中 国 病 理 生 理 杂 志, ( ): - 杂 志 网 址 : : [ 文 章 编 号 ] - ( ) - - 可 变 剪 接 在 结 肠 癌 与 正 常 组 织 间 的 * 差 异 表 达 陶 敏, 黄 良 祥, 蔡 鹏 威, 晋 龙, 吴 文 冰, 曾 长 青, 黄 毅, 伍 严 安 ( 福 建 医 科 大 学 省 立 临 床 医 学 院, 福 建 省 立 医 院, 福 建 福 州 ) [ 摘 要 ] 目 的 : 探 讨 内 收 蛋 白 ( ) 及 其 剪 接 体 与 结 直 肠 癌 ( ) 的 关 系 方 法 : - 方 法 检 测 对 组 织 对 结 直 肠 息 肉 组 织 经 - 氟 尿 嘧 啶 ( - ) 或 奥 沙 利 铂 干 预 前 后 的 ( 低 转 移 性 ) 和 ( 高 转 移 性 ) 结 肠 癌 细 胞 中 - - 和 - 的 表 达 量 用 检 测 细 胞 的 活 力, 用 划 痕 实 验 检 测 细 胞 的 转 移 能 力, 用 实 验 检 测 细 胞 的 侵 袭 性 结 果 : 组 织 中 与 - 的 表 达 量 低 于 正 常 组 织 ( <. ), - 比 值 高 于 正 常 组 织 ( <. ); 病 理 分 组 发 现 - 在 - 组 的 表 达 量 较 - 组 高 ( <. ) 结 直 肠 息 肉 组 织 中 - 和 - 的 表 达 量 低 于 正 常 组 织 ( <. ) 细 胞 中 - 和 - 的 表 达 量 低 于 细 胞 ( <. ), - 比 值 高 于 ( <. ); 在 经 奥 沙 利 铂 和 - 分 别 处 理 后, 在 和 细 胞 活 力 迁 移 和 侵 袭 能 力 减 弱, 而 - 和 - 的 表 达 量 均 有 不 同 程 度 增 高 结 论 : 中 - 和 减 少, 并 伴 随 - 比 值 升 高 及 其 剪 接 体 的 改 变 可 能 跟 的 侵 袭 能 力 有 关 [ 关 键 词 ] ; 结 直 肠 癌 ; 可 变 剪 接 ; 细 胞 侵 袭 [ 中 图 分 类 号 ] ; [ 文 献 标 志 码 ] : -, -, -,, -, -,, - (,,,, - : @ ) [ ] : ( ) ( ) :, - -,, - -, -, : - - ( <. ), - ( <. ) - - - ( <. ), - - ( <. ), - - ( <. ) - ( <. ) -,,, - - : -, - [ ] ; ; ; [ 收 稿 日 期 ] - - [ 修 回 日 期 ] - - *[ 基 金 项 目 ] 福 建 省 卫 生 计 生 委 创 新 课 题 ( - - ) 通 讯 作 者 : - ; - : @
结 直 肠 癌 (, ) 是 消 化 道 最 常 见 的 恶 性 肿 瘤 之 一, 死 亡 率 在 世 界 上 排 名 第 位, 在 我 国 排 名 第 位, 每 年 约 有 万 人 死 于 发 生 发 展 的 病 理 机 制 十 分 复 杂, 目 前 认 为 基 因 突 变 是 癌 变 过 程 中 最 早 涉 及 的 初 级 遗 传 事 件, 而 在 发 展 过 程 中 将 会 引 发 次 级 分 子 事 件, 即 基 因 表 达 改 变, 如 差 异 性 表 达 可 变 剪 接 与 融 合 基 因 近 几 年, 一 些 基 因 表 达 的 可 变 剪 接 体 与 肿 瘤 的 关 系 受 到 重 视, 内 收 蛋 白 (, ) 可 变 剪 接 体 就 是 其 中 的 一 个 已 有 报 道 可 变 剪 接 的 表 达 差 异 跟 非 小 细 胞 肺 癌 及 小 鼠 乳 腺 癌 细 胞 有 关, 本 研 究 组 在 前 期 工 作 中 发 现 一 例 患 者 的 可 变 剪 接 在 与 正 常 组 织 的 表 达 存 在 差 异, 这 些 均 引 起 我 们 进 一 步 探 讨 可 变 剪 接 体 与 关 系 的 兴 趣 的 基 因 定 位 于 染 色 体. -., 含 个 外 显 子 是 年 等 在 红 细 胞 中 发 现 的 一 种 细 胞 膜 骨 架 蛋 白, 其 有 参 与 细 