期 孙 志 洪 等 山 羊 瘤 胃 上 皮 细 胞 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 原 代 培 养 技 术 研 究 5 4 按 随 机 区 组 原 则 将 个 瘤 胃 或 空 肠 组 织 样 品 分 为 组 每 个 组 设 个 重 复 并 分 别 用 以 下 种 抗 生 素 洗 涤 液 进 行

动 物 营 养 学 报 山 羊 瘤 胃 上 皮 细 胞 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 原 代 培 养 技 术 研 究 孙 志 洪 张 庆 丽 贺 志 雄 韩 雪 峰 谭 支 良 张 恩 平 汤 少 勋 周 传 社 王 敏 中 国 科 学 院 亚 热 带 农 业 生 态 研 究 所 亚 热 带 农 业 生 态 过 程 重 点 实 验 室 长 沙 中 国 科 学 院 研 究 生 院 北 京 西 北 农 林 科 技 大 学 动 物 科 技 学 院 杨 凌 摘 要 本 研 究 旨 在 建 立 山 羊 瘤 胃 上 皮 细 胞!"#$!%! &' 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞!!"#$! %! ' 的 原 代 培 养 方 法 首 先 进 行 胃 肠 道 微 生 物 去 除 的 研 究 设 计 种 不 同 种 类 和 剂 量 的 抗 生 素 洗 涤 液 按 随 机 区 组 原 则 冲 洗 采 集 到 的 瘤 胃 上 皮 和 空 肠 黏 膜 根 据 微 生 物 去 除 试 验 结 果 选 择 最 佳 种 类 和 剂 量 的 抗 生 素 洗 涤 液 对 瘤 胃 上 皮 和 空 肠 黏 膜 进 行 洗 涤 然 后 采 用 不 同 的 方 法 对 &' 和 进 行 分 离 与 培 养 根 据 分 离 所 获 的 细 胞 特 征 以 及 细 胞 增 殖 活 性 结 果 确 定 适 合 山 羊 瘤 胃 上 皮 和 空 肠 黏 膜 特 性 的 分 离 方 法 结 果 表 明 为 有 效 去 除 黏 附 的 微 生 物 瘤 胃 上 皮 需 分 别 经 过 倍 青 链 霉 素 和 倍 庆 大 两 性 霉 素 洗 涤 液 的 冲 洗 而 空 肠 黏 膜 需 分 别 经 过 倍 青 链 霉 素 和 倍 庆 大 两 性 霉 素 洗 涤 液 的 冲 洗 瘤 胃 上 皮 和 空 肠 黏 膜 分 别 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 和 型 胶 原 酶 (,- 消 化 后 可 获 得 理 想 的 细 胞 分 离 效 果 以 及 细 胞 增 殖 活 性 本 研 究 结 果 提 示 根 据 胃 肠 道 微 生 物 的 组 成 特 征 以 及 组 织 特 性 选 择 所 确 定 的 抗 生 素 洗 涤 液 以 及 组 织 细 胞 分 离 方 法 可 用 于 山 羊 &' 和 ' 的 原 代 培 养 关 键 词 反 刍 动 物 原 代 细 胞 培 养 瘤 胃 空 肠 山 羊 中 图 分 类 号. 文 献 标 识 码 + 文 章 编 号 0 动 物 细 胞 培 养 是 现 代 生 物 学 研 究 中 应 用 最 为 广 泛 的 技 术 之 一 同 其 他 研 究 技 术 相 比 细 胞 培 养 技 术 具 有 以 下 突 出 优 点 可 长 时 期 监 控 检 测 甚 至 定 量 评 估 细 胞 形 态 结 构 和 生 命 活 动 等 可 人 为 控 制 研 究 条 件 便 于 研 究 各 种 物 理 化 学 生 物 等 外 界 因 素 对 细 胞 生 长 发 育 和 分 化 等 的 影 响 有 利 于 单 因 子 和 多 因 子 分 析 研 究 的 样 本 可 达 到 比 较 均 一 性 此 外 细 胞 培 养 技 术 还 具 有 研 究 范 围 比 较 广 泛 研 究 费 用 相 对 经 济 的 优 点 反 刍 动 物 瘤 胃 和 小 肠 是 消 化 吸 收 的 重 要 部 位 分 离 瘤 胃 上 皮 细 胞!"#$!%! &' 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞!!"#$! %! ' 用 于 细 胞 培 养 可 对 细 胞 的 增 殖 特 性 胃 肠 功 能 营 养 物 质 的 吸 收 转 运 及 机 制 等 进 行 研 究 反 刍 动 物 胃 和 肠 道 聚 居 着 细 菌 真 菌 支 原 体 和 原 虫 等 微 生 物 因 此 所 培 养 的 胃 肠 道 上 皮 细 胞 易 受 微 生 物 的 污 染 目 前 国 内 外 尚 无 可 靠 成 熟 的 反 刍 动 物 胃 肠 道 细 胞 分 离 及 培 养 技 术 可 供 参 考 本 研 究 在 借 鉴 国 际 上 人 以 及 其 他 动 物 胃 肠 道 细 胞 体 外 培 养 技 术 的 基 础 上 以 山 羊 为 动 物 模 型 研 究 山 羊 &' 和 的 原 代 培 养 技 术 拟 从 微 生 物 的 去 除 消 化 酶 的 选 用 和 使 用 等 方 面 出 发 寻 找 到 适 合 山 羊 瘤 胃 上 皮 和 空 肠 黏 膜 微 生 物 组 成 和 组 织 特 性 的 