中 南 大 学 学 报 医 学 版 D; -, + )- ) % % ) 8% % >- + ) ) &% >- % 54 )-) ) ) - ) + ) ) ;4 3 ; 5 ) - D; % &,, ) ) ) -) ) ) - % 54 ) - - ; / & + +, )) + >- + %

中 南 大 学 学 报 医 学 版 ) 基 因 多 态 性 与 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 酮 症 倾 向 糖 尿 病 的 关 系 周 敏 张 英 张 冬 梅 林 建 王 建 平 周 海 峰 周 智 广 中 南 大 学 湘 雅 二 医 院 代 谢 内 分 泌 研 究 所 糖 尿 病 中 心 长 沙 湘 雅 医 院 内 分 泌 科 长 沙 5 摘 要 目 的 探 讨 配 对 盒 ) 基 因 多 态 性 与 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 酮 症 倾 向 糖 尿 病 D; 的 关 系 方 法 应 用 变 性 高 效 液 相 色 谱 法 /; 4 筛 查 例 谷 氨 酸 脱 羧 酶 自 身 抗 体 % % 和 蛋 白 酪 氨 酸 磷 酸 酶 自 身 抗 体 8% % 阴 性 的 D; 患 者 D; 组 和 例 非 糖 尿 病 对 照 者 &4 组 的 ) 基 因 外 显 子 和 对 异 常 峰 型 者 经 测 序 证 实 其 碱 基 改 变 应 用 聚 合 酶 链 反 应 限 制 性 长 度 多 态 性 分 析 ;4 3 ; 法 对 例 D; 患 者 和 5 例 对 照 者 的 ) 基 因 % 54 多 态 位 点 进 行 等 位 基 因 和 基 因 型 频 率 分 析 结 果 在 本 组 人 群 中 未 发 现 ) 基 因 外 显 子 有 变 异 外 显 子 中 的 单 核 苷 酸 多 态 性 &; 位 点 % 54 引 起 错 义 突 变 ; / % 54 位 点 的 4 等 位 基 因 和 44 基 因 型 频 率 在 D; 组 与 &4 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义 按 性 别 分 层 后 D; 组 4 等 位 基 因 和 44 基 因 型 频 率 差 异 均 有 统 计 学 意 义 5 以 年 龄 分 层 后 岁 组 与 岁 组 比 较 4 等 位 基 因 和 44 基 因 型 频 率 分 布 差 异 均 有 统 计 学 意 义 在 44 基 因 型 的 D; 患 者 中 空 腹 4 肽 34; 水 平 高 于 %% 基 因 型 者 差 异 有 统 计 学 意 义 结 论 本 组 中 国 南 方 汉 族 人 群 ) 基 因 % 54 ; / 多 态 性 与 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 D; 未 见 关 联 但 分 层 研 究 提 示 ) 基 因 % 54 多 态 性 对 男 性 和 岁 的 D; 患 者 的 发 病 可 能 有 影 响 关 键 词 酮 症 倾 向 糖 尿 病 ) 基 因 单 核 苷 酸 多 态 性 变 性 高 效 液 相 色 谱 法 8 ) )./E0./%&6./%& 8&7 %&7./E/ +./E. - - & - &, & &, & & & 5 ) +),, ) ) ) -, 4 / -), + ) - + ) >- /; 4 ) - &4 - 收 稿 日 期 5 作 者 简 介 周 敏 博 士 副 主 任 医 师 主 要 从 事 糖 尿 病 及 相 关 研 究 通 信 作 者 周 智 广 1 ) - ) 基 金 项 目 国 家 项 目 49 湖 南 省 科 技 厅 项 目 73 湖 南 省 卫 生 厅 重 点 研 究 项 目 % - & ) ; 49 ; + ) 4 +/- ;, 73 D ; + ;- ) / ) 9- - +/- ;, % ; 4

