中 国 农 学 通 报 00,6(3):48-5 Chinese Agricultural Science Bulletin 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 提 取 方 法 的 比 较 及 ISSR-PCR 体 系 的 优 化 吴 田, 蓝 增 全 ( 西 南 林 业 大 学 园 林 学 院, 昆 明 6504; 西 南 林 业 大 学 环 科 系, 昆 明 6504) 摘 要 : 对 4 种 基 因 组 DNA 提 取 方 法 进 行 比 较, 得 到 一 种 效 率 较 高 的 且 适 用 于 葡 萄 柚 ISSR-PCR 的 DNA 提 取 方 法 同 时, 采 用 正 交 设 计 对 影 响 葡 萄 柚 ISSR-PCR 的 因 子 进 行 优 化 实 验 结 果 表 明, 改 良 的 SDS 法 提 取 的 基 因 组 DNA 最 适 宜 进 行 葡 萄 柚 的 ISSR-PCR 扩 增 ISSR-PCR 产 物 在 % 琼 脂 糖 凝 胶 上 检 测, 发 现 PCR 扩 增 的 平 均 条 带 数 为.7 条 葡 萄 柚 的 最 优 ISSR-PCR 反 应 体 系 为 :0 μl 总 体 积 中 含 有 buffer(mg + ),0. mmol/l dntps,0. μmol/l 引 物,0.3 U Taq DNA 聚 合 酶,5 ng DNA 模 板 关 键 词 : 葡 萄 柚 ;DNA 提 取 方 法 ; 正 交 设 计 ;ISSR-PCR 中 图 分 类 号 :S88 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :00-68 Comparison of Genomic DNA Extraction Method and Optimization of ISSR-PCR Amplification for Grapefruit Wu Tian, Lan Zengquan ( Key Laboratory of Landscape Plants and Ornamental Horticulture, Southwest Forestry University, Kunming 6504; Environment Science and Engineering Department, Southwest Forestry University, Kunming 6504) Abstract: An efficient genomic DNA extraction method useful for ISSR-PCR of grapefruit was selected by comparing four DNA extraction methods. Meanwhile, the factors influencing ISSR-PCR for grapefruit were optimized by orthogonal design. The results showed that improved SDS method was suitable for ISSR-PCR amplification. The average amplified bands were.7 which were detected in % agarose. The optimum amplification condition of ISSR-PCR was including 5 ng DNA template, 0. mmol/l dntps, 0. μmol/l primer, 0.3 U Taq DNA polymerase and buffer (Mg + ) in 0 μl reaction volumes. Key words: grapefruit; genomic DNA isolation method; orthogonal design; ISSR-PCR 0 引 言 葡 萄 柚 (Citrus paradisi Macf.) 又 称 西 柚 胡 柚, 芸 香 科 (Rutaceae) 柑 橘 属 (Citrus) 植 物, 原 产 西 印 度 群 岛, 是 一 种 常 绿 性 的 小 乔 木, 目 前 以 美 国 栽 植 最 多 [] 由 于 果 实 在 树 体 上 悬 挂 成 串, 簇 生 如 葡 萄, 所 以 被 称 为 葡 萄 柚 [] 葡 萄 柚 含 有 丰 富 的 营 养 成 分, 是 集 预 防 疾 病 及 保 健 与 美 容 于 一 身 的 水 果 葡 萄 柚 果 肉 柔 嫩, 多 [3] 汁 爽 口, 略 有 香 气, 味 偏 酸 带 苦 味 及 麻 舌 味 约 940 年 前 后, 葡 萄 柚 被 引 入 中 国 试 种, 由 于 早 期 葡 萄 柚 味 苦 偏 酸, 不 符 合 中 国 消 