食品与发酵工业 :""!;<!:==<@;@"<<!AB@=B!"!% ) * + - 1%2 * 2%)%1%% 利巴韦林发酵过程中腺嘌呤限量供应的初步研究! 刘莉!2!!王法松!2!!李燕军!2!!谢希贤!2!!陈宁!2! " 天津科技大学生物工程学院天津%%8)5 72" 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津%%8)5 " 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津%%8)5 摘7要7解淀粉芽孢杆菌 1) *+5 ) -+ @;2%1 D 是腺嘌呤缺陷型突变株!腺 嘌 呤 浓 度 过 低 会 影 响 菌体生长!过高又会反馈阻遏关键酶的合成" 首先对腺嘌 呤 供 体 的 种 类 和 用 量 进 行 了 研 究!摇 瓶 发 酵 结 果 表 明 BF 2)%6 是最佳的腺嘌呤供体!用量在 ) * D时最有利 于 利 巴 韦 林 积 累!但 发 酵 后 期 腺 嘌 呤 浓 度 过 高" 因 此在降低 BF 2)%6 的初始浓度的基础上!额外 添 加 腺 嘌 呤!结 果 发 现 初 始 腺 嘌 呤 总 量 为 85`) M* D时!发 酵液中腺嘌呤含量维持在 8% i)% M* D!VVV转酰胺酶活力最高!合成利巴韦林的量最大" 实验表明!控制腺嘌 呤供体酵母抽提物的初始用量!在发酵过程中流加酵母抽提物可能是维持适宜腺嘌呤浓度的有效手段" 在 5`) D 发酵罐上对 BF 2)%6 分批补料发酵方式进行研究!结果发现以 5`) * DBF 2)%6 为底物!流加 5`) * D的 BF 2)%6!比一次性添加 ) * D的 BF 2)%6!利巴韦林的积累量提高 `2" i 关键词7酵母抽提物利巴韦林腺嘌呤VVV转酰胺酶 77利巴韦林 " K - 是一种高效广谱的核苷类 抗病毒药物被应用于治疗多种病毒感染如小铁腺病 毒肺炎病毒性肝 炎呼 吸 道 合 胞 病 毒 感 染 等 - % 发 fx 酵法是利用核苷生 产 菌 自 身 产 生 前 体 物 鸟 苷 和 嘌 呤 核苷磷酸化 酶 " V<V 向 培 养 基 中 添 加 28 三 氮唑 羧甲酰胺" @\; 合 成 利 巴 韦 林 " 见 图 % 目 前对发酵法合成利巴韦林的研究主要集中于菌种选 育和发酵条件优化而培养基优化也主要是考察无机 盐的作用对于关键生长因子的功能研究较少 2 8 - % 成途径的关键酶其活力的高低直接影响嘌呤合成途 磷酸核糖焦磷酸" VVV 转酰胺酶是嘌呤从 头 合 图 71`5 ) D 中嘌呤核苷酸 生物合成的反馈控制机制 径的通量 ) - 是评价利 巴 韦 林 生 产 能 力 的 指 标 之 一% VVV转酰胺酶催化嘌呤合成途径中 VVV转 化 为 氨基 ) 磷酸核糖" V; 该酶受腺苷 酸 " ;V 肌 苷 : `7@E OK - M E - M FR - -R OK X - E - 1`5 ) D 酸" V 及 鸟 苷 酸 " dv 的 阻 遏 同 时 它 还 受 到 的腺嘌呤在酶的作用下直接合成 ;V 1 - % 腺 嘌 呤 含 ;V系和 dv系中任一物质的反馈阻遏 6 - % 如图 量不足会影响菌体生长过 多 会 转 化 为 大 量 的 ;V 所 示 在 1`5 ) D 中 V dv 进而阻遏 VVV转 酰 胺 酶 合 成% 因 此 腺 嘌 呤 的 