动 物 生 产 层 草 业 科 学! 甘 肃 地 区 绵 羊 支 原 体 病 原 菌 的 分 离 培 养 卷 期 "#$%!#% 朱 琳 常 卫 华 张 勇 叶 得 河 赵 兴 绪 甘 肃 农 业 大 学 动 物 医 学 院 甘 肃 兰 州 && 摘 要 在 甘 肃 省 ' 个 地 区 采 集 了 份 绵 羊 血 清 样 本 并 对 份 样 品 进 行 了 血 清 学 及 病 原 菌 分 离 培 养 试 验 血 清 学 检 测 初 步 鉴 定 为 份 阳 性 其 中 份 来 自 于 同 一 地 区 然 后 对 两 例 疑 似 患 病 羊 做 病 原 分 离 鉴 定 以 及 微 生 物 学 诊 断 和 鉴 定 并 对 病 原 菌 进 行 革 兰 氏 染 色 本 研 究 成 功 地 从 病 羊 身 体 中 分 离 出 细 小 纤 细 的 呈 球 形 双 球 形 线 状 螺 旋 状 半 月 状 和 短 杆 状 等 形 态 的 绵 羊 肺 炎 支 原 体 关 键 词 羊 支 原 体 肺 炎 分 离 培 养 鉴 定 中 图 分 类 号 文 献 标 识 码 文 章 编 号 ' 目 前 支 原 体 #$()*( 是 已 知 能 独 立 生 活 的 最 小 原 核 微 生 物 无 细 胞 壁 牛 胸 膜 肺 炎 病 原 体 丝 状 支 原 体 亚 种 在 临 床 兽 医 方 面 是 最 早 发 现 的 支 原 体 巴 斯 德 研 究 所 首 先 从 患 肺 炎 病 牛 的 胸 腔 积 液 中 成 功 分 离 到 支 原 体 该 微 生 物 菌 落 极 小 染 色 比 较 困 难 难 以 从 形 态 学 上 进 行 鉴 定 因 此 当 时 只 是 称 之 为 胸 膜 肺 炎 微 生 物 后 来 (+( 等 第 一 次 从 苏 格 兰 患 病 绵 羊 肺 中 成 功 分 离 出 绵 羊 肺 炎 支 原 体 在 国 内 胡 景 韶 谢 守 栋 等 分 别 于 年 ' 年 从 患 肺 炎 绵 羊 的 的 肺 脏 中 成 功 分 离 出 绵 羊 肺 炎 支 原 体 羊 支 原 体 肺 炎 是 以 咳 嗽 喘 气 渐 进 性 消 瘦 以 及 肺 间 质 增 生 性 炎 症 为 特 征 的 慢 性 呼 吸 道 疾 病 是 危 害 世 界 养 羊 业 的 重 要 传 染 病 之 一 该 病 临 床 诊 断 特 征 为 高 热 咳 嗽 胸 膜 腔 发 生 浆 液 性 以 及 纤 维 素 性 炎 症 一 般 有 急 慢 性 经 过 发 病 率 多 在,, 有 的 高 达,, 死 亡 率 ',, ' 由 于 羊 感 染 支 原 体 后 常 呈 亚 急 性 表 现 康 复 后 成 为 长 期 隐 性 带 菌 者 而 且 仅 仅 通 过 临 床 症 状 和 病 理 变 化 很 难 做 出 确 切 的 判 断 给 该 病 的 控 制 和 消 灭 带 来 很 大 困 难 给 养 羊 业 造 成 重 大 经 济 损 失 为 对 该 病 进 行 准 确 而 迅 速 地 诊 断 彻 底 控 制 和 消 灭 绵 羊 支 原 体 病 增 加 养 羊 企 业 的 经 济 效 益 本 研 究 对 甘 肃 地 区 的 绵 羊 肺 炎 支 原 体 进 行 了 分 离 培 养 及 鉴 定 材 料 与 方 法 % 材 料 %% 供 试 材 料 无 临 床 症 状 的 绵 羊 血 样 份 采 自 甘 肃 陇 西 某 种 羊 场 甘 肃 永 昌 某 种 羊 场 甘 肃 皋 兰 某 种 羊 场 甘 肃 民 勤 某 种 羊 场 及 景 泰 地 区 现 场 对 例 死 亡 的 羊 进 行 解 剖 编 号 为 采 集 病 变 肺 脏 之 后 对 同 舍 另 一 只 具 有 咳 嗽 呼 吸 困 难 的 病 羊 进 行 颈 动 脉 放 血 致 死 编 号 为 同 时 采 血 * 以 备 抗 体 检 测 切 取 右 侧 肺 脏 及 淋 巴 结 一 并 送 往 实 验 室 进 行 微 生 物 学 检 测 和 支 原 体 分 离 鉴 定 %% 主 要 药 品 及 试 剂 的 配 置 血 清 诊 断 液 羊 肺 炎 支 原 体 间 接 红 细 胞 血 凝 冻 干 抗 原 阳 性 血 清 阴 性 血 清 稀 释 液 均 由 兰 州 兽 医 研 究 所 提 供 *-. 