國 立 中 興 大 學 動 物 科 學 系 碩 士 學 位 論 文 Indirubin 對 猪 與 犬 卵 母 細 胞 體 外 成 熟 與 發 育 能 力 之 影 響 Maturation and development of porcine and canine oocytes after Indirubin treatment 指 導 教 授 : 范 揚 廣 博 士 Yang-Kwang Fan, Ph. D. 朱 志 成 博 士 Jyh-Cherng Ju, Ph. D. 研 究 生 : 莊 欣 萍 Sing-Ping Chuang 中 華 民 國 一 三 年 一 月
Department of Animal Science National Chung Hsing University Master Thesis Maturation and development of porcine and canine oocytes after Indirubin treatment Adviser: Yang-Kwang Fan, Ph. D. Jyh-Cherng Ju, Ph. D. Student: Sing-Ping Chuang January, 2014
誌 謝 本 論 文 承 蒙 指 導 教 授 范 揚 廣 博 士 與 朱 志 成 博 士 於 試 驗 上 悉 心 教 導 與 鞭 策, 讓 學 生 學 習 到 何 謂 科 學 研 究 使 我 能 順 利 完 成 碩 士 班 學 業, 感 謝 辛 苦 的 口 試 委 員 : 東 海 大 學 羅 能 文 博 士 與 屏 東 科 技 大 學 沈 朋 志 博 士 於 口 試 期 間 對 論 文 提 出 的 指 正 與 建 議, 讓 本 篇 論 文 更 加 完 善 同 時 感 謝 台 中 大 里 的 慈 濟 動 物 醫 院 與 彩 虹 動 物 醫 院 院 長 鄧 有 為 醫 師 潘 醫 師 曾 醫 師 與 醫 院 工 作 人 員 等 在 試 驗 期 間 不 間 斷 的 提 供 樣 品, 以 供 試 驗 所 需, 也 謝 謝 醫 院 的 大 家 於 精 神 上 的 鼓 勵 在 中 興 大 學 求 學 過 程 中, 非 常 感 謝 系 上 所 有 的 老 師 給 予 的 指 導 實 驗 上 的 幫 助 與 心 理 上 的 鼓 勵, 還 有 已 經 畢 業 的 學 長 姐 : 建 宗 Be 子 安 Tan Chawalit 沙 士 歐 弟 榮 卿 春 捲 石 力 詩 穎 亞 嵐 與 盈 之, 因 為 有 你 們 在 實 驗 上 的 指 導, 讓 我 可 以 在 研 究 的 路 上 走 得 更 順 與 平 穩, 也 因 為 你 們 的 帶 領, 我 才 看 得 到 不 一 樣 的 世 界 還 有 實 驗 室 眾 多 的 學 長 同 學 與 學 弟 妹 們 : 得 吉 Micheal 淳 茹 永 璇 鈺 瑄 俊 達 與 廷 宇, 這 段 期 間 慶 幸 有 你 們 不 辭 辛 勞 的 幫 忙, 讓 我 不 至 於 在 工 作 與 課 業 間 忙 得 焦 頭 爛 額 更 感 謝 在 論 文 寫 作 幫 最 多 的 好 室 友, 對 於 你 的 犧 牲 奉 獻 與 金 錢 上 的 支 持, 再 多 的 謝 謝 也 無 法 表 達 在 我 生 命 中 一 直 佔 據 很 重 要 一 塊 的 波 波, 無 論 現 在 我 們 能 不 能 陪 伴 一 輩 子, 我 答 應 你 的 已 經 努 力 做 到 了, 你 看 到 了 嗎? 還 有 謝 謝 子 安 學 長 在 最 重 時 刻 讓 San 留 在 我 身 邊, 讓 我 有 努 力 生 活 的 動 力 非 常 感 謝 一 直 陪 伴 在 我 身 邊 的 家 人, 因 為 你 們 的 默 默, 所 以 我 才 能 大 放 異 彩, 僅 將 此 論 文 獻 給 最 愛 的 你 們 莊 欣 萍 謹 誌 於 國 立 中 興 大 學 動 物 科 學 系 生 殖 生 物 技 術 研 究 室
摘 要 Indirubin-3 -oxime(indirubin) 為 一 CDK 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑, 主 要 是 藉 由 與 ATP 競 爭 p34 cdc2 kinases 之 ATP 結 合 位 置, 進 而 阻 斷 其 磷 酸 化 作 用, 導 致 成 熟 促 進 因 子 (maturation promoting factor, MPF) 無 法 致 活, 而 抑 制 卵 母 細 胞 原 泡 核 (germinal vesicle, GV) 的 崩 解 (GV breakdown, GVBD), 此 一 作 用 有 利 於 原 泡 核 轉 置 操 作 並 改 善 卵 母 細 胞 後 續 發 育 能 力 本 試 驗 之 目 的 為 探 討 Indirubin 對 猪 卵 母 細 胞 體 外 成 熟 與 其 孤 雌 胚 體 外 發 育 之 影 響 試 驗 一, 猪 卵 丘 卵 母 細 胞 複 合 體 (cumulus-oocyte complexes, COCs) 培 養 於 含 不 同 濃 度 Indirubin (0, 1.56, 3.13, 6.25 與 12.5 μm) 之 NCSU-23 培 養 液 中, 經 22 h 後 轉 至 不 含 Indirubin 之 NCSU-23 中 繼 續 培 養 44 h, 以 觀 察 COCs 之 擴 散 與 ERK 1/2 磷 酸 化 程 度 結 果 顯 示, 猪 卵 母 細 胞 經 過 Indirubin 處 理 22 h 後,COCs 外 圍 卵 丘 細 胞 擴 散 程 度 隨 Indirubin 濃 度 之 增 加 而 減 少, 而 在 較 高 濃 度 Indirubin(6.25 與 12.5 μm) 處 理 下 COCs 無 擴 散 現 象,ERK1/2 之 磷 酸 化 程 度 亦 與 GV 期 之 卵 母 細 胞 相 似, 但 低 於 對 照 組 者 (P < 0.05) 試 驗 二, 卵 母 細 胞 成 熟 後 經 孤 雌 激 活 後 再 觀 察 其 發 育 情 形 經 移 除 Indirubin 並 延 長 培 養 44 h 後, 猪 卵 母 細 胞 成 熟 率 於 各 處 理 組 (90.4-91.4 %) 對 照 組 (44 h;90.4 %) 及 延 長 培 養 組 (66 h,89.3 %) 之 間 並 無 差 異 (P > 0.05); 成 熟 卵 母 細 胞 經 激 活 (2.2 kv/cm, 30 μsec 與 2.5 mm 6-DMAP, 4 h) 後, 各 組 間 之 分 裂 率 亦 相 近 (88.6-95.8 %), 但 囊 胚 率 在 延 長 培 養 之 對 照 組 (17.4 %) 與 Indirubin 各 處 理 組 (20.7-28.7 %) 顯 著 低 於 對 照 組 (51.7 %, P < 0.05) 試 驗 三, 取 自 不 同 月 齡 家 犬 的 卵 巢 之 卵 母 細 胞, 以 Indirubin 處 理 後 與 未 處 理 組 繼 續 培 養 72 h, 卵 母 細 胞 皆 無 法 恢 復 減 數 分 裂 (< 10 %) 以 上 結 果 顯 示 適 當 濃 度 之 Indirubin 可 有 效 抑 制 猪 卵 母 細 胞 停 留 於 GV 期, 但 移 除 抑 制 劑 後 其 囊 胚 率 降 低, 可 能 與 延 長 體 外 培 養 時 間 或 殘 留 於 細 胞 內 之 濃 度 有 關 ; 另 外, 犬 卵 母 細 胞 經 Indirubin 處 理 並 未 改 善 其 成 熟 率, 此 仍 需 更 多 之 研 究 i
Abstract Indirubin is a specific cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor, which interacts with ATP binding pocket of p34 cdc2 kinases. Therefore, by inhibiting the phosphorylation activiting of p34 cdc2, MPF would not be activated and in-turn mieotic resumption of meiosis would be blocked. This study aimed to examine the effects of Indirubin, a potent kinase inhibitor, on the resumption of meiosis in porcine oocytes and their subsequent parthenogenetic development. In Experiment 1, cumulus oocyte complexes (COCs) were cultured for 22 h in North Carolina State University-23 (NCSU-23) medium containing various doses of Indirubin (0, 1.56, 3.13, 6.25, and 12.5 μm), Cumulus cell expansion and phosphorylation of ERK1/2 during Indirubin treatment were examined. Results In Experiment 2, COCs were cultured for 22 h in NCSU-23 containing Indirubin, followed by an extended culture period for 44 h in the same medium without the inhibitor, maturation rates and embryonic development after parthenogenetic activation were recorded at the end of extended culture. After an additional 44 h of culture, maturation rates of Indirubin-treated groups (90.4-91.4 %) had no differences from the normal (44 h, 90.4 %) and the extended control (66 h, 89.3 %) groups. After parthenogenetic activation (electrical pulse 2.2 kv/cm for 30 μsec and 2.5 mm 6-DMAP for 4 h), significantly lower blastocyst rates in the extended control group (17.4 %) and the Indirubin-treated groups (20.7 to 28.7%) were observed when compared to the control group (51.7%, P < 0.05). In experiment 3, canine follicular oocytes were treated with Indirubin (12.5 μm), and there was no ii
difference found between treatment groups (with or without Indirubin, P > 0.05). In conclusions, an optimized dose of Indirubin arrests porcine oocytes at the GV stage with compromised embryonic development, which may be attributed to the residual effect of the drug. No difference was observed in maturation rates of canine oocytes after Indirubin treatment, which requires more study. iii
目 次 頁 次 文 獻 檢 討 -------------------------------------------------------------------------1 一 前 言 ---------------------------------------------------------------------2 二 哺 乳 動 物 卵 母 細 胞 之 發 育 與 成 熟 ---------------------------------3 ( 一 ) 調 控 卵 母 細 胞 成 熟 之 因 子 --------------------------------------4 1. 內 泌 素 與 LH 潮 湧 ----------------------------------------------------4 2. 成 熟 促 進 因 子 (maturation promoting factor, MPF)---------5 3. 有 絲 分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK)------------------6 三 犬 科 動 物 之 生 殖 與 排 卵 ---------------------------------------------9 四 犬 科 動 物 之 生 殖 週 期 -----------------------------------------------10 五 犬 科 動 物 卵 母 細 胞 之 成 熟 -----------------------------------------12 六 犬 科 動 物 卵 母 細 胞 受 精 與 胚 之 形 成 -----------------------------13 七 犬 胚 之 發 育 -----------------------------------------------------------15 ( 一 ) 體 內 ----------------------------------------------------------------15 ( 二 ) 體 外 ----------------------------------------------------------------18 八 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑 對 卵 母 細 胞 減 數 分 裂 機 制 之 調 控 ----------19 試 驗 研 究 ------------------------------------------------------------------------21 一 前 言 ----------------------------------------------------------------------22 iv
二 材 料 與 方 法 -------------------------------------------------------------22 三 試 驗 設 計 ----------------------------------------------------------------35 四 統 計 分 析 ----------------------------------------------------------------36 五 結 果 ----------------------------------------------------------------------37 試 驗 一 猪 卵 母 細 胞 經 Indirubin-3 -oxime 處 理 後 之 影 響 ------------37 試 驗 二 猪 卵 母 細 胞 經 Indirubin-3 -oxime 處 理 後 其 減 數 分 裂 復 甦 與 後 續 發 育 之 影 響 ---------------------------------------42 試 驗 三 犬 濾 泡 發 育 與 卵 母 細 胞 經 Indirubin 處 理 後 減 數 分 裂 復 甦 之 能 力 --------------------------------------------------45 六 討 論 ----------------------------------------------------------------------53 七 結 論 ----------------------------------------------------------------------54 參 考 文 獻 ------------------------------------------------------------------------55 v