中 南 大 学 学 报 医 学 版 D; -, + )- ) % % ) 8% % >- + ) ) &% >- % 54 )-) ) ) - ) + ) ) ;4 3 ; 5 ) - D; % &,, ) ) ) -) ) ) - % 54 ) - - ; / & + +, )) + >- + % 54 ) D; ) - + 44 4 )) + >- D; - + 5 % +, 44 4 )) + >- ) ) D; - ),) +34; 44 - + ) +34; %% - % 54 ) ) ) ) ) - ) + ) -, D; 4 / -) /, % 54, - ) ) ) -, D; -. ) - + ) >- 酮 症 倾 向 糖 尿 病 D; 是 一 组 具 有 较 大 异 质 性 的 糖 尿 病 其 临 床 表 型 既 可 类 似 型 糖 尿 病 也 可 能 类 似 型 糖 尿 病 对 于 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 的 D; 患 者 有 学 者 称 其 为 酮 症 倾 向 型 糖 尿 病 或 特 发 性 型 糖 尿 病 由 于 它 以 酮 症 为 首 发 症 状 故 推 测 其 胰 岛 功 能 在 起 病 时 已 遭 受 较 大 损 害 可 能 存 在 遗 传 性 胰 岛 细 胞 分 泌 缺 陷 而 不 能 耐 受 高 糖 下 的 糖 脂 毒 性 导 致 细 胞 分 泌 功 能 急 剧 下 降 而 发 生 酮 症 酸 中 毒 D% 因 此 调 控 胰 岛 细 胞 功 能 的 相 关 基 因 异 常 可 能 是 其 病 因 之 一 转 录 因 子 配 对 盒 ;%A 是 配 对 同 源 结 构 域 转 录 因 子 ;%A 家 族 中 的 一 员 ;%A 对 产 生 胰 岛 素 的 细 胞 和 产 生 生 长 抑 素 的 细 胞 的 分 化 增 殖 至 关 重 要 研 究 发 现 敲 除 ) 基 因 将 导 致 细 胞 的 严 重 缺 乏 进 而 发 生 糖 尿 病 / ) 等 通 过 对 斯 堪 的 那 维 亚 半 岛 的 5 个 家 系 的 微 卫 星 分 析 发 现 包 含 ) 基 因 的 号 染 色 体 区 域 > 与 型 糖 尿 病 呈 连 锁 关 系 但 未 能 证 实 是 该 基 因 编 码 区 的 何 种 变 异 在 不 同 国 家 的 人 群 中 ) 基 因 的 不 同 变 异 与 不 同 糖 尿 病 亚 型 相 关 本 研 究 拟 探 讨 ) 基 因 外 显 子 和 外 显 子 的 多 态 性 及 其 与 中 国 南 方 汉 族 人 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 D; 的 关 系 / 0 对 象 与 方 法 研 究 对 象 中 南 大 学 湘 雅 二 医 院 和 湘 雅 医 院 内 分 泌 科 年 月 至 年 月 收 治 的 以 自 发 酮 症 D 或 D% 起 病 的 糖 尿 病 患 者 例 男 性 例 女 性 例 年 龄? @ 岁 入 组 条 件 为 新 发 糖 尿 病 患 者 症 状 不 超 过 个 月 个 月 内 首 次 发 生 D 血 酮 体 半 定 量 或 羟 丁 酸 ) 或 尿 酮 F F 以 上 或 D% D 或 D% 无 明 显 诱 因 如 感 染 手 术 外 伤 等 排 除 妊 娠 糖 尿 病 和 继 发 性 糖 尿 病 排 除 合 并 严 重 肝 肾 功 能 损 害 及 恶 性 肿 瘤 患 者 谷 氨 酸 脱 羧 酶 自 身 抗 体 % 和 蛋 白 酪 氨 酸 磷 酸 酶 自 身 抗 体 8% % 抗 体 阴 性 非 糖 尿 病 对 照 组 5 例 来 自 本 院 体 检 者 和 社 区 流 行 病 调 查 人 群 其 中 男 性 例 女 性 例 年 龄 5? 5 @ 岁 空 腹 血 糖

) 基 因 多 态 性 与 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 酮 症 倾 向 糖 尿 病 的 关 系 周 敏 等 ) 体 质 量 指 数 908 为 @ 入 组 条 件 为 无 亲 缘 关 系 的 汉 族 人 既 往 无 糖 尿 病 史 和 糖 尿 病 家 族 史 本 研 究 得 到 中 南 大 学 湘 雅 二 医 院 伦 理 委 员 会 批 准 方 法 &% 制 备 抽 取 受 检 者 外 周 血 1 % 抗 凝 采 用 常 规 苯 酚 氯 仿 抽 提 &% ;4 扩 增 ) 基 因 外 显 子 和 的 引 物 为 3 H 44 % 4 %4%44% 4 4 H H % 4 % %444 H 3 H 4444%4%44%4 44 H H 4%% % %% 4 4 4 % H 产 物 片 断 