(19) 中 华 人 民 共 和 国 国 家 知 识 产 权 局 (12) 发 明 专 利 *CN102266389B* (21) 申 请 号 201110253106.9 (22) 申 请 日 2011.08.30 (73) 专 利 权 人 中 国 科 学 院 长 春 应 用 化 学 研 究 所 地 址 130022 吉 林 省 长 春 市 朝 阳 区 人 民 大 街 5625 号 (72) 发 明 人 徐 经 伟 杨 艳 芹 杨 卫 房 学 迅 田 莉 肖 延 蒙 王 晨 旭 (10) 授 权 公 告 号 CN 102266389 B (45) 授 权 公 告 日 2013.04.17 期 ),E057-31. 栗 世 铀. 药 物 筛 选 研 究. 中 国 优 秀 博 硕 士 学 位 论 文 全 文 数 据 库 ( 博 士 ) 医 药 卫 生 科 技 辑. 中 国 学 术 期 刊 ( 光 盘 版 ) 电 子 杂 志 社,2005,( 第 04 期 ),E057-31. 审 查 员 高 原 (74) 专 利 代 理 机 构 长 春 菁 华 专 利 商 标 代 理 事 务 所 22210 代 理 人 南 小 平 (51)Int.Cl. A61K 36/58 (2006.01) A61P 31/16 (2006.01) A61K 129/00 (2006.01) (56) 对 比 文 件 栗 世 铀. 药 物 筛 选 研 究. 中 国 优 秀 博 硕 士 学 位 论 文 全 文 数 据 库 ( 博 士 ) 医 药 卫 生 科 技 辑. 中 国 学 术 期 刊 ( 光 盘 版 ) 电 子 杂 志 社,2005,( 第 04 权 利 权 要 利 求 要 书 求 书 1 页 1 页 说 说 明 明 书 书 4 4 页 附 图 1 页 CN 102266389 B (54) 发 明 名 称 苦 楝 皮 在 制 备 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 药 物 中 的 应 用 (57) 摘 要 苦 楝 皮 在 制 备 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 药 物 中 的 应 用, 属 于 中 药 应 用 领 域 本 发 明 是 通 过 以 下 技 术 方 案 实 施 的 : 首 先 制 备 苦 楝 皮 溶 液, 取 神 经 氨 酸 酶 溶 液 和 苦 楝 皮 溶 液 在 37 培 养 箱 中 孵 育 30 分 钟, 然 后 加 入 MUNANA 的 缓 冲 溶 液, 用 Bio-Red FLx-800 荧 光 酶 标 仪 进 行 检 测 本 发 明 为 苦 楝 皮 发 掘 了 新 的 医 疗 用 途, 开 拓 了 一 个 新 的 应 用 领 域 ; 本 发 明 以 苦 楝 皮 生 药 材 苦 楝 皮 提 取 物 抑 制 甲 型 H1N1 病 毒, 效 果 显 著, 为 今 后 开 发 出 一 种 新 的 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 的 药 物 奠 定 基 础
权 利 要 求 书 1/1 页 1. 苦 楝 皮 在 制 备 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 的 药 物 中 的 应 用, 其 特 征 在 于, 所 述 的 苦 楝 皮 提 取 物 的 制 备 方 法 为 将 苦 楝 皮 用 蒸 馏 水 浸 泡 过 夜 后, 过 滤, 得 第 一 次 浸 泡 过 滤 后 所 得 液 体 和 过 滤 后 的 苦 楝 皮, 将 过 滤 后 的 苦 楝 皮 再 加 入 蒸 馏 水 浸 泡 过 夜 后, 以 文 火 加 热 煮 中 药 3-5 小 时, 过 滤, 得 熬 煮 过 滤 后 的 液 体, 将 第 一 次 浸 泡 过 滤 后 所 得 液 体 和 熬 煮 过 滤 后 所 得 液 体 混 合, 得 到 混 合 溶 液, 冻 干 混 合 溶 液 后 得 到 苦 楝 皮 粉 末 2