表 次 頁 次 表 1 NCSU-23 基 礎 培 養 液 之 成 分 ---------------------------------------24 表 2 卵 母 細 胞 電 激 活 液 之 成 分 -------------------------------------------29 表 3 PZM-3 體 外 培 養 液 之 成 分 -------------------------------------------30 表 4 以 不 同 濃 度 之 Indirubin-3 -oxime 處 理 22 h 後 對 猪 卵 母 細 胞 恢 復 減 數 分 裂 之 影 響 -------------------------------------------------39 表 5 不 同 濃 度 之 Indirubin3'-oxime 處 理 22 h 後 對 猪 卵 母 細 胞 延 長 培 養 44 h 恢 復 減 數 分 裂 之 影 響 -------------------------------------43 表 6 不 同 濃 度 Indirubin-3'-oxime 處 理 22 h 後 對 猪 卵 母 細 胞 激 活 與 發 育 潛 能 之 影 響 ---------------------------------------------------44 表 7 體 外 培 養 前 猪 與 犬 卵 母 細 胞 GV 之 形 態 -------------------------51 表 8 Indirubin-3'-oxime 處 理 22 h 對 犬 卵 母 細 胞 於 後 續 培 養 72 h 後 恢 復 減 數 分 裂 之 影 響 ----------------------------------------------52 vi
圖 次 頁 次 圖 1 哺 乳 動 物 卵 母 細 胞 在 成 熟 與 受 精 過 程 中 MAPK 活 性 之 變 化 -----------------------------------------------------------------------8 圖 2 母 犬 之 生 殖 週 期 ---------------------------------------------------------11 圖 3 卵 母 細 胞 與 濾 泡 之 生 成 ------------------------------------------------13 圖 4 犬 科 動 物 體 內 生 殖 胚 於 輸 卵 管 之 發 育 天 數 ------------------------15 圖 5 卵 丘 卵 母 細 胞 經 過 22 h 於 含 有 不 同 濃 度 Indirubin 之 NCSU-23 培 養 液 處 理 後 之 形 態 ------------------------------------38 圖 6 猪 卵 母 細 胞 於 體 外 培 養 過 程 中 添 加 Indirubin 處 理 22 h 後 MAPK 之 變 化 ---------------------------------------------------------40 圖 7 3-6 月 齡 幼 犬 卵 巢 內 正 常 濾 泡 之 形 態 ------------------------------46 圖 8 犬 卵 巢 組 織 切 片 --------------------------------------------------------47 圖 9 犬 卵 母 細 胞 GV 核 之 形 態 --------------------------------------------49 vii
文 獻 檢 討 1
一 前 言 忙 碌 與 緊 張 的 社 會 節 奏, 常 常 導 致 現 代 夫 妻 主 動 或 是 被 迫 延 後 生 產 年 齡, 一 但 錯 失 生 育 的 黃 金 時 期, 男 性 與 女 性 生 育 能 力 不 斷 下 降 與 老 化 所 造 成 的 不 孕 症 逐 年 增 加, 卵 母 細 胞 所 產 生 的 問 題 也 一 一 浮 現, 除 了 受 孕 不 易 以 外, 染 色 體 異 常 所 造 成 的 畸 胎 率 與 畸 胎 兒 等 也 會 增 加 高 齡 產 婦 所 必 須 面 臨 最 大 的 風 險 即 為 卵 子 老 化 之 問 題, 而 原 泡 核 轉 置 技 術 (germinal vesicle transfer, GV transfer) 對 此 一 現 況 似 乎 可 以 有 效 的 改 善 人 類 不 孕 症 之 治 療, 利 用 原 泡 核 轉 置 技 術 替 換 老 化 之 卵 母 細 胞 質, 能 夠 有 效 改 善 發 育 能 力 以 及 染 色 體 異 常 等 問 題 (Takeuchi et al., 1999; Zhang et al., 1999; Takeuchi et al., 2001; Palermo et al., 2002; Takeuchi et al., 2004) 但 目 前 對 細 胞 核 重 組 (reprogramming) 與 核 質 之 間 的 交 感 作 用 機 制 與 減 數 分 裂 決 定 因 子 尚 未 充 分 瞭 解, 待 更 多 之 研 究 以 理 清 其 調 節 機 制 6-Dimethylaminopurine(6-DMAP) Butyrolactone I (BL I) Roscovitine 與 Indirubin-3 -oxime(io) 等, 這 些 稱 為 轉 磷 酸 激 酶 抑 制 劑 (cyclin-dependent kinase inhibitor, CDK), 主 要 作 用 為 抑 制 蛋 白 質 磷 酸 化 作 用, 如 成 熟 促 進 因 子 (maturation promoting factor, MPF) 的 活 性 受 到 抑 制, 卵 母 細 胞 自 發 性 的 原 泡 核 崩 解 (germinal vesicle breakdown, GVBD) 也 會 受 到 抑 制, 以 利 原 泡 核 轉 置 或 其 他 相 關 操 作 之 進 行 (Hsieh et al., 2006) 若 能 利 用 此 類 藥 劑 進 行 卵 母 細 胞 體 外 成 熟 培 養 (in vitro maturation, IVM), 可 能 有 效 提 高 卵 母 細 胞 內 mrna 或 蛋 白 質 含 量 之 積 蓄, 已 達 預 成 熟 (pre-maturation) 之 目 的, 並 期 望 能 改 善 卵 母 細 胞 後 續 之 發 育 能 力 (Anderiesz et al., 2000); 若 以 此 加 以 探 討 並 利 用 於 犬 科 動 物 卵 母 細 胞 之 體 外 成 熟 應 用, 期 望 能 改 善 犬 科 動 物 之 卵 母 細 胞 體 外 培 養 如 此 低 的 成 熟 率 犬 科 動 物 體 外 培 養 會 有 如 此 大 的 挑 戰? 牽 涉 到 其 本 身 特 殊 的 生 殖 週 期 排 卵 與 受 精 機 制, 然 而 這 些 都 是 尚 未 完 全 理 清 的 部 分, 仍 然 需 要 更 多 實 驗 與 探 討 多 數 的 CDK 轉 磷 酸 激 酶 抑 制 劑 雖 然 對 於 抑 制 卵 母 細 胞 減 數 分 裂 復 甦 具 有 可 逆 性, 可 是 對 於 卵 母 細 胞 有 多 大 層 面 之 影 響 亦 需 進 一 步 釐 清 2
二 哺 乳 動 物 卵 母 細 胞 之 發 育 與 成 熟 雌 性 動 物 於 胎 兒 時 期 之 個 體, 在 早 期 胚 體 之 中 胚 層 (mesoderm) 之 始 基 生 殖 細 胞 (primordial germ cell, PGC) 會 轉 移 至 生 殖 脊 (genital ridge), 此 後 這 些 細 胞 會 大 量 的 有 絲 分 裂 (mitosis) 而 增 生 便 形 成 了 最 初 的 卵 原 細 胞 (oogonia) 卵 原 細 胞 隨 著 胚 胎 的 發 育 會 經 歷 細 絲 期 (leptotene) 偶 絲 期 (zygotene) 粗 絲 期 (pachytene) 雙 絲 期 (diplotene) 最 後 停 在 第 一 次 減 數 分 裂 (prophase I) 之 核 網 期 (dictyate)(stack and Aderson, 2001), 此 時 的 卵 原 細 胞 已 經 失 去 細 胞 分 裂 之 能 力, 成 為 最 初 級 之 卵 母 細 胞 (primary oocyte), 而 一 開 始 的 生 殖 囊 泡 (germline cyst) 也 慢 慢 裂 解 形 成 始 基 濾 泡 (primordial follicles), 哺 乳 動 物 的 卵 母 細 胞 皆 停 留 於 此 細 胞 休 止 期, 此 一 時 期 卵 母 細 胞 之 染 色 質 散 佈 於 巨 大 細 胞 核 中, 所 以 此 時 期 又 稱 為 原 泡 核 (germinal vesicle, GV) 期 雌 性 哺 乳 動 物 達 發 身 (puberty), 受 到 激 性 腺 素 (gonadotropin) 或 其 他 調 節 因 子 刺 激 誘 導, 顆 粒 細 胞 (granulosa cells) 會 層 層 的 包 覆 卵 母 細 胞 形 成 次 級 濾 泡 (secondary follicles), 濾 泡 腔 與 卵 母 細 胞 不 斷 的 生 長, 但 是 在 眾 多 的 濾 泡 中 只 有 少 數 的 卵 母 細 胞 具 有 減 數 分 裂 與 發 育 之 能 力, 大 多 數 之 濾 泡 與 卵 母 細 胞 則 發 生 閉 鎖 性 退 化 (atretic degeneration) 無 法 正 常 排 出 (Hagglund et al., 2001) 腦 下 垂 體 在 受 到 激 性 腺 素 釋 放 因 子 (Gonadotropin releasing hormone, GnRH ) 刺 激 後 分 泌 促 濾 泡 成 熟 激 素 (follicle stimulating hormone, FSH) 和 黃 體 激 素 (luteinizing hormone, LH) 進 而 恢 復 減 數 分 裂, 卵 母 細 胞 在 減 數 分 裂 開 始 時 伴 隨 著 原 泡 核 崩 解 (germinal vesicle breakdown, GVBD ) 與 染 色 質 濃 縮 (chromatin condensation), 減 數 分 裂 分 為 第 一 次 減 數 分 裂 之 前 期 (prometaphase) 中 期 (metaphase) 後 期 (anaphase) 與 終 期 (telophase), 接 著 排 出 第 一 極 體 (first polar body) 且 休 止 於 第 二 次 減 數 分 裂 中 期 (metaphase II, M II), 而 此 為 卵 母 細 胞 核 之 成 熟, 此 時 卵 母 細 胞 為 次 級 卵 母 細 胞 其 細 胞 核 已 經 達 到 成 熟 之 階 段 再 度 呈 現 休 止 狀 態 並 且 準 備 受 精, 經 過 LH 潮 湧 後, 次 級 卵 母 細 胞 會 自 成 熟 的 濾 泡 3
中 排 出 卵 母 細 胞 成 熟 除 了 核 之 成 熟 外, 也 包 含 了 其 他 更 複 雜 之 卵 膜 及 細 胞 質 之 成 熟 (cytoplasmic maturation) 在 這 部 分 涉 及 了 某 些 特 殊 蛋 白 質 之 基 因 轉 錄 轉 譯 或 其 他 修 飾, 及 能 量 代 謝 模 式 之 改 變 和 卵 母 細 胞 外 圍 的 卵 丘 細 胞 (cumulus cell) 交 互 作 用 等 多 種 生 化 反 應 許 多 未 成 熟 的 卵 母 細 胞 於 體 外 培 養 時, 大 部 分 都 可 恢 復 其 減 數 分 裂, 但 是 只 有 少 數 的 卵 母 細 胞 能 完 成 後 續 發 育, 這 可 能 是 由 於 卵 母 細 胞 之 細 胞 質 在 成 分 或 是 結 構 上 有 差 異, 例 如 : 粒 線 體 (mitochondria) 的 數 目 以 及 分 佈 的 不 均 及 異 常, 而 造 成 能 量 不 足 及 代 謝 異 常, 或 伴 隨 這 些 異 常 所 發 生 的 閉 鎖 現 象 (Krisher and Bavister, 1999), 不 理 想 的 體 外 成 熟 培 養 液 成 分 會 造 成 粒 線 體 移 入 細 胞 質 內 部 不 完 整 而 影 響 細 胞 質 的 成 熟 (Sun et al. 2001) ( 一 ) 調 控 卵 母 細 胞 成 熟 之 因 子 1. 內 泌 素 與 LH 潮 湧 FSH 在 濾 泡 發 育 過 程 中 首 先 刺 激 顆 粒 性 細 胞 (granular cells) 的 增 生 分 化 與 囊 腔 之 行 成, 同 時 刺 激 鞘 膜 細 胞 (theca cells) 協 同 分 泌 動 情 素 (estrogen), 動 情 素 的 濃 度 升 高 後 會 隨 著 體 循 環 回 流 至 腦 下 垂 體, 以 提 高 腦 下 垂 體 對 下 視 丘 分 泌 黃 體 激 素 釋 放 素 (luteinizing hormone-releasing hormone, LH-RH) 之 感 受 性, 再 經 由 正 回 饋 路 徑 引 發 LH 潮 湧, 而 促 使 濾 泡 中 的 prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 和 prostaglandin F 2α (PGF 2α ) 濃 度 大 幅 上 升 以 備 排 卵 (Pathway to Pregnancy and Parturition, 2 th edition) 高 濃 度 的 FSH 刺 激 可 使 體 外 的 卵 丘 細 胞 擴 散, 反 之, 於 體 內 則 無 法 誘 導 卵 丘 細 胞 擴 散, 而 高 濃 度 的 LH 和 hcg 於 體 外 亦 不 能, 可 知 早 期 的 腔 狀 濾 泡 (antral follicles) 於 體 外 能 反 應 FSH 之 作 用, 濾 泡 中 的 成 分 能 抑 制 卵 丘 細 胞 在 LH 潮 湧 前 擴 散 (Eppig, 1980) 哺 乳 動 物 卵 母 細 胞 於 體 內 成 熟 過 程 中 受 到 LH 潮 湧 而 使 停 留 於 第 一 次 減 數 4