购 于 百 泰 克 生 物 工 程 有 限 公 司 /! 提 取 及 存 化 试 剂 盒 购 于 天 根 生 物 技 术 有 限 公 司 其 它 常 规 试 剂 均 购 于 甘 肃 凯 驰 新 达 生 物 技 术 有 限 公 司 支 原 体 培 养 基 * 培 养 基 的 配 置 称 取 01# 葡 萄 糖 丙 酮 酸 钠 加 水 至 &* 完 全 溶 解 1 取 %, 酚 红 %'* 酵 母 浸 出 液 * 加 入 中 混 匀 再 加 入 青 霉 素 钠 万 单 位, 醋 收 稿 日 期 接 受 日 期 基 金 项 目 甘 肃 省 教 育 厅 基 金 作 者 简 介 朱 琳 ' 女 甘 肃 兰 州 人 助 理 工 程 师 在 职 硕 士 生 从 事 兽 用 生 物 制 品 的 研 发 生 产 经 营 与 技 术 服 务 *(-$&%#* 常 卫 华 男 山 东 泰 安 人 在 读 博 士 生 研 究 方 向 为 临 床 兽 医 学 *(-$(23-4(%#* 通 信 作 者 赵 兴 绪 男 甘 肃 漳 县 人 教 授 博 士 研 究 方 向 为 兽 医 产 科 学 及 发 育 生 物 学 *(-$5(#..)(4%364%
草 业 科 学 第 卷 期 酸 铊 * 溶 解 后 于 ' 7 高 压 下 灭 菌 处 理 *- 待 冷 却 后 在 超 净 台 内 操 作 加 入 * 滤 过 灭 菌 的 羊 血 清 最 后 用 高 压 灭 菌 过 的!(08 调 节 至 8 值 为 &%&% % 羊 支 原 体 病 的 血 清 学 检 测 将 1 滴 于 " 型 反 应 板 各 孔 中 每 孔 ' 取 被 检 血 清 ' 于 第 孔 后 与 1 混 匀 倍 比 稀 释 至 第 & 孔 弃 去 ' 然 后 每 孔 加 入 抗 原 ' 均 设 阴 性 阳 性 对 照 每 组 滴 加 孔 当 液 体 加 完 后 将 " 型 反 应 板 放 在 振 荡 器 上 震 荡 *- 使 诊 断 液 中 的 血 细 胞 分 布 均 匀 然 后 从 震 荡 器 上 取 下 " 型 反 应 板 置 于 & 7 温 箱 中 孵 育 之 后 观 察 结 果 判 定 标 准 如 表 99 以 上 凝 集 者 判 为 阳 性 阳 性 对 照 组 滴 度 要 高 于 : 阴 性 对 照 组 除 第 孔 可 以 出 现 前 滞 现 象 9 外 其 余 孔 均 应 为 血 清 效 价 大 于 等 于 :99 者 判 为 阳 性 效 价 小 于 等 于 : & 者 判 为 阴 性 表 结 果 判 定 标 准 判 定 结 果 04#*3)#;63-)-# 9999 999 99 9 判 定 标 准 /3-)-#-3-( 红 细 胞 全 部 凝 集 形 成 一 层 均 匀 膜 布 满 孔 底 $36$##63$($4-(3;#*-($(3#;4-;#*;-$*(6;4$#;3##*#;3#$3 红 细 胞 孔 底 形 成 一 层 薄 膜 面 积 小 36$##63$);#*($(3#;;-$*(3##*#;3#$3(63(3(-))*($ 红 细 胞 孔 底 薄 膜 凝 集 边 缘 松 散 呈 锯 齿 状 36$##63$($4-(-(#$3##*;-$*363$##)3-63(-# 红 细 胞 呈 稀 薄 散 在 少 量 凝 集 孔 底 有 小 圆 点 #3)(3-)(336()*($(*#4#;($4-(-#(3##*#;3#$3()( )*($6# 红 细 胞 沉 于 孔 底 但 边 缘 不 光 滑 或 中 心 油 有 斑 36$##63$6#236(3##*#;3#$34#)*##363#3($())# 红 细 胞 完 全 沉 底 呈 光 滑 圆 点 36$##63$)#*$33$)-+()*##6# %! 