胞 膜 骨 架 网 状 结 构 构 建 和 维 持 细 胞 信 号 转 导 细 胞 膜 离 子 转 运 等 多 项 生 理 功 能 由 于 启 动 子 选 择 和 剪 接 方 式 不 同, 基 因 产 生 种 差 异 剪 接 体, 即 变 体 ( ) 变 体 ( ), 和 变 体 ( - ), 表 达 种 蛋 白 : 亚 型 (, ), 由 变 体 翻 译, 表 达 第 号 外 显 子 ; 亚 型 (, ), 由 变 体 和 变 体 翻 译, 第 号 外 显 子 表 达 缺 失 本 研 究 探 讨 中 总 的 - 亚 型 ( - ) 和 亚 型 ( - ) 的 变 化 及 其 意 义 组 织 和 细 胞 材 料 和 方 法 和 息 肉 组 织 在 知 情 同 意 的 情 况 下 收 集 年 月 ~ 年 月 于 本 院 胃 肠 外 科 及 肿 瘤 外 科 手 术 的 例 患 者 的 癌 组 织 及 距 离 癌 灶 边 缘 > 的 上 游 正 常 黏 膜 组 成 配 对 样 本, 其 中 结 肠 癌 例, 直 肠 癌 例 例 息 肉 患 者 在 肠 镜 下 取 出 的 息 肉 组 织 及 距 离 息 肉 边 缘 > 的 上 游 正 常 黏 膜 组 成 配 对 样 本 结 肠 息 肉 例, 直 肠 息 肉 例 结 直 肠 息 肉 多 数 为 ~ 个, 少 数 为 ~ 个 散 在 多 发 息 肉, 直 径. ~, 未 见 家 族 性 腺 瘤 性 息 肉 病 表 现, 均 无 家 族 性 腺 瘤 性 息 肉 病 家 族 史 所 有 样 本 均 在 内 切 下 即 放 入 保 存 液, 保 存 至 检 测 所 有 病 例 术 前 均 未 接 受 化 疗, 放 疗 及 生 物 治 疗 所 有 标 本 均 经 病 理 学 检 查 证 实 结 直 肠 癌 细 胞 株 采 用 国 内 外 通 用, 来 自 同 一 亲 本, 遗 传 背 景 一 致 的 人 大 肠 癌 高 转 移 性 细 胞 株 和 低 转 移 性 细 胞 株 购 自 中 科 院 上 海 细 胞 研 究 所, 由 福 建 省 肿 瘤 医 院 研 究 室 赠 予 主 要 试 剂 保 存 液 总 提 取 试 剂 和 - ( ) 购 自 北 京 康 为 世 纪 生 物 科 技 有 限 公 司 ; 第 一 链 合 成 试 剂 盒 购 自 ; 不 完 全 - 培 养 基 购 自 南 京 凯 基 生 物 科 技 发 展 有 限 公 司 ; 胎 牛 血 清 购 自 天 津 灏 洋 生 物 制 品 有 限 公 司 ; 胰 酶 购 自 ; 购 自 孔 板 和 基 质 胶 购 自 所 用 引 物 和 探 针 由 上 海 英 潍 捷 基 公 司 合 成, 序 列 见 表 表 引 物 和 探 针 序 列 ( - ) - - : : : - - - : : : - - - : : : - - - : : : - - - 主 要 方 法 细 胞 培 养 细 胞 置 于 含 % 胎 牛 血 清 不 完 全 - 培 养 基 中, 养, % 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 培 ~ 换 液 次, 实 验 用 细 胞 为 状 态 良 好 的 对 数 生 长 期 细 胞 比 色 法 检 测 细 胞 活 力 将 和 细 胞 接 种 于 孔 培 养 板, 每 孔 μ, 每 孔 接 种 细 胞 数 为, 每 组 设 个 复 孔, 培 养 ; 吸 弃 孔 中 培 养 基, 加 入 μ 含 有 浓 度 为.. 和 的 奥 沙 利 铂 培 养 液 或 浓 度 为.. 和 的 - 氟 尿 嘧 啶 ( -, - ) 的 培 养 液 培 养, 加 入 的 μ, 孵 育 后 小 心 吸 去 上 清, 加 入 μ 二 甲 基
