过 去 研 究 发 现 特 定 的 乳 酸 菌 (Lactic acid bacteria, 简 称 LAB) 具 有 抑 制 胃 幽 门 杆 菌 生 长 的 功 能, 包 含 L. acidophilus L. rhamnosus L. johnsonii L. casei L. gasseri

益 生 菌 在 幽 门 杆 菌 感 染 上 的 应 用 林 金 生 1, 李 幸 芬 1, 郑 伯 忻 2, 吴 俊 忠 ( 1. 生 合 生 物 科 技 集 团, 台 湾 高 雄 ;2. 成 功 大 学 医 学 检 验 生 物 技 术 学 系, 台 湾 台 南 ) 2 摘 要 : 胃 幽 门 杆 菌 (Helicobacter pylori) 是 主 要 感 染 人 类 胃 部 并 引 起 胃 溃 疡 十 二 指 肠 溃 疡, 也 与 胃 癌 息 息 相 关 的 病 原 菌 目 前 在 治 疗 上 以 抗 生 素 为 主, 但 由 于 细 菌 抗 药 性 问 题, 以 及 治 疗 所 延 伸 之 副 作 用, 使 得 抗 生 素 疗 法 仍 有 很 大 改 善 空 间 过 去 研 究 发 现 特 定 乳 酸 菌 可 以 抑 制 胃 幽 门 杆 菌, 故 本 研 究 尝 试 筛 选 具 有 高 度 抑 菌 能 力 之 菌 株 本 研 究 利 用 纸 锭 扩 散 实 验 证 实 乳 酸 菌 发 酵 上 清 液 可 以 抑 制 胃 幽 门 杆 菌 的 生 长, 且 筛 选 出 来 的 乳 酸 菌 抑 菌 效 果 优 于 商 品 化 乳 酸 菌 株 从 50 株 乳 酸 菌 中 筛 选 出 抑 制 幽 门 杆 菌 效 果 最 佳 的 前 三 株 乳 酸 菌, 分 别 为 Lactobacillusacidophilus LA27 Lactobacillus pentosus LPS16 与 Lactobacillus plantarum LP23, 进 行 进 一 步 的 研 究 实 验 证 实 这 3 株 乳 酸 菌 除 可 以 抑 制 一 般 性 胃 幽 门 杆 菌 外, 还 可 以 抑 制 多 重 抗 药 性 之 胃 幽 门 杆 菌, 且 其 对 十 二 指 肠 溃 疡 菌 株 之 抑 菌 能 力 优 于 胃 癌 菌 株 流 式 细 胞 仪 分 析 也 证 实 这 3 株 乳 酸 菌 可 吸 附 到 胃 细 胞 AGS 与 MKN45, 显 示 这 3 株 乳 酸 菌 有 更 大 的 机 会 停 留 在 胃 部 产 生 抑 菌 效 果 进 一 步 以 C57BL/6 公 鼠 进 行 动 物 实 验, 结 果 发 现, 先 喂 食 乳 酸 菌 再 感 染 幽 门 杆 菌,3 株 乳 酸 菌 皆 能 在 幽 门 杆 菌 感 染 后 3 周 或 6 周 内, 于 Antrum Body 或 整 体 胃 部 中 改 善 幽 门 杆 菌 造 成 的 急 性 或 慢 性 发 炎 反 应 因 此, 我 们 推 论 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 三 株 菌 具 有 减 缓 幽 门 杆 菌 感 染 与 降 低 因 感 染 而 引 起 发 炎 反 应 的 能 力 前 言 : 胃 幽 门 杆 菌 是 人 类 的 致 病 菌 之 一, 它 会 感 染 人 类 的 胃 组 织, 引 起 胃 溃 疡 (gastric ulcer) 十 二 指 肠 溃 疡 (duodenal ulcer) 等, 目 前 也 认 为 胃 幽 门 杆 菌 的 感 染 与 胃 癌 有 强 烈 的 关 连 性 全 球 约 有 5 成 人 口 受 胃 幽 门 菌 的 感 染, 在 开 发 中 国 家 的 成 人 盛 行 率 大 于 8 成, 且 大 多 数 人 在 10 岁 前 就 已 受 胃 幽 门 杆 菌 