研 究 报 告 生 物 技 术 通 报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013 年 第 10 期 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 在 sf9 细 胞 中 的 表 达 徐 影 赵 雪 于 源 华 ( 长 春 理 工 大 学 生 命 科 学 技 术 学 院, 长 春 130022) 摘 要 : 利 用 杆 状 病 毒 表 达 系 统 在 昆 虫 细 胞 sf9 中 表 达 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 基 因 (FVO) 人 工 合 成 FVO 基 因, 与 载 体 pfastbac1 连 接, 转 化 至 大 肠 杆 菌 DH10Bac 感 受 态 细 胞, 进 行 同 源 重 组 经 筛 选 得 到 重 组 杆 状 病 毒 载 体 Bacmid-pFastBac1-FVO, PCR 鉴 定 得 到 单 一 条 带 ; 用 该 重 组 载 体 转 染 sf9 细 胞, 收 获 毒 种 并 进 行 表 达 ; 对 表 达 产 物 进 行 SDS-PAGE Western blot 检 测 成 功 构 建 了 FVO 的 杆 状 病 毒 表 达 载 体, 并 在 sf9 细 胞 中 得 到 了 表 达,Western blot 检 测 出 现 1 条 约 40 kd 的 带 关 键 词 : 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 杆 状 病 毒 表 达 系 统 同 源 重 组 sf9 细 胞 真 核 表 达 Expression of Fructose Valine Oxidase in Sf9 Cells Xu Ying Zhao Xue Yu Yuanhua (College of Life Sciences,Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022) Abstract: It was to express the Fructose Valine Oxidase Gene with baculovirus expression system. FVO gene was artificially synthesized, and ligated to the vector pfastbac1 to obtain the recombinant vector, which was then transformed into E.coli DH10Bac competent cells to transposase with bacmid. After screening, the recombinant baculovirus Bacmid-pFastBac1-FVO was got, which appeared a single band after PCR identification. sf9 cells was transfected with the recombinant vector, and harvested the virus and expressed the protein. Results showed that the baculovirus expression vector was successfully constructed and expressed in the sf9 cells which appeared a 40 kd band with Western blot. Key words: Fructose Valine oxidase Baculovirus expressive system Homologous recombination Sf9 cell Eukaryotic expression [1] 美 拉 德 反 应 是 一 种 普 遍 存 在 于 自 然 界 中 的 非 酶 促 反 应, 还 原 性 糖 ( 如 葡 萄 糖 ) 的 羰 基 可 和 蛋 白 氨 基 酸 上 的 α- 或 ε- 氨 基 基 团 反 应, 缩 合 成 不 稳 定 的 席 夫 碱, 经 重 排 后 形 成 稳 定 的 Amadori 化 合 物, 为 与 酶 促 糖 基 化 反 应 区 别, 将 这 