4796 ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online) 研 发 前 沿 (diethylmitrosamine, DEN),,,. - -,, (diethylmitrosamine, DEN),,,. DEN,. 仓 鼠 1 只, 44 wk 处 死

wcjd@wjgnet.com 2014 11 8 ; 22(31): 4795-4799 ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online) RAPID COMMUNICATION DEN 诱 导 仓 鼠 肝 癌 模 型 的 建 立 及 其 异 种 成 瘤 性 incidence rate of liver cancer was 66.7% (8/12). The rate of xenograft tumor formation in nude mice was 62.5% (5/8). CONCLUSION: A hamster model of DEN induced hepatocellular carcinoma has been established successfully, and the incidence of hepatocellular carcinoma is high. This model can be used as a new and dynamic animal model. Establishment of a hamster model of diethylnitrosamine induced hepatocellular carcinoma Wan Zhao, Rong-Gan Liang, Qing Xu Wan Zhao, Rong-Gan Liang, Qing Xu, Department of Pharmacology, Guilin Medical College, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 81260354 Correspondence to: Qing Xu, Professor, Department of Pharmacology, Guilin Medical College, 109 Huancheng Second North Road, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. xq5895801@163.com Received: 2014-08-11 Revised: 2014-09-05 Accepted: 2014-09-17 Published online: 2014-11-08 2014 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved. Key Words: Diethylmitrosamine; hepatocellular carcinoma; Animal model Zhao W, Liang RG, Xu Q. Establishment of a hamster model of diethylnitrosamine induced hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2014; 2 2 ( 3 1 ) : 4 7 9 5-4 7 9 9 U R L : h t t p : / / w w w. w j g n e t. com/1009-3079/22/4795.asp DOI: http://dx.doi. org/10.11569/wcjd.v22.i31.4795 目 的 : (diethylmitrosamine, DEN). 