谷 胱 甘 肽 对 猪 精 液 常 温 保 存 效 果 的 影 响 1 刘 琦, 苏 泽 智, 王 乐, 冉 舒 文, 胡 亚 美, 曹 师 瑜, 李 思 慧, 杨 公 社, 胡 建 宏 ( 西 北 农 林 科 技 大 学, 动 物 科 技 学 院, 陕 西 杨 凌 712100) 摘 要 : 为 研 究 谷 胱 甘 肽 (GSH) 对 猪 精 液 常 温 保 存 的 影 响, 在 基 础 稀 释 粉 BTS 和 Modena 中 分 别 加 入 1 5 10 和 15mmol/L 的 GSH, 每 隔 24h 观 察 精 子 活 率, 统 计 精 子 有 效 保 存 时 间, 检 测 精 液 中 MDA H 2 O 2 含 量 及 SOD 活 力, 分 析 GSH 对 猪 精 液 常 温 保 存 效 果 的 影 响 结 果 表 明, 猪 稀 释 精 液 中 加 入 1mmol/L 的 GSH 能 够 减 少 精 子 的 氧 化 损 伤, 明 显 降 低 精 液 中 MDA H 2 O 2 含 量 (P<0.05), 显 著 提 高 精 液 SOD 活 力 (P<0.05); Modena 中 加 入 1mmol/L 和 5mmol/L GSH 精 子 有 效 保 存 时 间 和 精 子 活 率 无 明 显 差 异 (P >0.05), 精 子 有 效 保 存 时 间 为 5d, 精 子 活 率 分 别 为 0.603 和 0.63 因 此, 稀 释 液 中 加 入 GSH 可 以 提 高 猪 精 液 常 温 保 存 的 品 质, 稀 释 剂 Modena 比 BTS 更 能 延 长 猪 精 液 有 效 保 存 时 间,GSH 的 最 适 添 加 量 为 1mmol/L 关 键 词 : 猪 精 液 ; 常 温 保 存 ;GSH; 精 液 品 质 ; 抗 氧 化 性 能 Effects of GSH on Quality of Boar Semen Stored at Normal Temperature LIU Qi, SU Zezhi, LI Yaxin, LEI Jiaqi, WEI Haiyan, WANG Yuying, CHEN Dagang, YANG Gongshe and HU Jianhong (College of Animai Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China) Abstract: To investigate the effects of glutathion (GSH) on the quality of boar semen stored at room temperature, GSH was added at concentration of 1,5,10,15 mmol/l of 1 基 金 项 目 : 国 家 生 猪 产 业 技 术 体 系 (CARS-36), 2012 陕 西 省 农 业 专 项 资 金 项 目 作 者 简 介 : 刘 琦 (1990-), 女, 硕 士 研 究 生, 主 要 从 事 动 物 生 殖 生 理 调 控 方 面 的 研 究 E-mail:liuqi 19900709@163.com; 电 话 :15191450977 通 讯 作 者 : 胡 建 宏 (1969-), 男, 陕 西 白 水 人, 博 士, 教 授, 主 要 从 事 家 畜 生 殖 生 理 调 控 方 面 的 教 学 与 科 研 工 作
GSH to the two kinds of extender of BTS and Modena. Sperm motility, effective survival time, concentrations of malondialdehyde (MDA), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and superoxide dismutase (SOD) activity were measured and analyzed. The results showed that boar semen with 1 mmol/l of GSH can significantly decrease the concentration of MDA, H 2 O 2 (P< 0.05) and improve SOD activity (P< 0.05). Modena with 1 and 5 mmol/l of GSH can not significantly improve sperm motility and effective survival time (P>0.05). The effective survival time was five days. The sperm motility was 0.603 and 0.63 respectively