一 系 列 非 酶 促 反 应 称 为 糖 化 反 应 [2,3] 在 糖 尿 病 人 体 内, 由 于 血 糖 升 高 加 剧 了 血 液 中 蛋 白 质 的 糖 化 反 应 血 液 中 的 糖 化 血 红 蛋 白 反 映 了 一 段 时 期 内 生 物 体 内 血 糖 水 平, 近 年 来 被 用 作 糖 尿 病 诊 断 和 治 疗 的 重 要 指 标 [4,5] 目 前, 糖 化 血 红 蛋 白 可 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 微 柱 法 免 疫 法 等 来 测 定, 但 上 述 方 法 大 多 价 格 昂 贵, 或 检 测 时 间 长 测 量 精 度 差 ; 最 近 流 行 的 酶 法 检 测, 利 用 氧 化 还 原 反 应, 操 作 简 便 易 行, 精 度 高, 时 间 短, 广 泛 应 用 于 生 化 分 析 和 临 床 检 查 利 用 上 述 氧 化 还 原 反 应 的 糖 化 血 红 蛋 白 测 定 过 程 中, 需 要 一 类 特 殊 的 酶 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶, 该 酶 可 作 用 于 糖 化 血 红 蛋 白 或 糖 化 氨 基 酸, 产 生 过 氧 化 氢, 添 加 过 氧 化 物 酶 和 还 原 剂, 使 过 氧 化 氢 和 还 原 剂 之 间 发 生 氧 化 还 原 反 应, 可 通 过 测 定 还 原 剂 的 显 色 来 测 定 过 氧 化 氢 的 量, 从 而 可 知 样 品 中 糖 化 血 红 蛋 白 含 量 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 基 因 来 源 于 菌 株 Corynebacterium sp. 2-4-1, 它 由 1 119 个 核 苷 酸 组 成, 编 码 了 含 有 372 个 氨 基 酸 分 子 量 为 39.044 kd 的 蛋 白 质 [2] 国 内 大 多 采 用 原 核 表 达, 其 表 达 效 果 不 够 理 想 [6] 本 试 验 将 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 基 因 连 接 到 昆 虫 表 达 载 体 上, 构 建 出 同 源 重 组 杆 状 病 毒 表 达 载 体, 然 后 在 昆 虫 细 胞 sf9 中 表 达, 并 进 行 蛋 白 表 达 的 鉴 定, 为 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 在 真 核 表 达 的 研 究 奠 定 基 础 收 稿 日 期 :2013-04-19 作 者 简 介 : 徐 影, 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 : 分 子 生 物 学 ;E-mail :dyzxuying@126.com 通 讯 作 者 : 于 源 华, 女, 教 授, 博 士 生 导 师, 研 究 方 向 : 生 物 化 学 分 子 生 物 学 ;E-mail :yuyuanhua8888@126.com
2013 年 第 10 期 徐 影 等 : 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 在 sf9 细 胞 中 的 表 达 161 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 质 粒 和 菌 株 转 座 载 体 质 粒 pfastbac1 E.coli DH10Bac 由 长 春 生 物 制 品 研 究 所 细 胞 因 子 室 刘 景 会 主 任 惠 赠 ; 目 的 基 因 FVO(JM109-pMD19-T Simple- FVO) 由 TaKaRa 大 连 宝 生 物 工 程 公 司 合 成 ;E.coli DH5α 由 本 实 验 室 保 存 1.1.2 昆 虫 细 胞 株 昆 虫 细 胞 草 地 夜 蛾 (Spodoptera frugierda) 卵 巢 组 织 细 胞 Sf9 [7], 由 长 春 生 物 制 品 研 究 所 细 胞 因 子 室 刘 景 会 主 任 惠 赠 1.1.3 试 剂 限 制 性 内 切 酶 BamH Ⅰ Sal Ⅰ 购 自 TOYOBO 东 洋 纺 ( 上 海 ) 生 物 科 技 有 限 公 