中 国 食 品 学 报.29,9(4).-76-81 蛋 白 酶 原 均 购 于 sigma 公 司 ;Sephadex G-5 购 于 Pharmacia 公 司 ; 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 1.2 主 要 仪 器 HD-3 型 电 脑 核 酸 蛋 白 检 测 仪 ( 上 海 嘉 鹏

中 国 食 品 学 报.29,9(4).-76-81 河 蚌 酶 解 降 血 压 肽 的 初 步 分 离 及 性 质 研 究 戴 志 远 1 朱 凤 仙 张 燕 平 袁 晓 晴 ( 浙 江 工 商 大 学 水 产 品 加 工 研 究 所 杭 州 3135) 摘 要 以 酶 解 河 蚌 多 肽 为 原 料, 对 其 中 的 降 血 压 肽 进 行 了 初 步 分 离 及 性 质 研 究 采 用 凝 胶 Sephadex G-5 对 河 蚌 酶 解 多 肽 进 行 分 离 纯 化 得 到 两 个 组 分 MPP1 和 MPP2, 分 子 质 量 分 别 集 中 在 14125Da 和 1271Da 左 右 用 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 进 行 血 管 紧 张 素 转 化 酶 (ACE) 抑 制 率 测 定, 其 半 抑 制 浓 度 (IC 5 ) 分 别 为.88mg/mL 和.32mg/mL 结 果 表 明, 组 分 MPP2 具 有 明 显 的 降 血 压 作 用 氨 基 酸 组 成 分 析 结 果 表 明,MPP2 中 谷 氨 酸 (Glu) 含 量 最 高, 达 14.4g/1g, 疏 水 性 氨 基 酸 含 量 高 达 29.76g/1g, 与 其 较 高 的 降 血 压 活 性 有 密 切 关 系 关 键 词 河 蚌 多 肽 分 离 降 血 压 氨 基 酸 组 成 降 血 压 肽 (anti-hypertensive peptides) 是 一 类 能 够 降 低 高 血 压 病 人 血 压 的 多 肽 总 称 它 是 血 管 紧 张 素 转 化 酶 (angiotensin converting enzyme,ace) 的 抑 制 剂, 能 够 通 过 抑 制 人 体 肾 素 - 血 管 紧 张 素 系 统 中 血 管 紧 张 素 II 的 生 成 而 达 到 降 低 血 压 的 目 的 由 于 降 血 压 肽 具 有 低 毒 副 作 用 降 血 压 效 果 明 显 来 源 广 泛 等 特 点, 目 前 已 经 成 为 国 内 外 研 究 的 热 点 [1~3] 鱼 贝 类 蛋 白 是 人 类 膳 食 蛋 白 质 的 重 要 来 源, 含 有 人 体 生 长 发 育 所 必 需 的 营 养 成 分 研 究 表 明, 很 多 水 产 动 物 来 源 的 活 性 肽 类 具 有 降 血 压 功 [4] 能 曹 文 红 等 利 用 胃 蛋 白 酶 酶 解 毛 虾, 制 得 具 有 抑 制 血 管 紧 张 素 转 化 酶 (ACE) 的 活 性 肽 许 庆 [5] [6] 陵 等 用 G-15 分 离 了 鲢 鱼 头 酶 解 物, 并 测 定 了 酶 解 物 中 ACE 抑 制 肽 的 分 子 质 量 分 布 于 娅 等 以 无 壳 牡 蛎 为 原 料, 测 定 了 一 定 分 子 质 量 范 围 内 的 短 肽 具 有 较 好 的 ACE 抑 制 率, 其 中 质 量 浓 度 为.4mg/mL 的 牡 蛎 功 能 短 肽 ACE 抑 制 率 为 51.4% Tsai J S [7] 等 从 文 蛤 肉 中 酶 解 制 备 降 血 压 肽, 体 外 测 定 ACE 抑 制 率, 其 半 抑 制 浓 度 为.36mg/mL 河 蚌 (mussel), 是 我 国 重 要 的 贝 类 之 一 蚌 肉 蛋 白 质 含 量 丰 富, 具 有 清 热 消 炎 功 能, 可 用 来 治 疗 眼 疾 热 症 烫 伤 等, 因 此 蚌 肉 本 身 就 是 一 种 具 有 很 高 营 养 价 值 和 一 定 保 健 作 用 的 优 质 食 物 资 源, 具 有 很 大 的 开 发 前 景 然 而, 由 于 肉 质 粗 韧 土 腥 味 重 难 以 食 用, 蚌 肉 往 往 作 为 废 弃 物 丢 弃 或 烘 干 用 作 饲 料, 经 济 价 值 低 因 此, 充 分 利 用 蚌 肉 资 源, 以 其 为 原 料 开 发 功 能 性 保 健 食 品, 可 解 决 相 关 的 环 境 问 题, 提 高 产 品 附 加 值 本 研 究 以 河 蚌 肉 酶 解 得 到 的 河 蚌 多 肽 (mussel polypeptide,mpp) 为 原 料, 初 步 分 离 了 降 血 压 肽, 并 对 分 离 组 分 的 分 子 质 量 分 布 和 氨 基 酸 组 成 等 性 质 进 行 相 关 测 定 1. 