标题

1298 江苏农业学报( Jiangsu J. of Agr. Sci. ),2010,26(6) :1298 ~ 1303 王晓丰,薛摇 晖,丁正峰,等. 嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物的敏感性及耐药相关基因分析[ J]. 江苏农业学报,2010,26(6) : 1298鄄1303. 嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物的敏感性及耐药相关 基因分析 王晓丰,摇 薛摇 晖,摇 丁正峰,摇 杨摇 林 ( 江苏省淡水水产研究所, 江苏 南京 210017) 摇 摇 摘要:摇 为明确嗜水气单胞菌临床分离株对常用氟喹诺酮类药物的敏感性和耐药菌株中 gyra 和 parc 基因的 突变情况 试验采用自动化细菌药敏分析仪测定 4 种常用氟喹诺酮类药物对 23 株鱼源嗜水气单胞菌的最低抑菌 浓度,并依据耐药数目的不同选取 9 株嗜水气单胞菌,PCR 扩增其 gyra 及 parc 基因的喹诺酮抗性决定区( QRDR), 直接测序后进行多序列比对分析 结果显示:嗜水气单胞菌对诺氟沙星 氧氟沙星 恩诺沙星和环丙沙星的耐药率 依次为 8郾 7% 30郾 4% 73郾 9% 和 43郾 5% ;序列分析发现 gyra 基因编码的第 83 位氨基酸存在 Ser寅Ile Ser寅Val 的 突变, parc 基因编码的第 87 位氨基酸同样存在 Ser寅Ile 的突变 表明临床分离的嗜水气单胞菌对恩诺沙星耐药 最为严重,氧氟沙星 环丙沙星次之,对诺氟沙星较为敏感;尽管绝大多数耐药菌株的药物靶位基因 QRDR 区域有 突变发生,但是菌株的耐药性与药物靶位基因 QRDR 区域有无发生突变并不存在线性关联,提示我们药物靶位的 变化并非是氟喹诺酮类耐药菌株唯一的抗性机制 关键词:摇 嗜水气单胞菌; 氟喹诺酮; gyra 基因; parc 基因 中图分类号:摇 S941摇 摇 摇 文献标识码:摇 A摇 摇 摇 文章编号:摇 1000鄄4440(2010)06鄄1298鄄06 Fluoroquinolone Susceptibility and Resistance鄄associated Genes in Clinical Isolates of Aeromonas hydrophila WANG Xiao鄄feng,摇 XUE Hui,摇 DING Zheng鄄feng,摇 YANG Lin ( Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province, Nanjing 210017, China) 摇 摇 Abstract:摇 A general investigation about antibiotic susceptibility of Aeromonas hydrophila to fluoroquinolone was performed, and the gyra and parc gene mutation in fluoroquinolone resistant isolates were studied. Based on these, the correlation between the gene mutation and fluoroquinolone resistance of Aeromonas hydrophila was clarified. The minimal inhibitory concentration of 23 isolates of Aeromonas hydrophila collected from freshwater fish against four types of fluoro鄄 quinolone antibiotics were determined by automated bacteria analyzer HX鄄21, and 9 strains of Aeromonas hydrophila were selected to amplify quinolone resistance determining regions ( QRDR) in gyra gene and parc gene. The resistance rates of Aeromonas hydrophila isolates to norfioxacin, ofloxacin, enrofioxacin and ciprofloxacin were 8. 