司 ;Grace s Insect Medium 培 养 基 Sf-900 Ⅱ SFM 无 血 清 培 养 基 转 染 试 剂 Cell Fectin Bac PAK qpcr Titration Kit Bac PAK Baculovirus Rapid Titer Kit Chromogenic Western Blot Immunodetection Kit 购 自 Invitrogen 公 司 ;T4 DNA 连 接 酶 Taq DNA polymerase 质 粒 小 量 提 取 试 剂 盒 DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 PCR 产 物 回 收 试 剂 盒 DNA Markers(DL2000 DL0 DL15000 λ-hind Ⅲ digest) M 13 通 用 引 物 购 自 TaKaRa 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 1.1.4 仪 器 NBS Innova 4300 恒 温 摇 床 ;Little Genius TC-25/H PCR 仪 ;Sagecreation 北 京 赛 智 创 业 科 技 有 限 公 司 凝 胶 成 像 系 统 ; 上 海 一 恒 科 学 仪 器 有 限 公 司 电 热 恒 温 培 养 箱 ;ZHWY-103D 恒 温 培 养 振 荡 器 ;WD-9405B 型 水 平 摇 床 ;SDC-6 节 能 型 智 能 恒 温 槽 ;TG16-W 微 量 高 速 离 心 机 ;DNA 电 泳 仪 :Bio-Rad Power Pac 300 ; 蛋 白 电 泳 仪 :DYY-12 型 电 源 ; 雷 磁 PHS-3C 立 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 ;PALL CASCADE 通 用 纯 水 机 ;QL-861 涡 旋 振 荡 器 ; 苏 净 安 泰 SW-CJ-2F 洁 净 工 作 台 ;XB-40 雪 花 制 冰 机 ; 芬 兰 Finnplpette 移 液 枪 1.2 方 法 1.2.1 目 的 基 因 获 得 在 NCBI 的 GenBank 中 查 得 来 源 于 菌 株 Corynebacterium sp.2-4-1 中 编 码 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 的 基 因 序 列 ( 登 录 号 为 AB073548.1), 加 入 酶 切 位 点 BamH Ⅰ Sal Ⅰ 后 序 列 长 度 为 1 131, 由 TaKaRa 大 连 宝 生 物 工 程 公 司 合 成 该 序 列 至 pmd19-t Simple 载 体 中 1.2.2 重 组 的 质 粒 构 建 及 鉴 定 将 pfastbac1 质 粒 和 pmd19-t Simple-FVO 分 别 用 BamH Ⅰ 和 Sal Ⅰ 进 行 双 酶 切, 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 切 胶 回 收 载 体 和 目 的 片 段, 通 过 T4 DNA 连 接 酶 在 16 下, 过 夜 进 行 连 接 ; 连 接 产 物 转 化 至 E.coli DH5α 感 受 态 细 胞, 提 取 质 粒 双 酶 切 鉴 定, 获 得 正 确 插 入 的 载 体 pfasbac1-fvo ; 将 该 载 体 转 化 E.coli DH10Bac 感 受 态 细 胞, 经 过 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 四 环 素 及 蓝 白 斑 筛 选 得 到 重 组 阳 性 克 隆 挑 取 较 大 白 斑 进 行 菌 落 PCR 鉴 定, 进 一 步 划 线 分 离 单 菌 落, 再 次 菌 落 PCR 鉴 定 直 至 无 杂 带 提 取 重 组 杆 粒,PCR 鉴 定 1.2.3 重 组 质 粒 PCR 产 物 序 列 分 析 将 上 述 重 组 质 粒 的 PCR 鉴 定 产 物 ( 未 纯 化 ) 送 往 TaKaRa 大 连 宝 生 物 工 程 公 司 测 序 1.2.4 重 组 杆 状 病 毒 载 体 转 染 sf9 细 胞 sf9 细 胞 培 养 条 件 [8,9] : 使 用 无 血 清 培 养 基 Sf-900 Ⅱ SFM, 