费 者 的 口 味, 且 未 充 分 认 识 和 掌 握 葡 萄 柚 的 营 养 价 值 特 性 及 栽 培 技 术, 产 量 不 高, 效 益 低, 在 中 国 只 是 零 星 栽 培, 无 规 模 生 产, 商 品 量 [4] 基 本 处 于 空 白 状 态 随 着 新 品 种 果 实 风 味 口 感 的 改 善 和 人 们 对 葡 萄 柚 营 养 价 值 认 识 的 提 高, 葡 萄 柚 逐 [5] 渐 为 中 国 消 费 者 所 接 受 因 此, 近 年 来 中 国 南 方 不 [6-7] 少 地 方 相 继 开 展 了 葡 萄 柚 新 品 种 的 引 种 试 验 云 南 省 于 00 年 初 次 从 美 国 引 进 了 葡 萄 柚 品 种 [8-] ( 品 系 ), 并 开 展 了 相 关 研 究 目 前, 引 进 葡 萄 柚 的 基 金 项 目 : 国 家 林 业 局 948 项 目 多 功 能 诺 丽 良 种 及 其 配 套 栽 培 技 术 引 进 (007-4-08); 西 南 林 业 大 学 校 大 型 仪 器 设 备 共 享 基 金 (SWFU009) 第 一 作 者 简 介 : 吴 田, 女,980 年 生, 讲 师, 博 士, 主 要 从 事 植 物 生 物 技 术 及 分 子 生 物 学 方 面 的 研 究 通 讯 地 址 :6504 云 南 省 昆 明 市 盘 龙 区 白 龙 寺 300 号, 西 南 林 业 大 学 园 林 学 院 40 号 信 箱,Tel:087-386056,E-mail:wutianpotato@gmail.com 通 讯 作 者 : 蓝 增 全, 男,963 年 生, 硕 士, 教 授, 主 要 从 事 生 态 学 和 植 物 学 方 向 的 研 究 通 信 地 址 :6504 云 南 省 昆 明 市 盘 龙 区 白 龙 寺 300 号, 西 南 林 业 大 学 环 科 系,Tel:087-386406,E-mail:46577@qq.com 收 稿 日 期 :00-09-06, 修 回 日 期 :00-09-8
吴 田 等 : 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 提 取 方 法 的 比 较 及 ISSR-PCR 体 系 的 优 化 49 品 种 基 因 资 源 的 研 究 尚 少, 所 使 用 的 标 记 主 要 集 中 在 AFLP [5] 和 SSR [] 目 前, 有 关 适 用 于 葡 萄 柚 ISSR 标 记 的 基 因 组 DNA 提 取 方 法 未 见 报 道 ISSR 标 记 (inter-simple sequence repeats) 是 采 用 7~ 碱 基 的 重 复 锚 定 引 物 扩 增 重 复 之 间 的 片 段, 操 作 简 单 重 复 [3] 性 好 多 态 性 丰 富, 且 一 套 ISSR 引 物 可 在 多 种 作 物 中 通 用, 利 用 率 高, 在 遗 传 关 系 研 究 方 面 的 应 用 前 景 更 [4] 广 阔 基 因 组 DNA 提 取 是 ISSR 分 子 标 记 技 术 极 为 [5] 重 要 的 上 游 工 作 本 实 验 拟 进 行 相 关 研 究, 并 对 葡 萄 柚 ISSR-PCR 扩 增 体 系 优 化 进 行 研 究, 为 葡 萄 柚 品 种 的 进 一 步 开 发 利 用 遗 传 改 良 和 新 品 种 培 育 提 供 理 论 基 础 材 料 与 方 法. 材 料 葡 萄 柚 品 种 为 西 南 林 业 大 学 00 年 从 美 国 引 进 的 星 路 比, 种 植 于 校 实 验 基 地 内 选 无 病 虫 害 的 葡 萄 柚 嫩 叶, 洗 净 后 用 吸 水 纸 擦 干 并 用 液 氮 速 冻, 置 于 -70 冰 箱 备 用. 主 要 试 剂 CTAB 抽 提 缓 冲 液 :00 mmol/l Tris-HCl(pH 8.0), 0 mmol/l EDTA(pH 8.0),350 mmol/l NaCl,3% CTAB,% β- 巯 基 乙 醇 SDS 抽 提 缓 冲 液 :00 mmol/l Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol/l EDTA(pH 8.0), mmol/l NaCl,3% SDS,% β- 巯 基 乙 醇 本 实 验 所 使 用 的 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯.3 方 法 称 取 保 存 于 -70 冰 箱 葡 萄 柚 叶 片 于 液 氮 中 迅 速 研 成 粉 末, 取 约 0. mg 转 入.0 ml 离 心 管 中, 分 别 用 下 列 方 法 提 取 DNA.3. CTAB 法 () 加 入 ml 65 的 CTAB 抽 提 缓 冲 液, 混 匀, 65 水 浴 h;()7000 r/min 离 心 0 min, 取 上 清 液, 转 入 另 一 离 心 管 中, 加 入 等 体 积 氯 仿 : 异 戊 醇 (4:) 混 合 液, 充 分 混 匀, 至 水 相 由 绿 色 变 为 无 色 ;(3)0 r/min 离 心 0 min, 取 上 清 液, 转 入 另 一 离 心 管 中, 加 入 倍 体 积 -0 预 冷 的 无 水 乙 醇, 轻 柔 混 匀 ;(4)0 r/min 离 心 0 min, 将 上 清 液 缓 慢 倒 出, 用 75% 乙 醇 浸 泡 沉 淀 h 后 在 超 净 工 作 台 吹 干 至 无 酒 精 味, 溶 于 适 量 TE 缓 冲 液.3. 