亚 砜, 振 荡 溶 解 结 晶 后 用 波 长 比 色, 评 价 细 胞 存 活 率 实 验 重 复 次 划 痕 实 验 检 测 细 胞 迁 移 能 力 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 按 每 孔 加 入 孔 板, % 融 合 后, 用 μ 无 菌 枪 头 均 匀 划 痕, 洗 次, 更 换 为 含 % 胎 牛 血 清 的 培 养 基, 分 组 加 入 不 同 药 物 % 培 养 箱 培 养, 后 观 察 划 痕 愈 合 情 况 并 拍 照 每 组 实 验 重 复 次 实 验 用 无 血 清 培 养 基 稀 释 基 质 胶, 吸 μ 均 匀 铺 于 上 室 分 组 加 入 不 同 药 物, 用 无 血 清 培 养 基 调 整 细 胞 密 度 为 ; 取 μ 细 胞 悬 液 加 入 上 室, 下 室 加 μ % 胎 牛 血 清 培 养 基, % 培 养 取 出 小 室, % 多 聚 甲 醛 固 定 后 加. % 结 晶 紫 染 色, 洗 次, 用 棉 签 小 心 擦 去 上 室 细 胞, 倒 置 显 微 镜 下 随 机 选 取 个 视 野 计 数 细 胞 并 拍 照 ( ) 每 组 实 验 重 复 次 药 物 干 预 将 细 胞 接 种 于 孔 培 养 板, 每 孔, 细 胞 密 度 为, 每 组 设 个 复 孔, % 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 培 养, 细 胞 贴 壁 后 吸 弃 培 养 液, 加 入 不 含 血 清 的 培 养 液, 饥 饿 培 养 后 分 别 换 用 含 有 浓 度 为.. 和 的 奥 沙 利 铂 培 养 液 及 浓 度 为.. 和 的 - 的 培 养 液, 后 用 试 剂 收 集 各 孔 细 胞 实 验 重 复 次 - 将 收 集 的 细 胞 和 组 织 按 照 总 提 取 试 剂 的 操 作 说 明 书 进 行 总 的 提 取, 紫 外 分 光 光 度 计 比 色 后 选 用 在. ~. 的 标 本 μ 逆 转 录 成 取 进 行 - : ;,, 扩 增 个 循 环 统 计 学 处 理 采 用 国 际 通 用 的 - 相 对 定 量 ΔΔ 方 法 表 示 - - 和 - 的 相 对 表 达 水 平 实 验 数 据 采 用 均 数 ± 标 准 差 ( ± ) 表 示, 两 组 间 均 值 的 比 较 采 用 检 验, 病 理 分 析 运 用 非 参 数 - 检 验, 各 用 药 细 胞 组 内 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 ( - - ), - 法 行 各 组 间 均 数 的 两 两 比 较 所 有 统 计 学 处 理 均 在. 统 计 软 件 包 上 进 行 以 <. 为 差 异 有 统 计 学 意 义 结 组 织 的 表 达 量 比 较 中 的 表 达 量 低 于 正 常 组 织 ( < 果. ), 例 中 表 达 量 低 者 有 例 ( %); - 表 达 量 较 正 常 黏 膜 组 织 无 显 著 改 变 ; - 表 达 量 低 于 正 常 组 织 ( <. ), 例 中 表 达 量 低 者 有 例 ( %); - 的 比 值 高 于 正 常 组 织 ( <. ), 见 图 ± = ** <. 图 组 织 及 各 亚 型 的 表 达 量 组 织 的 病 理 分 析 将 对 组 织 ( 病 理 图 片 见 图 ) 根 据 美 国 癌 症 联 合 委 员 会 和 国 际 抗 癌 联 盟 结 直 肠 癌 分 ( ) 图 病 理 组 织 和 息 肉 组 织 的 形 态 学 观 察
期 ( 第 版 ) 划 分 深 度 ( 组 例, 组 例, 组 例, 组 例 ), 比 较 后 发 现 - 的 表 达 量 在 - 组 中 为. ±., 显 著 高 于 - 组 的. ±. ( <. ), 见 图 细 胞 和 细 胞 的 生 存 率 均 受 到 不 同 程 度 抑 制, 见 图 - - - ± = * <., ** <. 图 在 细 胞 和 细 胞 中 的 表 达 量 比 较 ± = ~ * <. - 图 - 在 病 理 分 组 - 和 - 中 的 表 达 量 结 直 肠 息 肉 组 织 表 达 量 的 比 较 - 和 - 表 达 量 在 结 直 肠 息 肉 组 织 ( 病 理 图 片 见 图 ) 中 分 别 为. ±.. ±. 