感 染, 足 可 见 胃 幽 门 杆 菌 对 于 人 类 健 康 之 危 害 (Suerbaum and Michetti, 2002) 目 前 治 疗 胃 幽 门 杆 菌 的 方 式 多 采 用 三 合 一 疗 法 (triple therapy), 主 要 是 以 合 并 两 种 抗 生 素 及 一 种 质 子 帮 浦 抑 制 剂 (proton-pump inhibitor) 为 主 但 由 于 细 菌 容 易 产 生 抗 药 性, 故 此 种 疗 法 无 法 治 愈 所 有 病 患, 此 外 由 于 三 合 一 疗 法 以 抗 生 素 为 主, 服 用 后 会 影 响 正 常 肠 内 菌 丛 的 分 布, 故 常 会 引 起 如 腹 痛 或 腹 泻 等 症 状 ; 另 外 三 合 一 疗 法 的 花 费 也 相 当 高 昂, 故 若 能 开 发 新 的 治 疗 法, 将 有 莫 大 优 势 (Gotteland, et al., 2006) 版 权 所 有 翻 印 必 究 1

过 去 研 究 发 现 特 定 的 乳 酸 菌 (Lactic acid bacteria, 简 称 LAB) 具 有 抑 制 胃 幽 门 杆 菌 生 长 的 功 能, 包 含 L. acidophilus L. rhamnosus L. johnsonii L. casei L. gasseri 以 及 B. lactis 等 都 有 报 导 (Coconnier, et al., 1998; Gotteland and Cruchet, 2003; Michetti, et al., 1999; Midolo, et al., 1995; Sakamoto, et al., 2001), 而 其 抑 制 的 机 制 有 可 能 是 透 过 细 菌 分 泌 的 酸 性 代 谢 产 物, 或 分 泌 抗 菌 蛋 白 (antimicrobial peptide) 来 抑 制 胃 幽 门 杆 菌 的 生 长 (Gotteland, et al., 2006); 此 外, 也 有 人 认 为 抑 菌 成 分 是 来 自 细 菌 菌 体 内 的 蛋 白 质 成 分 (Lorca, et al., 2001) 临 床 试 验 中 也 发 现 乳 酸 菌 有 效 提 升 胃 幽 门 杆 菌 的 清 除 率, 也 可 以 降 低 三 合 一 疗 法 所 引 起 的 副 作 用 (Gotteland, et al., 2006) 这 显 示 无 论 是 单 纯 使 用 乳 酸 菌, 或 是 合 并 三 合 一 疗 法 与 乳 酸 菌, 都 能 有 效 提 升 胃 幽 门 杆 菌 的 治 疗 成 效, 故 乳 酸 菌 将 是 抑 制 胃 幽 门 杆 菌 的 一 大 利 器 在 本 研 究 中, 我 们 从 上 千 株 的 乳 酸 菌 中 筛 选 出 50 株 产 酸 与 抑 制 一 般 病 源 菌 较 强 的 菌 株, 寻 找 可 有 效 抑 制 胃 幽 门 杆 菌 生 长 的 乳 酸 菌, 同 时 也 测 试 来 自 不 同 疾 病 或 具 有 不 同 抗 药 性 的 胃 幽 门 杆 菌, 是 否 一 样 可 受 乳 酸 菌 抑 制 另 外, 我 们 也 测 试 乳 酸 菌 吸 附 至 胃 组 织 细 胞 的 能 力 筛 选 出 具 有 优 异 特 性 的 乳 酸 菌 进 一 步 利 用 动 物 模 型 来 验 证 其 预 防 与 改 善 幽 门 杆 菌 感 染 的 效 果 结 果 : 筛 选 能 有 效 抑 制 胃 幽 门 杆 菌 生 长 的 乳 酸 菌 我 们 筛 选 了 50 株 乳 酸 菌 与 3 株 商 品 化 乳 酸 菌 株 (Bifidobacteria lactis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus, 