实 验 材 料 和 方 法 1.1 原 料 和 试 剂 河 蚌 酶 解 多 肽 由 浙 江 工 商 大 学 水 产 品 加 工 研 究 所 提 供 ; 血 管 紧 张 素 转 化 酶 (ACE) 马 尿 酞 组 胺 酞 亮 氨 酸 (Hip-His-Leu,HHL) 马 尿 酸 (HA) 谷 胱 甘 肽 牛 胰 岛 素 细 胞 色 素 C 和 胰 凝 乳 1 基 金 项 目 : 浙 江 省 科 技 重 大 攻 关 项 目 (No. 26C1267) 浙 江 省 科 技 重 点 项 目 (No.26C224) 作 者 简 介 : 戴 志 远, 男,1958 年 出 生, 教 授 级 高 工

中 国 食 品 学 报.29,9(4).-76-81 蛋 白 酶 原 均 购 于 sigma 公 司 ;Sephadex G-5 购 于 Pharmacia 公 司 ; 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 1.2 主 要 仪 器 HD-3 型 电 脑 核 酸 蛋 白 检 测 仪 ( 上 海 嘉 鹏 有 限 公 司 ),BSZ-16F 电 脑 自 动 部 分 收 集 器 ( 上 海 精 科 实 业 有 限 公 司 ),waters2695 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 美 国 waters 公 司 ),L-88 氨 基 酸 分 析 仪 ( 日 本 日 立 公 司 ) 1.3 方 法 1.3.1 凝 胶 过 滤 层 析 Sephadex G-25 和 Sephadex G-5 葡 聚 糖 凝 胶 分 别 用 适 量 蒸 馏 水 浸 泡 过 夜, 充 分 溶 胀, 去 除 细 颗 粒 装 柱, 用 去 离 子 水 平 衡 柱 子 将 2mg 河 蚌 酶 解 多 肽 溶 于 1mL 去 离 子 水,35rpm 离 心, 除 去 沉 淀, 过.45 m 滤 膜 然 后 上 Sephadex G-25 和 Sephadex G-5 柱 (1. cm 1 cm), 分 别 以 去 离 子 水.5mol/L 醋 酸 溶 液 (HAc) 和.5mol/L Tris-HCl(pH7.2) 缓 冲 液 进 行 洗 脱, 流 速 为.5mL/min, 每 管 6mL, 检 测 波 长 为 28nm [8~9] 1.3.2 降 血 压 活 性 测 定 血 管 紧 张 素 转 化 酶 反 应 取 样 品 15 L 和 ACE( 溶 于 ph=8.3,5mmol/l 的 硼 酸 缓 冲 液, 酶 活 6 mu/ml)45 L 于 37 恒 温 水 浴 中 保 温 5min, 加 入 75 L l7.6mmol/l 的 底 物 (HHL 溶 于 5mmol/L 的 硼 酸 缓 冲 液, 含 6.8mmol/L 的 氯 化 钠 )37 下 反 应 3min, 加 入 15 L 1% 的 TFA( 三 氟 乙 酸 ) 终 止 反 应, 至 室 温 取 1 L 反 应 产 物 进 样 色 谱 条 件 检 测 器 :waters 2695; 色 谱 柱 :SunFire BDS C18 4.6 25mm; 洗 脱 液 :3% 甲 醇 ( 含.1% 的 TFA 和.5% 乙 酸 ); 流 速 :.8mL/min; 检 测 波 长 :22nm; 上 样 量 :1 L 通 过 HPLC 洗 脱 图 谱 定 量 马 尿 酸 (HA) 生 成, 以 生 成 HA 的 量 来 测 定 样 品 的 ACE 抑 制 活 性 抑 制 率 I (%)=(B-A)/(B-C) 1% 式 中,B 不 加 ACE 抑 制 物 ( 多 肽 ) 的 吸 光 值 ;A 为 加 ACE( 酶 ) 及 ACE 抑 制 物 的 吸 光 值 ;C 不 加 ACE 的 吸 光 值 IC 5 值 : 对 ACE 抑 制 率 达 到 5% 时 的 ACE 抑 制 剂 浓 度,mg/mL 1.3.3 高 效 液 相 色 谱 法 测 分 子 质 量 取 一 定 量 河 蚌 酶 