分 裂 之 卵 母 細 胞 復 甦 並 誘 發 其 排 卵, 隨 之 卵 母 細 胞 中 的 cyclic adenosine monophosphate(camp) 也 跟 著 下 降 早 期 學 著 認 為, 在 卵 母 細 胞 上 並 不 具 有 LH 的 受 體, 卻 在 卵 丘 細 胞 及 顆 粒 細 胞 中 發 現 (Teerds and Dorrington, 1995), 而 在 後 期 的 研 究 中 顯 示, 在 小 鼠 的 卵 母 細 胞 也 同 樣 具 有 LH 受 體 的 存 在, 如 此 LH 直 接 作 用 於 卵 母 細 胞 的 可 能 性 大 幅 增 加 (Patsoula et al., 2001), 但 於 其 他 物 種 仍 有 待 證 實 卵 母 細 胞 在 排 卵 前 (preovulatory), 濾 泡 中 應 該 會 有 較 多 且 足 夠 的 LH 受 體 以 便 能 傳 遞 卵 母 細 胞 成 熟 的 誘 導 訊 息 (maturation-inducing signal) 進 入 卵 母 細 胞 中, 近 來 有 學 者 提 出, 可 能 有 體 細 胞 受 到 LH 刺 激 後 傳 遞 出 第 二 信 使 之 途 徑, 鞘 膜 細 胞 或 是 顆 粒 性 細 胞 會 分 泌 第 二 信 使 於 濾 泡 中 以 調 控 成 熟 過 程, 或 是 卵 丘 細 胞 將 訊 息 直 接 經 由 間 細 連 結 傳 遞 至 卵 母 細 胞 中 (Mattioli and Barboni, 2000) 文 獻 中 指 出,LH 的 刺 激 能 使 卵 母 細 胞 與 卵 丘 細 胞 的 訊 息 傳 遞 被 阻 斷, 而 降 低 卵 母 細 胞 中 的 camp 濃 度 以 致 減 數 分 裂 甦 醒, 此 乃 經 由 短 暫 調 控 Cx 蛋 白 之 磷 酸 化 與 其 含 量 ;Cx43 存 在 於 顆 粒 細 胞 ( 卵 丘 細 胞 ) 及 卵 母 細 胞 上,Cx43 蛋 白 質 轉 錄 作 用 受 到 LH 向 下 調 控, 此 與 PKA 抑 制 Cx43 蛋 白 質 轉 錄 相 呼 應, 以 LH 為 調 控 camp(ac PKA) 傳 遞 路 徑 之 初 始 信 息 LH 的 刺 激 也 可 以 活 化 卵 巢 中 濾 泡 細 胞 之 MAPK 活 性, 且 活 化 時 間 較 Cx43 磷 酸 化 更 早, 所 以 符 合 學 者 推 論 Cx43 磷 酸 化, 在 MAPK 阻 斷 濾 泡 細 胞 間 連 結 (gap junction) 傳 遞 過 程 中 扮 演 著 相 當 重 要 的 中 間 腳 色 (Granot et al.,2002;kalma et al., 2004; Sela-Abramovich et al., 2005) 於 體 外, 可 能 是 卵 母 細 胞 離 開 了 濾 泡 之 環 境 而 造 成 gap junction 斷 裂, 所 以 阻 斷 了 抑 制 減 數 分 裂 作 用 因 子 所 致, 而 卵 母 細 胞 的 完 整 的 GVBD 及 成 熟 過 程 之 作 用 機 制 則 尚 未 完 全 明 瞭 2. 成 熟 促 進 因 子 (maturation promoting factor, MPF) 1985 年 Fulka 等 人 把 第 一 次 減 數 分 裂 中 期 (MI stage) 與 GV 階 段 的 兩 種 卵 母 細 胞 融 合 (fusion) 後, 使 GV 階 段 的 卵 母 細 胞 核 發 生 GVBD 及 染 色 質 濃 5
縮 (chromatin condensation), 所 以 他 們 認 為 在 MI 時 期 的 卵 母 細 胞 含 有 促 進 卵 母 細 胞 恢 復 減 數 分 裂 的 因 子, 稱 其 為 成 熟 促 進 因 子 (maturation promoting factor, MPF), 其 結 構 主 要 為 蛋 白 質 激 酶 P34cdc2( 亦 稱 cdc2 或 CDK1) 與 細 胞 週 期 蛋 白 cyclin B 兩 種 次 單 元 (subunit) 結 合 之 複 合 體 (Motlik and Fubelka, 1990) 卵 母 細 胞 中 的 MPF 呈 現 活 化 與 不 活 化 兩 種 狀 態, 不 活 化 之 MPF(P34cdc2-cyclin B 複 合 體,pre-MPF) 主 要 存 在 於 G2 期 之 細 胞 中, 活 化 須 藉 由 P34cdc2 kinase 上 胺 基 酸 鍵 結 位 子 Threonine 14(Thr-14) Threosine 15(Thr-15) 及 Threonine 161(Thr-161) 經 磷 酸 化 (phosphorylation) 與 去 磷 酸 化 作 用 (dephosphorylation) 後 才 能 達 成 具 活 性 的 MPF 含 量 上 升 後, 會 使 卵 母 細 胞 恢 復 減 數 分 裂 並 開 始 進 行 GVBD 至 減 數 分 裂 中 期, 此 時 的 具 活 性 MPF 之 濃 度 達 到 高 峰, 但 是 受 到 CDK1 活 性 下 降 影 響, 會 有 短 暫 的 活 性 之 MPF 濃 度 下 降, 但 在 進 入 第 二 次 減 數 分 裂 時, 濃 度 又 會 回 到 最 大 值 (Fan and Sun, 2004) 3. 有 絲 分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) MAPK 家 族 包 含 細 胞 外 訊 息 調 控 蛋 白 激 酶 (extracellular signal regulated kinase, ERK) 及 緊 迫 活 化 蛋 白 激 酶 (stress-activated protein kinase, SAPK) MAPK 屬 於 serine/threonine 之 蛋 白 質 激 酶, 為 普 遍 真 核 生 物 之 重 要 訊 息 傳 遞 分 子 之 一, 經 由 其 上 游 激 酶 MAPK kinase(mapkk 或 MEK) 磷 酸 化 其 tyrosine 及 threonine 之 鍵 結 位 置 而 使 其 活 化,MAPK 一 般 在 GV 時 期 的 卵 母 細 胞 不 具 活 性, 於 GVBD 或 減 數 分 裂 復 甦 後 才 被 活 化, 而 其 活 性 會 在 MI 與 MII 時 期 維 持 高 峰 狀 態, 至 受 精 後 因 卵 母 細 胞 內 鈣 離 子 濃 度 增 加 使 得 protein kinase C(PKC) 路 徑 被 活 化 而 抑 制 MAPK 之 活 性 才 會 下 降 ERK/MAPK 至 少 包 含 五 種 型 式, 分 別 為 ERK1 ERK2 ERK3 ERK4 及 ERK5, 其 中 以 ERK1(p44 MAPK) 和 ERK2(p42 MAPK) 為 最 常 被 探 討, 從 文 獻 中 可 瞭 解 ERK/MAPK 與 減 數 分 裂 之 復 甦 和 卵 母 細 胞 激 活 後 訊 息 調 控 有 密 6
切 之 關 係, 且 為 參 與 卵 母 細 胞 成 熟 作 用 之 關 鍵 性 因 子 之 一 (Ito et al., 2004); MAPK 主 要 分 布 於 卵 母 細 胞 減 數 分 裂 時 紡 錘 體 兩 極 與 細 胞 質 內 微 管 組 織 中 心 (microtubular organizing center, MTOC;Verlhac et al., 1994), 因 MAPK 為 MTOC 之 功 能 組 成 份, 所 以 當 MAPK 活 性 變 化 後 連 帶 的 也 影 響 MTOC 功 能 改 變 與 微 管 重 組 有 絲 分 裂 中, 細 胞 核 分 裂 後,MPF 活 性 下 降, 染 色 質 去 濃 縮, 細 胞 邁 入 間 期 ; 但 於 卵 母 細 胞 兩 次 細 胞 分 裂 間, 雖 然 MPF 活 性 短 暫 降 低, 然 而 MAPK 活 性 自 MI 至 MII 期 間 卻 一 直 維 持 高 峰, 據 此 推 論 卵 母 細 胞 紡 錘 體 形 成 過 程 與 MII 休 止 期 是 由 於 高 活 性 之 MAPK 所 致, 亦 阻 止 了 紡 錘 體 微 管 向 間 期 狀 態 之 轉 化, 一 旦 MAPK 活 性 降 低, 微 管 即 會 發 生 重 組 (Sun et al., 2001) MAPK kinase 位 於 MAPK 上 游 (upstream) 之 調 控 者, 稱 為 MAPK-ERK kinase 或 MEK1, 可 有 效 磷 酸 化 MAPK 上 之 Thr-183 及 Thr-185, 屬 於 一 雙 特 異 性 轉 磷 酸 酶 (Crews et al., 1992), 而 MEK 也 是 經 由 磷 酸 化 過 程 而 致 活 ; 哺 乳 動 物 之 卵 母 細 胞 中, 其 上 游 調 控 致 活 者 為 MOS, 此 蛋 白 源 自 於 一 原 致 癌 基 因 (proto-oncogene)c-mos 儲 存 於 母 系 來 源 (maternal) 之 c-mos 將 會 隨 著 卵 母 細 胞 生 長 與 成 熟 而 進 行 轉 譯, 並 誘 導 一 連 串 MAPK 之 磷 酸 化 反 應 7
圖 1 哺 乳 動 物 卵 母 細 胞 在 成 熟 與 受 精 過 程 中 MAPK 活 性 之 變 化 (A) 部 分 為 囓 齒 類 動 物 卵 母 細 胞 自 發 性 的 減 數 分 裂 與 受 精 過 程 之 變 化 在 GVBD 後 MAPK ( 藍 線 ) 會 開 始 被 活 化 而 在 卵 母 細 胞 被 激 活 後 ( 如 : 受 精 ) 約 6-8 h,mapk 開 始 降 低 其 活 性, 此 特 性 於 體 外 受 精 與 孤 雌 激 活 也 可 觀 察 得 到 MAPK 在 MI 至 MII 期 活 性 皆 保 持 在 較 高 狀 態 下, 而 MPF( 紅 線 ) 之 活 性 則 在 卵 母 細 胞 由 MI 轉 換 至 MII 期 間 短 暫 且 小 幅 的 下 降 (B)FSH 可 誘 發 MAPK 影 響 活 性 減 數 分 裂 作 用, 8
於 小 鼠 卵 母 細 胞 之 成 熟 培 養 液 中 添 加 4 mm hypoxanthine(hx) 與 100 IU FSH, 其 結 果 顯 示 於 培 養 8 h 後 MAPK 之 活 性 開 始 上 升, 卵 母 細 胞 開 始 發 生 GVBD (C) 猪 卵 母 細 胞 之 培 養 液 中 添 加 GnRH 但 不 含 抑 制 減 數 分 裂 之 物 質 MAPK 之 活 性 於 培 養 18 h 被 活 化 (Fan and Sun, 2004) Figure 1. Changes of MAPK activity during mammalian oocyte maturation and fertilization. (A) Spontaneous meiotic maturation and fertilization in rodent oocytes. MAPK (blue line) is activated after GVBD and inactivated at approximately 6-8 h after activation, either by parthenogenetic stimulation or in vitro fertilization, MAPK remains high from MI tomiistage, whereas MPF (red line) activity drops temporarily between two metaphase. (B) FSH-induced changes of meiotic activity in MAPK. The maturation medium of mouse oocytes contains 4 mm hypoxanthine and 100 IU FSH, by which MAPK starts to be activated at 8 h after culture followed by the occurrence of GVBD of oocytes around 12 h after IVM. (C) Porcine oocytes cultured in the medium containing gonadotropin (GnRH) without meiotic inhibitor. MAPK is activated with the occurrence of GVBD at 18 h after maturation culture. (Modified from Fan and Sun, 2004) 三 犬 科 動 物 之 生 殖 與 排 卵 為 了 能 有 效 利 用 生 殖 生 物 技 術 在 研 究 與 臨 床 技 術 之 訓 練, 其 先 決 條 件 為 要 能 盡 可 能 準 確 的 決 定 排 卵 之 時 間, 現 今 有 許 多 方 法 已 被 用 來 估 計 排 卵 之 時 間, 如 母 犬 的 發 情 表 現, 陰 戶 出 血 是 被 廣 泛 用 來 預 測 排 卵 時 間 方 法 之 一, 但 這 兩 種 現 象 會 因 為 個 體 之 間 的 不 同 而 會 有 時 間 與 程 度 上 的 分 別, 並 且 母 犬 在 排 卵 前 的 三 到 五 天 就 願 意 與 公 犬 駕 乘, 因 此, 母 犬 在 動 情 週 期 的 行 為 改 變 並 不 能 正 確 的 預 測 排 卵 之 時 間 與 受 精 卵 發 育 之 程 度 9
四 犬 科 動 物 之 生 殖 週 期 不 同 於 鼠 科 與 兔 科 動 物 的 發 情 週 期 ( 鼠 : 4 ~ 5 天 ; 兔 : 8 ~ 15 天 ), 犬 科 動 物 的 乏 情 間 期 (Anestrus) 可 長 達 三 至 五 個 月, 在 乏 情 間 期 接 近 尾 端 時 雌 二 醇 (Estradiol, E 2 ) 會 有 一 段 小 波 峰 的 上 升 在 稍 微 下 降 至 發 情 前 期 的 開 始 ; 發 情 前 期 (Proestrus) 的 開 始 卵 巢 內 會 開 始 有 數 個 較 大 顆 濾 泡 存 在, 外 陰 部 會 開 始 腫 脹 也 會 有 些 微 的 血 液 排 出, 此 狀 況 會 維 持 七 至 九 天 的 時 間, 此 時 期 E 2 逐 漸 上 升 至 最 高 峰 後 伴 隨 的 LH 與 FSH 也 逐 漸 上 升, 在 發 情 前 期 結 束 後 母 犬 才 會 願 意 與 公 犬 交 配 當 LH 與 FSH 達 到 最 高 峰 時 便 是 發 情 期 (estrus) 的 開 始, 發 情 期 後 的 第 三 天 排 卵 (Ovulation) 動 作 便 會 完 成, 而 在 第 六 天 可 以 完 成 受 精 (Fertilization), 助 孕 激 素 (Progesterone, P 4 ) 也 在 進 入 發 情 期 時 開 始 逐 漸 上 升 一 直 持 續 到 乏 情 期 或 稱 發 情 間 期 (Diestrus, or Luteal phase) 達 到 最 高 量 不 管 受 孕 或 未 受 孕 的 母 犬 都 會 進 入 乏 情 期, 懷 孕 狀 態 並 不 會 改 變 乏 情 期 的 長 短, 而 P 4 濃 度 開 始 上 升 約 15 天 後 濃 度 會 開 始 下 降 母 犬 在 乏 情 期 時 也 常 發 生 假 懷 孕 (Pseudopregnancy) 的 現 象 ( 參 考 Pathway to Pregnancy and Praturition 2nd edition)( 圖 2) 10
