 一 个 多 功 能 的 丝 氨 酸 / 苏 氨 酸 类 激 酶, 是 一 类 在 机 体 内 分 布 广 泛 且 结 构 高 度 保 守 的 丝 苏 氨 酸 蛋 白 激 酶, 最 初 发 现 时 因 其 对 糖 原 代 谢 的 调 节 作 用 而 得 名 [16] 在 真 核 生 物 中 普 遍 存 在 GSK3β 在 多 种 细 胞 功 能 活 动 的 调 节 中 扮 演 着 重 要 的 角 色, 包 括 调 节 细 胞 的 结 构 细 胞 内 的 信 号 传 导 细 胞 的 分 裂 凋 亡 微 管 运 动 及 参 与 决 定 胚 胎 发 育 过 程 中 细 胞 的 命 运 [17] 在 过 去 的 几 年 中, 越 来 越 多 的 研 究 证 实 GSK3 是 调 节 细 胞 凋 亡 的 重 要 因 子 [18] 其 中 已 被 确 定 的 证 据 有 :GSK3β 的 活 化 与 神 经 元 凋 亡 的 增 加 直 接 相 关 GSK3β 在 脑 中 的 含 量 较 高 多 种 激 酶 (Akt/ 蛋 白 激 酶 B(PKB) 蛋 白 激 酶 A 和 蛋 白 激 酶 C) 均 可 导 致 GSK3β 的 磷 酸 化 并 使 其 失 活, 最 终 影 响 其 下 游 底 物 如 Bcl-2 家 族 蛋 白 等 [19] 许 多 证 据 表 明, GSK3β 为 众 多 神 经 元 凋 亡 模 型 中 细 胞 死 亡 的 关 键 激 活 因 子, 且 GSK3β 的 磷 酸 化 失 活 可 提 高 细 胞 活 性 [20] 作 为 一 种 胞 内 酶, 它 通 过 调 节 多 巴 胺 胆 碱 类 和 谷 氨 酸 等 神 经 介 质, 参 与 神 经 变 性 疾 病 和 精 神 疾 病 的 发 生 和 发 展 [21-22] Bax 是 重 要 的 GSK3β 下 游 靶 向 之 一 在 凋 亡 刺 激 下,Bax 可 从 细 胞 溶 质 转 位 至 线 粒 体 中, 引 起 线 粒 体 功 能 障 碍, 进 而 导 致 半 胱 天 冬 酶 激 活 与 细 胞 凋 亡 因 此 我 们 研 究 了 GSK3β 的 表 达 情 况 以 及 Bax 的 细 胞 内 分 布 情 况 本 课 题 采 用 6-OHDA 诱 导 PC12 细 胞 损 伤 建 立 帕 金 森 病 的 体 外 细 胞 培 养 模 型, 探 索 6-OHDA 对 PC12 凋 亡 的 可 能 作 用 机 制 我 们 利 用 蛋 白 免 疫 印 迹 分 析 确 定 在 6-OHDA 处 理 时 PC12 细 胞 内 GSK3β 蛋 白 水 平 的 改 变 以 及 Bax 的 细 胞 内 分 布 情 况, 从 而 明 确 6-OHDA 在 PC12 细 胞 中 诱 导 凋 亡 的 可 能 具 体 机 理, 为 下 一 步 研 究 打 下 基 础 2

促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 第 一 部 分 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 实 验 用 细 胞 PC12 细 胞 系 : 购 自 中 国 科 学 院 上 海 细 胞 生 物 学 研 究 所 1.1.2 主 要 试 剂 (1) 6-Hydroxydopamine(Sigma-Aldrich) (2) Mouse anti-β-actin(sigma-aldrich) (3) Rabbit anti-prohibitin(santa Cruz Biotechnology) (4) Mouse anti-bax(santa Cruz Biotechnology) (5) p-gsk3β(cell signaling) (6) GSK3β(cell signaling) (7) Cell Mitochondria Isolation Kit(Beyotime) (8) Enhanced chemiluminescence reagents(amersha Phamacia Biotech) (9) Protease inhibitor cocktail tablets ( Roche ) (10) Phosphatase inhibitor cocktail tablets ( Roche ) (11) PMSF ( Sigma ) (12) 10 RIPA 裂 解 液 ( Millipore ) (13) BCA Protein Assay kit ( Thermo Scientific ) (14) - 巯 基 乙 醇 ( Amresco ) (15) Acrylamide/Bisacrylamide ( 29:1 ) ( Generay Biotech ) (16) AP ( Sigma ) (17) SDS ( Sigma ) (18) DEPC(Invitrogen) (19) TEMED ( Sigma ) (20) Glycine ( Amresco ) (21) PVDF 膜 ( Millipore ) (22) Stripping Buffer ( Thermo Scientific ) (23) TWEEN-20 ( Beyotime ) (24) Protein Marker (Thermo ) 3

第 一 部 分 促 红 细 胞 生 成 素 通 过 抑 制 GSK3β 介 导 的 Bax 线 粒 体 转 位 减 少 6- 羟 基 多 巴 胺 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 (25) 6 SDS loading buffer(beyotime) (26) 1M Tris-HCl,pH 8.8(Beyotime) (27) 1M Tris-HCl,pH 6.8(Beyotime) (28) 脱 脂 奶 粉 ( 荷 兰 乳 牛 ) (29) HRP-goat anti-rabbit IgG ( Bioworld ) (30) HRP-goat anti-mouse IgG ( Bioworld ) (31) FBS ( Gibco ) (32) DMSO ( Sigma ) (33) 1 PBS ( Gibco ) (34) DMEM 高 糖 培 养 液 ( Gibco ) (35) Cell Mitochondria Isolation Kit(Beyotime) (36) ECL Advance Western Blotting Detection Kit(Thermo) (37) Hoechst 33258(Beyotime) (38) 不 含 EDTA 的 胰 酶 (Sigma) (39) BSA(Sigma) (40) 链 霉 素 - 青 霉 素 双 抗 (Hyclone) (41) 其 它 普 通 试 剂 : 异 丙 醇 无 水 乙 醇 NaCl KCl MgCl2 Na2HPO4 12H2O NaH2PO4 2H2O KH2PO4 等 1.1.3 主 要 仪 器 (1) 85-1 型 恒 温 磁 力 搅 拌 器 ( 江 苏 金 坛 市 荣 华 仪 器 厂 ) (2) 全 套 Bio-RAD 电 泳 及 转 膜 系 统 (Bio-Rad Laboratories) (3) 化 学 发 光 凝 胶 成 像 系 统 (Bio-Rad) (4) 核 酸 蛋 白 定 量 检 测 仪 (Eppendorf) (5) 高 速 冷 冻 离 心 机 (Hitachi) (6) 迷 你 离 心 机 (Bio-Rad) (7) 脱 色 摇 床 ( 南 京 新 校 园 生 物 技 术 研 究 所 ) (8) 超 纯 水 仪 (ELGA) (9) 压 力 蒸 汽 灭 菌 锅 Autoclave ES-315(Tomy Kogyd) (10) 超 低 温 冰 箱 (Thermo Electron Corporation) 4