7%, 30. 4%, 73. 9% and 43. 5%, respectively. Multiple sequence alignment results indicated that resistant strains carried a mutation point Ser寅Ile or Ser寅Val at codon 83 in the gyra QRDR, and also a mutation point Ser寅Ile at codon 87 in the parc QRDR. Aeromonas 收稿日期:2010鄄02鄄10 基金项目: 江 苏 省 科 研 院 所 社 会 公 益 研 究 与 服 务 专 项 基 金 项 目 ( BM2007705) 作者简介:王晓丰(1984鄄),男, 江苏盱眙人,硕士,主要从事水产病 害研究 ( E鄄mail) wangxiaof1983@ 163. com 通讯作者:薛摇 晖,( E鄄mail) jsxuehui@ 163. com hydrophila isolates had remarkable resistance to enrofioxacin, followed by ofloxacin and ciprofloxacin. Although amino acid variations were found in QRDR re鄄 gions of majority drug鄄resistant strains, the linear correla鄄 tion between them did not existed, indicating that altera鄄 tion of target genes was not the only mechanism contribu鄄

王 晓 丰 等 : 嗜 水 气 单 胞 菌 对 氟 喹 诺 酮 类 药 物 的 敏 感 性 及 耐 药 相 关 基 因 分 析 1299 ting to fluoroquinolone 鄄 resistant clinical isolates. Key words: 摇 Aeromonas hydrophila; fluoroquinolone; gyra gene; parc gene 摇 摇 嗜 水 气 单 胞 菌 ( Aeromonas hydrophila) 是 一 种 能 够 引 起 多 种 淡 水 养 殖 鱼 类 败 血 症 的 重 要 致 病 菌, 在 自 然 界 中 广 泛 分 布, 给 水 产 养 殖 业 造 成 了 较 严 重 [1 鄄 的 经 济 损 失 3] 20 世 纪 80 年 代 末 中 国 南 方 各 省 普 遍 流 行 所 谓 的 淡 水 鱼 暴 发 性 出 血 病 冶 即 是 由 该 菌 所 引 起, 当 时 流 行 范 围 之 大 发 病 死 亡 率 之 高, 受 到 人 们 的 高 度 关 注 [4] 直 到 现 在, 由 该 菌 引 起 的 各 类 水 产 病 害 仍 然 层 出 不 穷, 是 水 产 养 殖 中 颇 为 重 要 的 致 病 菌 之 一 多 种 抗 生 素 都 能 够 抑 杀 该 菌, 尤 其 是 氟 喹 诺 酮 类 药 物 在 这 类 病 害 的 防 治 过 程 中 更 是 发 挥 了 不 可 替 代 的 作 用 但 是 由 于 临 床 不 合 理 用 药 现 象 的 广 泛 存 在, 导 致 细 菌 耐 药 性 不 断 产 生 和 增 强, 防 治 效 果 有 时 不 尽 人 意 因 此 测 定 嗜 水 气 单 胞 菌 对 氟 喹 诺 酮 类 药 物 的 敏 感 性 不 仅 可 为 指 导 渔 民 用 药 提 供 依 据, 还 可 以 作 为 嗜 水 气 单 胞 菌 耐 药 性 趋 势 的 敏 感 指 标 氟 喹 诺 酮 类 药 物 的 作 用 靶 位 是 革 兰 氏 阴 性 菌 的 DNA 旋 转 酶 和 拓 扑 异 构 酶 郁, 二 者 都 是 由 2 对 不 同 的 亚 单 位 组 成 的 异 源 四 聚 体,DNA 旋 转 酶 由 2 个 gy 鄄 ra 亚 基 和 2 个 gyrb 亚 基 组 成, 拓 扑 异 构 酶 郁 由 2 个 [5 