27, 无 需 CO 2, 进 行 半 贴 壁 培 养,4-5 d 传 代 一 次 [10] 利 用 脂 质 体 法 对 Sf9 细 胞 进 行 转 染,27 连 续 培 养 72 h 左 右 观 察 sf9 细 胞 是 否 出 现 系 列 病 毒 感 染 现 象 在 转 染 试 剂 介 导 下, 重 组 杆 粒 转 入 sf9 昆 虫 细 胞, 组 装 成 完 整 的 病 毒 颗 粒, 收 获 P1 代 重 组 病 毒 1.2.5 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 的 表 达 与 鉴 定 继 续 感 染 sf9 细 胞, 扩 增 重 组 病 毒 : 取 MOI=0.3, 用 所 得 病 毒 液 反 复 感 染 对 数 生 长 期 的 sf9 细 胞,27 培 养 96 h, [11,12] 以 提 高 病 毒 滴 度 ; 利 用 磁 珠 法 提 取 病 毒 基 因 组 进 行 PCR 鉴 定 并 利 用 快 速 滴 定 试 剂 盒 测 定 滴 度 收 获 细 胞 : 单 独 收 获 上 清,14 000 r/min 离 心 5 min, 取 900 μl 上 述 上 清, 加 入 100 μl 100% 三 氯 乙 酸 [13,14], 充 分 混 匀,-20 冰 育 10 min,14 000 r/min 离 心 15 min, 去 上 清, 加 入 200 μl 丙 酮 洗 涤 两 次 ( 每 次 混 匀 后 14 000 r/min 离 心 5 min), 加 入 60 μl ph8.0 10 mmol/l TE 溶 解, 最 后 加 入 20 μl 蛋 白 电 泳 载 样 液 混 匀, 沸 水 煮 5 min ; 加 入 1 ml 培 养 基 用 细 胞 刮 刀 将 细 胞 沉 淀 刮 下 吸 出, 取 500 μl 沉 淀 3 000 r/min 离 心 5 min, 去 上 清, 加 入 100 μl 还 原 型 蛋 白 电 泳 载 样 液, 混 匀, 沸 水 煮 5 min 将 以 上 各 蛋 白 样 品 进 行 SDS- PAGE Western blot 检 测 2 结 果 2.1 质 粒 提 取 双 酶 切 及 回 收 用 软 件 Vector NTI 11.5 对 合 成 序 列 FVO 与 原 始 序 列 进 行 比 对, 结 果 完 全 一 致 用 试 剂 盒 提 取
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 162 pmd19-t Simple-FVO 及 pfastbac1 质粒 2013年第10期 质粒 pmd19-t Simple-FVO 经 BamH Ⅰ及 Sal Ⅰ M 1 2 23130 双酶切 得到 1 119 目的片段 FVO pfastbac1 同 样经过上述双酶切 电泳结果见图 1 位置正确 9416 用胶回收试剂盒对双酶切产物进行回收 回收效率 6557 较高 将上述酶切回收产物进行连接 转化大肠杆 4391 菌 E.coli DH5α 感受态细胞 挑单菌落 用试剂盒提 取质粒 对该质粒进行双酶切鉴定 结果正确 1 2 M 1 M2 3 4 M TaKaRaλ-Hind Ⅲ digest DNA Marker 1 2 重组杆粒 BacmidpFastBac1-FVO 图2 重组杆粒 Bacmid-pFastBac1-FVO 15000 2000 750 500 100 0 7500 5000 部分细胞裂解现象 细胞膜消失 图 3 图 4 以 上证明重组杆粒成功转染 sf9 并获得重组杆状病毒 1 pfastbac1 质粒 2 经 BamH Ⅰ及 Sal Ⅰ双酶切的 pfastbac1 质粒 M1 DNA marker DL2000 M2 DNA marker DL15000 3 经 BamH Ⅰ及 Sal Ⅰ双 酶切的 pmd19-t Simple-FVO 质粒 4 pmd19-t Simple-FVO 质粒 图 1 质粒 pmd19-t Simple-FVO 及 pfastbac1 双酶切 2.2 重组杆粒菌落PCR鉴定 将 pfastbac1-fvo 转 化 E.coli DH10Bac 中 同 源 图3 重组 挑取较大白斑作为模板 用 M13 引物进行菌 正常 sf9 细胞 40 落 PCR 并对产物进行电泳 预期大小应约 3 431 菌落 PCR 结果正确 2.3 重组杆粒提取及PCR鉴定 通过碱裂解法 