上 皮 细 胞 原 代 培 养 技 术 为 研 究 山 羊 和 其 他 反 刍 动 物 胃 肠 道 营 养 与 生 理 及 调 控 机 制 提 供 技 术 参 考 材 料 与 方 法 微 生 物 去 除 试 验 设 计 试 验 动 物 为 浏 阳 黑 山 羊 体 重 约 34 从 颈 静 脉 放 血 取 出 内 脏 组 织 分 离 瘤 胃 和 空 肠 去 掉 内 容 物 后 用 无 菌 生 理 盐 水 反 复 冲 洗 干 净 然 后 进 行 样 本 采 集 瘤 胃 和 空 肠 取 样 数 量 各 为 单 个 瘤 胃 和 空 肠 组 织 样 品 取 样 重 量 分 别 为 5 4 和 收 稿 日 期 11 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 与 中 国 科 学 院 知 识 创 新 工 程 重 要 方 向 项 目.0 联 合 资 助 作 者 简 介 孙 志 洪 1 男 四 川 成 都 人 助 理 研 究 员 博 士 研 究 生 主 要 从 事 反 刍 动 物 营 养 与 生 理 研 究 '$%2$,,%,% 通 讯 作 者 谭 支 良 研 究 员 博 士 生 导 师 '#%%

期 孙 志 洪 等 山 羊 瘤 胃 上 皮 细 胞 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 原 代 培 养 技 术 研 究 5 4 按 随 机 区 组 原 则 将 个 瘤 胃 或 空 肠 组 织 样 品 分 为 组 每 个 组 设 个 重 复 并 分 别 用 以 下 种 抗 生 素 洗 涤 液 进 行 冲 洗 对 照 无 菌 水 倍 青 链 霉 素 青 霉 素 ( 链 霉 素 倍 青 链 霉 素 倍 庆 大 两 性 霉 素 庆 大 霉 素 ( 两 性 霉 素 倍 庆 大 两 性 霉 素 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 以 及 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 倍 青 链 霉 素 和 倍 庆 大 两 性 霉 素 抗 生 素 洗 涤 液 浓 度 分 别 为 67- 青 霉 素 (4 - 链 霉 素 和 4 - 庆 大 霉 素 ( 4 - 两 性 霉 素 试 剂 配 制 11 羟 乙 基 哌 嗪 1811 乙 磺 酸 $29,:2!#$2 ""!!8!#$!;,%%9 ''.1 重 碳 酸 盐 等 压 缓 冲 液!!!!#,- 4. 先 加 最 后 加 然 后 加 入 ''. 配 制 的 过 程 中 充 入 调 " 至 保 存 备 用 抗 生 素 洗 涤 液 所 用 抗 生 素 购 自 江 苏 碧 云 天 生 物 研 究 所 用 ''. 等 压 缓 冲 液 配 到 所 需 浓 度 保 存 备 用 操 作 方 法 将 采 集 到 的 样 品 用 其 中 种 抗 生 素 洗 涤 液 冲 洗 次 然 后 将 样 品 放 入 - 灭 菌 蒸 馏 水 中 振 摇 后 取 出 组 织 样 品 再 加 入 - 灭 菌 蒸 馏 水 配 制 成! 的 稀 释 液 微 生 物 检 测 利 用 微 生 物 快 速 检 测 试 纸 上 海 '. 西 域 科 技 有 限 公 司 分 别 对 稀 释 液 中 细 菌 总 数 霉 菌 和 酵 母 进 行 测 定 检 测 方 法 参 考 汪 琦 简 要 程 序 如 下 菌 落 总 数 检 测 揭 起 覆 盖 试 纸 的 胶 片 将 - 稀 释 液 滴 于 纸 片 中 央 并 盖 好 用 压 板 轻 轻 压 下 将 稀 释 液 均 匀 分 布 在 试 纸 培 养 基 表 面 静 置 约 使 培 养 基 中 的 凝 胶 固 化 然 后 将 检 测 试 纸 水 平 放 于 恒 温 箱 内 培 养 5$ 后 计 数 红 色 菌 落 数 作 为 细 菌 总 数 霉 菌 和 酵 母 菌 检 测 接 种 后 程 序 同 上 下 培 养 9 后 计 数 酵 母 菌 落 特 征 为 小 型 菌 落 边 缘 清 晰 颜 色 均 一 灰 白 色 至 蓝 绿 色 菌 落 隆 起 霉 菌 菌 落 特 征 为 大 型 菌 落 边 缘 模 糊 中 间 颜 色 深 暗 颜 色 不 均 一 菌 落 扁 平 菌 落 数 计 算 菌 落 数 按 如 下 公 式 进 行 <"=# 式 中 为 每 毫 升 稀 释 液 中 菌 落 数 %;- " 为 试 纸 上 菌 落 数 %; 为 接 种 样 品 量 -# 为 稀 释 倍 数 细 胞 分 离 试 验 设 计 选 择 头 体 重 约 34 的 浏 阳 黑 山 羊 作 为 试 验 动 物 选 择 不 同 的 消 化 方 法 单 独 分 离 每 头 羊 的 &' 和 ' 消 化 方 法 如 表 所 示 组 织 *! 瘤 胃 上 皮 &!"#$! 表 山 羊 瘤 胃 上 皮 细 胞 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 分 离 方 法 *!!#$,9;,,#4&'9' 消 化 酶 消 化 温 度 )4!#>!!2! )4!#>!#!"!#! 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+ 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+ 消 化 时 间 )4!#>!#! 空 肠 黏 膜 型 胶 原 酶 (,- #2"!%,4!!(,- 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+ $! %, $ 试 剂 配 制,-?. 缓 冲 液 称 取 4 4 4 和 4 溶 于 - 蒸 馏 水 中 用 调 节 " 至 最 后 加