分 别 为 和 在 反 应 体 系 中 含 B9- + B )- 04) & ; / > 酶 E 引 物 &% 模 板 5 扩 增 条 件 I 预 变 性 I 变 性 5 I 退 火 I 延 长 每 一 循 环 退 火 温 度 下 降 I 共 个 循 环 之 后 I 变 性 I 退 火 I 延 长 共 个 循 环 I 延 长 变 性 高 效 液 相 色 谱 法 /; 4 分 析 例 患 者 和 例 对 照 的 ;4 产 物 不 需 纯 化 经 变 性 复 性 处 理 I 每 降 I 降 至 I 取 直 接 进 人 % 1 &% 片 段 分 析 系 统 美 国 公 司 ) 第 和 外 显 子 检 测 温 度 分 别 是 I I 紫 外 检 测 波 长 为 测 序 分 析 对 /; 4 检 测 出 的 每 一 种 异 常 峰 型 的 样 品 重 新 进 行 ;4 扩 增 后 测 序 以 明 确 碱 基 变 异 类 型 并 与 突 变 和 多 态 数 据 库 进 行 比 对 证 实 碱 基 变 异 是 否 为 单 核 苷 酸 多 态 性 &; 限 制 性 片 段 长 度 多 态 3 ; 分 析 对 例 患 者 和 5 例 对 照 应 用 ;4 3 ; 对 多 态 位 点 % 54 进 行 基 因 型 分 析 并 验 证 / ; 4 结 果 限 制 性 内 切 酶 & 8 &19 公 司 E I 水 浴 酶 切 酶 切 产 物 于 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 硝 酸 银 染 色 后 普 通 灯 光 下 观 察 结 果 统 计 学 处 理 所 有 样 本 进 行 / 平 衡 检 验 所 有 数 据 均 采 用 ; 统 计 软 件 进 行 分 析 计 量 资 料 以 均 数 @ 标 准 差 +@& 表 示 组 间 比 较 采 用 % 检 验 &; 位 点 等 位 基 因 和 基 因 型 频 率 组 间 差 异 采 用 检 验 以 为 差 异 有 统 计 学 意 义 关 联 分 析 采 用 ; 8&D 软 件 进 行 -, -?- ) ) 0 结 00 果 /; 4 结 合 测 序 法 筛 查 ) 基 因 外 显 子 和 的 结 果 在 所 有 检 测 样 本 中 ) 基 因 外 显 子 均 未 发 现 异 常 峰 型 /; 4 峰 型 见 图 外 显 子 出 现 种 异 常 峰 型 见 图 对 异 常 峰 型 的 样 本 进 行 测 序 发 现 5 % 4 变 异 此 为 已 知 多 态 测 序 图 见 图 酶 切 图 见 图 图 /0 基 因 外 显 子 的 峰 型 图 /0 4

S 中南大学学报 医学版 %&% ) +,+.+ / 0.1 %& ).-/ )./ )+,- %& 图 KH%&O 基因外显子 3 的异常峰型图& 4 -JKH>R0. %5 %- 5 %&%&O - + L%+3J 图 MH%&O 基因外显子 3 测序图& 7正常序列箭头处为 MS7 7&W变异序列箭头处为 MSR R/ 4 -JMH8.1 V3 + +- & -3 1%&%&O - + L%+3J7 8? 0 A/ be 1@.7? ; > )? 1 / MS7 7& W [ 1/ be 1@. 7? ; > )? 1 / MSR R. ) & % + ) & % 图 OH%&O 基因外显子 3 的 )\&9酶切凝胶电泳图& H _870 O & 泳道 S 为 RR基因型&泳道 %M53& 为 77基因型&余泳道为 7R基因型/ 4 -JOH8.-?? %).% 1 1) 3 %& 1 %+ +W /5 )OP9-1 %+) %3 1%&%&O - + L%+3JH _870 OJ &A 1 /S 1> RRB 1? ) &A 1 /%M53 1> & 77B 1? ) &? A 1 / 7RB 1? ).. BAO 基因多态位点7 MSR与 hy_的关系 各组基因型频率分布符合遗传平衡规律显 析 发 现 年 龄 和 性 别 对 hy_ 的 发 病 影 响 明 显 / 故 在 整 体 样 本 的 基 因 多 态 位 点 与 hy_ 的 关 联 分 析 示 样 本 具 有 群 体 代 表 性 / 在 hy_组 与 8R组 间 等 中把年龄和 性 别 作 为 协 变 量 进 行 了 校 正 结 果 位基因频率 和 基 因 型 频 率 分 布 差 异 无 统 计 学 意 显 示 7 MSR等 位 基 因 和 基 因 型 与 hy_ 患 病 无 义 Bo.\ M.& % 表 / 因 Z? B / @回 归 分 关联/