on the fifth day. In conclusion, GSH can improve the quality of boar semen stored at room temperature, Modena is better to improve the effective survival time, and which optimum addition level in Modena is 1mmol/L. Key words: Boar semen;stored at room temperature; GSH;Semen quality; Antioxidant capacity 猪 精 液 的 常 温 保 存 (17~25 ) 是 目 前 生 产 实 践 中 最 常 用 的 保 存 方 法 [1] 在 精 液 的 保 存 过 程 中, 精 子 质 量 降 低 与 呼 吸 代 谢 过 程 中 产 生 的 活 性 氧 族 (ROS) 有 关 [2] 高 浓 度 的 ROS 会 造 成 精 子 脂 质 过 氧 化 (LOP), 破 坏 精 子 质 膜 结 构, 降 低 精 子 活 力, 影 响 精 子 受 精 能 力 [3] 因 此, 稀 释 液 中 添 加 新 的 抗 氧 化 物 质 是 提 高 猪 精 液 常 温 保 存 的 研 究 热 点 谷 胱 甘 肽 (GSH) 是 一 种 三 肽 化 合 物, 可 降 低 精 子 质 膜 上 的 LOP 发 生 概 率 [4,5] Gadea 等 研 究 表 明, 随 着 猪 精 子 质 膜 结 构 发 生 变 化, 精 子 内 GSH 含 量 大 幅 度 减 少, 在 猪 冷 冻 稀 释 精 液 中 添 加 1mmol 的 GSH 对 提 高 精 子 活 力 效 果 最 佳 张 文 [6] 举 等 研 究 认 为, 牛 精 液 中 加 入 GSH 可 明 显 提 高 解 冻 后 精 子 受 胎 率 但 是, 任 [7] 俊 玲 等 研 究 表 明,GSH 的 添 加 对 猪 冷 冻 精 液 质 量 作 用 不 显 著 因 此, 目 前 大 多 研 究 GSH 对 于 冷 冻 精 子 的 影 响, 对 常 温 保 存 精 液 品 质 的 影 响 未 见 相 关 报 道 本 试 验 在 Modena 和 BTS 两 种 不 同 的 猪 常 温 保 存 稀 释 液 中 分 别 加 入 不 同 量 的 GSH, 通 过 检 测 精 子 活 率, 精 液 中 的 SOD H 2 O 2 和 丙 二 醛 (MDA) 含 量, 分 析 GSH 对 猪 精 液 常 温 保 存 效 果 的 影 响, 为 生 产 实 践 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法
1.1 稀 释 液 的 配 置 以 Modena 和 BTS 作 为 基 础 液, 分 别 加 入 1 5 10 和 15mmol/L 的 GSH 静 置 2h 后, 用 0.22µm 滤 膜 过 滤 除 菌 置 于 37 水 浴 锅 中 水 浴 加 热 待 用 1.2 精 液 收 集 陕 西 省 武 功 镇 山 佳 种 猪 场 的 健 康 成 年 大 白 种 猪 利 用 手 握 法 收 集 中 断 精 子 丰 富 部 分,1h 带 回 实 验 室 选 择 色 泽 正 常, 活 力 大 于 0.8, 密 度 3 ~5 10 8 /ml 的 精 液 用 于 试 验 1.3 精 液 的 稀 释 将 过 滤 好 的 稀 释 液 与 精 液 置 于 37 的 水 浴 锅 中 水 浴 至 与 稀 释 剂 等 温 将 精 液 平 均 分 成 8 份, 将 等 温 的 稀 释 剂 缓 慢 倒 入 精 液 中, 稀 释 倍 数 为 1:1 用 4 层 毛 巾 包 裹 稀 释 好 的 精 液, 待 降 至 室 温 (25 ), 置 于 17 的 保 温 箱 中 保 存 1.4 检 测 指 标 (1) 精 子 活 率 : 采 用 目 测 法 测 定, 每 个 样 品 随 机 选 取 3 个 视 野, 求 平 均 值 (2) 精 子 有 效 存 活 时 间 : 精 子 活 力 不 低 于 0.6 的 保 存 时 间 为 有 效 保 存 时 间 (3)MDA 浓 度 H 2 O 2 含 量 SOD 活 力 检 测 : 测 定 精 液 保 存 第 3d MDA MDA 浓 度,H 2 O 2 含 量 和 SOD 活 力, 按 照 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 的 试 剂 盒 说 明 进 行 1.5 统 计 分 析 用 SPSS 17.0 统 计 软 件 对 相 关 数 据 进 行 显 著 性 检 验, 结 果 以 平 均 数 ± 标 准 差 表 示 所 有 试 验 均 重 复 3 次 2 结 果 与 分 析