圖 2 母 犬 之 生 殖 週 期 乏 情 間 期 : 長 時 間 的 乏 情 間 期 負 責 生 殖 週 期 的 更 新 循 環 發 情 前 期 : 在 發 情 期 開 始 前 E 2 逐 漸 上 升 至 最 高 峰 發 情 期 : 短 暫 的 E2 高 峰 過 後 伴 隨 發 情 行 為 的 開 始, 當 LH 與 FSH 達 到 最 高 峰 時 即 是 發 情 期 的 開 始, 發 情 期 後 的 第 三 天 完 成 排 卵 動 作, 而 在 第 六 天 可 以 完 成 受 精,P 4 也 在 進 入 發 情 後 期 時 開 始 逐 漸 上 升 轉 而 進 入 黃 體 期 乏 情 期 : 不 論 受 孕 或 未 受 孕 的 母 犬 都 可 能 會 進 入 乏 情 期, 於 母 犬 懷 孕 狀 態 並 不 會 改 變 乏 情 期 的 長 短,P 4 濃 度 開 始 上 升 15 天 後 濃 度 會 開 始 下 降, 母 犬 在 乏 情 期 時 也 常 發 生 假 懷 孕 的 現 象 (Pathway to Pregnancy and Praturition 2nd edition) Figure 2. The reproductive cycle of bitch. Anestrus: This long anestrus period is responsible for a cyclic profile of three cycles. Proestrus: Estradiol(E 2 ) gradually increases and peaks slightly before the onset of estrus. Estrus: Shortly after peak E 2, behavioral estrus begins. Both LH and FSH peak in early estrus. Ovulation is completed at about the third day and fertilization is completed at about sixth day. Progesterone(P 4 ) increases during the latter part of estrus signifying luteinization. Diestrus: Both pregnant and open bitches are considered to be in diestrus. 11
Pregnancy status does not alter the length of diestrus. P 4 peaks at about 15 days then decreases gradually. Bitches that do not become pregnant are often considered to be pseudopregnant. (modified from: Pathway to pregnancy and praturition 2th revised edition ) 五 犬 科 動 物 卵 母 細 胞 之 成 熟 在 排 卵 前 幾 天 血 液 中 P 4 濃 度 開 始 上 升, 當 P4 濃 度 達 到 最 高 時 LH 的 量 也 開 始 上 升 使 其 排 卵 形 成 黃 體 化, 這 對 於 非 季 節 性 單 次 動 情 週 期 (monoestrus cycle) 的 犬 科 動 物 是 非 常 典 型 的 生 理 激 素 變 化 除 此 之 外, 犬 科 動 物 有 別 於 其 他 哺 乳 動 物 : 犬 科 動 物 將 卵 母 細 胞 排 出 濾 泡 進 入 輸 卵 管 中 時, 卵 母 細 胞 尚 處 於 未 成 熟 狀 態 ( 又 稱 原 泡 核 期 germinal vesicle, GV) Reynaud et al.,(2005) 發 現 在 排 卵 後 的 24 到 48 h, 卵 母 細 胞 已 經 從 輸 卵 管 近 端 移 往 中 間 部 分, 但 是 卵 母 細 胞 仍 然 處 於 未 成 熟 之 狀 態 (GV stage), 卵 母 細 胞 在 排 卵 後 48 h 發 現 開 始 恢 復 減 數 分 裂 並 進 入 M I stage 然 而, 第 一 個 成 熟 卵 母 細 胞 (M II stage) 卻 是 在 排 卵 後 的 48 到 54 h 的 輸 卵 管 發 現 (Tsutsui, 1975; Reynaud et al., 2005), 而 其 直 徑 介 於 86 到 135 μm 之 間, 平 均 值 約 為 110 μm (Holst and Phemister, 1971; Reynaud et al., 2005) 12
圖 3 卵 母 細 胞 與 濾 泡 之 生 成 ( 資 料 來 源 :Mehlmann, 2005) Figure 3. The progression of oogenesis and folliculogenesis. (Modified from Mehlmann, 2005) 六 犬 科 動 物 卵 母 細 胞 受 精 與 胚 之 形 成 犬 科 動 物 的 卵 與 胚 胎 生 物 學 與 其 他 哺 乳 動 物 者 不 同, 並 且 還 有 很 大 的 空 間 值 得 我 們 去 探 討 與 研 究 在 母 犬, 每 一 次 的 排 卵 數 約 6 到 12 個 之 間, 但 是 排 卵 的 時 間 可 以 延 伸 到 超 過 24 甚 至 36 h, 因 為 排 卵 之 時 間 缺 乏 一 致 性, 可 能 導 致 在 單 一 囊 胚 群 中 可 以 觀 察 到 不 同 成 長 時 期 之 囊 胚 群 雖 然 在 大 部 分 的 雌 性 哺 乳 動 物 排 出 的 卵 母 細 胞 都 處 於 已 成 熟 狀 態, 但 在 母 犬 所 排 出 的 卵 母 細 胞 仍 然 停 留 於 減 數 分 裂 前 期 的 第 一 期, 接 下 來 處 於 原 泡 核 期 的 卵 母 細 胞 會 在 輸 卵 管 中 停 留 54-60 h 達 到 MII 時 期, 此 時 的 卵 母 細 胞 才 達 到 成 熟 可 以 受 精 之 階 段 此 後, 受 精 作 用 發 生 在 排 卵 後 48 至 83 h 之 輸 卵 管 間, 有 些 研 究 也 已 提 出 精 子 進 入 犬 科 動 物 的 卵 母 細 胞 可 以 發 生 在 減 數 分 裂 尚 未 完 成 之 未 成 熟 的 卵 母 細 胞 中 (Van der Stricht, 1923; Farstad et al., 1993), 如 此 非 典 型 的 受 精 形 式 確 實 可 以 在 各 期 之 卵 巢 收 集 而 來 的 卵 母 細 胞 於 體 外 時 可 以 觀 察 得 到, 但 在 利 用 共 軛 焦 顯 微 鏡 觀 察 之 於 體 內 受 精 之 受 精 卵, 發 現 其 實 這 種 現 象 發 生 在 體 內 是 非 常 例 外 的 狀 況, 從 30 隻 已 配 種 的 母 犬 所 沖 出 的 13
112 個 尚 未 成 熟 的 卵 母 細 胞 只 有 從 同 一 隻 母 犬 中 的 未 成 熟 的 卵 母 細 胞 觀 察 到 三 個 有 發 生 受 精 作 用 (Reynaud et al., 2005), 如 同 其 他 哺 乳 動 物, 在 體 內 除 非 犬 科 動 物 的 卵 母 細 胞 已 成 熟 至 M II 時 期, 否 則 精 子 並 不 會 穿 過 透 明 帶 進 入 卵 母 細 胞 在 排 卵 後 3~5 天 可 以 找 到 含 有 兩 顆 原 核 時 期 的 早 期 胚, 而 在 排 卵 後 4~7 天 可 以 觀 察 到 二 細 胞 期 八 細 胞 期 的 基 因 組 之 主 要 活 動 在 排 卵 後 的 4.5 到 12 天 間 發 生, 排 卵 後 8.5 到 10 天 之 間, 發 育 中 的 胚 群 開 始 進 入 桑 葚 胚 並 且 滑 入 子 宮 角 中, 與 其 他 哺 乳 動 物 相 較 下, 犬 科 動 物 的 受 精 卵 在 輸 卵 管 中 花 上 較 長 的 時 間, 如 其 63 天 的 總 懷 孕 期 就 有 9 天 於 輸 卵 管 中, 而 母 牛 的 總 懷 孕 天 數 為 280 天, 第 一 顆 排 出 輸 卵 管 的 胚 在 第 4 天 時 被 發 現 排 卵 後 的 10 到 12 天 間 開 始 出 現 發 育 完 整 的 囊 胚, 擴 張 囊 胚 則 在 16 至 20 天 間 發 生, 而 擴 張 囊 胚 大 小 約 在 2.5 mm, 而 在 18 到 21 天 間 開 始 著 床, 雖 然 與 母 牛 的 受 精 卵 進 入 子 宮 角 的 時 間 和 在 排 卵 後 16 到 19 天 開 始 著 床 相 較 下 其 時 間 似 乎 較 長 也 晚, 但 在 仔 細 探 討 犬 科 動 物 的 卵 及 囊 胚 的 發 育 過 程, 與 本 身 並 不 會 太 慢, 因 為 犬 科 動 物 在 排 卵 後 48 到 72 h 後 才 有 受 精 作 用, 所 以 期 囊 胚 的 發 育 必 須 在 受 精 後 才 開 始 計 算 然 而, 犬 科 動 物 的 囊 胚 有 一 個 值 得 探 討 與 其 他 種 類 不 同 的 特 色 即 是 可 以 在 同 一 囊 胚 群 中 同 時 發 現 八 細 胞 期 與 未 退 化 的 二 細 胞 期 胚, 因 為 排 卵 之 時 間 可 以 從 0 h 延 長 至 36 h 才 會 造 成 這 些 少 數 不 同 的 發 育 程 度 (Boyd et al., 1993; Marseloo et al., 2004) 犬 科 動 物 的 卵 母 細 胞 與 囊 胚 相 較 於 其 他 多 數 的 哺 乳 動 物, 長 時 間 停 留 於 輸 卵 管 中 ( 犬 :8-10 天, 猪 :2 天, 牛 與 鼠 :3-4 天 ), 除 此 之 外, 囊 胚 發 育 也 相 對 更 緩 慢, 而 著 床 的 時 間 更 是 接 近 在 排 卵 後 的 18-20 天 14
After ovulation 72-124 h (3-5 days) Two-pronucleus stage 96-168 h (4-7 days) two-cell stage 122 and 288 h (4.5-12 days) eight-cell stage 8.5 and 10 days morula stage 10-12 days blastocysts 16 and 20 days Hatching or hatched 圖 4 犬 科 動 物 胚 於 輸 卵 管 之 發 育 天 數 ( 資 料 來 源 :Boyd et al., 1993; Marseloo et al., 2004) Figure 4. Days of maximum development of canine embryo in the oviduct.(modified from Boyd et al., 1993 and Marseloo et al., 2004) 七 犬 胚 之 發 育 ( 一 ) 體 內 體 內 產 製 的 囊 胚 主 要 藉 由 沖 洗 經 過 超 級 排 卵 或 無 並 且 完 成 受 精 作 用 之 母 犬 生 殖 道 所 收 集 而 來 而 這 些 收 集 而 來 的 囊 胚 則 會 轉 植 進 入 另 一 隻 其 生 理 週 期 與 囊 胚 捐 贈 者 相 同 ( 自 發 性 或 誘 發 性 ) 的 代 理 孕 母 之 生 殖 道 中, 而 此 一 技 術 已 相 當 普 遍 用 於 產 製 小 牛, 但 運 用 於 犬 科 動 物 身 上 卻 遭 遇 到 許 多 的 困 難 在 經 過 適 當 的 超 級 排 卵 處 理 後 的 許 多 種 類 的 雌 性 動 物 捐 卵 者 ( 如 : 牛 羊 人 類 與 貓 等 ), 相 較 於 一 般 未 經 處 理 的 個 體 預 期 可 以 收 集 到 更 多 的 卵 或 胚 數 量, 然 而 此 一 誘 發 的 超 級 排 卵 作 用 運 用 於 母 犬 卻 得 不 到 相 同 的 效 果, 在 自 然 動 情 週 期 狀 態 下 沒 有 經 過 超 級 排 卵 的 處 理, 平 均 可 以 從 每 一 隻 母 犬 收 集 到 6~8 顆 品 質 較 好 的 囊 胚, 而 這 項 技 術 運 用 在 其 他 種 類 動 物 身 上 最 需 克 服 的 則 為 動 物 解 剖 學 與 胚 胎 生 物 學 上 的 技 術 問 題, 在 犬 科 動 物 也 不 例 外 在 排 卵 後 的 第 九 天, 因 為 受 精 卵 還 停 留 在 輸 卵 管 中, 所 以 沖 胚 的 位 置 要 從 輸 卵 管 頂 部 開 始, 而 這 必 須 經 由 有 侵 入 性 的 外 科 手 術 來 操 15
作, 若 是 要 收 集 較 後 期 的 囊 胚, 亦 是 在 排 卵 的 十 天 後, 囊 胚 群 已 進 入 子 宮 角 中, 而 此 時 可 以 利 用 導 尿 管 插 入 陰 道 經 過 子 宮 頸 沖 洗 子 宮 角 此 種 非 侵 入 性 的 手 術 方 式 收 集 然 而, 儘 管 沖 胚 液 經 由 單 一 方 向 從 宮 管 交 接 處 經 子 宮 角 往 子 宮 體 方 向 沖 洗 無 論 是 否 有 侵 入 性 或 無 侵 入 性, 從 卵 巢 上 之 黃 體 數 預 期 可 以 回 收 到 的 囊 胚 數 量, 在 經 過 此 種 方 式 收 集 後 回 收 率 通 常 都 在 30~40% 之 間 (Archbald et al., 1980; Tsutsui et al., 2001b), 而 造 成 如 此 低 的 回 收 率 有 可 能 是 因 為 當 時 母 犬 的 生 理 週 期 為 了 讓 受 精 卵 能 順 利 著 床 於 子 宮 角 黏 液 膜 的 皺 摺 中, 其 子 宮 內 膜 肥 大 之 關 係 若 是 將 生 殖 道 移 出 體 外 ( 如 母 犬 結 紮 手 術 ) 進 行 沖 胚 手 術 即 可 大 大 提 升 囊 胚 的 回 收 率, 但 選 擇 此 種 方 式 則 會 犧 牲 掉 母 犬 在 實 驗 上 最 實 際 的 利 益 價 值 從 母 犬 收 集 而 來 如 此 少 量 的 囊 胚, 根 據 其 形 態 學 的 特 點 至 少 能 夠 有 80 ~ 90 % 之 囊 胚 能 夠 繼 續 正 常 發 育 下 去 (Tsutsui et al., 1975; Tsutsui and Ejima, 1988; Shimizu et al., 1990; Tsutsui et al., 2006) 藉 由 超 級 排 卵 的 方 式 在 乏 情 期 時 ( 約 六 個 月 ) 短 時 間 內 誘 發 發 情 排 卵 以 提 升 胚 的 數 量, 目 前 為 止 在 母 犬 身 上 作 用 並 不 大 (Kutzler et al., 2005), 但 若 是 母 犬 正 值 發 情 時 期 ( 或 前 期 ), 利 用 賀 爾 蒙 處 理 不 僅 可 以 縮 短 發 情 的 時 間 更 可 以 獲 得 更 多 的 受 精 卵 Kutzler (2005, 2007) 在 他 的 文 章 中 以 用 於 其 他 種 動 物 不 同 方 式 之 超 級 排 卵 ( 包 含 使 用 progestogens, oestrogens 與 gonadotropins) 運 用 於 母 犬, 證 明 了 許 多 在 犬 科 動 物 上 的 限 制 也 有 多 項 成 功 的 例 子 常 用 可 直 接 刺 激 多 巴 胺 受 體 的 藥 劑 處 理 使 其 發 情, 母 犬 需 要 長 時 間 不 間 斷 處 理 且 費 用 過 高, 而 其 成 效 則 由 母 犬 本 身 的 乏 情 期 階 段 來 決 定 現 在 已 經 被 發 現 最 有 希 望 的 合 成 藥 物 非 性 腺 激 素 釋 放 素 促 進 劑 (gonadotrophin-releasing hormone, GnRH, agonists) 莫 屬 了, 而 其 最 主 要 之 商 品 則 為 Deslorelin(Kutzler, 2005; Kutzler et al., 2009) 這 樣 的 機 制 與 技 術, 發 展 成 熟, 不 僅 能 誘 發 母 犬 發 情 排 卵, 同 樣 能 運 用 於 代 理 孕 母 的 同 期 化, 發 情 同 期 化 的 主 要 目 的 是 希 望 能 在 一 大 數 量 雌 性 動 物 群 中 要 求 他 們 的 自 然 生 理 週 期 能 在 同 一 個 時 間 點 上 發 生, 所 以 在 犬 科 動 物 至 少 能 有 一 個 或 多 個 的 排 卵 時 間 與 捐 卵 者 相 同 以 作 為 受 卵 者, 捐 卵 者 與 受 卵 者 排 卵 時 間 不 得 超 過 1 至 2 天 得 以 獲 得 16