) 基 因 多 态 性 与 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 酮 症 倾 向 糖 尿 病 的 关 系 周 敏 等 表 /0-4 组 和 1 组 基 因 / /; 位 点 等 位 基 因 和 基 因 型 频 率 比 较 &) /0 8 / /; -4 1 组 别 等 位 基 因 频 率 例 % 4 基 因 型 频 率 例 &4 组 5 D; 组 ) 基 因 多 态 位 点 % 54 与 性 别 的 关 系 因 性 别 对 D; 的 发 病 有 影 响 将 性 别 分 层 后 发 现 在 D; 组 男 性 的 44 基 因 型 高 于 女 性, 5 5 男 性 4 等 位 基 因 频 率 高 于 女 性, 5 &4 组 内 男 性 与 女 性 比 较 及 D; 组 与 &4 组 之 间 男 女 性 比 较 等 位 基 因 和 基 因 型 频 率 均 无 统 计 学 差 异 表 表 0 按 性 别 分 层 后 组 / /; 基 因 型 和 等 位 基 因 比 较 &) 0 / /; 8 组 别 等 位 基 因 频 率 例 % 4 基 因 型 频 率 例 &4 组 男 5 5 5 女 D; 组 男 5 女 5 D; 组 男 性 与 女 性 比 较 5 5 5 ) 基 因 多 态 位 点 % 54 与 年 龄 的 关 系 因 年 龄 对 D; 的 发 病 有 影 响 应 用 ; 检 验 按 不 同 年 龄 分 层 发 现 岁 组 44F%4 基 因 型 频 率 明 显 高 于 岁 组 5 组 之 间 4 等 位 基 因 频 率 也 有 统 计 学 差 异 / 5? 表 表 0-4 组 按 年 龄 分 层 后 两 组 基 因 型 和 等 位 基 因 比 较 &) 0 8 年 龄 岁 等 位 基 因 频 率 例 % 4 基 因 型 频 率 例 &4 组 5 D; 组 5 5 5 5 5 5 5 5 D; 组 组 与 组 比 较 / 5? 5

中 南 大 学 学 报 医 学 版 % 54 多 态 性 在 不 同 基 因 型 中 的 年 龄 908 和 34; 水 平 的 比 较 D; 患 者 不 同 基 因 型 组 年 龄 和 908 水 平 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 空 腹 4 肽 34; 浓 度 经 自 然 对 数 ) 转 换 后 符 合 正 态 分 布 组 间 均 数 比 较 发 现 44 基 因 型 组 34; 水 平 高 于 %% 和 %4 基 因 型 组 % 表 表 0-4 组 不 同 基 因 型 的 年 龄 和 4 水 平 的 比 较 &) 0 4-4 项 目 基 因 型 例 数 例 年 龄 岁 @ @ @ 908 @ 5 @ 5 @ % 34; ) 5 @ @ 5 @ 44 基 因 型 与 %%%4 基 因 型 比 较 0 讨 00 论 本 研 究 应 用 /; 4 测 序 方 法 筛 查 了 例 中 国 南 方 汉 族 人 ) 基 因 外 显 子 和 结 果 未 见 外 显 子 突 变 或 多 态 文 献 报 道 在 日 本 人 群 中 发 现 ) 基 因 外 显 子 的 突 变 与 型 糖 尿 病 有 关 而 在 西 非 裔 D; 患 者 中 发 现 ) 基 因 外 显 子 有 % 突 变 这 说 明 ) 基 因 外 显 子 突 变 存 在 种 族 差 异 本 研 究 发 现 ) 基 因 外 显 子 的 变 异 % 54 引 起 错 义 突 变 ; / 目 前 ; / 多 态 性 在 不 同 人 群 的 结 果 不 5 一 致 9 - 等 在 瑞 士 和 德 国 人 群 的 研 究 发 现 ) 基 因 外 显 子 的 ; / 多 态 性 与 儿 童 型 糖 尿 病 易 感 性 有 关 44 基 因 型 频 率 在 两 种 人 群 的 自 身 抗 体 阳 性 型 糖 尿 病 中 分 别 为 和 对 照 组 则 以 %4 基 因 型 为 主 两 种 人 群 的 频 率 分 别 为 和 但 在 芬 兰 和 匈 牙 利 等 其 他 欧 洲 人 群 中 未 发 现 ; / 多 态 性 与 型 糖 尿 病 相 关 有 关 % 54 多 