缩 写 分 别 是 B La Lb), 其 菌 体 (bac) 与 发 酵 上 清 液 (sup) 的 抑 菌 能 力, 并 先 以 胃 幽 门 菌 Hp238 J99 43504 作 为 测 试 抑 菌 能 力 的 代 表 菌 株 取 固 定 量 的 菌 体 发 酵 上 清 液 以 纸 锭 扩 散 法 测 试 其 抑 菌 效 果, 结 果 发 现 菌 体 本 身 无 法 抑 制 胃 幽 门 菌 Hp238 J99 43504 之 生 长 ( 图 1A), 仅 有 发 酵 上 清 液 具 有 抑 菌 效 果 ( 图 1B) 如 表 1 详 细 列 出 其 抑 菌 能 力, 并 依 能 力 由 强 至 弱 排 列,50 株 乳 酸 菌 中, 有 9 株 比 商 品 化 乳 酸 菌 株 Lb 更 具 有 效 的 抑 菌 能 力 ; 综 合 对 三 株 幽 门 杆 菌 的 抑 菌 能 力, 最 终 挑 选 No. 11 33 与 37 进 行 更 进 一 步 的 分 析, 而 这 3 株 乳 酸 菌 经 鉴 定 后 分 别 是 Lactobacillusacidophilus Lactobacillus pentosus 与 Lactobacillus plantarum, 并 分 别 给 予 编 号 LA27 LPS16 与 LP23 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 对 胃 幽 门 杆 菌 的 抑 制 能 力 为 了 进 一 步 证 实 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 的 抑 菌 效 果, 我 们 选 取 共 30 株 来 自 不 同 疾 病 或 多 重 性 抗 药 型 胃 幽 门 杆 菌, 来 测 试 乳 酸 菌 是 否 可 抑 制 其 生 长 取 用 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 的 发 酵 上 清 液, 每 次 皆 固 定 使 用 20 μl 滴 在 纸 锭 上 进 行 纸 锭 扩 散 实 验, 抑 制 圈 的 大 小 是 由 至 少 3 次 的 独 立 实 验 所 平 均 之 结 果 结 果 发 现 相 较 于 MRS 培 养 液,3 株 乳 酸 菌 的 发 酵 上 清 液 皆 具 有 显 著 的 抑 菌 能 力 (p <0.001, t test), 且 这 3 株 乳 酸 菌 对 胃 幽 门 杆 菌 的 抑 菌 能 力 并 无 明 显 差 异 ( 图 版 权 所 有 翻 印 必 究 2

2A) 但 若 比 较 胃 癌 十 二 指 肠 溃 疡 以 及 多 重 性 抗 药 型 胃 幽 门 杆 菌, 则 发 现 相 较 于 胃 癌 菌 株, 3 株 乳 酸 菌 对 十 二 指 肠 溃 疡 菌 株 有 较 显 著 的 抑 菌 能 力 (p <0.05, t test), 但 多 重 性 抗 药 型 菌 株 与 胃 癌 菌 株 相 比, 或 是 多 重 抗 药 型 菌 株 与 十 二 指 肠 溃 疡 菌 株 相 比 较, 则 无 明 显 差 异 ( 图 2B, C, D) 乳 酸 菌 吸 附 至 胃 细 胞 AGS 与 MKN45 的 能 力 由 于 胃 幽 门 杆 菌 仅 感 染 胃 部 细 胞, 若 乳 酸 菌 在 体 内 要 发 挥 最 大 抑 菌 效 果, 乳 酸 菌 最 好 能 停 留 在 胃 组 织 细 胞 上, 以 便 产 生 最 佳 的 抑 菌 能 力, 故 我 们 也 尝 试 测 量 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 是 否 能 吸 附 到 胃 细 胞 我 们 利 用 PKH2 