和. ±., 均 低 于 正 常 组 织 ( <. ); - 各 组 间 差 异 无 统 计 学 显 著 性, 见 图 - ± = * <., * <. 图 经 奥 沙 利 铂 或 - 处 理 后 细 胞 和 细 胞 存 活 率 的 比 较 ± = * <. 图 结 直 肠 息 肉 的 表 达 量 比 较 细 胞 和 细 胞 中 的 表 达 差 异 细 胞 中 的 表 达 量 与 细 胞 比 较 差 异 无 统 计 学 显 著 性 ( >. ); 细 胞 中 - 和 - 的 表 达 量 低 于 ( <. ), - 比 值 高 于 细 胞 ( <. ), 见 图 实 验 结 果 经 不 同 剂 量 奥 沙 利 铂 和 - 分 别 处 理 后 划 痕 实 验 结 果 经 奥 沙 利 铂 和 - 分 别 处 理 后, 细 胞 愈 合 速 度 明 显 慢 于 各 自 对 照 组 细 胞, 表 明 加 药 后 细 胞 和 细 胞 的 迁 移 速 度 减 慢, 见 图 实 验 结 果 经 奥 沙 利 铂 和 - 分 别 处 理 后, 细 胞 穿 膜 数 明 显 少 于 各 自 对 照 组 细 胞, 表 明 - 和 奥 沙 利 铂 作 用 后 细 胞 和 细 胞 的 侵 袭 能 力 降 低, 见 图 药 物 干 预 实 验 细 胞 和 细 胞 经 不 同 浓 度 奥 沙 利
- ( ) - 图 细 胞 和 细 胞 的 划 痕 实 验 铂 和 - 分 别 处 理 后, - 和 - 的 表 达 量 均 有 不 同 程 度 升 高 但 是 在 - 达 到 的 较 大 浓 度 时, 各 指 标 表 达 量 下 降, 见 图 讨 论 真 核 生 物 中, 成 熟 的 是 由 初 始 转 录 产 物 前 ( - ) 经 过 剪 接 过 程 产 生 一 种 - 具 有 多 种 剪 接 程 序, 从 而 形 成 不 同 的 异 常 剪 接 剪 接 过 程 改 变, 甚 至 某 一 特 定 可 变 剪 接 的 转 换, 都 可 能 在 肿 瘤 发 生 发 展 的 某 一 阶 段 起 到 重 要 作 用 有 研 究 表 明 可 变 剪 接 产 生 蛋 白 质 亚 型 的 比 例 的 改 变 可 引 发 疾 病 等 对 非 小 细 胞 肺 癌 组 织 的 研 究 发 现 : 相 对 于 正 常 组 织, 剪 接 体 中 缺 失 第 号 外 显 子 的 剪 接 体 ( 在 本 研 究 中 即 - ) 在 非 小 细 胞 肺 癌 中 表 达 减 低 等 对 例 组 织, 例 正 常 结 直 肠 黏 膜 组 织 和 例 肝 转 移 的 可 变 剪 接 研 究 中, 发 现 某 些 肿 瘤 特 异 性 的 可 变 剪 接 常 见 于 结 直 肠 癌 早 期, 可 变 剪 接 在 正 常 组 织 和 癌 症 的 早 期 含 [ ] 量 丰 富, 到 了 肝 转 移 时 大 幅 下 跌 等 的 研 究 发 现 微 小 - ( - ) 通 过 调 节 蛋 白 和
456 Figure 8. The images of the cell invasion assay ( 200 ). It showed that the invasion abilities of SW480 cells and SW620 cells were inhibited by oxaliplatin or 5 FU. 图 8 细胞侵袭性实验 Figure 9. The effect of oxaliplatin on the mrna expression of ADD3 in SW480 cells and SW620 cells. Mean ±SD. n =3. * P <0.05, ** P <0.01 vs 0 mg/ L. 图 9 经奥沙利铂处理 后 SW480 细胞和 SW620 细胞 ADD3 的 mrna 表达量 Figure 10. The effect of 5 FU on the mrna expression of ADD3 in SW480 cells and SW620 cells. Mean ±SD. n =3. * P <0.05, ** P <0.01 vs 0 mg/ L. 图 10 经 5 FU 铂处理后 SW480 细胞 和 SW620 细胞 ADD3 的 mrna 表达量 细胞黏附分子 ADD3 的活性来行使其肿瘤抑制作用 结合本研究结果提示了 ADD3 的表达减低可能跟细 从而减少人类胶质细胞瘤的增殖 黏附和侵袭能力 胞的侵袭和迁移功能有关