态 性 的 功 能 研 究 表 明 4 5 4 降 低 了 细 胞 对 葡 萄 糖 刺 激 的 增 殖 反 应 而 这 是 调 节 细 胞 生 长 的 主 要 生 理 效 应 因 此 % 54 多 态 性 可 能 影 响 细 胞 的 再 生 和 增 殖 5 本 研 究 检 测 了 ) % 54 多 态 性 在 中 国 汉 族 人 群 的 分 布 D; 组 和 &4 组 的 等 位 基 因 和 基 因 型 频 率 分 布 均 无 明 显 差 异 进 行 关 联 分 析 之 前 笔 者 先 研 究 了 协 变 量 年 龄 性 别 和 908 对 D; 发 病 的 影 响 回 归 分 析 发 现 年 龄 性 别 对 D; 的 发 病 影 响 明 显 所 以 在 整 体 样 本 的 基 因 多 态 位 点 与 糖 尿 病 的 关 联 分 析 中 把 年 龄 和 性 别 作 为 协 变 量 以 校 正 样 本 的 因 变 量 在 ; 8&D 软 件 中 通 过 回 归 法 检 测 多 态 位 点 与 D; 的 关 联 发 现 本 组 ) 基 因 % 54 多 态 性 与 中 国 南 方 汉 族 人 群 D; 患 病 无 关 联 张 云 等 也 发 现 % 54 多 态 性 与 中 国 汉 族 人 群 胰 岛 自 身 抗 体 阳 性 的 型 糖 尿 病 不 相 关 对 D; 患 者 进 行 性 别 和 年 龄 特 异 性 子 样 本 分 析 发 现 男 性 4 等 位 基 因 和 44 基 因 型 频 率 高 于 女 性 以 岁 为 截 点 分 层 岁 组 4 等 位 基 因 和 44 基 因 型 频 率 高 于 岁 组 这 提 示 % 54 多 态 性 存 在 性 别 和 年 龄 的 差 异 性 别 和 年 龄 对 D; 发 病 可 能 有 影 响 本 研 究 进 一 步 比 较 了 不 同 基 因 型 的 年 龄 908 和 34; 浓 度 观 察 到 年 龄 和 908 在 不 同 基 因 型 组 间 无 明 显 差 异 但 44 基 因 型 组 34; 浓 度 高 于 %4 和 %% 基 因 型 组 同 时 908 也 较 高 提 示 该 组 部 分 患 者 可 能 存 在 胰 岛 素 5 抵 抗 本 研 究 结 果 与 9 - 等 在 抗 体 阳 性 型 糖 尿 病 患 者 的 研 究 结 果 不 同 提 示 在 抗 体 阴 性 D; 患 者 中 可 能 存 在 胰 岛 素 抵 抗 这 可 能 也 是 该 类 患 者 易 于 发 生 酮 症 的 原 因 之 一 总 之 本 组 中 国 南 方 汉 族 人 群 中 未 发 现 ) 基 因 外 显 子 有 变 异 外 显 子 的 % 54 ; / 多 态 性 与 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 D; 发 病 无 关 联 但 % 54 多 态 性 对 不 同 性 别 和 年 龄 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 的 D; 患 者 可 能 有 影 响 其 机 制 尚 待 进 一 步 研 究 参 考 文 献 D %1 D - - + ) 7 74) 1 )0 5 5 5 5 0 -, 7, 3 1 ; ) D +- %+ ) ) ) - ) + ) +- -) 7 0 -, 7, 3 9 0 4 ) )

) 基 因 多 态 性 与 胰 岛 自 身 抗 体 阴 性 酮 症 倾 向 糖 尿 病 的 关 系 周 敏 等, 7 /- 0 )-) ; 9 + ) -) + ),) 7 0 )4 ) 5 5 / ) ; ) 9 - / ) 8 ) + - ) ) - > > > ), + ) 7 5 6 3- - / ) % - +; 7 7 5 5-6 0 - D 8 - ) %, ; ) +- 7 - ) - 7 0 4) 1 5 9 - % 9 9 0-0 ) % + ) ) -, + ;%A ) ) ), 7 ) 5 / 0 7 D ) + +;%A 3 /- -) 7 5 5 张 云 肖 新 华 王 等 ) 基 因 % 54 多 态 性 与 中 国 汉 族 人 型 糖 尿 病 的 相 关 性 7 中 国 医 学 科 学 院 学 报./%& 6- A8% A - %& / ) % % 54 ) ) / 4 7 % % 0 本 文 编 辑 郭 征