用 量 被不断利用不会出 现 过 度 积 累 的 现 象因 此 不 会 阻 是影响利巴韦林积累的关键因素 2 - % 遏 VVV转酰 胺 酶 的 合 成% 本 研 究 所 用 利 巴 韦 林 生 培养基中腺嘌呤主要来源于酵母抽提物但酵母 产菌株 1`5 ) D 为 腺 嘌 呤 缺 陷 抽提物因不同厂家及产地质量均有不同利巴韦林产 型菌株 5- 切 断 了 肌 苷 酸 到 腺 苷 琥 珀 酸 的 支 路% 但 ;V可以通过 补 救 途 径 合 成指 细 胞 利 用 培 养 基 中 量很容易受到腺嘌呤供体酵母抽提物质量的影响很 难保证发酵的稳 定 性% 本 研 究 采 用 摇 瓶 发 酵 对 腺 嘌 呤供体酵母抽提物种类和用量进行确定对发酵过程 第一作者!硕士研 究 生 " 陈 宁 教 授 为 通 讯 作 者 = M! - E R OR - % 7!天津市高等学校科技发展基金计划项目" < 2%8%6% 收稿日期!2%) %8 改回日期!2%) %) "!!")* +%)+" ) *! 中所需腺嘌呤量进行了优化并在发酵罐上研究了腺 嘌呤限量供应的作用为今后利巴韦林生产提供一定 指导意义%
研究报告 6 f 培养 % E 后将种子培养基按 %接入 5`) D发 7材料和方法 酵罐中" 装液 量 为 8 D % 发 酵 过 程 中 通 过 自 动 流 加 8:8;材料 氨水控制 FU 在 5`% 左 右 培 养 温 度 为 6 f% 当 培 ``7菌株 养基中葡萄糖浓度降至一定值时以设定脉冲速度将 利巴 韦 林 生 产 菌 1) *+5 ) 1%葡萄糖溶液流加至培养基中以维持葡萄糖的浓 D由天津科技大学代谢工程验室保藏% 度在菌体所需范 围 内% 每 2 E 添 加 2% @\;共 添 ``27培养基 加 次% 活化斜面培养基" * D!葡萄糖 蛋 白 胨 %牛 肉膏 %酵母膏 )< \2`)琼脂 2%FU5`% i5`2% 种子培养基 " * D! 葡 萄 糖 2% 豆 饼 水 解 液 2% 酵母粉 % 玉 米 浆 % < \2`) B"8 5U2 " U2 V"8 味精 )FU5`%% 发酵培养 基 " * D! 葡 萄 糖 1% 酵 母 粉 1 豆 饼 8:;分析方法 `6`7菌体 细 胞 生 长 量!!\T" 和 葡 萄 糖 消 耗 量 的 测定 发酵过程中取适量发酵液稀释后用紫外分光光 度计测定 6%% -M处 的 吸 光 度 值% 取 % MD发 酵 液 %%% * M - 离心 % M -用蒸馏水洗涤菌体 次置 水解液 82玉米浆 2" <U8 2 B"8 ) B"8 5U2 " 于真空干燥箱中 1% f干燥至恒重用分析天平称重% 12 UV"8 2`)味 精 )-B"8 %`%%6 : B"8 %`%2 菌体 生 物 量 以 干 重 "!\T 表 示! "!6%% -M l%`28) 无水 \ \ ) 葡萄糖酸钠 2FU5`%% 2 2` * D干 菌 体% 葡 萄 糖 浓 度 采 用 BC; 8%\生 物 传 感 仪 8:A;仪器与设备 测定% 高效液相 色 谱 ; -2%% 美 国 安 捷 伦5`) D i `6`27高效液相色谱分析 8:B;磷 酸 核 糖 焦 磷 酸! " 转 酰 胺 酶 的 活 性 检 发酵液中利巴韦林腺嘌呤含量以及酵母抽提物游离和 测 水解样品中氨基酸含量% 以 8乙腈为流动相流速为 粗酶液的制备蛋白质定量 分 析 和 