Green Fluorescence Cell Linker Kit 来 标 定 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23, 使 乳 酸 菌 能 产 生 绿 色 荧 光, 而 胃 细 胞 我 们 则 使 用 人 类 胃 上 皮 细 胞 腺 肿 瘤 细 胞 株 AGS 与 MKN45 如 图 3 所 示, 加 入 荧 光 标 定 之 乳 酸 菌 皆 能 让 胃 细 胞 的 荧 光 明 显 增 强, 若 以 荧 光 强 度 最 高 峰 (Gmean) 代 表 细 菌 吸 附 到 胃 细 胞 的 能 力, 则 可 明 显 发 现 相 较 于 仅 有 细 胞 的 组 别, 加 入 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 后 皆 能 让 细 胞 绿 色 荧 光 显 著 增 加 (p <0.05, t test), 且 在 这 3 株 乳 酸 菌 中, 以 LA27 吸 附 到 胃 细 胞 的 能 力 最 为 显 著 (p <0.05, t test), 但 平 均 而 言, 这 3 株 乳 酸 菌 都 具 有 吸 附 到 胃 细 胞 的 能 力 喂 食 乳 酸 菌 对 幽 门 杆 菌 感 染 小 鼠 能 力 的 影 响 三 株 乳 酸 菌 分 别 喂 食 小 鼠 后, 再 感 染 幽 门 杆 菌, 并 分 别 在 3 周 与 6 周 牺 牲 小 鼠, 观 察 小 鼠 胃 部 病 理 变 化 先 喂 食 乳 酸 菌 LA27, 再 感 染 幽 门 杆 菌 的 组 别, 相 较 于 仅 感 染 幽 门 杆 菌 之 小 鼠, 乳 酸 菌 LA27 对 整 体 胃 部 急 性 发 炎 指 数 在 6 周 有 显 著 下 降 ;LA27 也 能 有 效 减 低 感 染 幽 门 杆 菌 3 周 后 的 Antrum 部 位 的 慢 性 发 炎 指 数, 而 6 周 后 Body 部 位 和 整 体 胃 部 的 慢 性 发 炎 指 数 也 都 有 显 著 下 降 先 喂 食 乳 酸 菌 LPS16, 再 感 染 幽 门 杆 菌 的 组 别, 相 较 于 仅 感 染 幽 门 杆 菌 的 组 别, 乳 酸 菌 LPS16 能 减 低 幽 门 杆 菌 感 染 3 周 后 Antrum 部 位 的 慢 性 发 炎 指 数, 而 同 时 间 Body 部 位 的 慢 性 发 炎 指 数 也 同 样 降 低 具 有 显 著 差 异 ; 若 评 估 整 体 胃 发 炎 指 数, 不 论 3 周 或 6 周 在 急 性 与 慢 性 发 炎 反 应 都 有 下 降 趋 势, 且 具 有 显 著 意 义 先 喂 食 乳 酸 菌 LP23 再 感 染 幽 门 杆 菌 的 组 别, 相 较 于 仅 感 染 幽 门 杆 菌 的 组 别, 乳 酸 菌 LP23 于 感 染 幽 门 杆 菌 6 周 后, 能 减 低 Body 部 位 的 慢 性 发 炎 反 应 整 体 而 言, 乳 酸 菌 LP23 能 减 低 幽 门 杆 菌 感 染 3 周 后 整 体 胃 部 急 性 与 慢 性 发 炎 反 应, 且 抑 制 效 果 持 续 至 6 周 在 幽 门 杆 菌 密 度 的 分 析 上, 喂 食 乳 酸 菌 虽 无 法 显 著 降 低 胃 部 幽 门 杆 菌 的 密 度, 但 都 有 下 降 的 趋 势 版 权 所 有 翻 印 必 究 3