本 课 题 组 前 期 研 究 结 果 发 现, - 在 例 患 者 癌 组 织 中 表 达 量 增 加 本 次 研 究 中 我 们 发 现 - 和 - 两 种 剪 接 体 在 正 常 组 织 和 肿 瘤 组 织 中 均 有 表 达, 但 表 达 量 有 显 著 差 异 的 表 达 量 包 括 - 和 -, - 的 表 达 量 较 正 常 组 织 无 显 著 差 异, 而 - 和 在 组 织 中 表 达 量 显 著 低 于 正 常 组 织, 说 明 在 组 织 中 的 表 达 量 低 于 正 常 组 织 可 能 主 要 是 与 - 的 显 著 减 少 有 关, 伴 随 着 - 的 比 值 显 著 升 高 结 直 肠 息 肉 组 织 中 也 存 在 和 - 表 达 量 较 正 常 组 织 低 的 现 象, 这 可 能 表 示 及 其 剪 接 体 的 表 达 量 在 良 性 组 织 中 也 发 生 了 变 化, 与 不 同 的 是 - 在 息 肉 组 织 中 表 达 量 明 显 低 于 正 常 组 织, - 比 值 较 正 常 组 织 无 显 著 差 异 可 见 及 其 剪 接 体 的 表 达 差 异 在 结 肠 癌 与 息 肉 组 织 中 存 在 差 异 相 比 较 于 息 肉, - 表 达 量 上 调, 导 致 - 的 比 值 显 著 升 高 经 病 理 分 组 分 析 后 发 现 临 床 分 期 更 晚 的 ~ 组 中 - 的 表 达 量 高 于 临 床 分 期 早 的 ~ 组 在 细 胞 实 验 部 分, 从 细 胞 库 中 选 择 高 转 移 性 和 低 转 移 性 作 为 受 试 细 胞 株 检 测 发 现 株 细 胞 的 表 达 量 存 在 明 显 差 异, 这 个 结 果 提 示 了 及 其 剪 接 体 的 改 变 可 能 与 的 转 移 性 有 关 用 不 同 浓 度 奥 沙 利 铂 和 - 干 预 细 胞, 细 胞 划 痕 实 验 和 侵 袭 性 实 验 发 现 细 胞 迁 移 能 力 和 侵 袭 能 力 均 受 到 抑 制, 同 时 - 和 - 的 表 达 量 均 有 不 同 程 度 升 高, 从 另 一 个 角 度 验 证 了 及 其 剪 接 体 表 达 量 的 升 高 与 结 直 肠 癌 细 胞 株 迁 移 和 侵 袭 能 力 下 降 相 关 综 上 所 述, 本 研 究 结 果 提 示, 在 中 可 变 剪 接 体 的 表 达 发 生 了 改 变, - 比 值 的 升 高 可 能 是 可 变 剪 接 在 中 的 特 征 性 表 现, 并 可 能 与 的 侵 袭 能 力 有 关 下 一 步 值 得 进 行 中 的 工 作 是 探 讨 其 是 否 可 能 成 为 一 种 标 志 物, 以 及 反 映 侵 袭 性 的 标 志 物 这 一 比 值 在 中 的 变 化 与 肿 瘤 的 因 果 关 系 尚 不 明 确, 亦 需 要 进 一 步 的 研 究 [ 参 考 文 献 ],,, -,, ( ): -,,, : -,, -,, :,,,, -,, ( ):, - - -,, ( ): - 曲 利 娟, 丁 彦 青, 梁 莉 人 大 肠 癌 不 同 转 移 潜 能 细 胞 株 及 的 差 异 蛋 白 质 组 分 析 第 一 军 医 大 学 学 报,, ( ): -, - - ΔΔ,, ( ): - 王 科 俊, 吕 俊 杰, 冯 伟 兴, 等 可 变 剪 接 与 疾 病 的 生 物 信 息 学 研 究 概 况 生 命 科 学 研 究,, ( ): -,,, -,, ( ): - [ ],,, - -,, ( ): - ( 责 任 编 辑 : 林 白 霜, 罗 森 )