手提重组杆粒 进行 0.6% 琼 脂糖凝胶电泳 恒压 24 V 5 h 45 min 电泳结果如 图 2 所示 条带位置正确 以重组杆粒为模板 用 M13 引物进行 PCR 并 对 PCR 产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 预 期 大 小 为 3 431 PCR 电泳结果位置正确 将上述未纯化 图4 PCR 产物进行测序 结果无突变 2.4 用收获的 P1 代病毒扩增 P2 代 提高病毒滴度 收获重组杆状病毒及病毒因组PCR鉴定 用重组杆粒转染 sf9 细胞 27 避光培养 随 转染杆粒后 sf9 细胞 40 用磁珠法提取其基因组作为模板 用 M13 引物进行 时观察细胞状态 转染后 24 h 细胞体积逐渐增大 PCR 鉴定 以验证转染成功 病毒完整组装 结果 变圆 转染后 48 h 细胞明显停止生长 细胞核明 如图 5 所示 条带位置正确 显增大 转染后 72 h 细胞内出现较多颗粒状物质 2.5 部分细胞开始从培养板上脱落 转染后 96 h 出现 快速测定病毒滴度 采用快速滴定病毒滴度试剂盒 对 P2 代 P3
2013 年 第 10 期 徐 影 等 : 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 在 sf9 细 胞 中 的 表 达 163 0 7000 4000 2000 300 M 1 2 M :DNA marker DL0 ;1 : 未 加 模 板 空 白 对 照 ;2 : 重 组 杆 粒 PCR 产 物 图 5 P2 代 病 毒 因 组 PCR 鉴 定 代 病 毒 进 行 滴 度 测 定,P2 代 病 毒 滴 度 为 8 10 5 PFU/ ml,p3 代 病 毒 滴 度 为 5.2 10 7 PFU/mL 2.6 SDS-PAGE 电 泳 分 析 及 Western blot 检 测 为 定 量 分 析 重 组 蛋 白 的 表 达, 进 行 SDS-PAGE 检 测 用 P3 代 病 毒 扩 增 P4 代 高 滴 度 病 毒, 收 获 后 用 其 表 达 重 组 蛋 白 从 图 中 未 能 明 显 看 出 目 的 蛋 白 条 带 为 了 进 一 步 确 定 重 组 蛋 白 的 表 达, 对 样 品 进 行 特 异 性 的 Western blot 检 测 将 电 泳 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 转 膜 过 夜, 封 闭, 加 入 一 抗 ( 鼠 抗 FVO 抗 体 ) 二 抗 ( 羊 抗 鼠 IgG-HRP) 反 应, 显 色 结 果 细 胞 沉 淀 裂 解 液 在 43 kd 位 置 出 现 了 较 清 晰 的 单 一 条 带, 而 细 胞 上 清 液 未 出 现 条 带 说 明 FVO 基 因 能 够 在 sf9 细 胞 中 表 达, 且 表 达 产 物 主 要 存 在 于 细 胞 内 1 2 3 M kd 97.4 66.2 43.0 31.0 1 : 正 常 sf9 细 胞 裂 解 液 ;2 : 病 毒 感 染 的 细 胞 培 养 上 清 ;3 : 病 毒 感 染 的 细 胞 沉 淀 裂 解 液 ;M : 低 分 子 量 蛋 白 Marker 3 讨 论 图 6 FVO Western blot 分 析 本 试 验 采 用 Bac-to-Bac 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 系 统 对 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 的 生 物 学 活 性 进 行 了 研 究 Invitrogen 公 司 的 Bac-to-Bac 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 系 统 为 真 核 表 达 系 统 的 一 种, 该 系 统 的 Bacmid 包 含 mini-f 复 制 子 卡 那 霉 素 抗 性 筛 选 标 记 细 菌 转 座 子 Tn7 的 靶 位 点 (mini-atttn7) 以 及 编 码 β- 半 乳 糖 苷 酶 α 肽 的 部 分 DNA 片 段 [15] Bacmid 既 能 像 质 粒 一 样 在 E. coli 中 复 制, 又 能 像 病 毒 一 样 感 染 昆 虫 细 胞, 供 体 质 粒 pfastbac 含 有 庆 