2.1 不 同 猪 精 液 常 温 稀 释 剂 对 精 子 活 率 的 影 响 不 同 稀 释 粉 中 添 加 不 同 剂 量 GSH 对 猪 精 子 活 率 的 影 响 见 表 1 和 表 2 表 1 稀 释 剂 BTS 中 加 不 同 浓 度 GSH 对 精 子 活 率 的 影 响 GSH 添 加 量 /mmol L -1 保 存 时 间 /d 1 2 3 4 5 1 0.837 a ±0.012 0.807 a ±0.015 0.750 a ±0.010 0.690 ab ±0.020 0.590 a ±0.010 5 0.780 b ±0.040 0.753 b ±0.006 0.727 a ±0.006 0.703 a ±0.012 0.567 b ±0.015 10 0.777 b ±0.015 0.720 b ±0.020 0.630 b ±0.020 0.670 ab ±0.020 0.547 bc ±0.012 15 0.757 b ±0.015 0.747 b ±0.050 0.707 ab ±0.015 0.603 c ±0.012 0.537 c ±0.006 注 : 同 列 中 不 同 小 写 字 母 表 示 差 异 显 著 (P<0.05), 相 同 小 写 字 母 表 示 差 异 不 显 著 (P >0.05) 下 同 表 2 稀 释 剂 Modena 添 加 不 同 浓 度 GSH 对 精 子 活 率 的 影 响 GSH 添 加 量 /mmol L -1 保 存 时 间 /d 1 2 3 4 5 1 0.820a±0.010 0.797a±0.015 0.753a±0.025 0.680a±0.026 0.607a±0.047 5 0.803a±0.006 0.763a±0.015 0.717a±0.015 0.703a±0.012 0.630a±0.010 10 0.757c±0.015 0.720b±0.020 0.643b±0.021 0.620b±0.020 0.583a±0.015 15 0.780b±0.010 0.780a±0.026 0.723a±0.015 0.627b±0.021 0.597a±0.021 由 表 1 可 知, 稀 释 剂 BTS 中 加 入 1mmol/L GSH 时, 精 子 活 率 明 显 高 于 其 他 添 加 量 (P <0.05), 有 效 保 存 时 间 为 4d 表 2 可 知, 稀 释 剂 Modena 中 加 入 1mmol/L 和 加 入 5mmol/L 的 GSH, 精 子 活 率 明 显 高 于 加 入 10 和 15mmol/L 的 GSH(P <0.05), 但 加 入 1mmol/L 或 5mmol/L 的 GSH, 精 子 活 率 差 异 不 显 著 (P>0.05), 猪 精 液 有 效 保 存 时 间 为 5d 2.2 不 同 浓 度 GSH 对 精 液 中 MDA 浓 度 的 影 响 不 同 稀 释 粉 中 添 加 不 同 浓 度 的 GSH 的 对 精 液 中 MDA 的 影 响 如 图 1 所 示
图 1 添 加 不 同 浓 度 的 GSH 对 精 液 中 MDA 浓 度 的 影 响 由 图 1 可 知, 随 着 加 入 GSH 添 加 量 的 增 加,MDA 浓 度 显 著 增 加 (P <0.05), 但 加 入 1mmol/L 的 GSH, 精 液 中 的 MDA 含 量 显 著 低 于 其 他 添 加 量 (P <0.05) 稀 释 液 Modena 中 加 入 1~10mmol/L 的 GSH 时, 精 液 中 的 MDA 含 量 逐 渐 增 加, 超 过 10mmol/L 的 GSH 时,MDA 含 量 基 本 稳 定 2.3 不 同 浓 度 GSH 对 精 液 中 H 2 O 2 含 量 的 影 响 基 础 液 中 加 入 不 同 浓 度 GSH 对 精 液 中 H 2 O 2 含 量 的 影 响 见 图 2 图 2 添 加 不 同 浓 度 的 GSH 对 精 液 中 H 2 O 2 含 量 的 影 响 由 图 2 可 知, 当 添 加 1~10mmol/L 的 GSH,Modena 的 H 2 O 2 含 量 显 著 增 加 (P <0.05), 且 基 础 液 Modena 稀 释 的 精 液 中 H 2 O 2 含 量 高 于 BTS 当 加 入 5~15mmol/L 的 GSH 时,BTS 稀 释 的 精 液 中 H 2 O 2 含 量 显 著 增 加 (P<0.05)