VVV转 酰 胺 M D*M-柱温 1`) f检测波长为 2%5 -M测定发酵 x f 酶的活性测定参见文献 液上清液中的利巴韦 林% 以 %`2 M * DU V" 为 流 % 动相流 速 为 MD*M- 柱 温 26 f 检 测 波 长 26% 8:D;游离和水解氨基酸样品制备 取 酵母抽提物 直 接 溶 于 去 离 子 水 测定发 酵 液 上 清 液 中 的 腺 嘌 呤% 以 乙 腈 与 醋 酸 中 %%% -M * M - 离心 2 M -取 MD上清 液 用 于 测定酵母抽提 钠 溶 液 为 流 动 相 梯 度 洗 脱 柱 温 f 流 速 物中的游离氨基酸% MD* M -检测波长 6% -M用 28 二硝基氟苯柱前 水解酵母抽提物采用安培管封管法具体方法如 衍生测定游离和水解样品的氨基酸含量% C : ) 自动控制发酵罐美国 <CB 公司% 高效液相色谱采用的离子柱 ; R \1 分别测定 - 2 下!称取 的酵 母 抽 提 物 于 2% MD安 培 管 中 加 入 % MD6 M * DU\ 用液 氮 冷 冻待 液 体 超 过 * 凝 固后抽真空 熔 化 安 培 管 使 其 密 封% f 水 解 22 8 27结果与讨论 A:8;不同腺嘌呤供体对利巴韦林发酵的影响 E水解完成后冷却 后 过 滤取 适 量 滤 液 置 于 浓 缩 仪 由 于 实 验 所 用 的 1`5 ) D 或旋转蒸发仪中低于 6% f抽真空蒸发至干加入 是腺嘌呤缺陷型突变株因此腺嘌呤是影响利巴韦林 适量的去离子水溶解样品振荡混匀制得水解样品% 发酵的关键% 在培养 基 中 腺 嘌 呤 的 主 要 来 源 是 酵 母 8:E;发酵培养 抽提 物 实 验 分 别 选 取 种 酵 母 抽 提 物 " BF 摇 瓶 培 养! 将 1`5 ) D 菌 2)%6: 111D 1%% 添 加 量 为 1 * D 考 察 不 同 株经斜面活化后接 种 于 装 液 量 为 % MD的 种 子 培 养 来源的酵母抽提 物 对 利 巴 韦 林 发 酵 的 影 响% 摇 瓶 发 基中")%% MD摇瓶 6 f 培 养 % E 后 以 % 接 种 酵各参数见图 2可见采用不同来源 酵 母 抽 提 物 发 酵 量接种于 % MD发 酵 培 养 基 中 " )%% MD摇 瓶 每 组 时菌体的生长情 况 和 产 物 积 累 量 有 明 显 差 异% 由 图 个平行% 6 f 培养发酵周 期为 6% E期间 补 加 葡 2 ;菌体干重曲线可知利用 BF 2)%6 时菌体有 萄糖% 每 2 E 添加 2% @\;共添加 次% 一个较长的 对 数 期 在 6% E 达 到 最 大 生 物 量 `52 5`) D发酵罐培养!将 菌 株 经 斜 面 活 化 后 接 种 于 * D而利用 : 111 和 D 1%% 酵母抽 提 物 都 有 一 个 装液量 为 8 j%% MD的 种 子 培 养 基 中 " D摇 瓶 相对较短的对数期6 E 进入稳定期发酵 6% E 达到!"年第 %卷第 期! 总第!期" "!