动 物 营 养 学 报 卷 蒸 馏 水 定 容 至 - 细 胞 培 养 基 )' 培 养 基 购 自 美 国.4 公 司 使 用 前 加 入 灭 活 胎 牛 血 清 美 国 6>#, 4! 公 司 和 抗 生 素 江 苏 碧 云 天 生 物 研 究 所 抗 生 素 种 类 和 剂 量 根 据 微 生 物 去 除 试 验 而 定 4 - 的 三 碘 甲 腺 原 氨 酸 * 以 及 4 - 的 #1 缬 氨 酸 用 调 节 " 至 过 虑 除 菌 保 存 备 用 抗 生 素 洗 涤 液 所 用 抗 生 素 购 自 江 苏 碧 云 天 生 物 研 究 所 用,-?. 缓 冲 液 配 制 抗 生 素 种 类 和 剂 量 根 据 微 生 物 去 除 试 验 而 定 保 存 备 用 细 胞 消 化 液 胰 蛋 白 酶 购 自 美 国 & 公 司 型 胶 原 酶 购 自 美 国 @6? 公 司 首 先 用?. 溶 液 将 胰 蛋 白 酶 型 胶 原 酶 ')*+ 和 配 制 成 倍 于 最 终 浓 度 的 母 液 调 节 " 至 过 虑 除 菌 保 存 使 用 前 将 胰 蛋 白 酶 溶 液 和 ')*+ 溶 液 或 胶 原 酶 溶 液 和 溶 液 按 比 例 混 匀 操 作 方 法 &' 分 离 取 出 瘤 胃 组 织 去 除 内 容 物 用 无 菌 生 理 盐 水 反 复 冲 洗 干 净 钝 性 剥 离 瘤 胃 上 皮 用 抗 生 素 洗 涤 液 冲 洗 瘤 胃 上 皮 次 放 入 充 $ 的 )' 培 养 基 中 带 回 实 验 室 将 瘤 胃 上 皮 再 次 用 抗 生 素 洗 涤 液 浸 泡 冲 洗 后 每 头 羊 所 取 的 瘤 胃 上 皮 约 4 用 手 术 剪 刀 将 瘤 胃 上 皮 乳 头 剪 碎 到 左 右 后 加 入 到 - 细 胞 消 化 液 中 气 浴 振 荡 消 化 细 胞 消 化 液 每 更 换 次 前 次 的 瘤 胃 上 皮 酶 解 液 用 的 尼 龙 布 过 虑 弃 去 过 滤 液 以 去 除 角 质 细 胞 以 后 的 酶 解 液 用 的 尼 龙 布 进 行 过 滤 重 复 次 将 过 虑 液 集 中 到 一 起 加 入 等 体 积 细 胞 培 养 基 离 心 去 除 上 清 液 吸 取 - 细 胞 培 养 基 用 滴 管 反 复 吹 打 悬 浮 所 沉 淀 的 细 胞 细 胞 悬 液 和 台 盼 兰 染 液 按 的 比 例 混 合 染 色 后 在 倒 置 显 微 镜 下 用 血 球 计 数 板 进 行 细 胞 计 数 并 区 分 出 活 细 胞 和 死 细 胞 数 以 计 算 细 胞 活 力 将 细 胞 悬 液 加 入 到 细 胞 培 养 基 中 调 节 细 胞 数 量 级 至 = - 利 用 成 纤 维 细 胞 和 上 皮 细 胞 贴 壁 时 间 差 先 培 养 $ 再 倒 瓶 最 后 将 含 有 &' 的 培 养 基 加 入 到 孔 细 胞 培 养 板 中 每 孔 - 每 头 羊 设 个 重 复 分 布 在 个 培 养 板 上 每 板 个 重 复 每 个 培 养 板 另 设 个 阴 性 对 照 不 加 细 胞 置 于 培 养 箱 中 下 进 行 培 养 每 $ 更 换 培 养 基 次 分 别 在 培 养 后 和 $ 取 出 个 细 胞 培 养 板 倒 置 显 微 镜 下 观 察 &' 生 长 状 态 和 形 态 变 化 同 时 每 孔 加 入 - 的 试 剂 日 本 同 仁 化 学 研 究 所 下 测 定 吸 光 度 以 检 测 细 胞 增 殖 活 性 ' 分 离 取 出 空 肠 组 织 去 除 内 容 物 用 无 菌 生 理 盐 水 反 复 冲 洗 干 净 空 肠 组 织 沿 纵 向 剖 开 用 抗 生 素 洗 涤 液 冲 洗 空 肠 组 织 次 放 入 充 $ 的 )' 培 养 基 中 带 回 实 验 室 将 空 肠 再 次 用 抗 生 素 洗 涤 液 浸 泡 冲 洗 后 用 无 菌 载 玻 片 刮 取 肠 黏 膜 层 每 头 羊 所 需 刮 取 的 空 肠 黏 膜 长 度 约 4 随 后 将 空 肠 黏 膜 放 入 到 - 的 细 胞 消 化 液 中 气 浴 振 荡 $ 的 尼 龙 布 进 行 过 滤 加 入 等 体 积 细 胞 培 养 基 离 心 去 除 上 清 液 吸 取 - 细 胞 培 养 基 用 滴 管 反 复 吹 打 悬 浮 所 沉 淀 的 细 胞 细 胞 计 数 细 胞 培 养 细 胞 增 殖 以 及 上 皮 细 胞 鉴 定 方 法 同 &' 分 离 统 计 分 析 用.+. 