背 景 资 料,,. Abstract AIM: To establish a hamster model of diethylnitrosamine (DEN) induced hepatocellular carcinoma. METHODS: Twenty-four hamsters, weighing from 70 to 100 g, were randomly divided into either an experimental group (n = 12) or a control group (n = 12). The experimental group was injected with DEN via the abdominal cavity and simultaneously administered DEN in drinking water. In the control group, DEN was replaced with normal saline. Pathological morphology was observed after HE staining. RESULTS: Pathology results confirmed that hepatocellular carcinoma was successfully induced in 8 hamsters of the experimental group, and the 方 法 : 70-100 g 24, (n = 12) (n = 12), DEN,, HE. 结 果 :, 66.7%(8/12). 62.5%(5/8). 结 论 : DEN,,, 同 行 评 议 者,, 2014 WCJD www.wjgnet.com 2014-11-08 Volume 22 Issue 31

4796 ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online) 研 发 前 沿 (diethylmitrosamine, DEN),,,. - -,, (diethylmitrosamine, DEN),,,. DEN,. 仓 鼠 1 只, 44 wk 处 死 所 有 仓 鼠. URL: http://www.wjgnet.com/1009-3079/22/4795.asp DOI: http://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v22.i31.4795 0 引 言 肝 癌 是 我 国 最 常 见 的 消 化 系 恶 性 肿 瘤, 具 有 发 病 隐 匿 病 程 短 死 亡 率 高 等 特 点 [1]. 肝 癌 动 物 模 型 是 研 究 肝 癌 的 发 生 发 展 及 治 疗 的 基 础. 目 前 已 报 道 的 肝 癌 模 型 有 自 发 性 诱 发 性 及 移 植 性 等. 其 中, 化 学 致 癌 剂 诱 发 的 动 物 模 型 癌 变 过 程 具 有 多 阶 段 多 步 骤 的 特 点, 与 人 类 肝 癌 形 成 的 过 程 相 仿, 为 动 态 研 究 肝 癌 的 发 生 转 移 及 治 疗 提 供 了 理 想 的 平 台. 此 类 肝 癌 模 型 常 用 动 物 为 大 鼠 及 小 鼠, 也 有 应 用 其 他 动 物 ( 豚 鼠 兔 旱 獭 恒 河 猴 ) 诱 发 肝 癌 的 报 道 [2]. 仓 鼠 (Syrian Hamster, 叙 利 亚 金 色 仓 鼠 ) 在 形 态 学 生 物 学 以 及 免 疫 学 等 方 面 与 人 有 相 似 之 处 [3], 可 用 [4] 于 制 作 人 类 肿 瘤 等 多 种 疾 病 的 动 物 模 型. Chen [5] 等 通 过 皮 下 注 射 和 饮 用 二 乙 基 亚 硝 胺 (diethylmitrosamine, DEN) 水 溶 液 诱 发 具 转 移 性 的 仓 鼠 诱 发 性 肝 癌 模 型, 但 其 诱 导 成 瘤 率 较 低 且 造 模 动 物 死 亡 率 较 高. 本 研 究 通 过 腹 腔 注 射 和 饮 用 DEN 水 溶 液 诱 导 仓 鼠 诱 发 性 肝 癌 模 型, 探 讨 仓 鼠 肝 脏 病 变 的 形 态 学 演 变 过 程 及 其 异 种 成 瘤 性, 现 将 结 果 报 道 如 下. 药 3 d, 连 续 3 wk. 第 4 周 起 给 予 0.01% 的 DEN 水 溶 液 ( 蒸 馏 水 配 制 ), 自 由 饮 水. 对 照 组 给 予 等 剂 量 的 生 理 盐 水 腹 腔 注 射 及 蒸 馏 水 自 由 饮 水. 每 日 观 察 动 物 的 一 般 情 况 ( 精 神 饮 食 毛 色 及 活 动 等 ), 如 动 物 出 现 精 神 萎 靡, 活 动 减 少 及 饮 食 减 少, 体 质 量 下 降 等 情 况, 暂 停 给 药, 好 转 后 再 继 续 给 药. 