食品与发酵工业 :""!;<!:==<@;@"<<!AB@=B 其最大生 物 量 %`1 * D和 `61 * D% 另 外 利 用 的关键因素% 基于 上 个 实 验 确 定 BF 2)%6 是 腺 : 111 时发酵后期菌体有明显衰退% 分 析 种 酵 母 嘌呤的最佳供体实验分别选取 8 个浓度" % * D) 抽提物 的 氨 基 酸 含 量 " 见 表 和 图 2 C葡 萄 糖 消 耗 * D2% * D2) * D 考 察 不 同 浓 度 的 BF 2)%6 曲线可以看出 BF 2)%6 所 含 氨 基 酸 较 其 他 2 种 对利巴韦林发酵的影响摇瓶发 酵 各 参 数 见 图 % 由 高消耗葡萄糖量最少% 推测可能是其自身的氨基酸 图 可看出不同浓度的 BF 2)%6 发酵时菌体的 直接作为菌体生长所需的营养物质从而减少了葡萄 生长情况和产物积 累 量 有 明 显 差 异% 从 图 ;菌 体 糖的消耗% 从图 2 \发 酵 过 程 中 利 巴 韦 林 积 累 量 曲 干重 曲 线 和 图 C葡 萄 糖 消 耗 曲 线 可 以 看 出 随 着 线可知利 用 BF 2)%6 发酵 6% E利巴 韦 林 积 累 BF 2)%6 浓度 的 增 加 菌 体 生 物 量 和 耗 糖 也 有 明 量 达到 5`52 * D而利用 :111 和 D1%% 发酵 6% E 显增加% 从图 \发 酵 过 程 中 利 巴 韦 林 积 累 曲 线 可 时利巴韦林积累量仅有 )` * D和 6`88 * D% 结 合 以看出BF 2)%6 浓度为 ) * D时发酵过程利巴 图 2!发酵过程中腺嘌呤含量变化分析其与利巴韦 韦林积累 量 最 高达 到 1` 8 * D当 浓 度 大 于 ) * D 林积累之间的联系发现发酵中后期 种酵母抽提 物 时利巴韦林积累量逐步降低% 结合图!发酵过程 提供的腺嘌呤含量 越 低利 巴 韦 林 的 积 累 量 也 越 低% 中腺嘌呤含量变化分析其与利巴韦林 积 累 之 间 的 联 通过图 2!发现 BF 2)%6 对 腺 嘌 呤 具 有 缓 释 作 系发酵中后期腺嘌呤含量过低或过高都会影响利巴 用腺嘌呤浓度既满 足 了 菌 体 的 生 长 需 要又 不 会 在 韦林的积累量% 推测出现上述现象的原因是 BF 发酵中后期浓度过低因此利巴韦林和菌体可大量积 2)%6 在发酵过 程 中 缓 慢 释 放 腺 嘌 呤 导 致 后 期 腺 嘌 累% 综上所述利用 BF 2)%6 对菌体生长和产物 呤过量加 快 菌 体 生 长 大 量 的 葡 萄 糖 流 向 =V途 积累最有利确定 BF 2)%6 作为利巴韦林发酵的 径使得合成利巴韦林的代谢通量减弱% i 腺嘌呤供体% fx 图 27添加不同酵母抽提物利巴韦林摇瓶发酵 图 7添加不同浓度 BF 2)%6 的利巴韦林 摇瓶发酵各参数比较 的各参数比较 : `7\ MF - F M - K - : `27\ MF - F M - K E M - - R-O O -X _ E M - - R-O O - - - - BF 2)%6 表 8;三种酵母抽提物中游离和水解氨基酸含量% 磷酸核糖焦磷酸" VVV 转酰胺酶是嘌呤从头合 游离腺嘌呤含量!%<= 8;)* * 6)%@ *) % -6%*-%- * * 6 * +% 6 )= )*6 %*- = %6 -%@ *) % -6 *% - 成途径的关键酶该酶活性的高低直接影响进入核苷 合成 途 径 的 通 量% 对 于 1`5 ) D" 见图 2 来说自身不能合成 ;V由于补救途径 "- )= 6 % 6) " %6 % 6 BF 2)%6 : 111 D 1%% 的存在腺 嘌 呤 会 转 化 成 ;V进 而 影 响 VVV转 酰 游离氨基酸 * " M 2` 2`%) 28`28 