解 多 肽 溶 解 在 流 动 相 中, 用.45 m 膜 过 滤 后 上 柱, 记 录 出 峰 时 间, 根 据 标 准 曲 线 求 出 河 蚌 多 肽 的 分 子 质 量 色 谱 条 件 :Waters6 高 效 液 相 色 谱 仪 ; 色 谱 柱 :ultrahydrogel 12,ultrahydrogel 25; 流 动 相 :.1M PBS( 含.1M Na 2 SO 4 ); 检 测 波 长 :22nm, 流 速 :.5mL/min; 柱 温 :3, 检 测 波 长 :22nm 分 子 质 量 校 正 曲 线 所 用 标 准 品 : 谷 胱 甘 肽 (MW 37Da) 牛 胰 岛 素 (MW 5734Da) 细 胞 色 素 C(MW 125Da) 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 (MW 245Da) 1.3.4 氨 基 酸 组 成 用 浓 度 为 6mol/L HCl 水 解 河 蚌 酶 解 多 肽 后, 在 氨 基 酸 自 动 分 析 仪 上 测 定 氨 基 酸 含 量 2. 结 果 与 分 析 2.1 凝 胶 层 析 分 离 河 蚌 酶 解 多 肽 的 结 果 2.1.1 不 同 凝 胶 的 分 离 效 果 用 Sephadex G-25 和 Sephadex G-5 凝 胶 层 析 对 河 蚌 酶 解 多 肽 进 行 分 离, 结 果 如 图 1 图 2 所 示 样 品 在 Sephadex G-25 的 分 离 组 分 主 要 集 中 在 第 一 个 峰, 后 面 峰 所 占 的 比 例 不 大 ; 而 采 用 Sephadex G-5 填 料 进 行 分 离, 得 到 2 个 明 显 的 蛋 白 峰, 且 两 者 比 例 相 当 综 合 考 虑, 用 Sephadex G-5 填 料 分 离 的 效 果 优 于 Sephadex G-25 2.1.2 不 同 洗 脱 液 的 分 离 效 果 以 Sephadex G-5 凝 胶 为 填 料, 比 较 了 H 2 O.5mol/L HAc 溶 液 和.5mol/L Tris-HCl 溶 液 三 种 洗 脱 液 对 酶 解 河 蚌 多 肽 的 分 离 效 果, 结 果 如 图 2 图 3 图 4 所 示 由 图 可 见, 用 H 2 O 洗 脱 得 到 2 个 组 分 ;HAc 溶 液 的 洗 脱 峰 峰 形 平 缓, 各 组 分 分 离 效 果 不 太 明 显 ;Tris-HCl 洗 脱 峰 分 离 效 果 较 明 显, 但 与 用 水 洗 脱 时 比 较,2 个 组 分 得 率 悬 殊 此 外, 用 去 离 子 水 洗 脱 可 避 免 盐 分 的 带 入, 从 而 省 去 后 续 脱 盐 过 程 综 合 各 种 因 素, 选 定 Sephadex G-5 为 固 定 相 采 用 去 离 子 水 为 洗 脱 液 实 现 对 河 蚌 酶 解

A28 A28 A28 中 国 食 品 学 报.29,9(4).-76-81 多 肽 的 初 步 分 离, 收 集 蛋 白 峰 MPP1 和 MPP2, 冷 冻 干 燥 后 进 行 活 性 及 其 它 测 定 由 柱 层 析 分 离 得 到 MPP1 占 混 合 肽 的 比 率 约 为 3%,MPP2 所 占 比 率 约 61%.16.14.12.1.8.6.4.2 1 2 管 数 图 1 河 蚌 多 肽 Sephadex G-25 水 洗 脱 层 析 图 谱 Fig1. Chromatography on Sephadex G-25 of mussel polypeptide(mpp)eluted by H 2 O.1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 MPP1 MPP2 1 2 管 数 图 2 河 蚌 多 肽 Sephadex G-5 水 洗 脱 层 析 图 谱 Fig2. Chromatography on Sephadex G-5 of mussel polypeptide(mpp)eluted by H 2 O.1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 管 数