預 期 的 懷 孕 結 果 (Tsutsui et al., 2001a, 2001b) 囊 胚 的 冷 凍 或 許 也 意 味 著 能 自 由 的 控 制 與 選 擇 發 情 周 期 在 牛 與 猪 其 囊 胚 的 細 胞 質 含 有 高 量 的 脂 肪 已 經 干 擾 到 囊 胚 在 經 過 冷 凍 後 復 甦 的 能 力 (Nagashima et al., 1995; Diez et al., 2001), 在 犬 科 動 物 囊 胚 的 細 胞 質 中 尤 其 含 有 豐 富 的 脂 肪, 冷 凍 後 存 活 的 機 會 更 是 相 對 的 渺 茫, 不 過 Kim et al.,(2002) 收 集 在 交 配 後 第 13 天 的 囊 胚 在 經 過 冷 凍 後 的 8 顆 囊 胚 試 圖 轉 殖 在 代 理 孕 母 身 上, 但 並 未 獲 得 出 生 之 小 狗 無 論 是 那 一 種 技 術, 囊 胚 的 收 集 與 後 續 的 胚 轉 置 是 成 功 率 如 此 低 之 手 術, 而 犬 胚 的 體 內 產 製 仍 然 處 於 無 效 率 的 狀 態, 單 與 歐 洲 每 年 轉 植 入 約 十 萬 顆 體 內 產 製 之 牛 胚 其 懷 孕 率 約 60 % 相 比, 把 五 篇 與 犬 胚 移 置 相 關 文 獻 統 合 後, 包 含 57 代 理 孕 母 卻 不 超 過 45 隻 小 狗 出 生 (Kinney et al., 1979; Tsutsui et al., 1989, 2001a, 2001b, 2006; Kim et al., 2002) 因 為 從 子 宮 角 沖 胚 而 其 囊 胚 回 收 率 如 此 低 也 因 為 將 早 期 胚 轉 植 於 輸 卵 管 的 技 術 相 當 困 難,Tsutsui 等 在 2001 將 52 顆 在 合 子 到 八 細 胞 胚 時 期 植 入 於 13 隻 代 理 孕 母 的 子 宮 角 中, 共 有 四 隻 母 犬 懷 孕 並 有 六 隻 小 狗 成 功 地 出 生, 而 此 種 將 早 期 胚 提 早 轉 植 於 子 宮 內 的 做 法, 在 人 類 試 管 嬰 兒 之 囊 胚 轉 植 已 經 是 一 普 遍 並 高 效 率 之 方 法 轉 植 體 內 產 製 囊 胚 技 術 之 發 展, 有 可 能 提 升 不 適 合 在 體 內 懷 孕 足 月 但 在 遺 傳 學 上 有 用 的 母 犬 後 代, 尤 其 適 合 有 流 產 歷 史 或 是 長 期 伴 有 產 科 疾 病 之 犬 種 例 如 : 經 常 必 須 藉 由 帝 王 切 開 術 (Caesarean section) 以 幫 助 生 產 的 英 國 鬥 牛 犬, 則 可 利 用 此 一 技 術 收 集 其 囊 胚 轉 植 入 較 容 易 生 產 幼 犬 的 米 格 魯 品 種 之 代 理 孕 母 體 內 中 而 此 種 情 況 也 提 供 一 個 評 估 胎 兒 在 妊 娠 期 間 處 於 一 個 特 殊 的 母 體 環 境 與 養 育 方 式 所 帶 來 之 影 響 之 機 會 另 一 方 面, 在 著 床 前 的 胚 移 植 可 能 也 有 助 於 解 決 基 因 上 的 缺 陷 在 犬 科 動 物, 突 變 之 原 因 已 經 證 實 是 許 多 的 遺 傳 缺 陷 所 造 成, 包 括 了 眼 盲 耳 聾 肌 肉 萎 縮 症 腎 臟 疾 病 與 多 種 的 神 經 性 疾 病, 因 為 這 些 缺 陷 是 可 經 由 分 子 鑑 定 的, 胚 裏 異 常 的 基 因 在 殖 入 代 理 孕 母 體 內 前 就 可 以 先 行 鑑 定 出 來, 如 果 在 冷 凍 犬 胚 的 技 術 能 夠 發 展 成 熟, 遺 傳 物 質 的 交 流 與 保 存 也 將 是 可 行 的 而 在 某 些 品 種 上 利 用 分 子 17
篩 選 技 術 也 可 運 用 於 毛 色 毛 髮 長 度 以 及 尾 巴 長 度 之 選 擇 (Tsutsui et al., 2001) ( 二 ) 體 外 因 犬 科 動 物 生 殖 週 期 大 份 時 間 處 於 乏 情 期, 所 以 犬 卵 母 細 胞 最 常 於 乏 情 期 卵 巢 之 濾 泡 取 得, 而 在 經 過 72-96 小 時 的 培 養 其 成 熟 率 仍 然 相 當 的 低 (10-20%) (Luvoni et al., 2005; Songsasen and Wildt, 2007), 而 未 排 出 濾 泡 的 卵 母 細 胞 在 刺 破 濾 泡 後 其 成 熟 率 大 約 只 能 達 到 30% (Yamada et al., 1993) 經 過 成 熟 之 階 段 後, 讓 精 子 與 卵 丘 卵 母 細 胞 複 合 體 接 觸 後 則 完 成 的 體 外 授 精 之 過 程, 如 上 所 述, 在 體 內 之 受 精 率 非 常 的 高 而 且 目 前 為 止 並 未 發 現 有 多 精 入 卵 之 現 象, 相 反 地, 所 有 的 卵 母 細 胞 從 成 熟 到 受 精 的 整 個 過 程 中, 在 體 外, 進 入 卵 子 之 精 子 只 達 到 10-50%, 而 能 形 成 正 常 的 兩 個 原 核 只 佔 4-10%(Mahi and Yanagimachi, 1976; Saint-Dizier et al., 2001; Hatoya et al., 2006a; De los Reyes et al., 2009), 而 且 在 體 外 受 精 時 可 以 觀 察 到 如 戲 劇 性 地 高 多 精 入 卵 率,60 個 的 卵 母 細 胞 進 行 體 外 受 精, 有 47% 的 卵 母 細 胞 被 2~12 個 精 子 穿 透, 平 均 一 個 卵 子 含 有 3.3 個 精 子 (Saint-Dizier et al., 2001; Hatoya et al., 2006a) 因 此, 犬 胚 的 體 外 產 製 技 術 仍 未 完 善 胚 在 四 細 胞 到 八 細 胞 期 時 具 有 阻 滯 期 (Yamada et al., 1992; Hori and Tsutsui, 2003),maternal zygotic transition(mzt), 只 有 少 數 的 犬 胚 發 育 至 桑 葚 胚 與 囊 胚 之 文 章 被 發 表 過, 而 其 發 育 率 大 約 只 有 0.5%(Otoi et al., 2000; Hatoya et al., 2006a) 根 據 England 等 人 在 2001 年 時 發 表 的 資 料 顯 示, 將 體 外 生 產 的 犬 胚 轉 植 於 代 理 孕 母 體 中, 只 有 一 隻 懷 孕 (1/90) 但 卻 於 第 36 天 時 流 產 單 一 精 子 卵 質 內 顯 微 注 射 (Intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 或 許 可 以 同 時 解 決 低 受 精 率 和 高 多 精 入 卵 率 的 問 題, 可 是 在 犬 科 動 物 有 關 ICSI 方 面 的 研 究 很 少, 而 在 Fulton et al.,(1998) 研 究 中, 經 過 顯 微 注 射 的 卵 母 細 胞 能 形 成 兩 個 原 核 者 僅 約 8%, 這 些 用 來 顯 微 注 射 的 38 個 卵 母 細 胞 之 週 期 多 處 於 減 數 分 裂 前 期 無 論 是 使 用 IVF 或 是 ICSI, 其 成 效 都 相 當 有 限, 主 要 原 因 是 犬 卵 之 體 外 成 熟 率 相 18
當 的 低, 而 幸 運 成 熟 的 卵 在 胚 的 發 育 能 力 以 及 品 質 都 相 當 不 理 想 八 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑 對 卵 母 細 胞 減 數 分 裂 機 制 之 調 控 Indirubin-3 -oxime(io) 為 傳 統 的 中 草 藥 當 歸 龍 薈 丸 (Danggui Longhui Wan) 之 組 成 分 之 一, 早 期 主 要 用 於 癌 症 的 治 療 研 究 上, 如 慢 性 骨 隨 性 白 血 球 病 (chronic myelocytic leukemia)(ma and Yao, 1983;Hoessel et al., 1999); 其 對 於 CDK1/2 的 活 性 與 肝 醣 合 成 激 酶 3(glycogen synthase kinase-3,gsk-3) 磷 酸 化 之 活 性 具 有 抑 制 作 用, 並 能 有 效 抑 制 CDK 之 磷 酸 化 而 調 控 細 胞 週 期 G2/M 期 之 轉 換, 藉 此 降 低 細 胞 增 生 速 率, 阻 止 細 胞 由 G2 期 進 入 M 期, 以 抑 制 細 胞 增 生 ; 癌 症 即 是 由 於 細 胞 周 期 失 去 正 常 的 調 控 而 產 生 之 疾 病, 因 此 藉 由 IO 抑 制 細 胞 週 期 之 進 行, 而 阻 止 癌 細 胞 之 增 加 IO 之 作 用 機 制 主 要 是 利 用 凡 德 瓦 力 (van der Waals interactions) 及 氫 鍵 結 合 與 ATP-binding site 競 爭 CDK 上 之 結 合 位 置 (Hoessel et al., 1999), 使 得 MPF 無 法 被 活 化 或 失 去 活 性, 使 得 卵 母 細 胞 無 法 行 GVBD 並 恢 復 減 數 分 裂 (Hsieh et al., 2006) 此 外 經 研 究 發 現,IO 不 僅 能 抑 制 CDK 之 活 性, 對 於 GSK-3 具 有 相 同 作 用, 此 一 反 應 能 藉 由 調 控 Wnt 訊 息 傳 遞 路 徑 而 有 效 維 持 人 類 及 小 鼠 胚 幹 細 胞 之 多 能 性 (Damiens et al., 2001) 大 多 數 之 CDK 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑, 如 6-dimethylaminopurine(6-DMAP) 為 一 種 puromycin analog, 是 蛋 白 質 激 酶 抑 制 劑, 非 專 一 性 轉 磷 酸 酶 劑, 可 藉 由 抑 制 p34 cdc2 進 行 磷 酸 化 作 用 而 降 低 MPF 之 活 性, 並 可 阻 止 卵 母 細 胞 行 GVBD, 且 對 蛋 白 質 的 合 成 並 無 任 何 之 影 響 (Avery et al., 1998; Neant and Guerrier, 1988; Rime et al., 1989; Sirard et al., 1998 ; Fulka et al., 1991) Roscovitine 主 要 作 用 為 抑 制 cdc2 蛋 白 質 激 酶, 藉 與 p34 cdc2 kinase 競 爭 ATP-binding site 進 而 阻 止 p34 cdc2 行 磷 酸 化 作 用, 則 可 抑 制 卵 母 細 胞 GVBD 與 減 數 分 裂 之 進 行 (Faerge et al., 2001; Flament et al., 2000; Marchal et al., 2001; Mermillod et al., 2000 ; Krischek and Meinecke, 2001; Ju et al., 2003) Butyrolactone I (BL I) 則 是 屬 於 CDK 家 族 專 一 性 的 抑 制 劑, 可 19
抑 制 cdk2 cdc2 及 cdk5 之 活 性, 與 p34 cdc2 競 爭 ATP-binding site 而 阻 止 p34 cdc2 進 行 磷 酸 化 作 用, 進 而 抑 制 MPF 致 活, 可 使 哺 乳 動 物 的 卵 母 細 胞 停 留 於 GV 時 期, 而 對 其 他 蛋 白 質 激 酶 如 MAP kinase 或 蛋 白 質 激 酶 A(protein kinase A, PKA) 與 蛋 白 質 激 酶 C (protein kinase C, PKC) 亦 有 少 許 抑 制 作 用 (Kitagawa et al., 1993; Kubelka et al., 2000; Lonergan et al., 2000; Meijer et al., 1997; Mermillod et al., 2000; Motlik et al., 1998;) 上 述 常 用 之 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑 皆 具 有 多 數 之 研 究 證 實, 能 有 效 調 控 卵 母 細 胞 細 胞 週 期 之 抑 制 作 用 具 有 可 逆 性, 然 而 有 關 IO 於 此 一 方 面 之 研 究 甚 少 目 前 發 現, 以 濃 度 75 μμ 之 IO 處 理 22 h 能 有 效 抑 制 猪 卵 母 細 胞 之 GVBD(96%), 且 藥 物 移 除 後 之 成 熟 比 率 可 達 65%(Hsieh et al., 2006), 然 而 其 後 續 囊 胚 發 育 能 力 卻 顯 著 偏 低, 是 以 IO 處 理 之 最 佳 化 濃 度 仍 有 待 更 進 一 步 研 究 此 外 於 細 胞 試 驗 中, 以 所 需 抑 制 50% 酵 素 活 性 (IC 50 ) 之 代 謝 試 驗 可 知,IO 之 所 需 濃 度 較 roscovitine 與 BL I 為 低, 故 推 論 其 於 抑 制 MPF 活 性 上, 可 能 具 有 更 強 之 活 性 20
試 驗 研 究 21
一 前 言 哺 乳 動 物 於 出 生 時, 卵 巢 內 卵 母 細 胞 便 停 留 於 prophasesⅠ 期, 在 達 到 性 成 熟 發 身 前, 其 染 色 質 會 散 佈 於 巨 大 之 細 胞 核 中, 當 動 物 發 身 後 濾 泡 可 以 完 成 生 長, 經 由 LH 之 刺 激 卵 母 細 胞 會 開 始 進 行 減 數 分 裂 復 甦 減 數 分 裂 會 伴 隨 著 原 泡 核 崩 解 (GVBD) 染 色 質 濃 縮 以 及 釋 出 第 一 極 體, 停 止 於 第 二 次 減 數 分 裂 中 期, 而 卵 母 細 胞 成 熟 主 要 受 到 MPF 調 控 MPF 是 由 p34 cdc2 -cyclin B 之 複 合 體 所 組 成, 需 經 磷 酸 化 與 去 磷 酸 化 作 用 後 致 活 (Labbe et al., 1989; Draetta et al., 1989) Indirubin-3 -oxime 為 一 CDK 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑, 主 要 是 藉 由 與 ATP 競 爭 p34 cdc2 kinases 上 之 ATP binding site(hoessel et al., 1999), 進 而 阻 斷 其 磷 酸 化 作 用, 導 致 MPF 無 法 致 活, 而 抑 制 卵 母 細 胞 GVBD, 此 一 作 用 有 利 於 原 泡 核 轉 置 並 改 善 卵 母 細 胞 後 續 發 育 能 力 另 外, 以 濾 泡 之 發 育 和 卵 母 細 胞 之 原 泡 核 (GV) 形 態 來 探 討 犬 卵 母 細 胞 體 外 成 熟 之 可 行 性 本 研 究 目 的 為 參 考 Hsieh et al.,(2006) 與 沙 (2007) 之 步 驟 並 利 用 IO 最 佳 化 之 濃 度, 針 對 猪 卵 母 細 胞 減 數 分 裂 抑 制 復 甦 之 效 率 與 經 激 活 後 體 外 發 育 之 潛 能, 並 觀 察 犬 卵 母 細 胞 經 IO 處 理 後 體 外 發 育 之 能 力 二 材 料 與 方 法 ( 一 ) I. 猪 卵 巢 與 卵 母 細 胞 之 取 得 試 驗 中 所 使 用 之 女 猪 卵 巢 取 自 於 台 中 市 肉 品 市 場, 經 過 放 血 脫 毛 取 出 內 臟 後 迅 速 以 實 驗 用 剪 刀 將 子 宮 角 上 端 之 無 充 血 與 囊 腫 的 卵 巢 剪 下, 經 過 簡 易 清 洗 後 放 入 36~39 含 有 300,000 IU/ml 青 黴 素 懸 浮 液 之 生 理 食 鹽 水 溶 液 中 ( 0.9% NaCl, w/v, 南 光 化 學 ), 於 保 溫 杯 中 攜 回 實 驗 室 ; 再 以 相 同 之 水 溶 液 清 洗 2~3 回 後 置 於 39 水 浴 槽 中 保 溫, 以 徑 寬 較 大 之 18 G 針 頭 搭 配 10 ml 針 筒, 藉 由 負 壓 抽 取 3~7 mm 大 小 之 濾 泡, 回 收 濾 泡 液 於 15 ml 離 心 管 中 靜 置 數 分 鐘, 待 濾 泡 液 中 的 卵 母 細 胞 等 組 織 沉 澱 於 管 底, 底 部 之 濾 泡 液 置 於 100 mm 培 養 皿 22