胺酶活性因此培养基中酵母抽提物所提供的腺嘌呤 水解氨基酸 * " M 6` 6%`) 8`% 5`%% 8`26 25`)8 种类 腺嘌呤 * " M 就成为影响 VVV转 酰 胺 酶 的 关 键% 由 图 8 ;可 以 看出 BF 2)%6 浓度为 ) * D下 VVV转 酰 胺 酶 A:A;K *M AEN 浓度对利巴韦林发酵的影响 由于 1`5 ) D 是 腺 嘌 呤 缺 陷型突变株因此腺嘌呤的用量是影响利巴韦林发酵 "!%!")* +%)+" ) *! 活力最高因此进入 核 苷 合 成 途 径 的 通 量 也 就 越 大% 图 8 C表明在添加 ) * DBF 2)%6 的 发 酵 过 程 中 VVV转酰胺酶活性随发酵时间而逐渐 降 低而 图
研究报告!所示在发酵 6 E 后 腺 嘌 呤 含 量 逐 步 升 高% 原 因 可能是发酵中后期腺嘌呤含量上升除了导致上述代 谢溢流外同 时 降 低 了 VVV转 酰 胺 酶 活 性 进 而 影 响利巴韦林的合成% 综上所述在利巴韦林发酵过程 中控制 BF 2)%6 浓 度 为 ) * D可 以 避 免 高 浓 度的腺嘌呤对 VVV转酰胺酶的 阻遏 和 代 谢 溢 流有 利于利巴韦林的积累% 图 )7不同初始腺嘌呤浓度下利巴韦林的 摇瓶发酵各参数比较 : `)7\ MF - F M - K E M - - R-O O - - - - - O - - 分析发酵液中腺嘌呤含量对 VVV转酰胺 酶 有 明 显 影响但 比 ) * DBF 2)%6 下 发 酵 液 中 腺 嘌 呤 ;!发酵 6 E 时不同 BF 2)%6 浓度下 VVV转酰胺酶活性比较 含量有明显降低VVV酶 活 力 也 有 所 提 高% 结 合 图 C!) * DBF 2)%6 下不同发酵时间 VVV转酰胺酶活性比较 )!和图 6C分析发现发酵中后期维持发酵液中腺嘌 图 87VVV转酰胺酶活性比较 i 呤含量在 8% i)% M* D有 利 于 维 持 VVV转 酰 胺 酶 持 VVV转 酰 胺 酶 活 力 进 而 提 高 利 A:B;不同初始腺嘌呤浓度对利巴韦林积累的影响 定的范围内保 酵母抽提物富含多种发酵所需的生长因子前期 巴韦林积累量% x 实验中发 现 其 在 利 巴 韦 林 发 酵 过 程 中 难 以 被 取 代% f 本研究使用的 BF 2)%6 对腺嘌呤具有缓释作用 影 响 了 导致 发 酵 后 期 腺 嘌 呤 浓 度 过 高 " 图! VVV转酰胺 酶 活 力% 为 了 稳 定 发 酵 过 程 中 的 腺 嘌 呤含量维持较高的 VVV转酰胺 酶活 力既 满 足 菌 体 度降 低 BF2)%6 生长又不会带来过高腺嘌呤浓 的初始浓度额外添 加 腺 嘌 呤研 究 不 同 初 始 腺 嘌 呤 : `87\ MF - -^ X M VVV M O - 活力% 综上所述降低初始酵母抽提物浓度额外添加 腺嘌呤有利于发酵中后期腺嘌呤浓度维持在一个稳 浓度对利巴 韦 林 积 累 的 影 响% 初 始 培 养 基 中 以 BF 2)%6 为基 础 额 外 添 加 不 同 浓 度 的 腺 嘌 呤 ;!发酵 6 E 时不同初始腺嘌呤浓度下的 VVV转酰胺酶活性比 即 培 养 基 中 初 始 腺 嘌 呤 总 量 分 别 为 `5 8`5 较C!