讨 论 与 结 论 在 本 研 究 中, 我 们 发 现 筛 选 的 50 株 乳 酸 菌 的 发 酵 上 清 液 具 有 抑 制 胃 幽 门 杆 菌 生 长 的 能 力, 且 其 抑 制 能 力 优 于 现 今 商 品 化 乳 酸 菌 株 此 外, 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 可 以 抑 制 具 多 重 性 抗 药 性 的 胃 幽 门 杆 菌 之 生 长, 且 抑 菌 效 果 对 于 十 二 指 肠 溃 疡 菌 株 明 显 优 于 胃 癌 菌 株 此 外, 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 都 可 吸 附 到 胃 细 胞 AGS 与 MKN45 上, 显 示 这 3 株 乳 酸 菌 将 有 机 会 停 留 在 人 类 胃 部 内, 以 产 生 最 佳 抑 菌 效 果 先 喂 食 乳 酸 菌 能 显 著 干 扰 后 续 幽 门 杆 菌 的 感 染 能 力, 且 不 同 的 乳 酸 菌 在 不 同 的 时 间 和 部 位, 能 减 缓 幽 门 杆 菌 引 起 的 急 性 或 慢 性 发 炎 反 应, 而 整 体 看 来 乳 酸 菌 LPS16 能 抑 制 6 项 发 炎 指 数, 而 乳 酸 菌 LA27 与 LP23 分 别 能 抑 制 4 与 5 种 发 炎 指 数, 因 此 我 们 推 测 这 3 株 乳 酸 菌 确 实 具 有 减 缓 幽 门 杆 菌 于 小 鼠 胃 部 的 感 染 力 虽 然 在 动 物 试 验 中 幽 门 杆 菌 密 度 在 统 计 上 无 显 著 变 化, 但 是 有 下 降 的 趋 势, 大 部 分 的 发 炎 指 标 也 都 有 显 著 下 降 的 趋 势, 此 结 果 暗 示 了 乳 酸 菌 除 了 直 接 抑 菌 的 效 果 外, 于 动 物 体 内 也 可 能 透 过 影 响 幽 门 杆 菌 毒 力 因 子 的 表 现 进 而 干 扰 幽 门 杆 菌 的 致 病 机 转 Ryan 等 人 于 2009 年 发 现 Lactobacillus salivarius 分 泌 的 乳 酸 可 以 抑 制 幽 门 杆 菌 毒 力 因 子 CagA 的 表 现 由 于 体 外 试 验 中 我 们 发 现 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 能 大 量 产 酸 使 培 养 液 ph 值 降 低, 因 此 这 结 果 也 暗 示 我 们 所 使 用 的 乳 酸 菌 于 in vivo 条 件 中, 可 能 也 具 有 干 扰 幽 门 杆 菌 毒 力 因 子 表 现 的 能 力, 进 而 干 扰 幽 门 杆 菌 的 感 染 能 力 跟 据 本 研 究 的 结 果 显 示 乳 酸 菌 LA27 LPS16 与 LP23 可 以 抑 制 幽 门 杆 菌 吸 附 胃 表 皮 细 胞, 并 显 著 降 低 因 感 染 幽 门 杆 菌 所 造 成 的 发 炎 反 应 参 考 文 献 : Coconnier, M. H., V. Lievin, E. Hemery, and A. L. Servin. 1998. Antagonistic activity against Helicobacter infection in vitro and in vivo by the human Lactobacillus acidophilus strain LB. Appl Environ Microbiol 64:4573-4580. Dixon, M. F., R. M. Genta, J. H. Yardley, and P. Correa. 1996. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis, Houston 1994. Am. J. Surg. Pathol. 20:1161-1181. 版 权 所 有 翻 印 必 究 4

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