病 原 分 离 培 养 %!% 培 养 过 程 液 体 培 养 将 肺 组 织 剪 碎 取 小 碎 块 接 种 于 试 管 各 两 支 分 别 标 记 为 将 支 试 管 振 荡 混 匀 后 各 吸 取 约 %'* 混 匀 并 倍 递 减 稀 释 剪 碎 的 肺 组 织 用 匀 浆 器 匀 浆 后 吸 取 上 清 混 悬 液 约 %' * 各 接 种 于 试 管 支 分 别 标 记 为 11 并 从 中 各 吸 取 约 %'* 倍 递 减 稀 释 置 于 & 7 恒 温 箱 每 天 记 录 培 养 物 生 长 情 况 固 体 培 养 将 肺 组 织 剪 碎 取 小 碎 块 再 接 种 平 皿 各 个 划 线 分 离 视 生 长 情 况 继 而 选 取 单 个 典 型 菌 落 划 线 接 种 于 新 的 平 皿 最 终 得 到 纯 化 的 菌 落 %!% 培 养 鉴 定 当 11 试 管 液 体 变 成 橘 黄 色 时 再 倍 递 减 稀 释 & 7 培 养 两 次 至 培 养 物 变 成 黄 色 用 %'* 滤 膜 过 滤 培 养 物 分 离 纯 化 后 提 取 /! 做 检 测 同 时 将 变 黄 的 培 养 物 接 种 于 固 体 培 养 基 继 续 培 养 挑 取 单 个 典 型 菌 落 纯 化 并 进 行 革 兰 氏 染 色 镜 检 %" 病 原 检 测 %"% 样 本 检 测 样 本 的 提 取 步 骤 参 照 细 菌 基 因 组 /! 提 取 试 剂 盒!! 说 明 书 反 应 体 系 模 板 3*-.('( ( 加 灭 菌 668 0 至 ' 反 应 条 件 为 7 '*- 7 )' 7 )& 7 )' 个 循 环 & 7 *- %"% 病 原 菌 的 鉴 定 分 离 纯 化 后 提 取 支 原 体 /! 同 上 作! 基 因 反 应 体 系 为 模 板 3*-.(' 引 物 引 物 加 灭 菌 668 0 至 ' 反 应 条 件 为
7 '*- 7 ') 7 ')& 7 )' 个 循 环 & 7 *- %"%! 产 物 的 回 收 及 纯 化 产 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 以 /! 纯 化 回 收 试 剂 盒!! 离 心 柱 型 回 收 目 的 /! 片 段 回 收 步 骤 参 照 试 剂 盒 说 明 书 将 目 的 /! 片 段 送 公 司 测 序 %# 微 生 物 学 诊 断 涂 片 镜 检 及 革 兰 氏 染 色 取 载 玻 片 用 酒 精 擦 拭 消 毒 烘 干 滴 滴 无 菌 水 选 取 生 长 良 好 的 单 个 典 型 菌 落 放 置 于 水 上 均 匀 推 开 待 自 然 干 燥 或 固 定 后 按 革 兰 氏 染 色 的 具 体 步 骤 开 始 染 色! "#$%!