初始腺嘌呤浓度为 85`) M* D下 不 同 时 间 点 VVV转 酰 85`)6`665`%8 M* D摇瓶发酵各参数见图 )% 胺酶活性比较 由图 ) ;菌 体 干 重 曲 线 和 图 ) C葡 萄 糖 消 耗 曲 线可知随着初始腺 嘌 呤 含 量 的 增 加生 物 量 和 耗 糖 图 67VVV转酰胺酶活性比较 : `67\ MF - -^ X M VVV M O - 也随之增加% 从图 ) \发 酵 过 程 中 利 巴 韦 林 积 累 曲 线可以看出当发酵液中 初 始 腺 嘌 呤 浓 度 为 `5 i A:D;K *M AEN 分批补料发酵过程分析 85`) M* D时利 巴 韦 林 产 量 随 着 腺 嘌 呤 浓 度 的 增 前期工作中发现发酵过程中较高的腺嘌呤含量 加而增加当初始腺嘌呤浓度为 85`) M* D时发酵 有益于菌体生长较低的腺嘌呤含量有利于解除对关 6% E 时 利 巴韦林积累最高达到 1`8 * D但 当 初 始 键酶 VVV转酰胺酶的阻遏作用提高利巴 韦 林 积 累 腺嘌呤浓度高于 85`) M* D时发 酵 6% E 时 利 巴 韦 量% 采用不同工艺条件进行 5`) D分批补料发酵发 林积累量明显降低% 结合图 )!发酵液中 腺 嘌 呤 的 含 量 曲 线 和 图 6; 酵开始时添加一定 浓 度 的 BF 2)%6 用 于 菌 体 生 长发酵 6 E 开始以 `) * " DE 的速率流加不同浓!"年第 %卷第 期! 总第!期" "!
食品与发酵工业 :""!;<!:==<@;@"<<!AB@=B 度的 BF 2)%6 通 过 限 制 发 酵 液 中 腺 嘌 呤 的 含 范围导致 VVV转 酰 胺 酶 活 力 较 高 从 而 以 较 高 的 量解除其对 VVV转酰胺酶的 阻遏% 考 察 了 不 同 方 生产 速 率 合 成 利 巴 韦 林% 可 见 适 当 地 减 少 初 始 案对利巴韦林发酵的影响% 试验结果见表 2 和图 5% BF 2)%6 的浓度 通 过 流 加 酵 母 抽 提 物 有 利 于 方案!) * D的 BF 2)%6 直接 添 加 到 培 养 基中不流加 方案 2! 5`) * D的 BF 2)%6 为 底 物 流 加 5`) * D的 BF 2)%6 提高利巴韦林的合成速率% 7结论 本研 究 通 过 摇 瓶 实 验 确 定 了 BF 2)%6 是 利 方案! * D的 BF 2)%6 为 底 物 流 加 2 * D的 BF 2)%6% 巴韦林发酵的最 佳 腺 嘌 呤 供 体 用 量 在 ) * D时 最 有利于利巴韦林积累% 在 ) * DBF 2)%6 的 条 件下发酵中 后 期 VVV转 酰 胺 酶 活 力 显 著 下 降 说 表 A;K *M AEN 不同添加方案下利巴韦林分批 明发酵液中腺嘌 呤 含 量 仍 是 过 高% 为 了 降 低 发 酵 过 补料发酵过程参数比较 程中的腺嘌呤含量维持 VVV转酰胺酶活 力在 既 满!%<= A;)@K% 6 )*)K% %@ 6 * -7 <% " 足菌体生长又不会 带 来 过 高 腺 嘌 呤 浓 度 的 前 提 下 降 <%O * @ * % )**- - *K *M AEN 低 BF 2)%6 的初始 浓 度额 外 添 加 腺 嘌 呤发 现 - *M K )M %@6 初始腺 嘌 呤 总 量 为 85`) M* D时发 酵 液 中 腺 嘌 呤 试验方案 过程参数 2 初始酵母抽提物浓度 * " D ) 5`) 补料酵母抽提物浓度 * " D % 5`) 2 