分 别 在 11 23 34 37 wk 处 死 实 验 组 1.2.2 : 1% 戊 巴 比 妥 钠 麻 醉 后 除 去 腹 部 被 毛 消 毒 开 腹, 肉 眼 观 察 肝 脏 病 变 后, 确 认 有 肿 块 形 成 者 处 死 动 物, 摘 取 肝 脏 固 定 于 40 g/l 中 性 甲 醛 溶 液 中, 24 h 后 进 行 常 规 石 蜡 包 埋 切 片, HE 染 色 并 观 察 拍 照. 如 动 物 自 然 死 亡, 处 理 方 法 同 上. 1.2.3 : 35 wk 后 仓 鼠 肝 脏 形 成 明 显 肿 瘤, 分 离 肿 瘤, 取 鱼 肉 状 瘤 组 织, 切 成 1.0 mm 3 大 小 备 用 ; 裸 鼠 8 只, 体 质 量 18 g± 2 g, 适 应 性 饲 养 3 d, 0.1% 戊 巴 比 妥 钠 100 mg/kg 腹 腔 注 射 麻 醉, 消 毒, 在 剑 突 下 沿 腹 正 中 线 做 长 1 cm 切 口 ; 用 手 指 挤 压 裸 鼠 腹 腔, 挤 出 一 叶 肝 脏, 用 手 术 刀 片 于 肝 脏 接 种 部 位 以 30 度 做 一 斜 切 口 : 0.5 cm( 宽 ) 0.5 cm( 深 ); 用 镊 子 将 1.0 mm 3 大 小 的 瘤 组 织 植 入 切 口, 消 毒 棉 签 轻 压 切 口 止 血 固 定, 常 规 缝 合 关 腹. 全 程 均 为 无 菌 操 作. 1.2.4 : 手 术 后 12 wk, 处 死 裸 鼠, 开 腹, 肉 眼 观 察 肝 脏 病 变 后, 摘 取 肝 脏 固 定 于 40 g/l 中 性 甲 醛 溶 液 中, 24 h 后 进 行 石 蜡 包 埋 切 片, HE 染 色 并 观 察 拍 照. 计 量 资 料 用 mean±sd 表 示, 采 用 SPSS19.0 软 件 进 行 统 计 分 析, 检 验 方 法 采 用 One-way ANOVA 分 析 和 t 检 验. P <0.05 为 差 异 有 统 计 学 意 义. 相 关 报 道 D E N,,. 1 材 料 和 方 法 1.1 SPF 级 叙 利 亚 仓 鼠, 由 上 海 斯 莱 克 实 验 动 物 有 限 公 司 提 供 ; 裸 鼠, 由 广 西 医 科 大 学 动 物 实 验 中 心 提 供 ; DEN, 纯 度 99.9%, 美 国 Sigma 公 司 产 品 ( 批 号 : 1019827361). 1.2 1.2.1 : 仓 鼠 24 只, 3 wk, 体 质 量 70-100 g, 雌 雄 各 半, 分 笼 饲 养, 标 准 饲 料 喂 养, 定 期 更 换 垫 料, 适 应 性 饲 养 3 d, 采 用 完 全 随 机 分 实 验 组 (n = 12, 雌 雄 各 半 ) 和 对 照 组 (n = 12, 雌 雄 各 半 ). 实 验 组 : 按 10 mg/kg 给 予 腹 腔 注 射 DEN 水 溶 液 ( 生 理 盐 水 配 制 ), 每 周 连 续 给 2 结 果 2.1 实 验 开 始 时, 仓 鼠 进 食 饮 水 好, 好 活 动, 背 毛 柔 顺 有 光 泽. 诱 癌 6 wk 后, 实 验 组 仓 鼠 进 食 量 下 降, 行 动 迟 缓, 体 质 量 较 对 照 组 增 长 缓 慢, 停 用 DEN 溶 液, 第 8 周 仓 鼠 一 般 情 况 好 转 重 新 开 始 喂 食 DEN 溶 液. 诱 癌 7 wk 时, 实 验 组 开 始 出 现 死 亡, 未 见 尸 体, 死 前 体 质 量 未 见 明 显 减 轻, 考 虑 为 仓 鼠 互 斗 互 食. 第 13 周, 死 亡 1 只, 解 剖 时 见 少 量 腹 水, 肝 脏 肿 大, 表 面 不 光 滑. 第 17 周, 死 亡 数 量 最 多, 共 3 只, 解 剖 时 已 可 见 到 肝 脏 有 大 小 不 等 的 白 色 结 节. 44 wk 处 死 所 有 仓 鼠, 实 验 组 肝 癌 发 生 率 为 66.7%(8/12); 对 照