1/4 页 苦 楝 皮 在 制 备 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 药 物 中 的 应 用 技 术 领 域 [0001] 本 发 明 属 于 中 药 应 用 领 域, 具 体 涉 及 苦 楝 皮 在 制 备 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 药 物 中 的 应 用 背 景 技 术 [0002] 自 从 2009 年 3 月 18 日 墨 西 哥 发 现 首 例 甲 型 H1N1 流 感 病 例,2009 年 4 月 27 日 美 国 在 一 名 加 利 福 尼 亚 州 患 者 身 上 获 得 并 分 离 得 到 的 病 毒 基 因 序 列 研 究 表 明 : 这 种 病 毒 基 因 组 由 禽 流 感 猪 流 感 和 人 流 感 病 毒 基 因 混 合 而 成, 是 一 种 新 型 的 甲 型 H1N1 流 感 病 毒, 它 所 引 起 的 流 感 具 有 高 度 传 染 传 播 迅 速 易 流 行 的 特 点 [0003] 甲 型 流 感 病 毒 传 染 性 高 传 播 迅 速 易 发 生 流 行 变 异 速 度 快, 而 疫 苗 研 究 和 生 产 速 度 较 慢, 使 得 化 学 药 物 和 流 感 病 毒 疫 苗 难 以 发 挥 其 最 佳 治 疗 和 预 防 效 果 中 草 药 具 有 抑 制 流 感 病 毒 复 制 阻 止 病 毒 致 细 胞 病 变 调 节 免 疫 镇 痛 抗 炎 等 综 合 功 效, 在 防 治 流 感 病 毒 方 面 具 有 独 特 的 优 势 [0004] 苦 楝 皮, 来 源 于 楝 科 植 物 川 楝 的 干 燥 树 皮 及 根 皮, 具 有 如 下 作 用 : [0005] 1 驱 虫 作 用 : 川 楝 苦 楝 的 根 皮 或 干 皮 中 所 含 的 苦 楝 素 有 驱 蛔 作 其 酒 精 提 取 物 在 体 外 对 猪 蛔, 特 别 对 其 头 部 有 麻 痹 作 用 25%~ 50% 苦 楝 皮 药 液 在 体 外 对 小 鼠 蛲 虫 也 有 麻 痹 作 用 苦 楝 皮 提 取 液 尚 有 一 定 的 抗 血 吸 虫 作 用 [0006] 2 抗 真 菌 作 用 : 苦 楝 子 乙 醇 浸 液 (1 4) 在 试 管 内 对 黄 色 毛 癣 菌 同 心 性 毛 癣 菌 许 兰 毛 癣 菌 奥 杜 盎 小 芽 胞 癣 菌 铁 锈 色 小 芽 胞 癣 菌 羊 毛 状 小 芽 胞 癣 菌 红 色 皮 肤 癣 菌 星 形 奴 卡 菌 等 常 见 的 致 病 性 真 菌, 有 较 明 显 的 抑 制 作 用 [0007] 3 对 肌 肉 收 缩 的 作 用 : 实 验 表 明, 川 楝 素 对 骨 骼 肌 由 直 接 刺 激 引 起 的 收 缩 反 应 有 增 强 作 用 [0008] 4 研 究 表 明, 川 楝 素 有 抗 肉 毒 杆 菌 毒 素 的 作 用. 川 楝 素 能 显 著 延 长 肉 毒 中 毒 标 本 对 间 接 刺 激 收 缩 反 应 的 麻 痹 时 间, 提 示 其 能 在 神 经 肌 肉 接 头 处 对 抗 肉 毒 的 阻 遏 作 用 [0009] 迄 今 为 止, 尚 未 有 关 于 苦 楝 皮 在 制 备 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 药 物 中 的 应 用 的 报 道 发 明 内 容 [0010] 本 发 明 的 目 的 在 于 提 供 苦 楝 皮 在 制 备 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 