大 霉 素 抗 性 基 因 (Gen+) 及 Tn7 的 左 右 两 臂 序 列, 两 臂 序 列 之 间 是 多 角 体 蛋 白 的 启 动 子, 下 游 依 次 是 多 克 隆 位 点 SV40 的 PolyA 位 点 [16] Bac-to-Bac 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 系 统 安 全 性 好, 表 达 水 平 高, 可 进 行 翻 译 后 加 工 及 表 达 产 物 的 异 源 性 小, 是 一 种 非 常 理 想 的 真 核 表 达 系 统 该 系 统 独 特 的 性 质, 使 其 被 广 泛 地 应 用 于 基 因 工 程 药 物 开 发 疫 苗 生 产 表 达 免 疫 活 性 分 子 和 某 些 致 瘤 病 毒 蛋 白 以 及 基 因 表 达 调 控 研 究 等 多 个 领 域 中 近 年 来, 越 来 越 多 的 研 究 表 明, 糖 化 蛋 白 的 积 累 与 衰 老 及 一 些 疾 病 的 发 生 相 关, 如 动 脉 粥 样 硬 化 糖 尿 病 关 节 炎 及 神 经 衰 弱 等 因 此, 对 糖 化 蛋 白 的 含 量 检 测 具 有 重 要 意 义 而 果 糖 氨 基 酸 氧 化 酶 目 前 主 要 应 用 于 对 血 液 中 糖 化 蛋 白 含 量 的 检 测, 被 称 为 糖 尿 病 检 测 的 金 标 准 [1] 本 研 究 首 先 通 过 人 工 合 成 的 方 式, 获 得 了 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 基 因 ; 将 其 与 载 体 pfastbac1 连 接, 转 化 到 大 肠 杆 菌 DH10Bac 进 行 同 源 重 组, 经 过 一 系 列 筛 选 及 鉴 定, 成 功 构 建 了 含 有 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 基 因 的 杆 状 病 毒 表 达 载 体 ; 用 其 转 染 昆 虫 细 胞 sf9, 进 行 完 整 病 毒 的 组 装 及 重 组 蛋 白 的 表 达 对 表 达 产 物 进 行 12% SDS-PAGE 检 测, 结 果 无 法 看 到 明 显 目 的 蛋 白 条 带, 可 能 是 由 于 真 核 表 达 系 统 的 特 殊 性 和 局 限 性, 表 达 量 有 限, 肉 眼 很 难 识 别 ; 而 通 过 Western blot 检 测, 在 43 kd 处 得 到 单 一 条 带, 可 以 确 定 重 组 蛋 白 有 表 达 以 上 结 果 为 进 一 步 研 究 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 的 功 能 及 作 用 机 制 及 其 在 临 床 的 广 泛 应 用 奠 定 了 基 础 针 对 限 制 果 糖 氨 基 酸 氧 化 酶 商 业 化 的 因 素 进 行 研 究, 随 着 蛋 白 质 工 程 的 开 展, 人 们 会 获 得 性 质 更 加 优 良 的 果 糖 氨 基 酸 氧 化 酶, 使 其 在 临 床 检 测 中 取 得 更 加 广 泛 的 应 用 4 结 论 通 过 人 工 合 成 方 式 获 得 了 果 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 基 因 ; 并 成 功 构 建 了 含 有 糖 缬 氨 酸 氧 化 酶 基 因 的 杆 状
164 生 物 技 术 通 报 Biotechnology Bulletin 2013 年 第 10 期 病 毒 表 达 载 体 Bacmid-pFastBac1-FVO 用 其 转 染 昆 虫 细 胞 sf9, 进 行 完 整 病 毒 的 组 装 及 重 组 蛋 白 的 表 达, 在 43 kd 处 得 到 单 一 条 带, 确 定 重 组 蛋 白 成 功 表 达 参 考 文 献 [1] 陈 蓉, 张 琳, 高 静 华, 等. 果 糖 氨 基 酸 氧 化 酶 的 研 究 进 展 [J]. 