上, 透 過 解 剖 顯 微 鏡 下 觀 察, 挑 選 出 包 復 完 整 之 卵 丘 卵 母 細 胞 複 合 體 ( cumulus-oocyte complexes, COCs ) 暫 存 於 恆 溫 39 之 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 ( Dulbecco s phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco Cat. No. 21600-010 ) 中, 直 至 完 成 所 需 COCs 之 挑 選 後, 旋 即 進 行 後 續 之 體 外 成 熟 培 養 Ⅱ. 犬 卵 巢 與 卵 母 細 胞 之 取 得 試 驗 中 所 使 用 之 母 犬 卵 巢 主 要 取 自 台 中 彩 虹 以 及 慈 濟 動 物 醫 院, 以 腹 腔 切 開 去 除 子 宮 與 卵 巢 之 節 育 手 術 取 得 各 齡 層 之 犬 卵 巢 術 後 卵 巢 之 處 理 同 猪 卵 巢, 但 以 無 菌 手 術 刀 片 將 犬 卵 巢 於 解 剖 顯 微 鏡 下 重 複 細 切, 透 過 解 剖 顯 微 鏡 下 觀 察, 挑 選 出 包 復 完 整 之 卵 丘 卵 母 細 胞 複 合 體 ( cumulus-oocyte complexes, COCs ) 暫 存 於 恆 溫 39 之 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 ( Dulbecco s phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco Cat. No. 21600-010 ) 中, 直 至 挑 選 所 需 之 COCs 完 畢 後, 供 後 續 使 用 ( 二 ) 猪 卵 母 細 胞 之 體 外 成 熟 猪 卵 母 細 胞 體 外 成 熟 培 養 液 之 製 備 是 以 North Caroline State University-23 ( NCSU-23 ) ( 表 一 ) 為 基 礎 培 養 液 再 額 外 添 加 下 類 成 分 : NCSU-23 (+): - 10% porcine follicular fluids ( 高 速 離 心 後 過 濾 各 兩 次, 分 裝 後 藏 於 - 20 中 保 存 ) - 0.1 mg/ml Cyctein (sigma-c8152) - 10 ng/ml EGF (sigma-e4127) - 10 IU/mL hcg (sigma-c1063) - 10 IU/mL ecg (sigma-g4877) 23
NCSU-23 (-): 添 加 物 如 同 於 NCSU-23 (+), 不 同 在 於 未 添 加 激 素 (hcg 及 PMSG) 表 1 NCSU-23 基 礎 培 養 液 之 成 分 Table 1. The chemical composition of NCSU-23 ( 三 ) 猪 卵 母 細 胞 之 體 外 成 熟 培 養 進 行 體 外 成 熟 培 養 前, 猪 卵 母 細 胞 以 事 先 置 於 培 養 箱 中 平 衡 4 h 之 體 外 成 熟 培 養 液 (NCSU-23) 清 洗 三 次, 其 後 依 據 試 驗 所 需 每 組 以 15 顆 猪 卵 母 細 胞 培 養 於 35 mm 無 菌 塑 膠 培 養 皿 (Falcon 1008) 含 有 100 μl 的 NCSU-23(+) 液 滴 中, 經 22 h 更 換 為 NCSU-23(-), 並 在 試 驗 前 先 於 培 養 箱 中 平 衡 4 h, 同 時 整 個 培 養 過 程 維 持 在 39 5% CO 2 及 相 對 濕 度 飽 和 之 培 養 箱 中 進 行 經 體 外 成 熟 培 養 44 h 後 之 猪 卵 母 細 胞, 以 含 有 0.1% 玻 尿 酸 酶 (hyaluronidase) 之 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 中 以 玻 璃 針 吸 吐 方 式 進 行 去 除 卵 丘, 卵 丘 細 胞 去 除 後 再 於 解 剖 顯 微 鏡 下 尋 找 具 有 第 一 極 體 之 卵 母 細 胞, 含 有 第 一 極 體 之 猪 卵 母 細 胞 即 為 成 熟 卵 母 細 胞, 可 供 後 續 試 驗 所 需 之 材 料 24
( 四 )Indirubin-3 -oxime (IO) 之 配 製 Indirubin-3 -oxime 以 DMSO 配 製 成 1 mm 之 保 存 液, 經 分 裝 後 儲 存 於 20 備 用, 使 用 時 以 NCSU-23 培 養 液 稀 釋 成 試 驗 需 要 之 濃 度 ( 五 ) 免 疫 細 胞 化 學 染 色 (immunocytochemical staining) 在 此 試 驗 中 使 用 了 三 種 不 同 之 螢 光 染 劑 (Rhodamine-phalloidin FITC-conjugate anti-mouse IgG Hoechst 33342) 進 行 免 疫 化 學 螢 光 染 色, 分 別 標 定 微 絲 (microfilament) 微 管 (microtubule) 及 染 色 質 (chromatin), 材 料 方 法 乃 參 考 Ju et. al.(1999;2003;2004) 之 方 式 Ⅰ. 藥 品 配 製 (1)Stock solutions 1. Sodium-azide(NaN 3, Sigma S8032) 以 去 離 子 水 配 製 20 mg/ml, 儲 存 於 4 2. Triton-X 1 ml 加 去 離 子 水 至 10 ml, 於 室 溫 下 保 存 3. DTT(dithiothreotol, Sigma D977) 容 於 D2O(Sigma D4501) 中 配 製 成 1M, 以 10 μl 為 單 位 分 裝 儲 存 於 -20 4. Taxol(Sigma T7402/or T1912) 5. 將 anti-α-tubulin antibody(sigma T15168) 與 anti-β-tubulin antibody (Sigma T5293) 以 5 μl 為 單 位 分 裝,FITC-anti-mouse IgG (Capple#55514) 則 以 10 μl 為 單 位 分 裝, 皆 置 於 - 20 下 儲 存 6. 將 Rhodamine-phalloidin(Molecular Probes R415) 粉 末 溶 於 1.5 ml 甲 醇 中, 以 10 μl 為 單 位 儲 存 於 20 7. 將 Bisbenzimide(Sigma B2261) 染 劑 溶 解 於 滅 菌 去 離 子 水 中, 配 製 成 1 mg/ml Hoechst 33342 之 保 存 液 儲 存 於 20 備 用 使 用 時 以 含 20 % 甘 油 之 PBS 稀 釋 成 20 μg/ml 之 濃 度 25
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Ⅱ. 染 色 步 驟 1. 將 100-150μL 之 固 定 液 (MTSB-XF) 分 裝 至 0.5 ml 離 心 管 並 水 浴 回 溫 至 37 2. 將 卵 母 細 胞 放 入 MTSB-XF 中 固 定, 於 37 水 浴 維 持 60 min 以 上, 之 後 置 於 4 保 存 4-5 天 3. 以 washing solution 清 洗 卵 母 細 胞 3 次, 每 次 20-30 min, 洗 後 將 卵 母 細 胞 置 於 washing solution(37, 2 h 或 4, overnight) 4. 將 卵 母 細 胞 放 入 Anti-α-tubulin antibody 和 ( 或 )Anti-β-tubulin antibody 中 (37, 2 h 或 4, overnight, 抗 體 約 稀 釋 400 倍 ) 5. 以 washing solution 清 洗 3 次, 每 次 20-30 min 6. 將 卵 母 細 胞 置 入 FITC-anti-mouse IgG( 約 稀 釋 成 200 倍 ) 中,37 染 色 2 h 27
7. 以 washing solution 清 洗 3 次, 每 次 20-30 min 8. 於 37 以 rhodamine-phalloidin( 約 稀 釋 2000 倍 ) 染 色 30 min 9. 以 washing solution 清 洗 3 次, 每 次 20-30 min 10. 以 含 Hoechst 33342 之 mounting medium 於 室 溫 下 染 色 5 min 11. 將 卵 母 細 胞 置 於 載 玻 片 上, 以 蓋 播 片 覆 蓋 壓 片, 並 以 指 甲 油 封 片 12. 觀 察 前 可 於 4 下 避 光 保 存 Ⅲ. 觀 察 分 析 染 光 色 完 成 之 卵 母 細 胞 經 由 正 立 螢 光 顯 微 鏡 (Olympus AFX-70), 以 紫 外 光 (465 nm) 藍 光 (525 nm) 及 綠 光 (570 nm) 三 種 濾 鏡 分 別 觀 察 Chromatin(blue) Microtubules(green) Microfilaments(red) 之 變 化 卵 母 細 胞 之 細 胞 核 與 細 胞 骨 架 變 化 判 定 依 據 Ju et al.(2002) 所 述 ( 六 ) 卵 母 細 胞 激 活 藥 劑 與 培 養 液 之 製 備 1. 6-dimethylaminopurine(6-DMAP, Sigma D2629): 以 DMSO 配 製 成 125 mm 之 保 存 液 (stock solution), 分 裝 後 保 存 於 20 備 用, 使 用 時 以 PZM-3 培 養 液 稀 釋 成 2.5 mm 2. 電 機 活 液 : 以 去 離 子 水 添 加 下 列 成 分 配 製 而 成 ( 表 2), 經 濾 菌 後 儲 存 於 4 備 用 28
表 2 卵 母 細 胞 電 激 活 液 之 成 分 Table 2. The chemical composition of activation medium ( 七 ) 猪 卵 母 細 胞 之 激 活 成 熟 猪 卵 母 細 胞 經 電 激 活 液 清 洗 兩 次 後, 置 於 含 有 電 激 活 液 兩 極 為 1 mm 寬 之 電 激 活 槽 (BTX-450-1) 內, 使 用 電 激 活 操 作 器 (ECM 200;BTX Inc., San Diego,USA) 施 予 一 次 電 場 強 度 2.2 kv/cm 之 直 流 電 激, 持 續 時 間 為 30 μsec, 隨 後 將 已 激 活 處 理 之 猪 卵 母 細 胞 置 回 培 養 液 中, 經 5-10 min 後 移 入 含 2.5 mm 6-DMAP 之 激 活 培 養 液 中 處 理 4 h, 之 後 以 體 外 發 育 培 養 液 清 洗 數 次 後 置 於 39 5% CO 2 之 溼 度 飽 和 培 養 箱 中 培 養 ( 八 ) 體 外 發 育 培 養 液 之 製 備 以 Porcine Zygote Medium-3(PZM-3)( 表 3) 為 激 活 後 體 外 發 育 培 養 之 培 養 液, 配 製 完 後 期 酸 鹼 值 較 正 至 Ph 7.3-7.4, 滲 透 壓 值 為 290±5 mosm, 於 4 保 存 不 超 過 21 天 29
表 3 PZM-3 體 外 培 養 液 之 成 分 Table 3. The chemical composition of PZM-3. ( 九 ) 西 方 吸 漬 分 析 Ⅰ. 樣 品 處 理 將 各 處 理 組 之 猪 卵 母 細 胞 以 PBS 含 有 0.1% polyvinylpyrrolidone (PVP, Sigma PVP-360) 清 洗 至 少 三 次 後, 分 別 移 入 9 μl sample buffer ( 含 有 5 μl 4X sample buffer 和 4 μl 抑 制 劑 ) 之 0.5 離 心 管 中, 輕 微 震 盪 置 卵 母 細 胞 完 全 溶 於 buffer 中, 移 置 - 80 中 保 存 30
Ⅱ. 藥 品 製 備 (3)Stock solution 與 緩 衝 液 之 配 製 a. 各 濃 度 Tris-HCl b. 5 M NaCl:292.5 g 的 NaCl 加 入 D. D. H 2 O 至 1000 ml c. TBS/T(washing solution) 31
d. SDS-PAGE 緩 衝 液 (running buffer) e. 轉 印 緩 衝 液 (transfer buffer) Ⅲ. SDS 膠 片 (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide electrophoresis, SDS-PAGE) 之 製 備 32
1. 將 下 層 膠 溶 液 注 入 以 組 合 好 之 玻 璃 片 夾 板 裝 置, 在 緩 慢 加 入 少 許 D. D. H 2 O 於 其 與 空 氣 接 觸 之 介 面, 待 凝 固 30 min 2. 下 層 膠 凝 固 後, 將 上 部 之 D. D. H 2 O 倒 掉, 以 濾 紙 吸 乾 多 餘 水 分, 再 加 入 上 層 膠 溶 液 並 插 好 齒 狀 板 (comb), 待 凝 固 30 min 3. 將 凝 固 後 的 膠 體 放 置 入 電 泳 槽 中 固 定, 加 入 running buffer 於 電 泳 槽 至 超 過 通 電 線, 再 小 心 拔 出 comb, 以 22 G 針 頭 接 5 ml 針 筒 裝 running buffer 沖 洗 每 個 齒 槽 (well) 4. 將 裝 有 卵 母 細 胞 與 sample buffer 混 和 均 勻 之 離 心 管 以 parafilm 密 封 管 口, 於 100 水 浴 加 熱 5 min 後 置 於 冰 上 5. 各 處 理 組 之 離 心 管 以 低 速 離 心 30 sec 後, 將 內 容 物 全 部 移 入 well 中, 並 於 一 well 中 注 入 5 μl 之 marker(fermentas SM-1811) 6. 以 80 volts/45 min 於 上 層 膠, 以 120 volts/100 min 於 下 層 膠, 通 電 之 33
Ⅳ. 消 化 纖 維 濾 紙 轉 印 (transfer) 利 用 電 傳 導 使 膠 上 蛋 白 質 轉 移 置 消 化 纖 維 濾 紙 (nitrocellulose filter paper, NCpaper;Millipore-HAHY00010) 其 步 驟 如 下 : 1. 取 NC paper 與 濾 紙 切 成 膠 片 大 小 2. 取 出 轉 印 夾 打 開 平 放, 先 墊 一 張 方 形 海 綿 墊, 鋪 上 三 張 濾 紙, 疊 上 已 濕 潤 的 膠 片, 鋪 上 一 張 濕 潤 的 NC paper 轉 印 紙, 再 鋪 三 張 濾 紙 及 海 綿 並 去 除 夾 層 間 之 氣 泡, 依 序 如 下 疊 放 : (c) 將 轉 印 夾 放 入 裝 有 轉 印 緩 衝 液 (transferring buffer) 的 轉 印 槽 中, 以 200 ma 電 流 於 4 轉 印 2.5 h Ⅴ. Blocking 轉 印 後 NC paper 至 於 朔 膠 盒 中 並 以 blocking buffer(washing solution+ 5% chicken serum, sigma-c5405) 均 勻 覆 蓋 後 搖 晃 2 h Ⅵ. 免 疫 點 漬 反 應 與 分 析 (a) 經 blocking 之 NC paper 以 washing solution 清 洗 三 次, 每 次 5 min (b)nc paper 以 blocking buffer 所 稀 釋 之 初 級 抗 體 分 別 為 ERK1(Santa Cruz SC94, 1:1,000) phospho-mekk/erk1/2(cell Signaling 9101, 1:1000) (c) 以 washing solution 清 洗 NC paper 三 次, 每 次 15 min 34