鄄 parc 亚 基 和 2 个 pare 亚 基 组 成 6] 细 菌 靶 位 酶 的 改 变 直 接 影 响 到 药 物 与 其 结 合 的 亲 和 力 从 而 产 生 不 同 程 度 的 耐 药 性, 有 研 究 者 认 为 革 兰 氏 阴 性 菌 靶 位 酶 的 改 变 主 要 发 生 在 gyra 和 parc 亚 单 位 的 喹 诺 酮 抗 性 决 定 区 (QRDR), 就 嗜 水 气 单 胞 菌 来 说,gyrA 亚 单 位 的 QRDR 位 于 第 67 ~ 106 位 氨 基 酸,parC 亚 单 位 的 [7 鄄 QRDR 位 于 第 71 ~ 110 位 氨 基 酸 8] 因 此, 我 们 对 2007 ~ 2008 年 分 离 的 23 株 嗜 水 气 单 胞 菌 进 行 了 细 菌 药 物 敏 感 性 试 验, 同 时 选 取 了 具 有 代 表 性 的 9 株 细 菌 进 行 gyra 和 parc 基 因 的 PCR 扩 增 和 测 序, 分 析 其 突 变 模 式 旨 在 为 阐 明 嗜 水 气 单 胞 菌 耐 药 的 分 子 机 理 提 供 依 据 1 摇 材 料 与 方 法 1. 1 摇 菌 株 23 株 嗜 水 气 单 胞 菌 于 2007 ~ 2008 年 分 离 自 环 太 湖 流 域 患 有 暴 发 病 冶 的 水 产 养 殖 场, 其 中 10 株 分 离 自 鳊 鱼, 另 13 株 分 离 自 鲫 鱼 菌 株 于 30% 的 甘 油 肉 汤 中 -70 益 保 存 备 用 1. 2 摇 试 剂 HX 鄄 21 细 菌 鉴 定 / 药 敏 分 析 仪 随 机 体 外 诊 断 试 剂 板 购 自 合 肥 恒 星 科 技 开 发 有 限 公 司 ; 增 菌 用 LB 肉 汤 购 自 南 京 天 为 生 物 科 技 有 限 公 司 ;Taq DNA 聚 合 酶 和 100 bp DNA ladder 购 自 北 京 全 式 金 生 物 技 术 有 限 公 司 1. 3 摇 药 物 敏 感 性 试 验 参 照 HX 鄄 21 细 菌 鉴 定 / 药 敏 分 析 仪 随 机 体 外 诊 断 试 剂 板 使 用 说 明 书 进 行 1. 4 摇 细 菌 染 色 体 DNA 模 板 制 备 将 -70 益 冻 存 的 细 菌 接 种 到 3 ml 新 鲜 配 制 的 LB 液 体 培 养 基 中,37 益 150 r / min 过 夜 振 荡 培 养, 之 后 取 1 ml 的 纯 培 养 液 于 微 量 离 心 管 中,4 益 12 000 r / min 离 心 5 min 后 弃 去 上 清 液, 加 500 滋 l 双 蒸 水 重 悬 菌 体 沉 淀, 并 置 100 益 水 浴 锅 煮 沸 5 min, 短 暂 离 心 后 取 上 清 液 2 滋 l 作 为 PCR 反 应 用 模 板 1. 5 摇 PCR 扩 增 gyra 基 因 与 parc 基 因 QRDR 片 段 参 照 文 献 [9] 以 及 嗜 水 气 单 胞 菌 ATCC 7966 株 ( 登 录 号 NC_008570) 的 gyra 基 因 和 parc 基 因 全 序 列 分 别 设 计 引 物 并 送 交 上 海 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 合 成, 表 1 列 出 了 引 物 序 列 等 相 关 信 息 25 滋 l PCR 反 应 体 系 包 括 :10 伊 PCR 反 应 Buffer 2 郾 5 滋 l,4 种 dntp 的 终 浓 度 各 为 200 滋 mol / L,Mg 2+ 的 终 浓 度 为 1 郾 8 mmol / L,10 滋 mol / L 的 上 下 游 引 物 各 1 滋 l,5 U / 滋 l 的 Taq DNA 聚 合 酶 加 0 郾 2 滋 l,dna 模 板 2 滋 l, 余 者 以 双 蒸 水 补 齐 PCR 反 应 程 序 : 94 益 预 变 性 5 min; 94 益 变 性 1 min, 55 益 / 58 益 退 火 1 min, 72 益 延 伸 1 min, 共 35 个 循 环 ; 最 后 72 益 延 伸 10 min 1. 