4797 A 创 新 盘 点 DEN,,. 图 1 形 成. 仓 鼠 肝 脏 表 面 形 成 大 小 不 等 的 结 节, 并 有 明 显 肿 物 B 组 无 肝 癌 发 生. 统 计 实 验 组 死 亡 率 33.3%(4/12), 对 照 组 死 亡 率 25%(3/12). 2.2 诱 癌 开 始 时, 实 验 组 仓 鼠 体 质 量 与 对 照 组 无 明 显 差 异 (P >0.05); 15 wk 时, 实 验 组 仓 鼠 体 质 量 较 对 照 组 增 长 缓 慢, 但 仍 无 明 显 差 异 (P >0.05); 30 wk 时, 实 验 组 明 显 低 于 对 照 组 (P<0.05). 2.3 实 验 组 仓 鼠 在 第 1-13 周, 死 亡 及 处 死 仓 鼠 肝 脏 肉 眼 观 病 变 不 明 显. 第 14-24 周, 肝 脏 肿 大, 表 面 粗 糙, 肝 脏 已 出 现 小 米 粒 大 小 淡 黄 色 斑 点. 第 25-44 周, 肝 脏 肿 大, 表 面 粗 糙, 肉 眼 可 见 直 径 0.2-1.5 cm 大 小 的 灰 白 色 癌 结 节 ( 图 1). 肝 脏 质 地 变 脆, 癌 结 节 质 硬, 内 部 可 见 坏 死. 其 中 3 只 出 现 腹 水. 2.4 对 照 组 仓 鼠 肝 小 叶 结 构 完 整, 肝 细 胞 索 排 列 整 齐. 实 验 组 肝 脏 病 变 大 致 可 分 为 3 期. 第 1-13 周 为 肝 硬 变 前 期 : 肝 小 叶 结 构 完 整, 但 可 见 坏 死 灶 内 炎 性 细 胞 浸 润 并 可 见 肝 细 胞 嗜 酸 性 变 ; 第 14-23 周 为 肝 硬 变 期 : 正 常 肝 小 叶 结 构 破 坏, 由 广 泛 增 生 的 纤 维 组 织 将 肝 小 叶 分 割 包 绕 成 大 小 不 等 的 圆 形 肝 细 胞 团, 可 见 典 型 的 假 小 叶 结 构. 假 小 叶 内 肝 细 胞 索 排 列 紊 乱, 小 叶 中 央 静 脉 缺 如 ; 第 24-44 周 为 癌 变 期 : 出 现 肝 癌, 癌 细 胞 呈 现 多 形 性, 异 型 性 明 显, 细 胞 核 增 大, 胞 质 少, 嗜 碱 性, 可 见 较 多 病 理 核 分 裂 象 畸 形 核 及 多 核 巨 细 胞 ( 图 2). 2.5 裸 鼠 于 接 种 手 术 后 6 wk 出 现 疑 似 肿 块 生 长, 第 9 周 时 已 有 明 显 肿 块 形 成, 第 12 周 时 处 死 所 有 裸 鼠. 移 植 瘤 形 成 率 62.5%(5/8), 无 死 亡. 2.6 处 死 裸 鼠, 开 腹, 见 肝 脏 表 面 光 滑, 可 见 明 显 肿 块 形 成, 肿 块 与 周 围 组 织 界 限 清 楚 ( 图 3). 病 理 检 查 确 认 为 C D 图 2 仓 鼠 肝 脏 病 理 变 化 过 程 (HE 200). 移 植 性 肝 癌 ( 图 4). 3 讨 论 诱 发 性 肝 癌 模 型 在 肿 瘤 基 础 研 究 致 癌 物 质 促

4798 ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online) 应 用 要 点,. A B 图 3 裸 鼠 移 植 瘤 肉 眼 观. 癌 作 用 研 究 临 床 中 的 诊 断 和 治 疗 以 及 影 像 学 检 查 方 面 是 不 可 替 代 的, 而 且 广 泛 被 应 用 于 从 多 角 度 研 究 肝 癌 的 发 生 发 展 规 律 及 分 子 机 制. DEN 具 有 很 强 的 化 学 毒 性, 所 含 的 亚 硝 胺 基 具 有 中 毒 剂 和 诱 癌 剂 的 双 重 效 应 [6], 而 且 DEN 诱 发 的 肿 瘤 多 为 肝 细 胞 癌, 与 人 类 肝 细 胞 癌 较 为 相 似 [7]. DEN 诱 发 肝 癌 模 型 的 特 点 是 成 功 率 高, 对 肝 脏 专 一, 肝 细 胞 癌 所 占 比 例 大, 是 迄 今 应 用 最 广 泛 的 一 种 化 学 性 药 物 诱 发 肝 癌 模 型 [8]. 本 实 验 图 4 裸 鼠 移 植 瘤 (HE 200). 通 过 实 验 组 不 同 时 间 的 仓 鼠 肝 脏 病 理 学 检 查 发 Atroch A, Moreno FS, Dagli ML. Protective effects 现 病 理 过 程 分 3 个 阶 段 : 诱 癌 早 期 第 1-13 周 表 现 of guarana (Paullinia cupana Mart. var. Sorbilis) 为 中 毒 性 肝 炎 ; 第 14-23 周 为 肝 硬 变 期 ; 第 24-44 against DEN-induced DNA damage on mouse [9-15] 周 为 癌 变 期. 