医 药 前 沿, 2011, 01(17):76-77. [2] Ryoichi S, Minoru H, Naoki K.Cloning and expression of fructosylamino acid oxidase gene from Corynebacterium sp.2-4-1 in Escherichia coli[j]. Biosci Bitechnol Biochem, 2002, 66(6):1256-1261. [3] Yoshida N, Sakai Y, Isogai A, et al. Primary structures of fungal fructosyl amino acid oxidases and their application to the measurement of glycated proteins[j]. Biochem, 1996, 242, (3): 499-505. [4] Eckhardt BJ, Holzman RS, Kwan CK, et al. Glycated hemoglobin A1c as screening for diabetes mellitus in HIV-Infected individuals. AIDS Patient Care and STPS, 2012, 26(4):197-201. doi : 10.1089/apc. 2011.0379 [5] Mostafa S, Davies M, Webb D, et al. The potential impact of using glycated haemoglobin as the preferred diagnostic tool for detecting Type 2 diabetes mellitus[j]. Diabetic Medicine, 2010, 27(7): 762-769. [6] 孙 柏 欣, 刘 长 远, 陈 彦, 等. 基 因 表 达 系 统 研 究 进 展 [J]. 现 代 农 业 科 技, 2008, 25(2):205-209. [7] 周 亚 竞, 张 志 芳, 张 元 兴, 等. 昆 虫 细 胞 培 养 研 究 进 展 [J]. 蚕 业 科 学, 2000, 26 :74-78. [8] 谢 秋 玲, 郑 云 程, 廖 美 德. 昆 虫 细 胞 sf9 在 四 种 生 物 反 应 器 中 的 培 养 [J]. 暨 南 大 学 学 报, 2009, 30(1):96-100. [9] 张 寰, 张 永 安, 秦 启 联, 等. 昆 虫 细 胞 系 的 培 养 和 建 立 技 术 [J]. 昆 虫 学 报, 2007, 50(8):834-839. [10] 高 岑, 史 书 龙, 张 旭, 等. 脂 质 体 介 导 法 转 染 mlmcd-3 细 胞 的 可 行 性 及 最 佳 转 染 条 件 [J]. 中 国 组 织 工 程 研 究 与 临 床 康 复, 2011, 15(15):2739-2742. [11] 高 秋 月, 景 奉 香, 李 海 燕, 等. 基 于 磁 珠 的 细 菌 基 因 组 DNA 快 速 提 取 方 法 [J]. 安 徽 农 业 科 学, 2010, 38(21):11071-11074. [12] 陆 佳 飞, 周 科 隆, 王 缦. 磁 珠 快 速 提 取 乙 型 肝 炎 病 毒 DNA 方 法 的 建 立 及 其 应 用 研 究 [J]. 中 华 检 验 医 学 杂 志, 2012, 35(9): 150-154. [13] 牛 巍, 侯 彩 云, 祝 晓 芳, 等. 三 氯 乙 酸 沉 淀 法 与 硫 酸 铜 沉 淀 法 在 液 态 奶 蛋 白 质 检 测 中 适 用 性 研 究 [J]. 中 国 乳 品 工 业, 2008, 36(9):59-61. [14] 陈 少 迁, 吴 少 雄, 柳 陈 坚, 等. 三 氯 乙 酸 沉 淀 液 态 奶 蛋 白 的 最 佳 实 验 条 件 研 究 [J]. 乳 液 科 学 与 技 术, 2009, 22(6):278-281. [15] Edelman L, Maroaritte C, Cchaabihi H, et al. Obtaining a functional recombinant anti-rhesus(d)antibody using the baculovirusinsect cell expression system[j]. Immunology, 1997, 91(1): 13-19. [16] 兰 丽 盼, 吴 小 锋. 昆 虫 杆 状 病 毒 研 究 和 应 用 新 进 展 [J]. 农 业 生 物 技 术 学 报, 2008, 16(6):1056-1060. ( 责 任 编 辑 李 楠 )