lg Mw A28 图 3 河 蚌 多 肽 Sephadex G-5 HAc 洗 脱 层 析 图 谱 中 国 食 品 学 报.29,9(4).-76-81 Fig3. Chromatography on Sephadex G-5 of mussel polypeptide (MPP) eluted by HAc.1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 管 数 图 4. 河 蚌 多 肽 Sephadex G-5 Tris-HCl 洗 脱 层 析 图 谱 Fig4. Chromatography on Sephadex G-5of mussel polypeptide(mpp)eluted by Tris-HCl 2.2 河 蚌 酶 解 多 肽 分 子 质 量 测 定 结 果 用 谷 胱 甘 肽 牛 胰 岛 素 细 胞 色 素 C 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 作 为 标 准 品, 经 凝 胶 排 阻 高 效 液 相 色 谱 测 得 其 出 峰 时 间, 其 分 子 质 量 对 数 与 保 留 时 间 的 标 准 曲 线 如 图 5 所 示 根 据 标 准 曲 线, 求 得 MPP1 的 分 子 质 量 在 14125Da 左 右,MPP2 的 分 子 质 量 集 中 在 1271Da 左 右 6 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 24 26 28 3 32 34 36 时 间 /min 图 5. 蛋 白 质 和 肽 相 对 分 子 质 量 标 准 曲 线 Fig5. Working curve for relative molecular mass of standard protein and peptides 降 血 压 肽 的 分 子 质 量 范 围 是 一 个 相 当 复 杂 的 问 题, 从 已 有 的 研 究 成 果 来 看, 由 酶 解 得 到 的 降 血 压 肽 从 2 3 肽 到 15 16 肽 均 有 分 布 [1], 且 活 性 也 差 别 较 大 但 目 前 比 较 公 认 的 是 酶 解 降 血 压 肽 的 分 子 质 量 相 对 于 蛋 白 质 来 说 较 小, 一 般 在 几 个 KDa 以 内 2.3 降 血 压 活 性 测 定 结 果 对 2 个 河 蚌 酶 解 多 肽 组 分 MPP1 和 MPP2 进 行 ACE 抑 制 活 性 测 定 图 6 是 马 尿 酸 出 峰 图 谱, 根 据 河 蚌 酶 解 多 肽 对 生 成 的 马 尿 酸 的 量 计 算 ACE 抑 制 率, 如 图 7 所 示 经 计 算, 组 分 MPP1 的 IC 5 为.88mg/mL, 组 分 MPP2 的 IC 5 为.32mg/mL 结 果 表 明, 组 分 MPP2 的 ACE 抑 制 活 性 高 于 组 分 MPP1 本 实 验 结 果 表 明 降 血 压 肽 的 分 子 质 量 较 小, 这 与 相 关 研 究 结 果 吻 合 文 献 报 道, 降 血 压 肽 的

抑 制 率 (%) AU 中 国 食 品 学 报.29,9(4).-76-81 作 用 与 氨 基 酸 组 成 有 关, 因 此 进 行 氨 基 酸 组 成 分 析.15.1 HA.5. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 1. 11. 12. 13. 14. 15. 分 钟 图 6 马 尿 酸 的 高 效 液 相 保 留 时 间 图 谱 Fig6. The retain time of HA by HPLC 9.% 8.% 7.% 6.% 5.% 4.% MPP2 MPP1 3.% 2.% 1.%.4.8 1.2 多 肽 浓 度 /mg.ml -1 2.4 氨 基 酸 组 成 分 析 图 7 MPP1 和 MPP2 的 ACE 抑 制 率 Fig7. The ACE inhibitory of MPP1 and MPP2 河 蚌 酶 解 多 肽 的 氨 基 酸 组 成 分 析 结 果 见 图 8 结 果 表 明,MPP2 中 谷 氨 酸 (Glu) 含 量 最 高, 达 14.4g/1g 谷 氨 酸 被 认 为 能 促 进 脑 细 胞 进 行 呼 吸, 利 于 脑 组 织 中 氨 的 排 除, 调 节 人 体 的 新 陈 代 谢, 而 这 将 会 对 血 压 造 成 一 定 的 影 响 [11] 降 血 压 肽 样 品 的 氨 基 酸 总 量 为 82.19g/1g, 其 中 酸 性 氨 基 酸 (Asp Glu) 总 量 为 22.43g/1g; [12] 碱 性 氨 基 酸 (His Lys Arg) 总 量 为 16.7g/1g 此 外,Kohmura 等 研 究 表 明 降 血 压 肽 分 子 中 的 疏 水 性 氨 基 酸 较 重 要, 其 侧 链 可 与 ACE 受 体 紧 密 结 合, 从 而 维 持 其 高 活 性 实 验 分 析 也 表 明, 样 品 中 的 疏 水 性 氨 基 酸 含 量 很 高, 达 29.76g/1g, 与 其 较 高 的 降 血 压 活 性 有 密 切 关 系