改 良 的 CTAB 法 加 入 ml CTAB 提 取 介 质, 混 匀,65 水 浴 h, 放 至 室 温, 加 300 μl NaAc(pH 4.8), 混 匀, 后 续 步 骤 同.3..3.3 SDS 法 () 加 入 ml 65 的 SDS 抽 提 缓 冲 液, 混 匀,65 水 浴 h;() 放 至 室 温, 加 300 μl KAc(pH 4.8), 混 匀, 7000 r/min 离 心 0 min, 取 上 清 液, 转 入 另 一 离 心 管 中, 加 入 倍 体 积 -0 预 冷 的 无 水 乙 醇, 轻 柔 混 匀 ;(3) 0 r/min 离 心 0 min, 将 上 清 液 缓 慢 倒 出, 用 75% 乙 醇 浸 泡 沉 淀 h 后 在 超 净 工 作 台 吹 干 至 无 酒 精 味, 溶 于 适 量 TE 缓 冲 液.3.4 改 良 的 SDS 法 () 加 入 ml 65 的 SDS 抽 提 缓 冲 液, 混 匀,65 水 浴 h;() 放 至 室 温, 加 300 μl KAc(pH 4.8), 混 匀, 7000 r/min 离 心 0 min, 取 上 清 液, 转 入 另 一 离 心 管 中, 加 入 等 体 积 氯 仿 : 异 戊 醇 (4:) 混 合 液, 充 分 混 匀, 至 水 相 由 绿 色 变 为 无 色 ;(3)0 r/min 离 心 0 min, 取 上 清 液, 转 入 另 一 离 心 管 中, 加 入 倍 体 积 -0 预 冷 的 无 水 乙 醇, 轻 柔 混 匀 ;(4)0 r/min 离 心 0 min, 将 上 清 液 缓 慢 倒 出, 用 75% 乙 醇 浸 泡 沉 淀 h 后 在 超 净 工 作 台 吹 干 至 无 酒 精 味, 溶 于 适 量 TE 缓 冲 液.4 基 因 组 DNA OD 值 检 测 取 3 μl DNA 样 品 用 超 微 量 分 光 光 度 计 (NanoVue, 英 国 ) 测 定 A 60/A 80 A 60/A 30 和 DNA 样 品 浓 度.5 电 泳 检 测 取 5 μl DNA 样 品 与 3 μl 上 样 缓 冲 液 混 匀 后 点 样 于 % 琼 脂 糖 胶 孔,0 V 电 压 下 电 泳 0 min, 溴 化 乙 锭 (EB) 染 色, 用 凝 胶 成 像 系 统 照 相, 保 存.6 ISSR-PCR 扩 增 根 据 British Columbia 大 学 ( 加 拿 大 ) 设 计 的 ISSR 引 物, 随 机 选 择 39 条 ( 表 ), 由 上 海 生 工 合 成 PCR 试 剂 均 购 自 TAKARA 公 司 ( 日 本 ) 原 初 PCR 反 应 液 体 系 为 0 μl, 含 有 buffer( 含 Mg + ),0. mmol/l dntps,0.5 μmol/l 引 物, U Taq DNA 聚 合 酶,30~ 50 ng DNA 模 板, 不 足 体 积 用 无 菌 超 纯 水 补 足 PCR 反 应 程 序 为 :94 5 min;94 30 s,53 45 s,7 90 s, 40 个 循 环 ;7 0 min 扩 增 产 物 在 TAE 缓 冲 系 统 下 用.0% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离,EB 染 色, 在 UVP 凝 胶 成 像 系 统 ( 美 国 ) 上 照 像 并 保 存.7 葡 萄 柚 ISSR-PCR 扩 增 反 应 体 系 的 优 化 ISSR-PCR 扩 增 反 应 体 系 的 优 化 按 常 规 采 用 单 因 素 试 验, 共 试 验 了 5 个 因 素 各 4 个 水 平 ( 表 ) 其 余 条 件 同.6 结 果 与 分 析. 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 的 提 取 电 泳 检 测 发 现 ( 图 片 未 显 示 ), 用 上 述 4 种 方 法 均 能 提 取 得 到 葡 萄 柚 基 因 组 DNA, 条 带 整 齐 无 弥 散 使 用 超 微 量 分 光 光 度 计 测 定 DNA 浓 度 ( 表 ), 结 果 表