统 计 软 件 包 对 试 验 数 据 进 行 统 计 分 析 并 对 组 间 平 均 值 的 差 异 性 进 行 )% 氏 新 复 极 差 多 重 比 较 结 果 微 生 物 去 除 如 表 所 示 瘤 胃 上 皮 通 过 倍 青 链 霉 素 和 倍 庆 大 两 性 霉 素 或 倍 青 链 霉 素 和 倍 庆 大 两 性 霉 素 的 抗 生 素 洗 涤 液 清 洗 后 倍 稀 释 液 中 检 测 到 的 菌 落 总 数 霉 菌 数 和 酵 母 数 均 为 %;- 空 肠 黏 膜 通 过 倍 青 链 霉 素 和 倍 庆 大 两 性 霉 素 的 抗 生 素 洗 涤 液 清 洗 后 倍 稀 释 液 中 能 检 测 到 的 菌 落 总 数 霉 菌 数 和 酵 母 数 均 为 %;- 表 细 胞 分 离 如 表 所 示 瘤 胃 上 皮 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 消 化 所 获 的 活 细 胞 数 量 显 著 低 于 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 消 化 所 获 的 活 细 胞 数 量 $ 而 细 胞 活 力 则 是 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 显 著 高 于 胰 蛋 白 酶 ( ')*+$ 空 肠 黏 膜 经 型 胶 原 酶 (,- 消 化 液 消 化 所 获 的 活 细 胞 数 量 显 著 低 于 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 所 获 的 活 细 胞 数 量 $ 而 细 胞 活 力 则 是 型 胶 原 酶 (,- 消 化 液 极 显 著 高 于 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 $

期 孙 志 洪 等 山 羊 瘤 胃 上 皮 细 胞 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 原 代 培 养 技 术 研 究 表 抗 生 素 洗 涤 液 对 瘤 胃 微 生 物 的 去 除 *!%,!!,>4;,!"#$!2#,#%A$4,#, %;- 项 目 6#! 菌 落 总 数 *,# %,,2 霉 菌,9 酵 母!# 倍 青 链 霉 素 #!"!%#!"#,2% % 倍 青 链 霉 素 #!"!%#!"#,2% % % % 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!4!#%"$,#!% % 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!4!#%"$,#!% % % % 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!"!%#!"#,2%(#!4!#%"$,#!% 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!"!%#!"#,2%(#!4!#%"$,#!% 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!"!%#!"#,2%(#!4!#%"$,#!% 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!"!%#!"#,2%(#!4!#%"$,#!% % % % % % % % % % % % % 对 照,#,.' $ 值 $>! 同 列 数 据 肩 标 相 同 小 写 字 母 表 示 差 异 不 显 著 $ 相 邻 小 写 字 母 表 示 差 异 显 著 $ 相 间 小 写 字 母 表 示 差 异 极 显 著 $ 下 表 同 6#$!!%,>!A#$#$!!!#!"!%"#!,4;%#9;;!!%!$A#$#$! 9%!#!#!"!%"#!4;%#9;;!!%! $9A#$#$!#!"$!!#!"!%"#!4;%#9;;!!%!$*$!!!,A 表 抗 生 素 洗 涤 液 对 空 肠 黏 膜 微 生 物 的 去 除 *!%,!!,>4;,! %,2#,#%A$4,#, %;- 项 目 6#! 菌 落 总 数 *,# %,,2 霉 菌,9 酵 母!# 倍 青 链 霉 素 #!"!%#!"#,2% % % % 倍 青 链 霉 素 #!"!%#!"#,2%!;4!;4!;4 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!4!#%"$,#!% 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!4!#%"$,#!%!;!;!; 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!"!%#!"#,2%( #!4!#%"$,#!% 9 9 9 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!"!%#!"#,2%( #!4!#%"$,#!%!!! 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!"!%#!"#,2%( #!4!