6 摇 PCR 产 物 测 序 及 测 序 后 的 分 析 将 经 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 为 阳 性 的 PCR 扩 增 产 物 送 交 上 海 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 进 行 测 序, 将 测 序 得 到 的 DNA 序 列 翻 译 为 氨 基 酸 序 列 后 提 交 T 鄄 Coffee ( http: / / www. tcoffee. org / ) 进 行 序 列 比 对, 找 出 氨 基 酸 变 异 位 点 2 摇 结 果 2. 1 摇 细 菌 药 物 敏 感 性 试 验 测 定 了 4 种 常 用 氟 喹 诺 酮 类 药 物 对 23 株 鱼 源 嗜 水 气 单 胞 菌 的 最 低 抑 菌 浓 度 ( 表 2), 依 据 文 献

1300 江 苏 农 业 学 报 摇 2010 年 第 26 卷 第 6 期 [10] 结 果 判 为 : 对 于 诺 氟 沙 星,2 株 耐 药 2 株 中 度 耐 药 19 株 敏 感, 耐 药 率 8 郾 7% ; 对 于 氧 氟 沙 星,7 株 耐 药 10 株 中 度 耐 药 6 株 敏 感, 耐 药 率 30 郾 4% ; 对 于 恩 诺 沙 星,17 株 耐 药 4 株 中 度 耐 药 2 株 敏 感, 耐 药 率 73 郾 9% ; 对 于 环 丙 沙 星,10 株 耐 药 7 株 中 度 耐 药 6 株 敏 感, 耐 药 率 43 郾 5% 表 1 摇 扩 增 gyra 基 因 与 parc 基 因 QRDR 片 段 的 引 物 序 列 信 息 Table 1 摇 Primers used to amplify the QRDRs in gyra and parc genes 引 物 摇 摇 摇 摇 序 列 (5 忆 寅 3 忆 ) 位 置 产 物 大 小 (bp) 退 火 温 度 ( 益 ) gyraf AGAGTTCCTATCTTGATTACG 53 ~ 73 683 55 gyrar ATTAGCACGCATATAGACG 717 ~ 735 683 55 parcf CGAGCAGGCTTACTTGAACT 63 ~ 82 524 58 parcr AGACTTACCGCGAGTTGTG 568 ~ 586 524 58 表 2 摇 嗜 水 气 单 胞 菌 对 氟 喹 诺 酮 类 药 物 的 细 菌 药 物 敏 感 性 试 验 结 果 及 耐 药 基 因 的 氨 基 酸 变 异 模 式 Table 2 摇 Susceptibilities of A. hydrophila isolates to fluoroquinolone and amino acid mutations in the QRDRs of gyra gene and parc gene 菌 株 最 低 抑 菌 浓 度 MIC ( 滋 g / ml) NOR OFX ENX CIP gyra 氨 基 酸 突 变 parc Thb07 鄄 01 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 - - Thb07 鄄 02 8. 00 4. 00 8. 00 4. 00 Ser 寅 Ile Ser 寅 Ile Thb07 鄄 03 1. 00 0. 50 1. 00 0. 25 - - Thb07 鄄 04 4. 00 8. 00 16. 00 4. 00 - - Thb08 鄄 01 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 - - Thb08 鄄 02 2. 00 4. 00 8. 00 1. 00 Ser 寅 Ile 0 Thb08 鄄 03 4. 00 8. 00 8. 00 4. 00 - - Thb08 鄄 04 2. 00 4. 00 8. 00 4. 00 Ser 寅 Ile 0 Thb08 鄄 05 2. 00 4. 00 8. 00 2. 00 - - Thb08 鄄 06 8. 00 8. 00 16. 00 4. 00 Ser 寅 Val Ser 寅 Ile Thj07 鄄 01 2. 00 4. 00 8. 00 2. 00 - - Thj07 鄄 02 16. 00 16. 00 32. 00 8. 00 Ser 寅 Ile Ser 寅 Ile Thj07 鄄 03 0. 25 0. 25 1. 00 0. 25 0 0 Thj07 鄄 04 2. 