与 相 关 报 道 的 基 本 一 致, 经 历 肝 liver. Food Chem Toxicol 2006; 44: 862-867 [PMID: 16406177] 炎 肝 硬 化 阶 段 进 而 形 成 肝 癌, 很 好 的 模 拟 了 5 Chen G, Dai ZK, Liang RG, Xiao SJ, He SQ, Zhao 人 类 肝 癌 的 发 生 发 展 过 程. 因 仓 鼠 对 环 境 要 求 较 高, 且 生 性 好 斗, 饲 养 时 经 验 不 足, 造 成 对 照 组 仓 鼠 出 现 死 亡. 实 验 需 要 注 意 下 列 方 面 : (1) 动 物 的 选 择 : 根 据 我 们 的 实 验 结 果 提 示, 应 选 择 3-4 wk 的 仓 鼠, 雌 雄 成 瘤 率 无 明 显 差 别 ; (2) 仓 鼠 饲 养 : 仓 鼠 生 性 好 斗, 每 笼 动 物 不 能 过 多, 2-3 只 为 HL, Xu Q. Characterization of diethylnitrosamineinduced liver carcinogenesis in Syrian golden hamsters. Exp Ther Med 2012; 3: 285-292 [PMID: 22969883] 6 Okubo H, Moriyama M, Tanaka N, Arakawa Y. Detection of serum and intrahepatic hepatocyte growth factor during DEN-induced carcinogenesis in the rat. Hepatol Res 2002; 24: 385-394 [PMID: 12479937 DOI: 10.1016/S1386-6346(02)00143-2] 佳, 勤 换 垫 料, 防 止 动 物 生 病. 本 模 型 操 作 方 法 简 便, 周 期 较 短, 诱 癌 23 wk 以 后, 病 理 结 果 证 实 7 2000; 7: 561-563 仓 鼠 已 经 形 成 肝 癌, 并 且 所 形 成 的 肿 瘤 有 很 好 8 Yoshiji H, Yoshii J, Ikenaka Y, Noguchi R, Tsujinoue H, Nakatani T, Imazu H, Yanase K, Kuriyama 的 异 种 成 瘤 性, 为 肝 癌 的 诊 断 和 治 疗 提 供 了 新 S, Fukui H. Inhibition of renin-angiotensin system 的 实 验 平 台. attenuates liver enzyme-altered preneoplastic lesions 4 参 考 文 献 and fibrosis development in rats. J Hepatol 2002; 37: 22-30 [PMID: 12076858 DOI: 10.1016/ S0168-8278(02)00104-6] 1 DEN 9 Qian Y, Ling CQ. Preventive effect of Ganfujian 2010; 35: granule on experimental hepatocarcinoma in rats. 1843-1846 World J Gastroenterol 2004; 10: 755-757 [PMID: 2 14991955] 2001; 18: 479-480 10 3 van der Weyden L, Bradley A. Mouse chromosome engineering for modeling human disease. DEN 2005; 12: 806-808 Annu Rev Genomics Hum Genet 2006; 7: 247-276 [PMID: 16824018 DOI: 10.1146/annurev.genom.7.080505.115741] 11 DEN PLCε 2013; 23: 17-20 4 Fukumasu H, Avanzo JL, Heidor R, Silva TC, 12