50 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 表 本 研 究 中 所 用 引 物 866 (CTC)6 858 (TG)8RT 8 (GA)8A 8 (GA)8C 857 (AC)8YG 855 (AC)8YT 808 (AG)8C 80 (AT)8G 854 (TC)8RG 850 (GT)8YC 803 (AT)8C 805 (TA)8C 847 (CA)8RC 846 (CA)8RT 806 (TA)8G 84 (CT)8A 844 (CT)8RC 853 (TC)8RT 84 (TC)8G 834 (AG)8YT 860 (TG)8RA 87 (AC)8G 835 (AG)8YC 836 (AG)8YA 86 (AC)8C 85 (AC)8T 840 (GA)8YT 84 (GA)8YC 83 (TC)8C 88 (CA)8G 845 (CT)8RG 848 (CA)8RG 85 (CT)8G 84 (GA)8YG 895 AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC 856 (AC)8YA 88 (TG)8A 8 (TC)8A 900 ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA 表 ISSR 反 应 体 系 优 化 的 因 素 和 水 平 编 号 0 buffer(mg + )/μl DNTPs/(mmol/L) 引 物 /(μmol/l) DNA/ng Taq 酶 /U 0. 0..5 0. 0.5 0.5 5 0. 3 3 0.3 0.8 5 0.3 4 4 0.4 0 0.4 表 3 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 吸 光 值 测 定 结 果 方 法 A60/A80 A60/A30 DNA 浓 度 /(mg/ml) SDS 法.90.8 39 CTAB 法.93.63 350 改 良 的 SDS 法.935. 3658 改 良 的 CTAB 法.855.094 373 明 4 种 方 法 所 得 DNA 浓 度 均 在 3000 ng/μl 以 上, 表 明 上 述 4 种 方 法 在 葡 萄 柚 中 提 取 DNA 均 能 得 到 较 高 浓 度 此 外,A 60/A 80 比 值 均 在.8~.0 之 间,A 60/A 30 比 值 均 大 于.0, 表 明 所 提 取 DNA 样 品 较 为 纯 净. 葡 萄 柚 ISSR-PCR 扩 增 用 40 个 不 同 的 ISSR 引 物, 分 别 用 改 良 SDS 法 ( 图 ) 和 改 良 CTAB 法 ( 图 ) 得 到 的 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 为 模 板, 进 行 了 PCR 扩 增, 发 现 至 少 有 3 个 ISSR 引 物 能 扩 增 出 产 物, 且 用 改 良 的 SDS 法 提 取 的 DNA 为 模 板 所 跑 PCR 条 带 更 为 清 晰 稳 定 综 合. 的 实 验 结 果, 表 明 改 良 的 SDS 法 提 取 DNA 最 适 宜 进 行 葡 萄 柚 的 ISSR-PCR 扩 增 以 图 为 例, 进 行 条 带 统 计 ( 表 3), 发 现 PCR 产 物 在 % 琼 脂 糖 凝 胶 上 共 得 到 6 条 条 带, 每 条 引 物 的 扩 增 的 平 均 条 带 数 为.7 条 其 中, 引 物 846 M 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 6 7 8 9 0 3 50 00 M:DL;~3 泳 道 :ISSR 引 物 866 858 857 855 854 850 847 846 844 853 860 87 86 85 83 88 85 84 88 8 8 8 808 图 用 改 良 SDS 法 得 到 的 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 的 ISSR 扩 增
吴 田 等 : 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 提 取 方 法 的 比 较 及 ISSR-PCR 体 系 的 优 化 5 M 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 6 7 8 9 0 3 50 00 M:DL;~3 泳 道 :ISSR 引 物 866 858 857 855 854 850 847 846 844 853 860 87 86 85 83 88 85 84 88 8 8 8 808 图 用 改 良 CTAB 法 得 到 的 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 