培养时间 * E )% 最大菌体浓度 * " D 6`5 最大葡萄糖消耗量 * " D 最大利巴韦林产量 * " D ) 5`62 )2 6` 6 1`81 含量维持在 8% i)% M* DVVV转酰胺酶活 力 最 高 i 合成利巴韦林的 量 最 大% 在 分 析 以 上 发 酵 过 程 曲 线 的基础上认为控制腺嘌呤供体酵母抽提物的初始浓 嘌呤供应 方 式% 采 用 以 5`) * DBF 2)%6 为 底 ) *D的 BF2)%6 的方式分批补料发 物流加 5` 产 利 巴 韦 林 比 一 次 性 添 加 ) *D的 BF 酵生 x f 2)%6利巴韦林的积累量提高 `2% )2 )`6 % 5`%1 度对数生长期时流 加 酵 母 抽 提 物可 能 为 有 效 的 腺 56 年 " E 等 8- 首 次 提 出 发 酵 法核 苷 生 产 菌自身产生前体物鸟苷和表达嘌呤核苷磷酸化酶只 向培养 基 中 添 加 @\; 即 可 实 现 利 巴 韦 林 的 合 成% 由于菌株自身的嘌呤核苷磷酸化酶活性低利巴韦林 产量仅有 %`21 * D% 2%%5 年武改红等 8- 利用枯草芽 孢杆菌 @% 作 为 利 巴 韦 林 生 产 菌 优 化 培 养 基 成 图 57不同 BF 2)%6 添加方案下发酵过程菌体 分前体物 @\;培养温度及 FU等条件发 酵 结 束 时 比生长速率和利巴韦林比生产速率 利 巴 韦 林 仅 有 ) * D% 而 本 研 究 所 用 的 菌 株 : `57 - F M K - M - - F H E -O F K - F OR - R-O O -BF 2)%6 O F M 1`5 ) D 能 高 效 表 达 嘌 呤 磷 酸 化酶弥补 早 期 实 验 中 嘌 呤 磷 酸 化 酶 活 性 不 足 的 问 题% 此外经本工艺 优 化利 巴 韦 林 积 累 量 最 高 达 到 77结合表 2 和图 5 可知随初始培养基中腺嘌呤 供 1`8 * D% 由此可见采用腺嘌呤限量供应的发酵 工 体 BF 2)%6 浓度不同菌体生物量及利巴韦林的 艺能够显著提高利巴韦林产量为工业化生产利巴韦 积累量有明显差异% 方 案 和 方 案 2 获 得 的 最 大 生 林的发酵过程控制提供借鉴% 物量差异不大分别为 6`5 * D和 6` * D但 方案 2 中后期比生长速率缓慢下 降方 案 2 有 较 高 的 比 生 产 速 率 与 方 案 相 比 利 巴 韦 林 积 累 量 高 出 `2% 方案 获 得 的 最 大 生 物 量 仅 有 )`6 * D 参 考 文 献 - 7C R E!dU O\E - B U H E R -O F F O R O - ER K - 有较低的比生长速率与方案 相比利巴韦林积累 量 F _ F R F FEX _ D Y -`\ - - 降低 5`)% 在 方 案 2 下 腺 嘌 呤 维 持 在 合 适 浓 度 R! 2%%)"2! 8) 88` "!!")* +%)+" ) *!