00 4. 00 8. 00 4. 00 - - Thj07 鄄 05 2. 00 8. 00 8. 00 2. 00 - - Thj07 鄄 06 0. 25 0. 25 1. 00 0. 25 - - Thj07 鄄 07 4. 00 4. 00 8. 00 2. 00 - - Thj07 鄄 08 2. 00 4. 00 8. 00 2. 00 - - Thj08 鄄 01 16. 00 16. 00 32. 00 8. 00 0 0 Thj08 鄄 02 4. 00 8. 00 32. 00 8. 00 Ser 寅 Ile 0 Thj08 鄄 03 2. 00 4. 00 8. 00 4. 00 - - Thj08 鄄 04 1. 00 4. 00 8. 00 2. 00 Ser 寅 Ile 0 Thj08 鄄 05 0. 50 0. 50 1. 00 0. 50 - - NOR: 诺 氟 沙 星,MIC 逸 16 滋 g / ml 表 示 耐 药, 臆 4 滋 g / ml 表 示 敏 感 ;OFX: 氧 氟 沙 星,MIC 逸 8 滋 g / ml 表 示 耐 药, 臆 2 滋 g / ml 表 示 敏 感 ;ENX: 恩 诺 沙 星, MIC 逸 2 滋 g / ml 表 示 耐 药, 臆 0. 25 滋 g / ml 表 示 敏 感 ;CIP : 环 丙 沙 星,MIC 逸 4 滋 g / ml 表 示 耐 药, 臆 1 滋 g / ml 表 示 敏 感 0 表 示 氨 基 酸 无 突 变

王 晓 丰 等 : 嗜 水 气 单 胞 菌 对 氟 喹 诺 酮 类 药 物 的 敏 感 性 及 耐 药 相 关 基 因 分 析 1301 2. 2 摇 PCR 扩 增 gyra 基 因 与 parc 基 因 QRDR 片 段 依 据 药 物 敏 感 性 试 验 结 果, 从 23 株 鱼 源 嗜 水 气 单 胞 菌 中 按 照 细 菌 耐 药 数 目 的 不 同 选 出 9 株 进 行 PCR 试 验 这 9 株 细 菌 分 别 是 : 耐 4 种 药 的 Thj07 鄄 02 Thj08 鄄 01; 耐 3 种 药 的 Thj08 鄄 02 Thb08 鄄 06; 耐 2 种 药 的 Thb07 鄄 02 Thb08 鄄 04; 耐 1 种 药 的 Thb08 鄄 02 Thj08 鄄 04; 以 及 对 4 种 药 均 敏 感 的 Thj07 鄄 03 图 1 显 示 了 这 9 株 细 菌 gyra 基 因 与 parc 基 因 QRDR 片 段 的 PCR 扩 增 结 果 M:100bp DNA ladder;1 ~ 9 号 泳 道 分 别 是 嗜 水 气 单 胞 菌 Thb07 鄄 02 Thj07 鄄 02 Thj08 鄄 01 Thj07 鄄 03 Thj08 鄄 02 Thb08 鄄 02 Thb08 鄄 04 Thj08 鄄 04 Thb08 鄄 06;10 号 泳 道 是 阴 性 对 照 图 1 摇 9 株 细 菌 gyra 基 因 与 parc 基 因 QRDR 片 段 的 PCR 扩 增 产 物 电 泳 图 Fig. 1 摇 PCR amplification of the gyra and parc QRDR sequences from 9 strains of A. hydrophila 2. 3 摇 序 列 比 对 分 析 将 PCR 产 物 测 序 得 到 的 DNA 序 列 翻 译 为 氨 基 酸 序 列 后, 与 嗜 水 气 单 胞 菌 标 准 菌 株 ATCC 7966 株 的 gyra 基 因 和 parc 基 因 编 码 的 氨 基 酸 分 别 进 行 序 列 比 对, 发 现 gyra 基 因 编 码 的 第 83 位 氨 基 酸 存 在 Ser 寅 Ile Ser 寅 Val 突 变,parC 基 因 编 码 的 第 87 位 氨 基 酸 存 在 Ser 寅 Ile 突 变 ( 图 2 图 3 表 2) 3 摇 讨 论 嗜 水 气 单 胞 菌 引 起 的 鱼 类 疾 病 是 水 产 养 殖 中 最 为 常 见 的 细 菌 性 病 害 之 一 该 菌 可 以 导 致 多 种 淡 水 鱼 发 病, 包 括 : 鲢 鳙 的 打 印 病 冶 ; 鲤 鱼 的 红 斑 病 竖 鳞 病 ; 青 鱼 草 鱼 的 肠 炎 和 疥 疮 病 ; 以 及 异 育 银 鲫 的 溶 血 性 