#% 结 果 与 分 析 % 血 清 学 鉴 定 结 果 不 同 地 区 羊 血 清 的 阳 性 率 有 差 异 表 表 明 羊 支 原 体 病 的 流 行 呈 区 域 性 景 泰 地 区 普 遍 存 在 该 病 应 尽 快 进 行 大 规 模 检 测 工 作 以 免 造 成 更 严 重 的 后 果 损 害 农 户 经 济 效 益 危 害 人 类 生 命 安 全 就 整 体 而 言 该 病 有 大 规 模 流 行 的 趋 势 各 地 区 应 加 强 对 该 病 的 预 防 与 控 制 % 病 原 分 离 鉴 定 与 检 测 结 果 经 分 离 初 步 鉴 定 得 到 株 支 原 体 图 初 步 鉴 定 11 均 出 现 与 阳 性 对 照 一 致 的 条 带 其 中 1 条 带 明 显 约 表 血 清 学 鉴 定 结 果 $%&'' 地 区 被 检 份 数 阳 性 分 数 阳 性 率 3-# ()633- ()#;#)--3 #)--3(3, 陇 西 某 种 羊 场 1336-)33#;#.- %' 永 昌 某 种 羊 场 1336-)33#;#( 皋 兰 某 种 羊 场 1336-)33#;(#$( 民 勤 某 种 羊 场 1336-)33#;-- 景 泰 地 区 1336-)33#;<-(- % 总 计 #($ '% 图 病 原 菌 分 离 鉴 定 与 绵 羊 肺 炎 支 原 体 特 异 性 $ 产 物 凝 胶 电 泳 %''(%' $'%'((')&')') 注 ' 分 别 为 (+3 组 织 样 品 1 组 织 样 品 组 织 样 品 1 组 织 样 品 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照!#3'(6(3(+3-))43)(*$31-))43)(*$3-))43)(*$31-) )43)(*$3#)--3##$(63(-3##$3)3-3$%
草 业 科 学 第 卷 期 通 过 /! 回 收 扩 增 后 获 得 一 个 的 目 的 片 段 与 病 原 分 离 电 泳 结 果 相 一 致 图 1 %! 微 生 物 学 鉴 定 结 果 经 过 多 次 固 体 培 养 基 接 种 分 离 纯 化 后 在 固 体 培 养 基 上 挑 取 单 个 典 型 菌 落 用 革 兰 氏 染 色 涂 片 镜 检 可 见 到 细 小 纤 细 的 呈 球 形 双 球 形 线 状 螺 旋 状 半 月 状 和 短 杆 状 等 形 态 的 革 兰 氏 阴 性 菌 体 图! 讨 论 图 支 原 体 革 兰 氏 染 色 %*&')%)% 支 原 体 是 一 类 缺 乏 细 胞 壁 的 原 核 微 生 物 其 基 本 形 态 为 小 球 形 年 (+( 等 首 次 从 苏 格 兰 绵 羊 病 肺 中 分 离 出 该 病 原 体 直 到 后 来 ( *-3($ 等 证 明 了 这 种 支 原 体 具 有 致 病 性 并 建 议 命 名 为 绵 羊 肺 炎 支 原 体 然 而 由 于 支 原 体 对 培 养 基 要 求 比 较 高 生 长 速 度 比 较 缓 慢 分 离 培 养 比 较 难 因 此 到 目 前 有 关 绵 羊 肺 炎 支 原 体 的 分 离 鉴 定 报 道 比 较 少 培 养 基 中 都 含 有 青 霉 素 以 及 醋 酸 铊 由 于 醋 酸 铊 和 青 霉 素 对 支 原 体 的 生 长 都 会 产 生 影 响 为 了 提 高 支 原 体 分 离 的 成 功 率 本 研 究 对 样 品 进 行 匀 浆 然 后 取 上 清 用 %'* 的 滤 器 过 滤 除 去 杂 菌 过 滤 完 后 再 接 种 到 培 养 基 中 进 行 培 养 当 对 支 原 体 进 行 初 次 分 离 培 养 的 时 候 最 好 对 接 种 样 品 进 行 稀 释 这 样 支 原 体 就 会 在 环 境 适 宜 的 条 件 下 更 好 地 生 长 本 研 究 通 过 微 生 物 的 分 离 培 养 革 兰 氏 染 色 等 过 程 成 功 地 分 离 得 到 了 绵 羊 肺 炎 支 原 体 该 微 生 物 呈 细 小 纤 细 的 球 形 双 球 形 线 状 螺 旋 状 半 月 状 和 短 杆 状 等 形 态 与 前 人 报 道 结 果 一 致 为 后 续 工 作 奠 定 了 基 础 支 原 体 的 鉴 定 方 法 通 常 采 用 微 生 物 学 鉴 定 和 分 子 鉴 定 由 于 支 原 体 种 类 繁 多 在 生 化 特 征 方 面 仅 存 在 微 小 差 异 而 且 在 血 清 学 反 应 上 存 在 严 重 的 交 叉 反 应 因 此 无 法 利 用 普 通 微 生 物 学 的 鉴 定 方 法 和 血 清 学 鉴 定 方 法 准 确 区 分 其 种 类 而 分 子 鉴 定 比 常 规 鉴 定 方 法 更 准 确 ( 等 根 据! 