药 物 中 的 应 用 本 发 明 是 通 过 以 下 技 术 方 案 实 施 的 : 苦 楝 皮 在 制 备 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 药 物 中 的 应 用 所 述 苦 楝 皮 为 生 药 材 或 苦 楝 皮 提 取 物 中 的 一 种 所 述 的 苦 楝 皮 提 取 物 的 制 备 方 法 为 : 将 苦 楝 皮 用 蒸 馏 水 浸 泡 过 夜 后, 过 滤, 得 第 一 次 浸 泡 过 滤 后 所 得 液 体 和 过 滤 后 的 苦 楝 皮, 将 过 滤 后 的 苦 楝 皮 再 加 入 蒸 馏 水 浸 泡 过 夜 后, 以 文 火 加 热 煮 中 药 3-5 小 时, 过 滤, 得 熬 煮 过 滤 后 的 液 体, 将 第 一 次 浸 泡 过 滤 后 所 得 液 体 和 熬 煮 过 滤 后 所 得 液 体 混 合, 得 到 混 合 溶 液, 冻 干 混 合 溶 液 后 得 到 苦 楝 皮 粉 末, 所 述 浸 泡 苦 楝 皮 的 溶 液 为 甲 醇 或 乙 醇 中 的 一 种 [0011] 将 所 述 冻 干 后 的 苦 楝 皮 粉 末 溶 解 用 蒸 馏 水 溶 解 至 浓 度 为 10mg/mL, 得 苦 楝 皮 溶 3
2/4 页 液 将 神 经 氨 酸 酶 溶 解 在 MES 缓 冲 液 (PH 6.5) 和 CaCl 2 中, 得 神 经 氨 酸 酶 溶 液, 取 神 经 氨 酸 酶 溶 液 和 苦 楝 皮 溶 液 在 37 培 养 箱 中 孵 育 30 分 钟, 然 后 加 入 MUNANA 的 缓 冲 溶 液, 立 即 用 Bio-Red FLx-800 荧 光 酶 标 仪 进 行 检 测, 激 发 波 长 360nm, 发 射 波 长 450nm, 测 定 时 间 为 8min [0012] 对 0.001-0.1U 的 神 经 氨 酸 酶, 对 其 具 有 抑 制 作 用 的 苦 楝 皮 溶 液 浓 度 为 31.25-250ug/mL [0013] 本 发 明 的 原 理 : 本 发 明 的 效 果 主 要 是 通 过 对 神 经 氨 酸 酶 (neuraminidase,na) 的 抑 制 能 力 来 验 证 的 NA 是 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 最 重 要 的 蛋 白 之 一, 在 病 毒 从 感 染 细 胞 中 的 释 放 的 过 程 中, 特 别 是 病 毒 复 制 周 期 后 期,NA 起 主 要 作 用 由 于 它 具 有 酶 功 能, 能 水 解 细 胞 膜 上 各 种 糖 蛋 白 受 体 末 端 的 唾 液 酸, 因 此,NA 能 够 清 除 病 毒 颗 粒 表 面 糖 蛋 白 末 端 的 唾 液 酸, 防 止 病 毒 的 自 我 聚 积, 促 使 子 代 病 毒 释 放 另 外,NA 是 一 个 重 要 的 抗 原, 并 且 是 病 毒 穿 透 呼 吸 道 上 皮 黏 液 所 必 需 的 NA 一 旦 发 生 突 变, 可 导 致 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 对 神 经 氨 酸 酶 抑 制 剂 产 生 抗 性 作 用 [0014] 本 发 明 的 有 益 效 果 : [0015] 1 本 发 明 为 苦 楝 皮 发 掘 了 新 的 医 疗 用 途, 开 拓 了 一 个 新 的 应 用 领 域 [0016] 2 本 发 明 以 苦 楝 皮 生 药 材 苦 楝 皮 提 取 物 抑 制 甲 型 H1N1 病 毒, 效 果 显 著, 苦 楝 皮 对 神 经 氨 酸 酶 的 半 数 抑 制 浓 度 (IC 50 ) 为 IC 50 (μg/ml) = 184.3±13.1 和 IC 50 (μg/ml) = 