腹 水 病 等 [11] 调 查 发 现 第 3 代 氟 喹 诺 酮 类 药 物 以 其 抗 菌 活 性 强, 防 治 效 果 好 在 生 产 实 践 中 被 广 为 应 用 诺 氟 沙 星 自 20 世 纪 90 年 代 初 开 始 应 用 于 水 产 养 殖 行 业, 而 后 由 于 防 治 效 力 下 降, 逐 渐 被 恩 诺 沙 星 和 环 丙 沙 星 所 取 代, 然 而 在 某 些 地 区 长 期 的 不 合 理 用 药 已 经 导 致 细 菌 对 这 2 种 药 物 产 生 耐 药 性 本 研 究 中 23 株 嗜 水 气 单 胞 菌 的 药 物 敏 感 性 试 验 结 果 表 明 17 株 细 菌 对 恩 诺 沙 星 耐 药, 耐 药 率 高 达 73 郾 9% 特 别 值 得 一 提 的 是 环 丙 沙 星, 虽 然 农 业 部 早 在 2002 年 将 其 列 为 无 公 害 水 产 禁 用 药 物 [12], 但 是 仍 然 有 10 株 细 菌 对 其 耐 药, 耐 药 率 达 43 郾 5 % 但 同 时 我 们 也 发

1302 江 苏 农 业 学 报 摇 2010 年 第 26 卷 第 6 期 2 条黑线之间的区域即为 gyra 基因 QRDR 片段(67 ~ 106 位氨基酸) ; 标示第 83 位氨基酸 图 2摇 gyra 基因 QRDR 片段编码的氨基酸序列比对 Fig. 2摇 Alignment of gyra QRDR amino acids sequences 2 条黑线之间的区域即为 parc 基因 QRDR 片段(71 ~ 110 位氨基酸) ; 标示第 87 位氨基酸 图 3摇 parc 基因 QRDR 片段编码的氨基酸序列比对 Fig. 3 Alignment of parc QRDR amino acids sequences 现,仅有 2 株细菌对诺氟沙星耐药,提示我们某种抗 何突变,提示我们药物靶位的变化并非是氟喹诺酮 生素停用一段时间后,在一定程度上又可恢复对细 类耐药菌株唯一的抗性机制,细菌外膜通透性下降 菌的敏感性 因此,实施标准化的渔业生产以及加 主动外排增强等耐药机制可能也发挥着十分重要的 强科学用药的宣传和指导至为关键 越来越多的研究证明 gyra 与 parc 基因的突变 是细菌 对 氟 喹 诺 酮 类 药 物 产 生 耐 药 性 的 主 要 机 作用 [14鄄16] 参考文献: 制 [6鄄7,13] 本研究发现,耐氟喹诺酮类药物的嗜水气 [1] 摇 张翠娟, 于宙亮, 赵宝华,等. 嗜水气单胞菌研究进展[ J]. 中 发生突变,主要突变形式是 Ser 寅 Ile,只有 Thb08鄄06 [2] 摇 吕爱军,胡秀彩,李槿年,等. 水产动物致病性嗜水气单胞菌的 单胞菌 gyra 基因 QRDR 区域普遍在第 83 位氨基酸 号细菌发生 Ser 寅 Val 的突变; 此外有 3 株细 菌 在 parc 基因 QRDR 区域还发现第 87 位氨基酸存在突 变:Ser寅Ile,提示在水产动物病害防治过程中大量 氟喹诺酮类药物的使用给嗜水气单胞菌造成了巨大 的选择压力 我们并没有发现菌株耐药数目与药物 靶位基因 QRDR 区域的氨基酸突变数目之间存在 线性关联,尤其是 Thj08鄄01 号菌株 药敏试验结果 是对 4 种氟喹诺酮全部耐药,然而却并没有发现任 国兽药杂志,2008,42 (7) :46鄄50. 分离鉴定[ J]. 江苏农业科学,2008(2) :172鄄174. [3] 摇 陈摇 勇,郭摇 丽,陈舒泛. 感染后暗纹东方鲀补体组分 C3 C4 表达分 析 [ J ]. 江 苏 农 业 科 学, 2008 ( 2 ) : 172-174. 175鄄 177,240. [4] 摇 陆承平. 致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述[ J]. 水产学 报,1992,16(3) :282鄄286. [5] 摇 苑青艳, 王摇 强, 李晓云,等. 猪源链球菌对环丙沙星耐药性 与耐药基因突变的相关性研究[ J]. 中国预防兽医学报,2009, 31(3) :202鄄203. [6] 摇 HOPKINS K L, DAVIES R H, THRELFALL E J. Mechanisms of

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