4799 C3H/HeN 14 同 行 评 价 2012; 36: 543-547 DEN 13 Kawaguchi T, Nomura K, Hirayama Y, Kitagawa 2009; 17: 1827-1831, T. Establishment and characterization of a chicken 15 hepatocellular carcinoma cell line, LMH. Cancer Res,, 1987; 47: 4460-4464 [PMID: 3607775] 2004; 12: 563-566, DEN, 20 70-80,,. ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online) DOI: 10.11569 2014 年 版 权 归 百 世 登 出 版 集 团 有 限 公 司 所 有 世 界 华 人 消 化 杂 志 外 文 字 符 标 准 消 息 本 刊 讯 本 刊 论 文 出 现 的 外 文 字 符 应 注 意 大 小 写 正 斜 体 与 上 下 角 标. 静 脉 注 射 iv, 肌 肉 注 射 im, 腹 腔 注 射 ip, 皮 下 注 射 sc, 脑 室 注 射 icv, 动 脉 注 射 ia, 口 服 po, 灌 胃 ig. s( 秒 ) 不 能 写 成 S, kg 不 能 写 成 Kg, ml 不 能 写 成 ML, lcpm( 应 写 为 1/min) E%( 仪 器 效 率 ) 60 = Bq, ph 不 能 写 PH 或 P H, H pylori 不 能 写 成 HP, T1/2 不 能 写 成 tl/2 或 T, V max 不 能 Vmax, µ 不 写 为 英 文 u. 需 排 斜 体 的 外 文 字, 用 斜 体 表 示. 如 生 物 学 中 拉 丁 学 名 的 属 名 与 种 名, 包 括 亚 属 亚 种 变 种. 如 幽 门 螺 杆 菌 (Helicobacter pylori, H.pylori ), Ilex pubescens Hook, et Arn.var.glaber Chang( 命 名 者 勿 划 横 线 ); 常 数 K ; 一 些 统 计 学 符 号 ( 如 样 本 数 n, 均 数 mean, 标 准 差 SD, F 检 验, t 检 验 和 概 率 P, 相 关 系 数 r ); 化 学 名 中 标 明 取 代 位 的 元 素 旋 光 性 和 构 型 符 号 ( 如 N, O, P, S, d, l ) 如 n -(normal, 正 ), N -(nitrogen, 氮 ), o -(ortho, 邻 ), O -(oxygen, 氧, 习 惯 不 译 ), d -(dextro, 右 旋 ), p -(para, 对 ), 例 如 n -butyl acetate( 醋 酸 正 丁 酯 ), N -methylacetanilide(n- 甲 基 乙 酰 苯 胺 ), o -cresol( 邻 甲 酚 ), 3-O -methyl-adrenaline(3-o- 甲 基 肾 上 腺 素 ), d -amphetamine( 右 旋 苯 丙 胺 ), l -dopa( 左 旋 多 巴 ), p -aminosalicylic acid( 对 氨 基 水 杨 酸 ). 拉 丁 字 及 缩 写 in vitro, in vivo, in situ ; Ibid, et al, po, vs ; 用 外 文 字 母 代 表 的 物 理 量, 如 m ( 质 量 ), V ( 体 积 ), F ( 力 ), p ( 压 力 ), W ( 功 ), v ( 速 度 ), Q ( 热 量 ), E ( 电 场 强 度 ), S( 面 积 ), t ( 时 间 ), z ( 酶 活 性, kat), t ( 摄 氏 温 度, ), D ( 吸 收 剂 量, Gy), A ( 放 射 性 活 度, Bq), ρ( 密 度, 体 积 质 量, g/l), c ( 浓 度, mol/l), j( 体 积 分 数, ml/l), w ( 质 量 分 数, mg/g), b ( 质 量 摩 尔 浓 度, mol/g), l ( 长 度 ), b ( 宽 度 ), h ( 高 度 ), d ( 厚 度 ), R ( 半 径 ), D ( 直 径 ), T max, C max, V d, T 1/2 CI 等. 基 因 符 号 通 常 用 小 写 斜 体, 如 ras, c-myc ; 基 因 产 物 用 大 写 正 体, 如 P16 蛋 白.