2.4 不 同 浓 度 GSH 对 精 液 中 SOD 活 性 的 影 响 不 同 浓 度 GSH 的 精 液 中 SOD 活 力 的 影 响 如 图 3 所 示 图 3 添 加 不 同 浓 度 的 GSH 对 精 液 中 SOD 活 力 的 影 响 根 据 图 3 可 知, 两 种 稀 释 剂 内 添 加 1mmol/L 的 GSH, 精 液 内 SOD 活 力 显 著 高 于 其 他 试 验 组 (P <0.05) 稀 释 液 Modena 中 加 入 1 和 10mmol/L 的 GSH 时, SOD 活 力 显 著 高 于 其 他 试 验 组 (P <0.05) 3 讨 论 本 研 究 结 果 表 明, 稀 释 液 中 添 加 一 定 量 的 GSH 可 以 减 缓 精 子 脂 质 过 氧 化, 延 长 精 子 有 效 保 存 时 间, 显 著 降 低 精 液 中 MDA H 2 O 2 含 量, 增 强 SOD 活 力, [8] 与 任 俊 玲 等 的 研 究 结 果 一 致, 且 Modena 中 添 加 GSH 比 BTS 保 存 效 果 更 好, [9] 精 子 有 效 保 存 时 间 更 长 但 是, 王 争 光 等 研 究 认 为, 稀 释 液 中 添 加 0.5mmol/L GSH 显 著 提 高 金 华 猪 冷 冻 精 液 活 率, 而 本 研 究 表 明 GSH 的 最 适 添 加 量 为 1mmol/L, 这 可 能 是 基 础 液 不 同 的 原 因 所 致 GSH 是 一 种 广 泛 存 在 于 哺 乳 动 物 细 胞 内 的 含 有 巯 基 (-SH) 的 三 肽, 具 有 抗 氧 化 作 用 当 外 源 性 补 充 GSH 时, 会 抑 制 精 液 ROS 的 产 生, 降 低 LOP 程 度 [10] GSH 可 以 催 化 GSH-PX 活 性, 将 细 胞 内 H 2 O 2 还 原 成 H 2 O, 切 断 LOP 循 环 链 [11] ; GSH 可 直 接 清 除 自 由 基, 从 H 2 O 2 和 氢 过 氧 自 由 基 夺 取 电 子, 使 其 还 原 成 H 2 O; GSH 还 可 保 护 细 胞 膜 PUFA 形 成 稳 定 的 化 合 物, 使 之 免 受 ROS 攻 击 [12] Uysal
[13] 等 研 究 表 明, 马 精 液 中 加 入 GSH 后, 精 子 的 抗 氧 化 能 力 明 显 增 强 本 研 究 结 果 表 明, 基 础 液 中 加 入 1mmol/L 的 GSH, 精 子 活 率 显 著 优 于 其 他 剂 量, 且 Modena 的 保 存 效 果 比 BTS 好 可 能 是 因 为 随 着 精 液 保 存 时 间 的 延 长, 精 子 代 谢 产 生 大 量 的 酸 性 产 物, 不 利 于 猪 精 液 的 常 温 保 存 Modena 含 有 碳 酸 氢 钠 柠 檬 酸 钠 Tris 等 缓 冲 剂, 可 以 很 好 维 持 猪 稀 释 精 液 的 PH 值, 保 证 精 子 活 率, 而 BTS 缺 少 可 以 缓 解 精 子 代 谢 性 酸 中 毒 的 产 物 [14], 从 而 导 致 BTS 的 维 持 精 液 酸 碱 稳 定 的 能 力 比 Modena 差, 因 而 精 子 活 率 和 有 效 保 存 时 间 没 有 Modena 好 随 着 精 液 保 存 时 间 的 延 长, 精 液 内 环 境 发 生 变 化, 抑 制 了 精 子 内 抗 氧 化 酶 对 ROS 的 消 除 作 用, 过 多 的 ROS 作 用 于 精 子 质 膜 上 的 多 不 饱 和 脂 肪 酸 (PUFA), 使 质 膜 发 生 脂 质 过 氧 化 (LOP) [15], 损 伤 精 子 膜, 降 低 精 子 质 量 Watson [16] 研 究 表 明,LOP 是 降 低 精 子 活 率 重 要 原 因 之 一 MDA 是 LOP 的 终 产 物 之 一, 其 含 量 与 LOP 程 度 成 正 相 关 [8] SOD 作 为 抗 氧 化 酶 系 统 最 重 要 的 酶, 可 将 细 胞 内 的 O 2 - 变 成 H 2 O 2, 其 活 力 代 表 精 液 抗 LOP 的 能 力 [17] 本 试 验 显 示, 当 添 加 1mmol/L 的 GSH 可 以 显 著 增 强 精 子 内 SOD 活 力, 降 低 精 子 LOP 程 度, MDA 含 量 最 低 但 当 GSH 添 加 量 逐 渐 增 加 时,SOD 活 力 反 而 降 低 而 MDA 含 量 增 加, 这 是 可 能 随 着 SOD 活 力 增 强 产 生 的 H 2 O 2 逐 渐 增 多, 致 使 精 液 抗 氧 化 系 统 无 法 及 时 清 除, 使 得 精 子 LOP 程 度 增 强, 同 时 氧 化 产 物 MDA H 2 O 2 增 加, 精 子 受 到 损 伤, 活 率 降 低 4 结 论 在 猪 常 温 保 存 的 稀 释 精 液 中 加 入 1mmol/L 的 GSH 时, 能 够 提 高 精 子 活 率, 延 长 精 子 有 效 保 存 时 间, 降 低 精 子 质 膜 脂 质 过 氧 化 损 伤, 改 善 猪 精 液 常 温 保 存 效 果 猪 精 液 常 温 保 存 稀 释 剂 Modena 比 BTS 精 子 有 效 保 存 时 间 更 长, 精 子 活 率 更 好 参 考 文 献 ( 略 )