#%"$,#!% ;4 ;4 ;4 倍 青 链 霉 素 ( 倍 庆 大 两 性 霉 素 #!"!%#!"#,2%( #!4!#%"$,#!% 4 4 4 对 照,#,.' $ 值 $>! 如 表 所 示 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 消 化 所 获 的 &' 在 培 养 后 的 个 时 间 点 所 检 测 到 的 细 胞 增 殖 活 性 均 显 著 或 极 显 著 高 于 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 消 化 所 获 的 &'$ 或 $ 型 胶 原 酶 (,- 消 化 液 消 化 所 获 的 ' 在 培 养 的 个 时 间 点 所 检 测 到 的 细 胞 增 殖 活 性 均 高 于 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 消 化 所 获 的 '$ 或 $

动 物 营 养 学 报 卷 表 瘤 胃 上 皮 细 胞 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 特 征 *!$%#!#%,;&'9' 组 织 *! 消 化 酶 )4!#>!!2! 活 细 胞 数 量 B!%! 2!9 = - 细 胞 活 力! >#2 瘤 胃 上 皮 &!"#$! 空 肠 黏 膜! %, 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+ 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+.' $ 值 $>! 型 胶 原 酶 (,- #2"! %, 4!!(,- 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+ %.' $ 值 $>! 组 织 表 瘤 胃 上 皮 细 胞 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 增 殖 活 性 *!,;!#,%#>#2,;&'9' 消 化 酶 培 养 时 间 #!#!$ *! 瘤 胃 上 皮 &!"#$! 空 肠 黏 膜! %, )4!#>!!2! 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+ 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+ % %.' $ 值 $>! 型 胶 原 酶 (,- #2"! %, 4!!(,- 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ #2"( ')*+ % %.' $ 值 $>! 图 为 瘤 胃 上 皮 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 + 和 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液? 消 化 所 获 的 &'&' 分 离 后 呈 亮 球 形 多 成 单 个 存 在 多 数 细 胞 纤 毛 清 晰 可 见 细 胞 大 小 均 匀 形 态 差 异 不 大 瘤 胃 上 皮 消 化 后 其 细 胞 悬 浮 液 中 同 时 含 有 一 定 数 量 的 成 纤 维 细 胞 以 及 少 量 的 血 管 内 皮 细 胞 成 纤 维 细 胞 呈 长 梭 形 核 为 椭 圆 形 血 管 内 皮 细 胞 呈 扁 平 状 多 边 形 胞 体 较 大 核 圆 形 或 椭 圆 性 图 为 空 场 黏 膜 经 型 胶 原 酶 (,- 消 化 液 + 和 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液? 消 化 所 获 的 '' 形 态 特 征 同 &' 空 场 黏 膜 消 化 后 其 悬 浮 液 中 成 纤 维 细 胞 比 例 低 于 &' 悬 浮 液 而 血 管 内 皮 细 胞 比 例 高 于 后 者 讨 论 微 生 物 去 除 污 染 是 阻 碍 细 胞 培 养 成 功 的 关 键 因 素 而 微 生 物 污 染 是 细 胞 培 养 过 程 中 最 易 发 生 的 微 生 物 污 染 中 最 常 见 的 微 生 物 有 革 兰 氏 阳 性 菌 如 枯 草 杆 菌 以 及 大 肠 杆 菌 假 单 胞 菌 等 革 兰 氏 阴 性 菌 真 菌 污 染 也 是 细 胞 培 养 过 程 中 经 常 发 生 的 常 见 的 真 菌 有 烟 曲 霉 黑 曲 菌 孔 子 霉 毛 霉 菌 和 酵 母 菌 支 原 体 是