(d) NC paper 以 blocking buffer 所 稀 釋 之 HRP-conjugated 二 級 抗 體 (KLP 474-1516, 1:5,000) 於 室 溫 下 作 用 1 h (e) 以 washing solution 清 洗 NC paper 三 次, 每 次 15 min (f) 於 暗 房 將 NC paper 與 螢 光 受 質 液 (SuperSignal@ West Pico Chemiluminescent Substrate, PIERCE prod#34080) 作 用 於 室 溫 下 1 min (g) 進 行 X 光 片 壓 片 後 顯 影 定 影, 視 結 果 調 整 壓 片 時 間 (h)x 光 片 掃 瞄 後 以 ImageJ(Rasband, 2006) 軟 體 分 析 其 表 現 量 三 試 驗 設 計 試 驗 一 猪 卵 母 細 胞 經 Indirubin-3 -oxime 處 理 後 之 影 響 猪 卵 母 細 胞 以 12.5 μm 6.3 μm 3.1 μm 1.6 μm 等 4 種 濃 度 之 Indirubin-3 -oxime 處 理 22 h 後 其 卵 丘 細 胞 之 黏 液 擴 散 化 程 度 減 數 分 裂 程 度 及 卵 母 細 胞 中 的 有 絲 分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK) 之 蛋 白 質 濃 度 變 化 試 驗 二 猪 卵 母 細 胞 經 Indirubin-3 -oxime 處 理 後 其 減 數 分 裂 復 甦 及 後 續 發 育 之 影 響 猪 卵 母 細 胞 以 12.5 μm 6.3 μm 3.1 μm 1.6 μm 等 4 種 濃 度 之 Indirubin-3 -oxime 處 理 22 h 後 繼 續 培 養 44 h, 觀 察 卵 母 細 胞 經 4 種 濃 度 之 IO 處 理 後 其 成 熟 率 及 後 續 發 育 能 力 試 驗 三 犬 隻 濾 泡 發 育 與 卵 母 細 胞 經 Indirubin 處 理 後 恢 復 減 數 分 裂 復 甦 之 能 力 不 同 月 齡 之 犬 卵 巢 以 10% 福 馬 林 固 定 後 切 片, 觀 察 其 濾 泡 變 化 與 月 齡 之 關 係, 並 染 色 觀 察 與 比 較 犬 卵 母 細 胞 其 四 種 不 同 核 之 GV 形 態 ; 以 12.5 μm 之 IO 35
處 理 22 h 後 續 培 養 72 h 觀 察 犬 卵 母 細 胞 恢 復 減 數 分 裂 復 甦 之 能 力 四 統 計 分 析 本 試 驗 數 據 資 料 以 統 計 分 析 系 統 (statistical analysis system, SAS) 軟 體 之 General Linear Model(GLM) 與 TUKEY 模 式 測 定 其 差 異 之 顯 著 性 西 方 吸 漬 法 測 得 之 蛋 白 質 強 度 以 Image J 軟 體 分 析, 其 結 果 百 分 率 資 料 先 利 用 arcsine 轉 換 為 結 果 之 顯 著 性 所 有 試 驗 之 顯 著 性 檢 定 以 P < 0.05 為 標 準 36
五 結 果 試 驗 一 將 各 組 之 猪 COCs 分 別 經 體 外 成 熟 處 培 養 0 h 與 22 h, 觀 察 卵 丘 細 胞 黏 液 化 擴 散 情 形 ; 於 培 養 後 去 除 卵 丘 細 胞, 利 用 免 疫 細 胞 染 色 法 對 卵 母 細 胞 進 行 染 色, 以 觀 察 其 細 胞 核 內 之 染 色 體 位 置 ; 並 於 培 養 後 以 西 方 吸 漬 分 析 方 式, 觀 察 調 控 卵 母 細 胞 成 熟 過 程 中 之 MAPK 家 族 磷 酸 化 之 程 度 實 驗 結 果 顯 示, 猪 卵 母 卵 丘 細 胞 經 22 h 培 養 具 有 黏 液 擴 散 化 現 象, 而 經 IO 處 理 濃 度 越 高 之 組 別, 其 擴 散 程 度 則 越 低, 也 越 接 近 GV 之 對 照 組, 反 之 濃 度 越 低, 則 擴 散 程 度 越 高, 也 越 接 近 22 h 無 添 加 IO 之 對 照 組, 是 以 COCs 之 黏 液 化 程 度 隨 著 IO 濃 度 不 同 而 有 所 改 變, 呈 現 濃 度 依 賴 性 之 關 係 ( 圖 4);12.5 6.3 及 3.1 濃 度 之 IO 能 有 效 抑 制 猪 卵 母 細 胞 原 泡 核 崩 解 (Germinal Vesicle Break Down, GVBD), 使 其 停 留 於 原 泡 核 時 期 (GV stage),1.6 μm 則 效 果 明 顯 低 於 其 他 三 者, 但 並 不 影 響 其 對 於 卵 母 細 之 GVBD 與 MI 之 抑 制 ( 表 4); 以 西 方 吸 漬 法 分 析 各 組 蛋 白 質 之 表 現, 其 結 果 顯 示 成 熟 之 猪 卵 母 細 胞 內 ERK 之 總 蛋 白 (total ERK) 磷 酸 化 (p-erk) 或 其 相 對 活 性 之 表 現 量 明 顯 高 於 其 他 各 組, 隨 著 IO 之 濃 度 增 加, p-erk/total ERK 之 活 性 有 越 被 抑 制 之 趨 勢,12.5 6.3 與 3.1 μm 濃 度 之 IO 抑 制 ERK 磷 酸 化 之 效 果 與 GV 對 照 組 無 差 異 性 ( 圖 5) 37
圖 5 卵丘卵母細胞經過 22 h 於含有不同濃度 Indirubin 之 NCSU-23 培養液處 理後之形態 卵丘卵母細胞分別培養於含有 1.6 3.1 6.3 與 12.5 μμ Indirubin 之 NCSU-23 培養液中 22 h 分別觀察經過 22 h 卵丘卵母細胞擴散之程度 由 圖片得之 Indirubin 濃度越高之組別 卵丘細胞擴散程度則越低 呈現濃度依 賴性之關係 (A)培養前卵母細胞 (B) 12.5 μm (C) 6.3 μm (D) 3.1 μm (E) 1.6 μm 處理組 (F)22 h 對照組 比例尺 100 微米 Figure 5. The morphology of Cumulus-oocyte-complexes (COCs) after cultured with various concentrations of Indirubin for 22 h. COCs were cultured for 22 h in NCSU-23 medium containing various doses of Indirubin (1.6, 3.1, 6.3, and 12.5 μm). After 22 h of Indirubin treatment, the degree of COCs expansion was concentration-dependent.(a) Control 0 h; (B) treatment at 12.5 μm; (C) 6.25 μm; (D) 3.125 μm; (E) 1.56 μm; (F) Control 22 h. Scale bar: 100 μm. 38
表 4 以 不 同 濃 度 之 Indirubin-3 -oxime 處 理 22 h 後 對 猪 卵 母 細 胞 恢 復 減 數 分 裂 之 影 響 Table 4. Reversibility in meiotic resumption of porcine oocytes after treatment with various concentrations of Indirubin for 22 h. *Control 22 h: oocytes were IVM in NCSU-23 for 22 h; 1.6-12.5 μm: oocytes were cultured in NCSU-23 with different Indirubin-3 -oxime concentrations for 22 h. ** abc Within a column, means without a common letter differ (P < 0.05). (7 replicates, 15 oocytes/replicate) 39
圖 6 猪 卵 母 細 胞 於 體 外 培 養 過 程 中 添 加 Indirubin 處 理 22 h 後 MAPK 之 變 化 MAPK 家 族 中 之 ERK 表 現 量 於 不 同 階 段 (GV, 22 h and MII stage) 與 處 理 22 h 不 同 濃 度 Indirubin 之 猪 卵 母 細 胞 Indirubin 濃 度 較 高 之 處 理 組 (6.3 與 12.5 μm) 其 卵 丘 卵 母 細 胞 ERK1/2 抑 制 磷 酸 化 程 度 相 似 於 未 處 理 之 GV 組, 但 相 對 其 他 濃 度 較 低 之 組 別, 則 低 於 對 照 組 (A) 為 p-erk 與 total ERK( 分 子 量 44 與 42 kda) (B)Indirubin 處 理 組 (12.5, 6.3, 3.1 and 1.6 μm) 與 對 照 組 (GV, 22 h and MII) 以 Image-J 軟 體 量 化 後 p-erk 之 密 度 分 析 數 據 分 析 以 GV 為 對 照 組, 條 40
狀 圖 形 表 示 SEMs,a, b, c: p < 0.05( 本 試 驗 九 重 複, 每 組 50 個 猪 卵 母 細 胞 ) Figure 6. Expression of MAPK in porcine oocytes after treatment with Indirubin for 22 h during in vitro maturation. Experssion of ERKs in different stages of porcine oocytes (GV, 22 h and MII stage) and oocytes after treatment for 22 h with various concentrations of Indirubin. The ERK1/2 phosphorylation levels of COCs after 22 h of inhibition in higher Indirubin concentrations (6.3 and 12.5 μm) were similar to those at the GV stage, but lower than those in control group. (A) A representative immuno-blot of ERK1/2 (42 and 44 kda). (B) Densitometry analyses of p-erk1/2 between the Indirubin-treated groups (12.5, 6.3, 3.1 and 1.6 μm) and the control (GV, 22 h and MII) were detected using Image J System. Data are expressed as folds of the control (GV) and error bars are SEMs. abc Within the same column, numbers without a common letter differ (P < 0.05) (9 replicates and each lane contained 50 oocytes). 41
試 驗 二 猪 卵 母 細 胞 以 4 種 不 同 濃 度 之 IO 處 理 22 h 後, 移 除 藥 物 後 以 NCSU-23 培 養 液 繼 續 培 養 44 h, 觀 察 卵 母 細 胞 經 藥 物 處 理 後 恢 復 減 數 分 裂 復 甦 之 能 力 以 及 其 後 續 孤 雌 激 活 發 育 潛 能 是 否 有 受 到 影 響 試 驗 結 果 顯 示, 經 過 IO 處 理 後 的 猪 卵 母 細 胞 其 恢 復 減 數 分 裂 復 甦 之 能 力 與 44 h(90.4%) 和 66 h(89.3%) 對 照 組 無 顯 著 性 之 差 異, 而 在 各 處 理 組 間 (90.4-91.4%) 也 無 明 顯 之 不 同 ( 表 5); 在 孤 雌 激 活 胚 的 發 育 能 力 上 44 h(51.7%) 對 照 組 明 顯 高 於 66 h(17.4 %) 對 照 組 及 各 IO 處 理 組 (20.7-28.7%) 此 外 各 組 囊 胚 所 得 之 平 均 細 胞 數,44 h 對 照 組 明 顯 高 於 66 h 對 照 組 與 各 IO 處 理 組, 然 而 在 IO 濃 度 最 低 與 最 高 之 組 別 其 囊 胚 平 均 細 胞 數 明 顯 高 於 其 他 兩 組 與 66 h 對 照 組 (1.6 μm: 35.7, 3.1 μm : 34.1, 6.3 μm: 28.8,12.5 μm: 37.3,44 h: 45.9,66 h: 30.8, P< 0.05; 表 6) 42
表 5 不 同 濃 度 之 Indirubin3'-oxime 處 理 22 h 後 對 猪 卵 母 細 胞 延 長 培 養 44 h 恢 復 減 數 分 裂 之 影 響 Table 5. Reversibility of meiotic resumption of porcine oocytes treated with various concentrations of Indirubin-3 -oxime for 22 h after an additional 44 h of culture. *Control 44 h: oocytes were IVM in NCSU-23 for 44 h; Control 66 h: oocytes were IVM in NCSU-23 for 66 h; 1.6-12.5 μm: concentrations of Indirubin incubation for 22 h, and then IVM for 44 h after removal of the inhibitor. (7 replicates) 43
表 6 不 同 濃 度 Indirubin-3'-oxime 處 理 22 h 後 對 猪 卵 母 細 胞 激 活 與 發 育 潛 能 之 影 響 Table 6. Parthenogenetic development of porcine oocytes after treatment with various concentrations of indirubin-3-oxime for 22 h during in vitro maturation. *Control 44 h: oocytes IVM for 44 h; Control 66 h: oocytes IVM for 66 h; 1.6-12.5 μm: concentrations of Indirubin during incubation for 22 h and then IVM for an additional 44 h without inhibitor. **Each of them were activated by an electric pulse (2.2 kv, 30 μsec) and 6-DMAP (2.5 mm for 4 h). ab Within a column, means without a common letter differ (P <0.05). (8 replicates, 15 oocytes/replicate) 44