氨 基 酸 含 量 /% 中 国 食 品 学 报.29,9(4).-76-81 18 16 14 12 1 8 6 4 2 Asp Thr Ser Glu Pro Ala Cys Val 图 8 MPP2 组 分 的 氨 基 酸 组 成 Fig8. The component of amino acids of MPP2 fraction Met 氨 基 酸 Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Pro 3. 结 论 酶 解 得 到 的 的 降 血 压 肽, 由 于 其 分 子 质 量 较 小 组 成 成 分 复 杂 等 特 点, 其 分 离 纯 化 方 式 不 同 于 蛋 白 质 凝 胶 层 析 是 按 分 子 质 量 差 异 实 现 对 多 肽 类 物 质 的 分 离 比 较 了 不 同 型 号 凝 胶 柱 不 同 洗 脱 条 件 对 河 蚌 酶 解 多 肽 分 离 效 果 的 影 响, 结 果 表 明 采 用 Sephadex G-5 柱 层 析 去 离 子 水 进 行 洗 脱 效 果 最 佳, 降 血 压 肽 MPP2 的 得 率 为 61% 左 右 对 Sephadex G-5 柱 层 析 分 离 所 得 两 组 分 进 行 活 性 测 定, 结 果 表 明 有 较 高 抑 制 ACE 活 性 的 多 肽 大 部 分 集 中 在 分 子 质 量 较 小 的 组 分, 主 要 在 1271Da 左 右 氨 基 酸 分 析 结 果 表 明,MPP2 中 必 需 氨 基 酸 含 量 较 高, 其 中 谷 氨 酸 含 量 最 高, 达 14.4g/1g 疏 水 性 氨 基 酸 含 量 高 达 29.76g/1g, 与 其 较 高 的 降 血 压 活 性 具 有 密 切 关 系 参 考 文 献 1. Fujita H K, Yokoyama M.Classification and antihypertensive activity of angiotensin-i-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins [J].J Food Sci, 2, 65 (4): 564~569. 2. Fitzgerald R J, Meisel H.Milk protein-derived peptide inhibitors of angiotensin-i-converting enzyme [J].British J Nutr, 2, 84 (1):33~37. 3. Wu J P, Ding X L.Hypertensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats [J].J Agric Food Chem, 21, 49 (1): 51~56. 4. 曹 文 红, 秦 小 明, 章 超 桦 等. 中 国 毛 虾 酶 解 产 物 的 分 子 量 分 布 及 ACE 抑 制 活 性 [J]. 食 品 科 技,27,32(5): 145~148. 5. 许 庆 陵, 曾 庆 祝, 崔 铁 军 等. 鲢 头 酶 解 物 对 ACE 的 抑 制 活 性 [J]. 大 连 水 产 学 院 学 报,24,19(2):87~91. 6. 于 娅, 杨 瑞 金, 王 璋. 牡 蛎 短 肽 的 制 备 及 ACE 抑 制 活 性 [J]. 无 锡 轻 工 大 学 学 报,24,23(2):49~53. 7. Tsai J S,Chen J L,Pan B S.ACE-inhibitory peptides identified from the muscle protein hydrolysate of hard clam (Meretrix lusoria) [J].Process Biochemistry28,7(43):743~747. 