基 因 设 计 两 对 引 物 检 测 鸡 毒 支 原 体 证 明 技 术 在 临 床 检 测 方 面 具 有 明 显 的 优 势 是 一 种 可 靠 的 临 床 诊 断 方 法 =((-( 等 用 方 法 成 功 地 检 测 到 了 猪 肺 炎 支 原 体 通 过 优 化 条 件 提 高 了 的 灵 敏 度 和 特 异 性 在 前 人 研 究 的 基 础 上 本 研 究 通 过 的 方 法 对 绵 羊 支 原 体 进 行 了 验 证 成 功 扩 增 出 的 目 的 条 带 建 立 了 利 用 验 证 绵 羊 肺 炎 支 原 体 的 扩 增 体 系 该 检 测 方 法 对 分 离 株 鉴 定 具 有 特 异 性 高 准 确 快 速 等 优 势 但 直 接 用 于 检 测 肺 脏 病 料 时 检 测 工 作 量 大 所 需 试 剂 代 价 高 并 不 适 合 用 于 临 床 样 本 的 检 测 因 此 在 实 践 中 必 须 进 一 步 优 化 该 体 系 寻 找 出 一 种 灵 敏 度 更 高 可 在 内 同 时 完 成 对 两 种 支 原 体 培 养 物 的 鉴 定 对 临 床 病 料 进 行 检 测 不 需 要 进 行 支 原 体 分 离 培 养 的 检 测 方 法 方 可 大 大 提 高 羊 支 原 体 肺 炎 的 诊 断 效 率 这 是 我 国 羊 支 原 体 肺 炎 病 快 速 诊 断 技 术 的 重 点 发 展 方 向 之 一 参 考 文 献 ()3$%6*#6!#(6'(6333 (#;36-)#3#;3;-)*#$()*( <%8-)#-363)-33)>6-($3) '% 孙 继 国 袁 万 哲 景 翠 等 % 绵 羊 支 原 体 肺 炎 的 研 究 概 况 <% 中 国 兽 医 杂 志 &%?#$60(-5(-#;#-*($83($%#(-#4)(-3 $34#34*#-(% (4($#; /-(#)- 3)) (6 "(-3);# 33)-($ -*($)(**($)1-6)(6 133)%' 36%(-)0;-3 3(-#($ /3) -5##-3)% 储 岳 峰 赵 萍 高 鹏 程 等 % 绵 羊 和 山 羊 霉 形 体 病 研 究 概 述 <% 畜 牧 兽 医 科 技 信 息 % ' 刘 少 华 徐 天 菊 吕 增 顺 等 % 云 南 省 曲 靖 市 羊 肺 炎 支 原 体 病 的 调 查 <% 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ' '% 王 爱 华 柴 静 张 煜 % 山 羊 支 原 体 体 外 药 敏 试 验 <% 河 北 畜 牧 兽 医 % & 林 密 孙 继 国 柴 静 % 羊 支 原 体 性 肺 炎 两 标 准 株 对 抗 菌 药 物 敏 感 性 的 研 究 <% 中 国 兽 医 科 技 '% 付 琦 赵 宝 华 朱 子 杰 等 % 绵 羊 肺 炎 支 原 体 的 分 离 与 鉴 定 <% 华 北 农 学 报 增 刊 岳 文 斌 孙 效 彪 % 羊 场 疾 病 控 制 与 净 化 % 北 京 中 国
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