的 ISSR 扩 增 扩 增 出 6 条,808 8 均 能 扩 增 出 5 条, 表 明 ISSR 分 子 标 记 适 用 于 葡 萄 柚 此 外, 对 引 物 的 碱 基 重 复 进 行 分 析, 发 现 5 条 含 AC 重 复 4 条 含 TC 重 复 的 引 物 能 够 产 生 PCR 条 带, 而 4 条 含 AT 或 TA 重 复 的 引 物 均 不 能 产 生 PCR 条 带, 暗 示 着 葡 萄 柚 基 因 组 中 富 含 AC 及 TC 碱 基 重 复, 而 鲜 有 AT 或 TA 重 复.3 葡 萄 柚 ISSR-PCR 条 件 优 化 结 果 显 示 ( 图 3),DNA 用 量 在.5~0 ng Taq 酶 用 量 在 0.~0.4 U 引 物 浓 度 在 0.~ μmol/l 时 PCR 扩 增 结 果 无 差 异 ;0 buffer(mg + ) 终 浓 度 为 倍 时 最 合 适, 而 4 倍 时 无 条 带 ;dntps 用 量 为 0. mmol/l 时 PCR 扩 增 较 好, 而 用 量 为 0.5 mmol/l 时,PCR 无 扩 增 综 合 上 述 结 果, 考 虑 到 实 验 成 本, 葡 萄 柚 的 ISSR-PCR 的 最 优 体 系 为 0 μl PCR 反 应 液 体 系 中 含 有 buffer (Mg + ),0. mmol/l dntps,0. μmol/l 引 物,0.3 U Taq DNA 聚 合 酶,5 ng DNA 模 板 3 结 论 与 讨 论 本 研 究 对 CTAB 法 改 良 CTAB 法 SDS 法 和 改 良 SDS 法 等 4 种 方 法 提 取 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 的 效 果 进 行 了 比 较, 发 现 改 良 SDS 法 是 葡 萄 柚 基 因 组 DNA 提 M 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 6 7 8 9 0 50 00 M: 分 子 量 DL; 泳 道 ~4:buffer 终 浓 度 分 别 为 3 4 ; 泳 道 5~8:dNTPs 浓 度 分 别 为 0.5 0. 0.5 0.3 mmol/l; 泳 道 9~: 引 物 浓 度 分 别 为 0. 0.5 0.8.0 μmol/l; 泳 道 3~6:DNA 浓 度 分 别 为 0.5 5 5 0 ng; 泳 道 7~0:Taq 酶 的 用 量 分 别 为 0. 0. 0.3 0.4 U 图 3 PCR 各 条 件 因 子 对 葡 萄 柚 ISSR 扩 增 结 果 的 影 响 取 的 最 优 方 法 改 良 SDS 法 在 原 来 SDS 方 法 的 基 础 上 用 氯 仿 : 异 戊 醇 (4:) 混 合 液 进 行 提 纯, 极 大 程 度 地 去 除 了 蛋 白 质, 因 此, 所 提 取 的 DNA 较 为 纯 净, 更 适 用 于 后 续 的 ISSR 实 验 通 过 葡 萄 柚 ISSR-PCR 扩 增 和 条 件 优 化, 获 得 优 化 的 ISSR-PCR 体 系, 并 发 现 影 响 ISSR 结 果 的 最 重 要 因 素 是 基 因 组 DNA 的 质 量 有 3 条 引 物 能 够 产 生 扩 增 条 带, 引 物 的 平 均 扩 增 带 数 为.7 条, 扩 增 率 为 57.5%, 表 明 ISSR 分 子 标 记 适 用 于 葡 萄 柚 后 续 葡 萄 柚 资 源 分 析 实 验 中, 可 以 直 接 用 筛 选 出 来 的 引 物 进 行 扩 增 鉴 于 琼 脂 糖 凝 胶 的 分 辨 率 不 够 高, 在 以 后 的 实 验 中 可 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶, 以 获 得 高 分 辨 率 参 考 文 献 [] 吴 海 波, 刘 惠 民. 葡 萄 柚 的 栽 培 及 研 究 概 况 [J]. 经 济 林 研 究,005,3 ():69-73. [] 杨 连 珍. 葡 萄 柚 概 述 [J]. 中 国 南 方 果 树,996,5():67-7. [3] 李 贤 忠, 刘 惠 民, 金 德 良, 等. 美 国 葡 萄 柚 营 养 成 分 分 析 与 评 价 [J]. 经 济 林 研 究,006,4(4):3-7. [4] 刘 晓 东, 郝 开 兰. 对 开 发 葡 萄 柚 之 我 见 [J]. 中 国 南 方 果 树,997,6 (6):9. [5] 刘 惠 民, 何 承 忠, 孟 瑜, 等. 引 进 葡 萄 柚 品 种 基 因 资 源 的 AFLP 分 析 [J]. 经 济 林 研 究,008,6():-5.
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