!$ 期 孙志洪等$山羊瘤胃上皮细胞和空肠黏膜上皮细胞原代培养技术研究 #"& 介于细菌与病毒之 间 能 独 立 存 活 的 微 生 物!最 小 直 培养过程中的微生物污染还包括病毒和非同种细胞 径只有 " >!#.!一 般 过 滤 除 菌 无 法 去 除 支 原 体!光 污染&细胞培养过程中微生物污染的主要来源包括 镜下也难以看清其形态结构&支原体能在偏碱条件 动物组织标本(空气(操作以及血清& " >"#下 生 存!对 青 霉 素 有 抗 药 性& 细 胞 >%$G 4Z+ 图!! 经 #" &( 胰蛋白酶 )*" *#( +,-.#.$和 &" *( 胰蛋白酶 )*" *#( +,-.# $ 消化后获得的瘤胃上皮细胞 g #!B6389:W 5 3W\P!' )"? 5, 0@"' "!? 9ABC " C#10W)' ""? 5, 0@"' "!? 9ABC " c# R' R3 P4 P4 图 #! 经 *" #(! 型胶原酶#.$和 *" #&( 胰蛋白酶# $消化后获得的空肠黏膜上皮细胞 'E:1:2 g!!b63<9:w 5 3W\P"'!"? 5 2 2 1R301 3@"' )"..D 2 C#!" R' R3 P43! 7D 10W"'!)? 5, 0@"' "!? 9ABC " c# P4!! 反刍动物瘤胃 中 栖 息 的 微 生 物 包 括 细 菌 "超 过!"" 种!活菌数高达 #a#"## 7 Y -'.E#(原虫"超过!) 个属!真菌 孢子 为 #a#"$ $#a#") 7 '.E#(古 菌 和 Y - 个属"其数 量 为 #a#"( $#a#"% 7 Y -'.E#(真 菌 " ) 以细胞数量计!瘤 胃 微 生 物 数 量 约 为 反 刍 动 物 自 身 '.E#)!&$*& 噬菌体"其 数 量 可 达 #a#"+ $#a#"* 7 Y -

动 物 营 养 学 报 卷 细 胞 数 目 的 倍 同 瘤 胃 一 样 反 刍 动 物 肠 道 也 寄 生 着 大 量 微 生 物 )!#$!;! 等 发 表 在 美 国 公 共 科 学 图 书 馆 生 物 学 -,.,,42 杂 志 上 的 一 篇 文 章 称 肠 道 内 的 细 菌 数 量 是 原 有 认 识 的 倍 以 上 肠 道 微 生 物 可 分 为 细 菌 古 菌 和 真 核 生 物 其 中 细 菌 细 胞 密 度 最 高 正 因 为 反 刍 动 物 胃 和 肠 道 中 寄 生 着 种 类 和 数 量 如 此 之 多 的 微 生 物 进 行 &' 和 ' 培 养 的 首 要 工 作 就 是 去 除 微 生 物 的 干 扰 目 前 对 采 集 的 瘤 胃 上 皮 或 肠 道 黏 膜 组 织 通 常 采 用 倍 或 倍 甚 至 更 高 浓 度 的 青 链 霉 素 洗 涤 液 进 行 冲 洗 青 链 霉 素 洗 涤 液 浓 度 即 使 再 高 也 只 能 去 除 反 刍 动 物 胃 肠 道 组 织 中 的 革 兰 氏 阳 性 菌 和 革 兰 氏 阴 性 菌 并 且 洗 涤 溶 液 过 高 对 组 织 本 身 具 有 毒 副 作 用 影 响 细 胞 生 长 因 此 所 采 集 的 反 刍 动 物 胃 肠 道 上 皮 组 织 除 使 用 青 链 霉 素 洗 涤 液 清 洗 外 还 应 配 合 使 用 其 他 种 类 的 抗 生 素 洗 涤 液 庆 大 霉 素 对 支 原 体 具 有 杀 菌 或 抑 菌 作 用 而 两 性 霉 素 对 酵 母 或 霉 菌 具 有 杀 菌 或 抑 菌 作 用 本 研 究 结 果 证 实 了 上 述 理 论 单 独 使 用 青 链 霉 素 或 庆 大 两 性 霉 素 都 无 法 去 除 瘤 胃 上 皮 或 空 肠 黏 膜 所 黏 附 的 微 生 物 瘤 胃 上 皮 先 后 经 过 倍 青 链 霉 素 洗 涤 液 和 倍 的 庆 大 两 性 霉 素 洗 涤 液 冲 洗 后 能 够 有 效 去 除 黏 附 的 微 生 物 而 空 肠 黏 膜 通 过 倍 青 链 霉 素 洗 涤 液 和 倍 的 庆 大 两 性 霉 素 洗 涤 液 冲 洗 后 才 能 有 效 去 除 黏 附 的 微 生 物 同 时 比 较 表 和 表 后 发 现 通 过 相 同 浓 度 的 抗 生 素 洗 涤 液 倍 青 链 霉 素 洗 涤 液 和 倍 的 庆 大 两 性 霉 素 洗 涤 液 除 外 清 洗 后 瘤 胃 上 皮 微 生 物 稀 释 液 中 的 菌 落 总 数 霉 菌 数 和 酵 母 数 均 低 于 空 肠 黏 膜 微 生 物 稀 释 液 本 研 究 结 果 表 明 空 肠 黏 膜 黏 附 的 微 生 物 比 瘤 胃 上 皮 更 难 去 除 出 现 这 一 结 果 可 能 有 个 方 面 的 原 因 单 位 面 积 空 肠 黏 膜 黏 附 的 微 生 物 种 类 和 数 量 高 于 瘤 胃 上 皮 关 于 这 一 点 尚 未 有 权 威 的 文 献 报 道 空 肠 黏 膜 同 微 生 物 的 黏 附 度 高 于 瘤 胃 上 皮 这 可 能 是 由 组 织 黏 附 差 异 性 造 成 的 细 胞 分 离 &' 分 离 瘤 胃 上 皮 从 浆 膜 侧 到 黏 膜 侧 可 分 为 基 底 层 棘 状 细 胞 层 颗 粒 细 胞 层 和 角 质 化 细 胞 层 基 底 层 与 肌 层 相 连 基 底 层 细 胞 具 有 完 全 功 能 的 线 粒 体 和 其 他 细 胞 器 中 间 层 细 胞 棘 状 细 胞 层 和 颗 粒 细 胞 层 形 状 多 样 从 棘 状 层 到 颗 粒 层 细 胞 内 线 粒 体 数 量 逐 渐 减 少 拥 有 丰 富 线 粒 体 的 基 底 层 和 棘 状 层 细 胞 在 瘤 胃 上 皮 代 谢 方 面 如 生 酮 发 挥 主 要 作 用 因 此 从 代 谢 角 度 进 行 评 