研 究 报 告 % ;@7!<1 1 "" 8-! " - < 1" -1"-1 :" -!! 1! 1 :! ":!- " "12 1"! 5" ; <+ 1! - 115:! " < % 6 @ @ ;@!< -!! 1 12 1! 1! 1" -1"-1 :"!"! 1 1 1 " 1 ; <61 ;1 12 1 115: + 1! - 115: < % 武 改 红 赵 希 景 徐 庆 阳 等 < 微 生 物 发 酵 法 生 产 利 巴 韦 林 的 初 步 研 究 ; < 中 国 医 药 工 业 杂 志 < % 陈 宁 张 克 旭 张 蓓 < 代 谢 控 制 发 酵 < 北 京 中 国 轻 工 业 出 版 社 < % 徐 咏 全 张 蓓 张 克 旭 < 谷 氨 酰 胺 磷 酸 核 糖 焦 磷 酸 转 酰 胺 酶 研 究 进 展 ; < 生 物 技 术 通 讯 < % @ *!<!! 1! 1 12 : 1 "" 5 1" -1"-1 :" ; <;1 12 - % 王 镜 岩 朱 圣 庚 徐 长 法 < 生 物 化 学 < 北 京 高 等 教 育 版 社 < % 吴 敏 芝 钟 士 清 < 肌 苷 发 酵 中 酵 母 粉 限 量 控 制 的 初 步 研 究 ; < 农 牧 产 品 开 发 < % 吴 敏 芝 刘 咏 梅 王 焕 章 < 肌 苷 发 酵 酵 母 粉 量 控 制 及 其 表 现 ; < 发 酵 科 技 通 信 < % 李 良 秋 邱 玉 堂 < 腺 嘌 呤 对 枯 草 杆 菌 @ 发 酵 生 产 肌 苷 的 影 响 ; < 微 生 物 学 杂 志 < % 刘 国 生 王 玉 娟 黄 倩 < 肌 苷 发 酵 过 程 腺 嘌 呤 含 量 变 化 规 律 ; < 食 品 科 学 < % ;7 - ; 1 -!<*!! 2! 1 12!- 5! -1"-1 1":: 1-1"-! 1! "2 " 5! "! 1! 1!-!- -1"-1 1":: 1-1"-! "! ; <;1 12+ 1 15 - "! : < % - *!1 : <8 1! 1 12 1 :2!! 1 "" ; <;1 12!- 5! - *1!:12; < % 1 ) 6 @ "1 5 7 5 1 5 12+ 1! - 115: ) "!:12* - 115: - 5 5 12 2! @ 1 2! -! 1 1 )! 5 5 12! 1 1! 1!! 1-115: -!"% "5 1" 1!- 1! 1-:- 1!! 1!- 2!! 1 1!- "! 2!1 "!11! 2!!- 5 1!- 12! :fxi -!11 - "!!- ":!- " "12 : : " "!:!-!: 12 1 1!" 1! 1!! 1 1! - "!"!!-!* 5 "!- "! 1 1 5 "1! 21! 1 71!- 1!! 1 12 " 2 1!- " 1" 12* 5 "!11-5-!!- 122!! 1-21!-! =!!:12* 5 "! " - "!"!!-!!-!!:128 88 1! "2 "!-!! 12 1!- - 5- "! -!- 1!! 1!! 1 " 5 1 5:!-!- 2!! 1 = "!! E 5 - "!!!-! 1! 1 5!-!! 1 12: "!!! 2!- 2 5 1! =!!:12: "!!!" :2 " :!1 1! 1 1!! 1!- 2!! 1 * 5 2! - 2!! 1 2!! 1! ""! 6-5 * 5 " " "" "!! 1!- 5 * 5 "2!1!- 2!! 1 1!-!- 1! 1 " : 1!11!! 1 12 5 * 5 - "! :1! 1! 112 1 1 "1 " 25 21 "! 1! 1 12 %: "!!! 8 88 1! "2 " 年 第 卷 第 期 总 第 期