試 驗 三 犬 卵 巢 經 過 切 片 HE 染 色 可 以 看 到 發 身 前 (3-6 月 齡 ) 之 幼 犬 其 尚 未 完 成 生 長 之 小 型 濾 泡, 可 以 明 顯 辨 識 卵 丘 卵 母 細 胞 顆 粒 細 胞 鞘 膜 細 胞 與 完 整 的 濾 泡 腔, 而 在 發 情 後 犬 隻 之 卵 巢 切 片 可 以 觀 察 到 黃 體 細 胞 ( 圖 6) 從 2 月 齡 3-6 月 齡 到 7-8 月 齡 發 身 前 幼 犬 卵 巢 切 片 結 果 得 知, 卵 巢 中 之 濾 泡 隨 著 越 接 近 發 身 月 齡 從 初 級 濾 泡 (primary follicle) 次 及 濾 泡 (secondary follicle, preantral follicle) 到 排 卵 前 的 濾 泡 (preovulatory follicle) 逐 次 增 加, 顯 微 鏡 下 可 見 之 濾 泡 數 量 也 明 顯 增 加, 並 且 可 以 觀 察 到 於 進 入 乏 情 期 之 黃 體, 其 體 積 增 大 會 擠 壓 其 他 濾 泡, 也 會 抑 制 其 他 濾 泡 之 生 長 ( 圖 7) 於 免 疫 化 學 染 色 後, 犬 卵 母 細 胞 GV 核 可 以 分 為 下 列 四 種 型 態,type A 之 染 色 質 環 繞 於 細 胞 核 週 圍, 或 稱 之 為 環 繞 細 胞 核 ",type B 染 色 質 四 散 於 細 胞 核 中 或 是 瀰 漫 性 點 狀 擴 散 於 細 胞 核 中,type C 染 色 質 於 細 胞 核 中 成 絲 狀 在 核 可 以 的 範 圍 內 或 小 或 大,type D 之 染 色 質 於 細 胞 核 中 處 於 修 補 的 狀 態, 範 圍 可 能 是 較 小 或 是 較 大 一 點 的 狀 態 ( 圖 8), 經 由 試 驗 比 較, 結 過 指 出 type C 之 形 態 於 體 外 培 養 前 所 佔 比 例 明 顯 高 於 其 他, 而 在 猪 卵 母 細 胞 中, 四 種 形 態 無 明 顯 差 異 ( 表 7); 犬 卵 母 細 胞 經 IO 處 理 22 h 後 再 續 培 養 72 h 其 結 果 與 對 照 組 無 差 異 ( 表 8) 45
圖 7 3-6 月齡幼犬卵巢內正常濾泡之形態 (A)包含被卵丘細胞(cc)環繞之卵 子 小濾泡腔(ac)與壁狀顆粒細胞(mgc) 也有一層明顯的鞘膜細胞(t)環繞在濾 泡的外圍 (B)於乏情期晚期之黃體切片 比例尺 100 微米 Figure 7. The antral follicles exhibit a normal morphology from prepubertal puppies (3-6 months) with (A) an oocyte surrouned by cumulus cells (cc), an antral cavity (ac) mural granulosa cells (mgc), and a distinct layer of theca cells (t) also surrounding the follicle. (B) Histologic section of a corpus luteum (cl) in late diestrus. Scale bar: 100 μm. 46
47
圖 8 犬 卵 巢 組 織 切 片 由 HE 染 色 得 知 卵 巢 皮 質 上 層 有 多 種 形 態 的 濾 泡 聚 集 於 上, 隨 著 犬 隻 的 月 齡 增 長 濾 泡 的 數 量 和 大 小 也 跟 著 上 升 卵 巢 的 組 織 切 片 從 (a) (b) 的 2 月 齡,(c) (d) (e) (f) 和 (g) 的 3-6 月 齡,(h) 和 (i) 的 7-8 月 齡,(j) 早 期 乏 情 期 之 黃 體, 而 (k) 和 (l) 則 是 乏 情 期 晚 期 黃 體 比 例 尺 :100 微 米 Figure 8. Histological section of canine ovarian tissue. Haematoxylin and eosin (HE)-stained shows multiple follicles in the ovarian crotex, they increase the number and size with the age. Histological section of ovarian tissue from 2 months puppies (a) and (b), 3-6 months puppies (c), (d), (e), (f) and (g), 7-8 months (h) and (i), (j) a ovarian crotex with cropus luteum in late diestrus, (k) and (l) a corpus luteum in early diestrus. Scale bar:100 μm. 48
49
圖 9 犬 卵 母 細 胞 GV 核 之 形 態 染 色 後 於 顯 微 鏡 下 可 觀 察 出 下 列 四 種 不 同 形 態 :type A 之 染 色 質 環 繞 於 細 胞 核 週 圍, 或 稱 之 為 環 繞 細 胞 核 "(a),type B 染 色 質 四 散 於 細 胞 核 中 (b) 或 是 瀰 漫 性 點 狀 擴 散 於 細 胞 核 中 (c),type C 染 色 質 於 細 胞 核 中 成 絲 狀 在 核 可 以 的 範 圍 內 或 小 (d) 或 大 (e),type D 之 染 色 質 於 細 胞 核 中 處 於 修 補 的 狀 態, 可 能 是 較 小 (f) 或 是 較 大 一 點 (g) 的 狀 態 比 例 尺 :10 微 米 Figure 9. The different GV types of canine oocytes. Four chromatin patterns were visualized: type A nucleus with chromatin in the perinucleolar region, named as surrounded nucleous (a), type B nucleus with diffuse chromatin (b) or diffuse-dots chromatin (c), type C nucleus with filamentous chromatin and small (d) or large (e) nuclear area, type D nucleus with patched chromatin and small (f) or large (g) and (h). Scare bar: 10 μm. 50
表 7 體 外 培 養 前 猪 與 犬 卵 母 細 胞 GV 之 型 態 Table 7. The types of GV nucleus between canine and porcine oocytes before in vitro maturation. ab Within a horizontal, means without a common letter differ (P<0.05). (porcine: 4 replicates, canine: 13 replicates) 51
表 8 Indirubin3'-oxime 處 理 22 h 對 犬 卵 母 細 胞 於 後 續 培 養 72 h 後 恢 復 減 數 分 裂 之 影 響 Table 8. Effects of Indirubin-3 -oxime treatment on the meiotic resumption of canine oocytes after an additional 72 h of IVM culture. *Control 72 h: oocytes IVM for 72 h; 12.5 μm: concentrations of Indirubin during incubation for 22 h and then IVM for an additional 72 h without the inhibitor. ab Within a horizontal, means without a common letter differ (P <0.05). (3 replicates) 52
六 討 論 Indirubin-3 -oxime 為 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑 與 p34 cdc2 競 爭 ATP binding site, 而 阻 止 p34 cdc2 kinases 磷 酸 化 作 用, 抑 制 MPF 之 活 性, 進 而 調 控 G2/M phase check point, 阻 止 細 胞 進 入 M phase, 以 抑 制 細 胞 分 裂, 利 用 此 特 性 調 控 細 胞 週 期 調 控 機 制, 常 應 用 於 慢 性 骨 隨 性 白 血 病 (Hoessel et al., 1999), 或 是 阻 止 卵 母 細 胞 減 數 分 裂 復 甦 (Hshieh et al., 2006) 由 試 驗 一 可 得 知,IO 可 成 功 抑 制 猪 卵 母 細 胞 走 向 GVBD, 不 論 是 在 卵 丘 細 胞 黏 液 擴 散 化 的 程 度 上 或 是 在 細 胞 核 免 疫 染 色 上 的 證 明, 最 重 要 的 是, 於 培 養 過 程 中 添 加 IO 於 培 養 液 中 確 實 能 抑 制 卵 母 細 胞 成 熟 過 程 中 有 絲 分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK) 之 蛋 白 質 濃 度 變 化, 其 證 明 IO 不 僅 可 以 抑 制 一 般 細 胞 此 一 訊 息 傳 遞 路 徑, 於 卵 母 細 胞 也 有 相 同 之 效 果 ( 圖 5) 試 驗 二 結 果 發 現, 經 過 IO 處 理 之 猪 卵 母 細 胞, 於 恢 復 減 數 分 裂 復 甦 與 對 照 組 並 無 差 異, 但 在 後 續 發 育 能 力 之 實 驗 結 果 看 到, 處 理 組 之 囊 胚 率 明 顯 低 於 44 h 對 照 組, 於 此, 猜 測 可 能 是 因 為 IO 之 處 理 影 響 卵 母 細 胞 於 後 續 發 育 能 力 之 因 素, 但 又 與 66 h 對 照 組 無 明 顯 差 異, 中 和 以 上 兩 種 結 果, 推 測 於 後 續 延 續 之 培 養 時 間 有 很 大 之 關 係, 經 IO 處 理 後 之 卵 母 細 胞 其 成 熟 時 間 可 能 大 幅 縮 短 (Avery et al., 1998), 在 未 來, 可 將 後 續 培 養 時 間 調 整 縮 短 至 40 h 以 下, 以 測 試 其 發 育 能 力 是 否 與 IO 處 理 或 是 後 續 培 養 時 間 有 關 於 試 驗 三, 可 以 得 知 發 身 前 之 幼 犬 卵 巢 期 濾 泡 大 部 分 停 留 於 次 及 濾 泡 之 前, 於 顯 微 鏡 下 細 切 其 卵 巢, 無 法 獲 得 完 整 之 卵 丘 卵 母 細 胞, 甚 至 其 卵 母 細 胞 之 卵 質 不 明 顯, 並 不 適 合 用 於 體 外 培 養 之 用, 所 以 必 須 挑 選 5 月 齡 以 上 之 卵 巢, 而 在 發 情 後 之 卵 巢 容 易 有 充 血 與 黃 體 現 象, 因 為 荷 爾 蒙 抑 制 之 關 係, 卵 巢 中 其 它 尚 未 發 育 完 成 之 濾 泡 受 到 抑 制, 其 狀 態 如 同 發 身 前 幼 犬 隻 卵 巢, 亦 不 適 合 用 於 體 外 培 養 ; 由 免 疫 染 色 可 得 知 犬 卵 母 細 胞 於 培 養 前, 其 細 胞 核 GV 型 態 有 70.8 % 呈 現 type C 染 色 質 成 絲 狀 散 布 在 巨 大 之 細 胞 核 中, 但 文 獻 指 出 於 體 外 培 養 後 其 所 占 比 例 卻 為 最 低 的, 而 type A 通 常 來 自 於 直 徑 較 大 之 卵 母 細 胞, 所 以 可 視 為 卵 質 較 好 之 卵 母 細 53
胞 (Reynaud et al., 2012) 雖 然 在 試 驗 三 中 並 沒 有 犬 卵 母 細 胞 體 外 培 養 液 添 加 IO 之 測 試, 但 於 試 驗 一 二 之 結 果, 我 們 對 於 犬 卵 母 細 胞 體 外 培 養 液 添 加 IO 是 否 能 提 升 其 恢 復 減 數 分 裂 復 甦 之 能 力 有 樂 觀 之 想 法, 犬 卵 母 細 胞 於 體 外 成 熟 試 驗 上 調 整 適 當 之 IO 濃 度 處 理 IO 之 時 間 後 續 培 養 時 間 與 培 養 液 上 的 配 合, 應 該 能 有 效 提 升 其 恢 復 減 數 分 裂 復 甦 之 能 力 七 結 論 Indirubin-3 -oxime 為 CDK 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑 能 有 效 抑 制 猪 卵 母 細 胞 走 向 GVBD, 試 驗 結 果 顯 示, 以 12.5 μm 6.3 μm 3.1 μm 1.6 μm 等 4 種 濃 度 之 Indirubin-3 -oxime 處 理 之 猪 卵 母 細 胞, 恢 復 減 數 復 甦 能 力 與 對 照 組 並 無 差 異, 其 後 續 發 育 能 力 雖 然 低 於 對 照 組, 可 能 尚 有 其 他 因 素 影 響 其 後 續 發 育 能 力, 如 : 縮 短 後 續 培 養 時 間 而 在 犬 卵 母 細 胞 體 外 培 養 上 仍 有 一 段 相 當 大 的 挑 戰, 不 僅 是 在 培 養 液 上 的 測 試, 犬 科 動 物 之 生 殖 週 期 卵 與 胚 胎 生 物 學 在 未 來 都 需 更 進 一 步 理 清 與 研 究 54
參 考 文 獻 沙 士 文 2007 Indirubin-3 -oxime 濃 度 最 佳 化 與 猪 卵 母 細 胞 體 外 發 育 之 探 討 碩 士 論 文 國 立 中 興 大 學 動 物 科 學 系 Abdel-Ghani, M. A., T. Shimizu, T. Asano, and H. Suzuki. 2012. In vitro maturation of canine oocytes co-cultured with bovine and canine granulosa cell monolayers. Theriogenology 77: 347-355. Anderiesz, C., C. Y. Fong, A. Bongso and A. O. Trounson. 2000. Regulation of human and mouse oocyte maturation in vitro with 6-dimethylaminopurine. Hum. Repord. 15: 379-388. Anderson, E. and D. F. Albertini. 1976. Gap juuctions between the oocyte and compantion follicle cells in the mammlian ovary. J. Cell Biol. 71: 680-686. Archbald, L. F. B. A. Baker, L. L. Clooney and R. A. Godke. 1980. A surgical method for collecting canine embryos after induction of estrus and ovulation with exogenous gonadotropins. Vet. Med. Small Animl. Clin. 75: 228-238. Avery, B., A. Hay-Schmidt, P. Hyttel and T. Greve.1998. Embryo development, oocyte morphology, and kinetics of meiotic maturation in bovine oocytes exposed to 6-dimethylaminopurine 55
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