定 基 底 层 和 棘 状 层 细 胞 是 瘤 胃 上 皮 最 重 要 的 细 胞 也 是 体 外 研 究 瘤 胃 上 皮 营 养 代 谢 的 最 佳 细 胞 而 坚 实 的 角 质 层 是 进 行 细 胞 分 离 的 主 要 障 碍 @; 等 首 次 应 用 胰 蛋 白 酶 连 续 消 化 法 首 先 去 除 角 质 层 细 胞 再 通 过 连 续 消 化 获 得 以 棘 状 层 和 颗 粒 层 为 主 的 &' 进 行 瘤 胃 上 皮 生 酮 研 究,# 等 对 消 化 缓 冲 液 和 胰 蛋 白 酶 浓 度 进 行 了 优 化 获 得 大 量 活 细 胞 比 例 极 高 的 &' 目 前 消 化 瘤 胃 上 皮 所 采 用 的 胰 蛋 白 酶 浓 度 通 常 为 和 胰 蛋 白 酶 消 化 能 力 强 但 会 损 坏 细 胞 并 且 消 化 活 力 易 受 ( 4 ( 等 二 价 离 子 削 弱 ')*+ 可 螯 合 细 胞 表 面 和 培 养 皿 上 的 ( 4 ( 等 二 价 离 子 以 增 强 胰 蛋 白 酶 对 组 织 细 胞 的 分 离 本 研 究 结 果 显 示 瘤 胃 上 皮 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 消 化 后 活 细 胞 数 量 低 于 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 但 是 细 胞 活 力 以 及 细 胞 培 养 和 $ 后 所 检 测 到 的 细 胞 增 殖 活 性 明 显 高 于 或 好 于 后 者 本 研 究 结 果 表 明 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 体 重 为 34 的 山 羊 的 瘤 胃 上 皮 可 获 得 细 胞 活 力 较 高 以 及 细 胞 增 殖 活 性 较 好 的 &' ' 分 离 小 肠 各 段 肠 壁 结 构 大 致 相 同 由 内 向 外 分 为 黏 膜 层 黏 膜 下 层 肌 层 和 浆 膜 层 其 中 黏 膜 层 由 上 皮 和 固 有 膜 组 成 黏 膜 上 皮 细 胞 为 单 层 柱 状 类 型 有 吸 收 细 胞 和 杯 状 细 胞 种 前 者 约 占 固 有 膜 由 类 似 网 状 结 缔 组 织 组 成 内 含 丰 富 的 毛 细 血 管 网 毛 细 淋 巴 管 弥 散 的 淋 巴 组 织 和 淋 巴 小 结 神 经 分 散 的 平 滑 肌 及 多 种 细 胞 成 分 如 吞 噬 细 胞 淋 巴 细 胞 和 浆 细 胞 等 因 小 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 #!#!" #$! %! 6' 是 体 内 更 新 最 快 的 一 类 细 胞 故 其 成 为 研 究 细 胞 增 殖 和 分 化 调 控 机 制 的 理 想 模 型 6' 培 养 已 发 展 成 为 一 项 较 成 熟 的 技 术 广 泛 应 用 于 医 药 和 营 养 等 领 域 发 达 国 家 已 在 一 些 医 药 开 发 等 领 域 构 建 了 细 胞 库 但 其 仅 局 限 于 人 类 的 生 物 制 药 开 发 应 用 目 前 已 建 立 的 一 些 肠 上 皮 细 胞 系 如 %,* 和 * 等 多 属 于 癌 细 胞 株 以 畜 禽 6' 作 为 研 究 素 材 的 报 道 较 少 6' 的 体 外 培 养 对 于 研 究 肠 上 皮 干 细 胞 的 增 殖 分 化 机 理 肠 上 皮 细 胞 间 信 号 传 导 营 养 物 质 的 吸 收 利 用 和 转 化 以 及 肠 道 免 疫 等 方 面 具 有 重 要 意 义 但 小 肠 上 皮 细 胞 的 分 离 培 养 难 度 较 大 能 成 功 建 立 单 克 隆 6' 系 的 报 道 较 少 正 因 为 如 此 6' 分 离 要 求 格 外 严 格 @, 等 和 '> 等 以 大 鼠 6' 为 材 料 研 究 建 立 了 大 鼠 6' 原 代 培 养 方 法 能 使 6' 的 结 构 和

期 孙 志 洪 等 山 羊 瘤 胃 上 皮 细 胞 和 空 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 原 代 培 养 技 术 研 究 功 能 得 到 较 好 的 保 持 在 此 基 础 上 众 多 国 内 外 学 者 对 6' 的 分 离 和 培 养 方 法 进 行 了 探 讨 对 影 响 6' 培 养 的 因 素 有 了 初 步 认 识 首 先 是 动 物 样 本 用 于 分 离 培 养 的 小 肠 黏 膜 组 织 应 确 保 无 菌 小 肠 黏 膜 组 织 取 自 刚 出 生 未 进 奶 的 新 生 动 物 最 好 对 已 进 食 的 动 物 分 离 培 养 过 程 中 使 用 的 组 织 洗 涤 液 细 胞 分 离 液 和 培 养 液 均 应 加 入 一 定 浓 度 的 抗 生 素 溶 液 其 次 是 消 化 酶 分 离 到 形 态 完 整 的 小 肠 绒 毛 隐 窝 细 胞 团 是 6' 体 外 培 养 成 功 的 一 个 关 键 因 素 而 联 合 应 用 胶 原 酶 和 中 性 蛋 白 