0.76±0.27, 本 发 明 提 供 了 苦 楝 皮 在 作 为 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 的 药 物 中 活 性 成 分 的 应 用, 为 今 后 开 发 出 一 种 新 的 抑 制 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 的 药 物 奠 定 基 础 附 图 说 明 [0017] 图 1 为 细 胞 相 对 活 力 与 苦 楝 皮 溶 液 浓 度 的 关 系 ; [0018] 图 2 为 苦 楝 皮 溶 液 浓 度 与 病 毒 产 量 的 MTT 检 测 图 具 体 实 施 方 式 [0019] 以 下 通 过 实 例 形 式 的 具 体 实 施 方 式 对 本 发 明 作 进 一 步 的 详 细 说 明 [0020] 实 施 例 1 [0021] 称 取 10g 粉 碎 的 苦 楝 皮,100ml 蒸 馏 水 浸 泡 过 夜, 过 滤, 得 第 一 次 浸 泡 过 滤 后 所 得 液 体 和 过 滤 后 的 苦 楝 皮, 在 过 滤 后 的 苦 楝 皮 中 再 加 入 100ml 蒸 馏 水, 浸 泡 过 夜 后, 以 文 火 加 热 煮 中 药 4 小 时, 过 滤, 得 熬 煮 过 滤 后 的 液 体, 将 第 一 次 浸 泡 过 滤 后 所 得 液 体 和 熬 煮 过 滤 后 所 得 液 体 混 合, 得 到 混 合 溶 液, 冻 干 混 合 溶 液 后 得 到 苦 楝 皮 粉 末 将 苦 楝 皮 粉 末 用 蒸 馏 水 溶 解 至 浓 度 为 10mg/mL, 得 苦 楝 皮 溶 液 [0022] 实 施 例 2 [0023] 将 神 经 氨 酸 酶 (A/California/7/2009(H1N1)NYMC X-179A c 流 感 病 毒 株, 经 鸡 胚 传 代, 收 尿 囊 液,-70 保 存 备 用 ) 溶 解 在 32.5mmol/L 的 MES 缓 冲 液 (PH 6.5) 和 4mmol/L CaCl 2 中, 得 神 经 氨 酸 酶 溶 液, 取 49μL 神 经 氨 酸 酶 溶 液 和 1μl 苦 楝 皮 溶 液 在 37 培 养 箱 中 孵 育 30 分 钟, 然 后 加 入 终 浓 度 为 20μmol/L 的 MUNANA 的 缓 冲 溶 液 50μl, 立 即 用 Bio-Red FLx-800 荧 光 酶 标 仪 进 行 检 测, 激 发 波 长 360nm, 发 射 波 长 450nm, 测 定 时 间 为 8min 检 测 结 果 为, 苦 楝 皮 对 神 经 氨 酸 酶 的 半 数 抑 制 浓 度 (IC 50 ) 为 IC 50 (μg/ml) = 184.3±13.1 4
3/4 页 [0024] 实 施 例 3 [0025] 将 神 经 氨 酸 酶 (Clostridium perfringens(c.welchii),n2876, 购 于 Sigma) 溶 解 在 32.5mmol/L 的 MES 缓 冲 液 (PH 6.5) 和 4mmol/L CaCl 2 中, 得 神 经 氨 酸 酶 溶 液, 取 49μl 神 经 氨 酸 酶 溶 液 和 1μl 苦 楝 皮 溶 液 在 37 培 养 箱 中 孵 育 30 分 钟, 然 后 加 入 终 浓 度 为 20μmol/L 的 MUNANA 的 缓 冲 溶 液 50μl, 立 即 用 Bio-Red FLx-800 荧 光 酶 标 仪 进 行 检 测, 激 发 波 长 360nm, 发 射 波 长 450nm, 测 定 时 间 为 8min 抑 制 程 度 的 强 弱 可 以 从 加 或 不 加 苦 楝 皮 的 初 始 反 应 速 率 来 决 定 检 测 结 果 为, 苦 楝 皮 对 神 经 氨 酸 酶 的 半 数 抑 制 浓 度 (IC 50 ) 为 IC 50 (μg/ml) = 0.76±0.27 [0026] 实 施 例 4 [0027] 结 合 图 1 图 2 说 明 本 实 施 例 [0028] 为 了 检 测 苦 楝 皮 在 细 胞 水 平 的 抗 流 感 作 用, 我 们 将 由 实 施 例 1 得 到 的 苦 楝 皮 溶 液 按 梯 度 稀 释 成 不 同 的 浓 度, 分 别 为 31.25ug/ML 62.5ug/ML 125ug/ML 和 250ug/ML, 将 上 述 苦 楝 皮 溶 液 分 别 与 100TCID50 的 病 毒 等 体 积 孵 育 2 小 时, 总 体 积 为 200μL, 并 且 稀 释 液 都 用 维 持 液 ( 即 无 血 清, 含 10ug/ml 胰 酶 的 DMEM), 然 后 将 上 述 一 系 列 苦 楝 皮 溶 液 与 100TCID50 的 病 毒 的 混 合 物 接 种 到 已 经 长 成 单 层 的 MDCK 细 胞 培 养 板 上,2 小 时 后, 换 不 含 FBS 的 维 持 液,24 小 时 后 换 含 2% FBS 的 维 持 液, 连 续 观 察 2-3 天, 用 MTT 法 检 测 细 胞 病 变 效 果 同 时 设 只 加 维 持 液 只 加 同 稀 释 度 的 病 毒 液 或 者 只 加 不 同 浓 度 药 物 稀 释 液 作 为 对 照 组, 于 37 5% CO 2 培 养, 对 中 药 苦 楝 皮 进 行 抗 病 毒 活 性 研 究 [0029] 结 果 如 图 1 所 示, 在 没 有 加 入 H1N1 病 毒 时, 细 胞 活 力 随 着 苦 楝 皮 浓 度 的 增 加 呈 现 降 低 趋 势, 说 明 苦 楝 皮 提 取 物 具 有 细 胞 毒 性 ; 在 同 时 加 入 苦 楝 皮 提 取 物 和 H1N1 病 毒 时, 随 着 苦 楝 皮 提 取 物 浓 度 的 增 加, 细 胞 活 力 也 随 着 增 加 说 明 苦 楝 皮 可 以 抑 制 流 感 病 毒, 保 护 MDCK 细 胞 免 受 病 毒 破 坏, 而 且 保 护 效 应 随 着 苦 楝 皮 提 取 物 浓 度 的 增 加 而 增 加 即 呈 现 浓 度 依 赖 性 [0030] 图 2 为 苦 楝 皮 溶 液 浓 度 与 病 毒 产 量 的 MTT 检 测 图, 由 图 可 见, 随 药 物 浓 度 的 提 高, 病 毒 产 量 逐 渐 下 降, 这 同 时 辅 证 了 苦 楝 皮 有 较 好 抗 流 感 病 毒 作 用 [0031] 实 施 例 5 [0032] 为 了 进 一 步 说 明 苦 楝 皮 具 有 抗 流 感 病 毒 的 活 性, 我 们 做 了 动 物 实 验 将 六 星 期 大 的 雌 性 BALB/c 小 鼠 ( 由 长 春 生 物 制 品 研 究 所 提 供 ) 用 50μl 0.2% 戊 巴 比 妥 钠 麻 醉, 滴 鼻 吸 入 50μl A/FM/1/47(H1N1) 流 感 病 毒 ( 由 白 求 恩 医 科 大 学 分 子 生 物 实 验 室 提 供 ) 将 小 鼠 分 成 五 组, 每 组 十 只, 一 二 三 组 每 十 五 天 分 别 喂 饲 40,80 和 160mg/kg 的 苦 楝 皮 提 取 物, 第 一 次 喂 饲 在 小 鼠 被 流 感 病 毒 感 染 之 前 两 天 实 施 每 十 五 天 观 察 一 下 小 鼠 的 死 亡 率 结 果 如 表 3 所 示, 从 中 可 以 看 出 喂 饲 苦 楝 皮 提 取 物 的 三 组 小 鼠 的 死 亡 之 书 只 数 明 显 小 于 病 毒 组, 生 存 天 数 也 明 显 长 于 病 毒 组, 说 明 苦 楝 皮 可 以 增 加 被 流 感 病 毒 感 染 的 小 鼠 的 存 活 率 [0033] 表 3 5
4/4 页 [0034] 6
附 图 1/1 页 图 1 图 2 7