8. Wu J P, Aluko R E, Muir A D.Improved method for direct high-performance liquid chromatography assay of angiotensin-converting enzyme-catalyzed reactions [J].Journal of chromatography A, 22,95: 125~13. 9. Je J Y, Park P J, Byun H G, Jung WK, Kim S.Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory peptide derived from the sauce of fermented blue mussel [J].Mytilusedulis. Bioresource Technology, 25,96: 1624~1629. 1. Yanewa J.Characterization of inhibition and stability of soyprotein derived angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides [J].Food Research Internation, 22, 35(4): 367~372.

中 国 食 品 学 报.29,9(4).-76-81 11. 曾 可 斌, 胡 长 林, 陈 阳 美. 谷 氨 酸 对 原 代 培 养 海 马 神 经 元 的 兴 奋 特 性 [J]. 中 国 应 用 生 理 学 杂 志,25,21(4): 381~383. Separation and Character of Anti-hypertensive Peptides Hydrolyzed from Mussel Dai Zhiyuan Zhu Fengxian Zhang Yanping Yuan Xiaoqing (Institute of Aquatic Products Processing, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 3135) Abstract: The preliminary separation and characterization of anti-hypertensive peptide(s), enzymatically hydrolyzed from mussel proteins, were investigated. The fractions of MPP1 and MPP2 were obtained by gel chromatography on column of Sephadex G-5, with the molecular weight distribution of about 14125Da and 1271Da respectively. The IC 5 of angiotensin converting enzyme was respectively.88mg/ml and.32mg/ml by the means of high performance liquid chromatography. The results showed MPP2 had stronger anti-hypertension effect than that of MPP1. Furthermore, the amino acid test manifests that the content of Glu in MPP2 was highest (14.4g/1g) and the total content of hydrophobic amino acids was 29.76g/1g. This was closely related with the high anti-hypertension effect. Key words Mussel polypeptide Separation Anti-hypertension Amino acid composition

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