酶 消 化 小 肠 黏 膜 上 皮 组 织 可 获 得 最 好 的 分 离 效 果 且 所 用 酶 浓 度 低 消 化 时 间 短 再 次 是 血 清 和 基 质 进 行 6' 培 养 所 用 的 胎 牛 血 清 的 浓 度 一 般 不 低 于 和 超 过 培 养 基 中 加 入 表 皮 生 长 因 子 胰 岛 素 和 谷 氨 酰 胺 等 物 质 更 利 于 6' 的 生 长 本 研 究 以 小 肠 中 的 空 肠 黏 膜 为 样 本 在 实 施 细 胞 分 离 之 前 首 先 根 据 胃 肠 道 微 生 物 去 除 试 验 的 研 究 结 果 分 别 用 倍 青 链 霉 素 和 倍 的 庆 大 两 性 霉 素 对 采 集 的 空 肠 黏 膜 进 行 洗 涤 对 空 肠 黏 膜 所 粘 附 的 微 生 物 进 行 了 有 效 去 除 细 胞 分 离 试 验 结 果 显 示 空 肠 黏 膜 经 型 胶 原 酶 (,- 消 化 液 消 化 后 细 胞 活 力 显 著 高 于 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 虽 然 细 胞 悬 浮 液 中 活 细 胞 数 量 前 者 低 于 后 者 研 究 结 果 表 明 型 胶 原 酶 (,- 消 化 液 消 化 山 羊 ' 的 能 力 低 于 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 但 对 细 胞 的 破 坏 却 低 于 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 消 化 液 细 胞 增 殖 试 验 也 证 实 了 这 一 观 点 有 别 于 其 他 学 者 本 研 究 所 采 用 的 消 化 酶 为 型 胶 原 酶 同 时 在 消 化 液 中 加 入 胶 原 酶 激 活 剂 研 究 结 果 包 括 分 离 所 获 的 上 皮 细 胞 特 征 和 细 胞 增 殖 表 明 型 胶 原 酶 和 的 混 合 消 化 液 可 用 于 分 离 ' 此 外 本 研 究 过 程 中 由 于 利 用 了 &' 或 ' 同 成 纤 维 细 胞 的 贴 壁 时 间 差 以 及 在 培 养 液 中 加 入 促 进 上 皮 细 胞 生 长 的 三 碘 甲 腺 原 氨 酸 和 抑 制 成 纤 维 细 胞 增 殖 的 # 1 缬 氨 酸 使 成 纤 维 细 胞 减 少 达 到 纯 化 的 目 的 同 时 结 合 的 尼 龙 布 进 行 过 滤 可 以 得 到 纯 度 较 高 的 上 皮 细 胞 结 论 瘤 胃 上 皮 分 别 经 过 倍 青 链 霉 素 和 倍 庆 大 两 性 霉 素 洗 涤 液 的 冲 洗 可 有 效 去 除 黏 附 的 微 生 物 为 达 到 同 样 效 果 空 肠 黏 膜 需 分 别 经 过 倍 青 链 霉 素 和 倍 庆 大 两 性 霉 素 洗 涤 液 的 冲 洗 瘤 胃 上 皮 和 空 肠 黏 膜 分 别 经 胰 蛋 白 酶 ( ')*+ 和 型 胶 原 酶 (,- 消 化 后 可 获 得 理 想 的 细 胞 分 离 效 果 以 及 细 胞 增 殖 活 性 根 据 胃 肠 道 微 生 物 的 组 成 特 征 以 及 组 织 特 性 选 择 所 确 定 的 抗 生 素 洗 涤 液 以 及 组 织 细 胞 分 离 方 法 可 用 于 山 羊 &' 和 的 原 代 培 养 参 考 文 献 汪 琦 食 品 中 霉 菌 检 测 两 种 方 法 的 比 较 中 国 误 诊 学 杂 志!.#%#!,;#$!!$!%, #2,;#$!!+""!99'>,! # %,,,42 )!$,#2?+*,+';;!%#,;;!!94;! D!%2,%#! 9;4 %,%!##, " 9,#$!"!#!#$!!,,; +.%!%! )!#$!;!-!..,4 -!#*$!"!> >!!;;!%#,;#,#%,#$!$4#%,,#!>!!929!!".&+!D!%4 -,.?,,42 $#?,!)!!,32,#! #$!!!,#2,%!!94,;#$!#, +%9!2,;.%!%! @;!,492.#C#!,;!"#$! %!;,,>! %,B!#!2 &!!%$,%#,,#-?9A& -@&!#&!;!!# "2!!"#$! %! %#, #!%$D!,,;)2.%!%! @,&>9!, ':A! -'!#6, #,,;%,,%%2"##$###%# 9!#,%>#2%@#,!#!,,42 '>@.*$!9!>!,"!#,;!#$,9;,#$! "!"#,,;##!#!"#$! %! "2 %#!,,;!.%!%! 戴 定 威 吴 圣 媚 李 敏 等 新 生 大 鼠 小 肠 上 皮 细 胞 分 离 培 养 研 究 细 胞 生 物 学 杂 志 王 莉 段 相 林 大 鼠 小 肠 上 皮 细 胞 的 体 外 原 代 培 养 军 事 医 学 科 学 院 院 刊 伍 峰 全 先 庆 吴 仕 孝 等 小 肠 黏 膜 上 皮 细 胞 原 代 培 养 最 适 条 件 的 研 究 重 庆 医 科 大 学 学 报

动 物 营 养 学 报 卷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编 辑 菅 景 颖